CN109641931A - 核糖核酸h-磷酸酯单体的合成方法和使用了该单体的寡核苷酸合成 - Google Patents
核糖核酸h-磷酸酯单体的合成方法和使用了该单体的寡核苷酸合成 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及核糖核酸H‑磷酸酯单体的合成方法和使用了该单体的寡核苷酸合成的方法。本发明涉及选择性地保护合成RNA寡核苷酸所需的核糖核苷单体的2’位、且能够以低成本制造的H‑磷酸酯核苷衍生物的制造方法。本发明的特征在于，通过使反应性稍有不同的2’位和3’位的羟基与芳香族酰卤在低温下反应，从而进行2’位选择性的酯化，随后通过利用膦酰基捕获一锅中的3’位的羟基，而不会引起酰基的2’位和3’位的重排。
Description
技术领域
本发明涉及选择性地保护合成RNA寡核苷酸所需的核糖核苷单体的2’位、且能够以低成本制造的H-磷酸酯核苷衍生物的制造方法。
背景技术
自发现RNAi以来，RNA寡核苷酸以siRNA为首可期待用于药品中并在全世界范围内进行了开发。
发明内容
用于解决问题的方案
本发明人等进行了深入研究，结果通过使用亚磷酸酯作为用于导入制造RNA单体所需的磷部分的磷试剂，从而能够容易去除磷试剂的残渣，且开发出操作得以显著改善的合成法。
本发明还提供以下的项目。
(项目1)
一种制造以下的通式所示的化合物或其盐或其溶剂化物的方法，
[化学式1]
(式(1)中，R1表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，R2表示氢原子或羟基的保护基，B表示任选具有保护基的核酸碱基)
该方法包括工序1和工序2，
工序1是使[化学式2]与[化学式3]反应而得到[化学式4]的工序，
[化学式2]
[化学式3]
(式(3)中，X为卤素原子)
[化学式4]
工序2是使[化学式5]与P(OR3)(OR3’)OH反应而得到[化学式6]的工序，
[化学式5]
[化学式6]
(式P(OR3)(OR3’)OH中，R3和R3’分别独立地表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团)，
该工序1和该工序2在1个反应容器内进行。
(项目2)
根据上述项目所述的方法，其中，所述任选具有保护基的核酸碱基选自由如下组成的组，
[化学式7]
(式(7)中，R3a、R3b和R3c分别独立地表示选自由氢原子、取代或未取代的直链或支链烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，或者R3a与R3b一起形成脒型保护基的基团)。
(项目3)
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述脒型保护基为N,N-二甲基甲脒基或N,N-二甲基乙脒基。
(项目4)
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，R1为取代或未取代的芳基。
(项目5)
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述取代或未取代的芳基为苯基。
(项目6)
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述羟基的保护基为选自由醚系保护基、甲硅烷基醚系保护基、缩醛系保护基和酰基系保护基组成的组的保护基。
(项目7)
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述醚系保护基为：
[化学式8]
(式(R2a)中，R4a1、R4a2、R4a3、R4a4、R4a5、R4b1、R4b2、R4b3、R4b4、R4b5、R4c1、R4c2、R4c3、R4c4和R4c5分别独立地为选自由氢原子、取代或未取代的直链或支链烷氧基和取代或未取代的直链或支链烷基组成的组的基团。)。
(项目8)
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述取代或未取代的直链或支链烷氧基为直链或支链全氟烷氧基。
(项目9)
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述取代或未取代的直链或支链烷基为直链或支链全氟烷基。
(项目10)
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述甲硅烷基醚系保护基为：
[化学式9]
(式(R2b)中，R4d、R4e和R4f分别独立地为选自由取代或未取代的直链或支链烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的烯基组成的组的基团。)。
(项目11)
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述取代或未取代的烯基为烯丙基。
(项目12)
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述甲硅烷基醚系保护基为：
[化学式10]
(式(R2c)中，R4g、R4h和R4i分别独立地为选自由取代或未取代的烃基、取代或未取代的甲硅烷基和取代或未取代的甲硅烷基氧基烷基组成的组的基团。)。
(项目13)
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述甲硅烷基被1～3个烷基取代。
(项目14)
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述取代或未取代的烃基为选自由取代或未取代的直链或支链烷基、取代或未取代的直链或支链烯基、取代或未取代的直链或支链炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的直链或支链芳基烷基组成的组的基团。
(项目15)
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述取代或未取代的直链或支链烷基为直链或支链卤代烷基。
(项目16)
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述直链或支链卤代烷基为直链或支链全氟烷基。
(项目17)
一种用于制造以下通式所示的化合物的试剂盒，其中，所述通式为：
[化学式13]
其中，式(13)中，各记号与前述含义相同，
所述试剂盒包含：
[化学式11]
[化学式12]
和
P(OR3)(OR3’)OH，
式(11)中，R2表示氢原子或羟基的保护基，B表示任选具有保护基的核酸碱基，
式(12)中，R1表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，X为卤素原子，
式P(OR3)(OR3’)OH中，R3和R3’分别独立地表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团。
(项目18)
根据上述项目所述的试剂盒，其中，任选具有前述保护基的核酸碱基选自由如下组成的组，
[化学式14]
(式(14)中，R3a、R3b和R3c分别独立地表示选自由氢原子、取代或未取代的直链或支链烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，或者R3a与R3b一起形成脒型保护基的基团)。
(项目19)
根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，前述脒型保护基为N,N-二甲基甲脒基或N,N-二甲基乙脒基。
(项目20)
根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，R1为取代或未取代的芳基。
(项目21)
根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，前述取代或未取代的芳基为苯基。
(项目22)
根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，前述羟基的保护基为选自由醚系保护基、甲硅烷基醚系保护基、缩醛系保护基和酰基系保护基组成的组的保护基。
(项目23)
根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，前述醚系保护基为：
[化学式15]
(式(R2a)中，R4a1、R4a2、R4a3、R4a4、R4a5、R4b1、R4b2、R4b3、R4b4、R4b5、R4c1、R4c2、R4c3、R4c4和R4c5分别独立地为选自由氢原子、取代或未取代的直链或支链烷氧基和取代或未取代的直链或支链烷基组成的组的基团。)。
(项目24)
根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，前述取代或未取代的直链或支链烷氧基为直链或支链全氟烷氧基。
(项目25)
根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，前述取代或未取代的直链或支链烷基为直链或支链全氟烷基。
(项目26)
根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，前述甲硅烷基醚系保护基为：
[化学式16]
(式(R2b)中，R4d、R4e和R4f分别独立地为选自由取代或未取代的直链或支链烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的烯基组成的组的基团。)。
(项目27)
根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，前述取代或未取代的烯基为烯丙基。
(项目28)
根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，前述甲硅烷基醚系保护基为：
[化学式17]
(式(R2c)中，R4g、R4h和R4i分别独立地为选自由取代或未取代的烃基、取代或未取代的甲硅烷基和取代或未取代的甲硅烷基氧基烷基组成的组的基团。)。
(项目29)
根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，前述甲硅烷基被1～3个烷基取代。
(项目30)
根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，前述取代或未取代的烃基为选自由取代或未取代的直链或支链烷基、取代或未取代的直链或支链烯基、取代或未取代的直链或支链炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的直链或支链芳基烷基组成的组的基团。
(项目31)
根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，前述取代或未取代的直链或支链烷基为直链或支链卤代烷基。
(项目32)
根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，前述直链或支链卤代烷基为直链或支链全氟烷基。
(项目33)
一种用于选择性地制造以下通式所示的化合物或其盐或其溶剂化物的磷试剂，其中，所述通式为：
[化学式18]
(式(18)中，R1表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，R2表示氢原子或羟基的保护基，B表示任选具有保护基的核酸碱基)
所述磷试剂包含P(OR3)(OR3’)OH，
(式P(OR3)(OR3’)OH中，R3和R3’分别独立地表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团)。
(项目34)
根据上述项目所述的磷试剂，其中，任选具有前述保护基的核酸碱基选自由如下组成的组，
[化学式19]
(式(19)中，R3a、R3b和R3c分别独立地表示选自由氢原子、取代或未取代的直链或支链烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，或者R3a与R3b一起形成脒型保护基的基团)。
(项目35)
根据上述项目中任一项所述的磷试剂，其中，前述脒型保护基为N,N-二甲基甲脒基或N,N-二甲基乙脒基。
(项目36)
根据上述项目中任一项所述的磷试剂，其中，R1为取代或未取代的芳基。
(项目37)
根据上述项目中任一项所述的磷试剂，其中，前述取代或未取代的芳基为苯基。
(项目38)
根据上述项目中任一项所述的磷试剂，其中，前述羟基的保护基为选自由醚系保护基、甲硅烷基醚系保护基、缩醛系保护基和酰基系保护基组成的组的保护基。
(项目39)
根据上述项目中任一项所述的磷试剂，其中，前述醚系保护基为：
[化学式20]
(式(R2a)中，R4a1、R4a2、R4a3、R4a4、R4a5、R4b1、R4b2、R4b3、R4b4、R4b5、R4c1、R4c2、R4c3、R4c4和R4c5分别独立地为选自由氢原子、取代或未取代的直链或支链烷氧基和取代或未取代的直链或支链烷基组成的组的基团。)。
(项目40)
根据上述项目中任一项所述的磷试剂，其中，前述取代或未取代的直链或支链烷氧基为直链或支链全氟烷氧基。
(项目41)
根据上述项目中任一项所述的磷试剂，其中，前述取代或未取代的直链或支链烷基为直链或支链全氟烷基。
(项目42)
根据上述项目中任一项所述的磷试剂，其中，前述甲硅烷基醚系保护基为：
[化学式21]
(式(R2b)中，R4d、R4e和R4f分别独立地为选自由取代或未取代的直链或支链烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的烯基组成的组的基团。)。
(项目43)
根据上述项目中任一项所述的磷试剂，其中，前述取代或未取代的烯基为烯丙基。
(项目44)
根据上述项目中任一项所述的磷试剂，其中，前述甲硅烷基醚系保护基为：
[化学式22]
(式(R2c)中，R4g、R4h和R4i分别独立地为选自由取代或未取代的烃基、取代或未取代的甲硅烷基和取代或未取代的甲硅烷基氧基烷基组成的组的基团。)。
(项目45)
根据上述项目中任一项所述的磷试剂，其中，前述甲硅烷基被1～3个烷基取代。
(项目46)
根据上述项目中任一项所述的磷试剂，其中，前述取代或未取代的烃基为选自由取代或未取代的直链或支链烷基、取代或未取代的直链或支链烯基、取代或未取代的直链或支链炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的直链或支链芳基烷基组成的组的基团。
(项目47)
根据上述项目中任一项所述的磷试剂，其中，前述取代或未取代的直链或支链烷基为直链或支链卤代烷基。
(项目48)
根据上述项目中任一项所述的磷试剂，其中，前述直链或支链卤代烷基为直链或支链全氟烷基。
(项目49)
一种P(OR3)(OR3’)OH在用于选择性地制造如下通式所示的化合物或其盐或其溶剂化物中的应用，其中，所述通式为：
[化学式22A]
(式(22A)中，R1表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，R2表示氢原子或羟基的保护基，B表示任选具有保护基的核酸碱基)，
(式P(OR3)(OR3’)OH中，R3和R3’分别独立地表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团)。
本发明中，对于上述一个或多个特征，除了已揭示的组合之外，还可以试图进一步组合来提供。本领域技术人员根据需要阅读以下的详细说明则可意识到本发明的其它实施方式和优点。
发明的效果
根据本发明，能够以低成本制造核糖核酸H-磷酸酯单体，作为其结果，能够以低成本制造RNA。本发明的特征在于，通过使反应性稍有不同的2’位和3’位的羟基与芳香族酰卤在低温下反应，从而进行2’位选择性的酯化，随后通过利用膦酰基捕获一锅中的3’位的羟基，而不会引起酰基的2’位和3’位的重排。
附图说明
图1示出5’-HO-rU19dT-3’-OH的LC-MS分析结果。
图2示出5’-HO-rU3rCrGrArU3dT-3’-OH的LC-MS分析结果。
具体实施方式
以下边示出最佳方式边对本发明进行说明。在整个说明书中，单数形式的表示在没有特别声明时，应理解为还包含其复数形式的概念。因此，单数形式的冠词(例如，英语的情况“a”、“an”、“the”等)在没有特别声明时，应理解为还包含其复数形式的概念。另外，本说明书中使用的术语在没有特别声明时，应理解为以在该领域中通常使用的意思来使用。因此，只要没有定义为其它意思，则本说明书中使用的全部专业术语和科学技术术语具有与本发明所属的领域的本领域技术人员通常理解相同的意思。在矛盾的情况下，本说明书(包括定义)优先。
(术语的定义)
以下对本说明书中的术语进行说明。
本说明书中“取代”是指：将有机化合物的某个特定的氢原子用其它原子或原子团取代。将代替氢原子被导入的原子或原子团称为“取代基”。官能团均可以视为取代基。作为取代基的例子，例如可列举出：卤素原子、羟基、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或杂芳基等。
“卤素原子”包括氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。
本说明书中“羟基”是指：-OH所示的基团。
本说明书中为“直链”的基团是指：构成该基团的碳既无分支且也不形成环地具有连接成直线状的形状的基团。
本说明书中为“支链”的基团是指：具有2个以上的碳原子与构成该基团的碳原子键合的结构的基团。
在本说明书中，C1、C2、Cn表示碳数(此处，n表示任意的正整数。)。因此，C1用于表示1个碳数的取代基。
本说明书中“烷基”是指：从甲烷、乙烷、丙烷之类的脂肪族烃(烷烃)中失去一个氢原子而生成的1价的基团，通常由CnH2n+1-表示(此处，n为正整数)。例如可列举出：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、正庚基、异庚基、正辛基、异辛基、正壬基、正癸基等。本说明书中“取代烷基”是指：烷基的H被上述规定的取代基取代的烷基。
本说明书中“烯基”是指：从在分子内具有一个双键的脂肪族烃(烯烃)中失去一个氢原子而生成的1价的基团，通常由CnH2n-1-表示(此处，n为2以上的正整数)。例如可列举出：乙烯基、烯丙基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、异戊烯基(Prenyl)、丁二烯基、戊烯基、异戊烯基(Isopentenyl)、戊二烯基、己烯基、异己烯基、己二烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基等。“取代烯基”是指：烯基的H被上述规定的取代基取代的烯基。
本说明书中“烯丙基”是指：CH2＝CH-CH2-所示的基团。
本说明书中“炔基”是指：从在分子内具有一个三键的脂肪族烃(炔烃)中失去一个氢原子而生成的1价的基团，通常由CnH2n-3-表示(此处，n为2以上的正整数)。例如包括：乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等。“取代炔基”是指：炔基的H被上述规定的取代基取代的炔基。
本说明书中“环烷基”是指：具有环式结构的烷基。例如可列举出：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基等。“取代环烷基”是指：环烷基的H被上述规定的取代基取代的环烷基。
本说明书中“环烯基”是指：具有环式结构的烯基。例如可列举出：环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基、环壬烯基、环癸烯基等。“取代环烯基”是指：环烯基的H被上述规定的取代基取代的环烯基。
本说明书中“芳基”是指：使与芳香族烃的环键合的1个氢原子脱离而生成的基团。由苯衍生苯基(C6H5-)、由甲苯衍生甲苯基(CH3C6H4-)、由二甲苯衍生二甲苯基((CH3)2C6H3-)、由萘衍生萘基(C10H8-)、由菲衍生菲基(C14H9-)、由蒽衍生蒽基(C14H9-)、由并四苯衍生并四苯基(C18H11-)、由屈衍生屈基(C18H11-)、由芘衍生芘基(C18H11-)、由苯并芘衍生苯并芘基(C20H11-)、由并五苯衍生并五苯基(C22H13-)。
本说明书中“杂芳基”是指：在环内具有1个以上任意地选自O、S和N中的相同或不同的杂原子的、单环或二环以上的芳基。二环以上的杂芳基还包括在单环或二环以上的杂芳基上稠合了上述“芳基”中的环而成的基团。
作为单环的杂芳基，优选5～8元、更优选为5元或6元。例如可列举出：吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三唑基、三嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异恶唑基、恶唑基、恶二唑基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基等。
作为二环的杂芳基，例如可列举出：吲哚基、异吲哚基、吲唑基、吲嗪基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、二氮杂萘基、喹喔啉基、嘌呤基、蝶啶基、苯并咪唑基、苯并异恶唑基、苯并恶唑基、苯并恶二唑基、苯并异噻唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并三唑基、咪唑并吡啶基、三唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、吡嗪并哒嗪基、唑并吡啶基、噻唑并吡啶基等。
作为三环以上的杂芳基，例如可列举出：咔唑基、吖啶基、呫吨基、吩噻嗪基、吩恶噻基、吩嗪基、二苯并呋喃基等。
本说明书中“烷氧基”是指：上述“烷基”与氧原子键合的基团。例如可列举出：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、戊氧基、异戊氧基、己基氧基等。
本说明书中“卤代烷基”是指：1个以上的上述“卤素原子”与上述“烷基”键合的基团。例如可列举出：单氟甲基、单氟乙基、单氟丙基、2,2,3,3,3-五氟丙基、单氯甲基、三氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、2,2,2-三氯乙基、1,2-二溴乙基、1,1,1-三氟丙烷-2-基等。
本说明书中“全氟烷基”是指：与烷基的碳键合的全部或一部分氢被氟取代的烷基。
本说明书中“全氟烷氧基”是指：与烷氧基的碳键合的全部或一部分氢被氟取代的烷氧基。
本说明书中“烷基酰基”是指：上述“烷基”与羰基键合的基团。例如可列举出：甲基羰基、乙基羰基、丙基羰基、异丙基羰基、叔丁基羰基、异丁基羰基、仲丁基羰基、戊基羰基、异戊基羰基、己基羰基等。
本说明书中“芳基酰基”是指：上述“芳基”与羰基键合的基团。例如可列举出：苯基羰基、萘羰基、菲氧基羰基、蒽基羰基等。
本说明书中“芳基烷基”是指：被1个以上的上述“芳基”取代的烷基。例如可列举出：苄基、苯乙基、苯基丙炔基、二苯甲基、三苯甲基、萘甲基等。
本说明书中“甲硅烷基”是指：上述“烷基”、“烯基”、“炔基”或“芳基”中的3个与硅原子键合的基团。此处与3个硅原子键合的基团可以相同或不同。例如可列举出：三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)等。
本说明书中“甲硅烷基氧基烷基”是指：上述“烷基”上的氢被作为上述“甲硅烷基”与氧原子键合的基团的“甲硅烷基氧基”取代的基团。例如可列举出：三甲基甲硅烷基氧基甲基、三乙基甲硅烷基氧基乙基、叔丁基二甲基甲硅烷基氧基甲基、三异丙基甲硅烷基氧基丙基、叔丁基二苯基甲硅烷基氧基丁基等，但不限定于此。
本说明书中“阳离子”是指：具有正电荷的离子，例如可列举出：氢离子、季铵离子、锂离子、钠离子、钾离子等，但不限定于此。
本说明书中“叔胺”是指：氨的全部氢被上述“烷基”或上述“芳基”取代的化合物。例如可列举出：三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、三丙胺等，但不限定于此。
本说明书中“核酸碱基”是指：构成核酸的碱基成分，例如可列举出：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)等，但不限定于此。
本说明书中“低聚物”是指：低聚合度的聚合物，低聚物的聚合度不限定于此，为2～100。
本说明书中“保护基”是指：用于保护官能团免受特定的化学反应影响而使用的基团。
作为羟基的保护基，可列举出：醚系保护基(甲基(Me)、苄基(Bn)、对甲氧基苄基(PMB)、叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(Tr)等)、甲硅烷基醚系保护基(三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)等)、缩醛系保护基(甲氧基甲基(MOM)、2-四氢呋喃基(THP)、乙氧基乙基(EE)等)、酰基系保护基(乙酰基(Ac)、特戊酰基(Piv)、苯甲酰基(Bz)等)等，但不限定于此。
作为氨基的保护基，可列举出：氨基甲酸酯系保护基(叔丁氧基羰基(Boc)、苄基氧基羰基(Cbz)、9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)、2,2,2-三氯乙氧基羰基(Troc)、烯丙基氧基羰基(Alloc)等)、酰胺系保护基(三氟乙酰基等)、酰亚胺系保护基(邻苯二甲酰基(Pht)等)、磺酰胺系保护基(对甲苯磺酰基(Ts)、2-硝基苯磺酰基(Ns)等)、脒型保护基(N,N-二甲基甲脒基、N,N-二甲基乙脒基等)等，但不限定于此。
本说明书中“脒型保护基”是指：以下的通式所示的保护基，
[化学式23]
(式(23)中，R1、R2和R3分别独立地为选自由氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基组成的组的基团)
例如，可列举出：N,N-二甲基甲脒基、N,N-二甲基乙脒基等，但不限定于此。
在本说明书中，“溶剂化”是指：一些溶剂分子被溶质分子或离子包围而成为一个集团的现象。
本发明的化合物还可以以盐的形式提供。例如可列举出有机碱(三乙胺等)的盐。尤其可列举出与三乙胺的盐。可以利用通常进行的方法形成这些盐。或根据本发明的制造方法的条件，可以以盐的形式生成化合物(例如是源自添加剂的物质)。
本发明的化合物还可以以溶剂化物的形式提供。例如可列举出与水、叔胺的溶剂化物。这样的溶剂化物可以利用通常进行的方法来形成。或根据本发明的制造方法的条件，可以以溶剂化物的形式生成化合物。进而，上述化合物的盐可以以溶剂化物的形式生成并提供。
在本说明书中，“反应容器”是指：在化学物质的制造过程中进行化学反应的装置，例如可列举出：烧瓶、烧杯等，但不限定于此。
在本说明书中，“构成单元”是指：构成低聚物的基本结构的一部分的原子或原子团，与“单体”同义地使用。
(优选的实施方式的说明)
以下对本发明的优选的实施方式进行说明。以下所提供的实施方式是用于更好地理解本发明而提供的例子，可理解为本发明的范围不应限定于以下的记载。因此，本领域技术人员可以参考本说明书中的记载并在本发明的范围内进行适宜改变是显而易见的。另外，可理解为本发明的以下的实施方式可以单独使用或组合它们来使用。
在一个方式中，本发明提供一种制造以下的通式所示的化合物或其盐或其溶剂化物的方法，所述通式为：
[化学式24]
(式(24)中，R1表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，R2表示氢原子或羟基的保护基，B表示任选具有保护基的核酸碱基)
该方法包括工序1和工序2，
工序1是使[化学式25]
与[化学式26]反应，
(式(26)中，X为卤素原子)
而得到[化学式27]的工序，
工序2是使[化学式28]
与P(OR3)(OR3’)OH反应，
而得到[化学式29]的工序，
(式P(OR3)(OR3’)OH中，R3和R3’分别独立地表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团)，
该工序1和该工序2在1个反应容器内进行。
以往，在通过有机合成反应来选择性地得到2’位保护核糖核苷单体时，已知如下式所示那样，
[化学式30]
在2’位的羟基导入保护基后，使用磷试剂在3’位的羟基导入磷酸基这样的方法。进行上述合成时，2’位的羟基被保护的中间体(A)与3’位的羟基被保护的中间体(B)处于平衡关系，随着时间经过中间体(A)与中间体(B)的摩尔比达到50/50，因此需要迅速地进行导入磷酸基的反应。因此需要使用反应性非常高的磷试剂。
然而，反应性非常高的磷试剂通常有毒性高，在室温下不稳定等操作困难。另外，还存在根据磷试剂而难以去除试剂残渣(例如磷酸)，需要增加柱色谱法的次数等在纯化上费时这样的问题点。
本发明中通过使用反应性相对较低的磷酸酯作为磷试剂，从而意外地发现，在2’位的羟基选择性地导入保护基并能从反应产物中容易去除磷酸酯的残渣。进而由于能容易去除磷酸酯的残渣，因此与现有方法相比也使2’位保护核糖核苷单体的纯度提高。
另外，由于比使用现有的酶的方法的底物特异性广，因而能够合成更多种类的2’位保护核糖核苷单体。
在一个优选的实施方式中，工序1在低于室温的低温下进行，此时的反应温度为-40～20℃、-40～15℃、-40～10℃、-40～5℃、-40～0℃、-40～-10℃、-40～-20℃、-40～-30℃、-30～20℃、-20～20℃、-10～20℃、0～20℃、5～20℃，但不限定于此，优选为-40～20℃下。尽管不期望受到理论的约束，但原因在于根据碱基、溶剂，中间体(A)与中间体(B)的异构化反应进行，因而使中间体(A)与中间体(B)的摩尔比达到50/50。需要说明的是，即使在室温以上进行反应的情况下，在较短的时间(数小时)内也并不会发生异构化，证实了在特定的条件(例如浓缩时)下保持在室温以上时上述异构化反应进行。另外，即使异构化反应进行，若为10％左右，则可以在磷酸化后通过纯化而去除，因此可以接受。
在一个优选的实施方式中，在工序1结束后1分钟以内、2分钟以内、3分钟以内、4分钟以内、5分钟以内、10分钟以内、20分钟以内、30分钟以内、40分钟以内、50分钟以内、1小时以内、2小时以内、3小时以内、4小时以内进行工序2、优选在工序1结束后1小时以内进行工序2。工序1是否结束可以利用薄层色谱法(TLC)、液相色谱法来进行确认，但不限定于此。另外，在预先进行预实验，估计要到工序1结束的时间的情况下，可以在不对工序1是否结束进行确认的前提下进行工序2。
在一个优选的实施方式中，进行工序2时的反应体系中的温度为-40～25℃、-40～20℃、-40～10℃、-40～5℃、-40～0℃、-40～-10℃、-40～-20℃、-40～-30℃、-30～25℃、-20～25℃、-10～25℃、0～25℃、5～25℃、10～25℃、20～25℃、-30～20℃、-20～20℃、-10～20℃、0～20℃、5～20℃、10～20℃，但不限定于此，优选为-20～20℃。
在一个优选的实施方式中，在工序2中优选在添加亚磷酸酯前添加碱。虽然期望不受理论约束，但这是用于猝灭在工序1中所添加的过量的酰卤。此时添加的碱优选二甲胺盐酸盐，但不限定于此。添加碱后直至添加亚磷酸酯的时间为30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时，但不限定于此。另外，添加碱时的温度为-40℃～室温、-40～30℃、-40～20℃、-40～10℃、-40～5℃、-40～0℃、-40～-10℃、-40～-20℃、-40～-30℃、-30～30℃、-20～30℃、-10～30℃、0～30℃、5～30℃、10～30℃、20～30℃，但不限定于此，优选为-40℃～室温、-40～0℃。
通过本发明的反应而得到的产物对于纯化前的纯度而言也比通过现有的反应而得到的产物高，因此之后的纯化也能比通过现有的反应而得到的产物容易进行。
在一个优选的实施方式中，任选具有前述保护基的核酸碱基选自由如下组成的组，
[化学式31]
(式(31)中，R3a、R3b和R3c分别独立地表示选自由氢原子、取代或未取代的直链或支链烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，或者R3a与R3b一起形成脒型保护基的基团)，在进一步优选的实施方式中，前述脒型保护基为N,N-二甲基甲脒基或N,N-二甲基乙脒基。本发明的反应中，不仅在核酸碱基为嘌呤碱基时，即使在为嘧啶碱基时也选择性地在2’位进行。
在一个优选的实施方式中，R1为取代或未取代的芳基，在进一步优选的实施方式中，前述取代或未取代的芳基为苯基。尽管不期望受到理论的约束，但原因在于在进行工序1的反应时在2’位选择性地进行反应。
在一个优选的实施方式中，前述羟基的保护基为选自由醚系保护基、甲硅烷基醚系保护基、缩醛系保护基和酰基系保护基组成的组的保护基。即使使用任意的保护基2’位也选择性地进行反应。
在进一步优选的实施方式中，前述醚系保护基为：
[化学式32]
(式(R2a)中，R4a1、R4a2、R4a3、R4a4、R4a5、R4b1、R4b2、R4b3、R4b4、R4b5、R4c1、R4c2、R4c3、R4c4和R4c5分别独立地为选自由氢原子、取代或未取代的直链或支链烷氧基和取代或未取代的直链或支链烷基组成的组的基团。)。尽管不期望受到理论的约束。但通过改变苯基上的取代基而能够调节脱离能力。
在进一步优选的实施方式中，前述取代或未取代的直链或支链烷氧基为直链或支链全氟烷氧基，另外，前述取代或未取代的直链或支链烷基为直链或支链全氟烷基。尽管不期望受到理论的约束，但原因在于，通过使用含有氟的溶剂能够进行简便的分离/纯化脱保护后的保护基和目标产物。
在进一步优选的实施方式中，前述甲硅烷基醚系保护基为：
[化学式33]
(式(R2b)中，R4d、R4e和R4f分别独立地为选自由取代或未取代的直链或支链烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的烯基组成的组的基团。)。在进一步优选的实施方式中，前述取代或未取代的烯基为烯丙基。尽管不期望受到理论的约束，但通过改变硅原子上的取代基而能够调节脱离能力。
在进一步优选的实施方式中，前述甲硅烷基醚系保护基为：
[化学式34]
(式(R2c)中，R4g、R4h和R4i分别独立地为选自由取代或未取代的烃基、取代或未取代的甲硅烷基和取代或未取代的甲硅烷基氧基烷基组成的组的基团。)，在进一步优选的实施方式中，前述甲硅烷基被1～3个烷基取代。不期望受到理论的约束，但通过改变取代基而能够调节脱离能力。
在进一步优选的实施方式中，前述取代或未取代的烃基为选自由取代或未取代的直链或支链烷基、取代或未取代的直链或支链烯基、取代或未取代的直链或支链炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的直链或支链芳基烷基组成的组的基团。
在进一步优选的实施方式中，前述取代或未取代的直链或支链烷基为直链或支链卤代烷基，在进一步优选的实施方式中，前述直链或支链卤代烷基为直链或支链全氟烷基。尽管不期望受到理论的约束，但原因在于通过使用含有氟的溶剂能够简便地分离/纯化脱保护后的保护基和目标产物。
在一个方式中，本发明提供用于制造以下通式所示的化合物的试剂盒，其中，所述通式为：
[化学式37]
(式(37)中，各记号与前述含义相同)
所述试剂盒包含：
[化学式35]
[化学式36]
和
P(OR3)(OR3’)OH，
(式(35)中，R2表示氢原子或羟基的保护基，B表示任选具有保护基的核酸碱基)，
(式(36)中，R1表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，X为卤素原子)，
(式P(OR3)(OR3’)OH中，R3和R3’分别独立地表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团)，
尽管不期望受到理论的约束，原因在于在使用上述试剂盒来合成2’位保护核糖核苷单体的情况，由于能在纯化时容易地去除磷试剂的残渣，而能够容易地得到纯度高的2’位保护核糖核苷单体。
在一个方式中，本发明提供用于选择性地制造以下通式所示的化合物或其盐或其溶剂化物的磷试剂，其中，所述通式为：
[化学式38]
(式(38)中，R1表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，R2表示氢原子或羟基的保护基，B表示任选具有保护基的核酸碱基)，
所述磷试剂包含P(OR3)(OR3’)OH，
(式P(OR3)(OR3’)OH中，R3和R3’分别独立地表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团)。
尽管不期望受到理论的约束，但上述“选择性地制造”是指：在预计得到X个产物的情况下，反应产物整体中的目标产物的比例为1/X以上或大于1/X。例如预计得到2个产物的情况，是指：反应产物整体中的目标产物的比例为50％(＝1/2)以上或大于50％，优选为55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％以上或更大。
核糖核酸H-磷酸酯单体的一般合成方法
[化学式39]
(上述流程图中，PG1和PG2表示任意的羟基的保护基，R3和R3’表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，B表示任选具有保护基的核酸碱基)
(1)5’位保护核苷的合成
在非活性气体(例如氮气)气氛下，在适合的反应容器(例如三口烧瓶(500mL))中加入核苷(例如腺苷5.34g(20mmol))和适合的反应溶剂(例如吡啶400mL)，在适合的反应温度(例如0℃)下进行搅拌。添加适合的保护试剂(例如叔丁基氯二甲基硅烷3.07g(20.4mmol)的二氯甲烷溶液40mL)(例如通过缓慢滴加)，在非活性气体(例如氮气)气氛下、在适合的温度下搅拌适合的时间(例如在室温下12小时)。蒸馏去除反应溶剂，在得到的残渣中加入水(例如100mL)和有机溶剂(例如氯仿100mL/甲醇40mL)并进行萃取。减压蒸馏去除(例如进一步用氯仿100mL再一次萃取水层后，)有机层。对得到的混合物进行(例如利用硅胶柱进行)纯化，对目标馏分进行减压浓缩，由此得到目标产物(例如白色固体)。
(2)核糖核酸H-磷酸酯单体的合成
在非活性气体(例如氮气)气氛下，在适合的反应容器(例如三口烧瓶(300mL)中加入5’位保护核苷(例如叔丁基二甲基甲硅烷基保护腺苷3.82g(10mmol))和适合的溶剂(例如吡啶100mL)，在适合的反应温度(例如-40℃)下进行搅拌。添加适合的保护试剂(例如苯甲酰氯2.11g(15mmol)的二氯甲烷溶液10mL)(例如通过用30分钟缓慢滴加)，在适合的温度下搅拌适合的时间(例如在-40℃下3小时)。在反应液中加入适合的试剂(例如二甲胺盐酸盐489mg(6mmol))，提高(例如拆卸冷却槽并从-40℃至室温)温度，添加试剂后搅拌适合的时间(例如2小时)。在适合的温度(例如室温)下添加适合的磷试剂(例如二苯基亚磷酸酯7.03g(30mmol)的吡啶溶液20mL)(例如通过缓慢滴加)，在适合的温度下搅拌适合的时间(例如在室温下3小时)。加入适合的碱(例如三乙胺10mL和水10mL)后，进而在适合的温度下搅拌适合的时间(例如在室温下1小时)。减压蒸馏去除反应溶剂(例如吡啶、二氯甲烷)，在得到的残渣中加入水(例如100mL)，用有机溶剂(例如氯仿100mL)进行(例如两次)萃取。进行得到的有机层的清洗(例如加入三乙胺4mL和水100mL)，然后减压蒸馏去除有机溶剂(例如氯仿)。进行(例如在粗产物中加入0.5mL的三乙胺，利用硅胶柱进行)纯化，对目标馏分进行减压浓缩，由此得到目标产物(例如白色固体)。
(3)寡核苷酸的合成
对于寡核苷酸的合成，在适合的反应溶剂(例如吡啶：MeCN＝1：1(0.05M))中、在适合的反应温度(例如25℃)下使用起始碱基(5’-OH-dT-3’-O-suc-O-PEG)、单体(例如TBDMS-rU-H-磷酸酯(1.3当量))、缩合剂(例如特戊酰氯(6.5当量))、氧化剂(例如0.1M I2(1.5当量))、脱硅烷基化剂(四正丁基氟化铵(TBAF)(15当量))来进行(例如通过液相合成)延伸反应，在各延伸时(例如通过醚沉淀)进行纯化。延伸至期望的聚合度(例如聚合度20)后通过适合的试剂(例如乙二胺)进行2’位羟基的保护基和3’位羟基的聚合物的脱保护，然后得到(例如通过进行进一步HPLC纯化)期望的寡核苷酸。进而，通过适合的试剂(例如TBAF)进行5’位羟基的保护基(例如TBDMS基)的脱保护，然后得到(例如通过进一步进行HPLC纯化)期望的寡核苷酸。
对于本说明书中引用的科学文献、专利、专利申请等的参考文献，其全部内容与各自具体记载的内容相同程度地作为参考引用至本说明书中。
以上为了容易理解本发明而示出并说明了优选的实施方式。以下基于实施例对本发明进行说明，但上述的说明和以下的实施例仅用于示例而提供，不是用于限定本发明而提供的。因此，本发明的范围既不限定于本说明书中具体记载的实施方式也不限定于实施例，仅通过权利要求书而限定。
实施例
依据以下的实施例·比较例对本发明进行更具体地说明，但本发明并不限定性解释于这些例子，适宜组合各实施例中公开的技术手段而得到的实施例也包含在本发明的范围内。需要说明的是，以下的实施例和比较例中所示的化合物名未必一定依据IUPAC命名法。
另外，本说明书中使用的缩写表示以下的意思。
Bu：丁基
Et：乙基
d：脱氧(DNA)
HPLC：高效液相色谱法
Me：甲基
NMR：核磁共振
PEG：聚乙二醇
Ph：苯基
r：核糖(RNA)
suc：琥珀酸
TBAF：四正丁基氟化铵
TBDMS：叔丁基二甲基甲硅烷基
t-Bu：叔丁基
THF：四氢呋喃
X：卤素基团
利用Bruker公司制AVANCE III 400测定了NMR光谱。
(参考例1)使用了腺苷的2’位选择的酯化反应的条件研究
[化学式40]
对叔丁基二甲基甲硅烷基保护腺苷缩醛锡(adenosine tin acetal)的苯甲酰化进行了条件研究。2’-酯与3’-酯的分离可以通过硅胶柱进行，进行纯化并利用分离收率求出了生成比。
[表1]
表1
作为试剂使用苯甲酸酐时，优先选择3’位被保护的酯体。使用了苯甲酰氯的情况，优先选择目标2’位被保护的酯体。若进行进一步选择性地反应，将缩醛锡、硼酸酯作为促进剂的反应的情况，观察到选择性的降低。
可知：在室温以上下将反应液减压浓缩时以摩尔比计发生了异构化，成为50/50。
根据上述结果，通过进行基于一锅法的磷酸酯体的合成，从而能够解决异构化的问题，能够以良好的收率得到作为目标化合物的腺苷单体。
(实施例1)核糖核酸H-磷酸酯单体的合成
(1)腺苷单体的合成方法
[化学式42]
(1-1)5’-叔丁基二甲基甲硅烷基腺苷的合成
在氮气气氛下、在三口烧瓶(500mL)中加入腺苷5.34g(20mmol)和吡啶400mL，在0℃下进行搅拌。缓慢滴加叔丁基氯二甲基硅烷3.07g(20.4mmol)的二氯甲烷溶液40mL，在氮气气氛下以室温搅拌12小时。蒸馏去除吡啶和二氯甲烷，在得到的残渣中加入水100mL和氯仿100mL/甲醇40mL并进行了萃取。进一步用氯仿100mL再一次萃取水层后，减压蒸馏去除有机层。利用硅胶柱对得到的混合物进行纯化，对目标馏分进行减压浓缩，由此得到4.80g(收率63％)白色固体。
(1-2)5’-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-苯甲酰基腺苷-3’-H-磷酸酯的合成
在氮气气氛下、在三口烧瓶(300mL)中加入叔丁基二甲基甲硅烷基保护腺苷3.82g(10mmol)和吡啶100mL，在-40℃下进行搅拌。用30分缓慢滴加苯甲酰氯2.11g(15mmol)的二氯甲烷溶液10mL，在氮气气氛下在-40℃下搅拌3小时。在反应液中加入二甲胺盐酸盐489mg(6mmol)，拆卸冷却槽并将温度由-40℃升高至室温，添加二甲胺盐酸盐后搅拌2小时。在20℃下缓慢滴加二苯基亚磷酸酯7.03g(30mmol)的吡啶溶液20mL，在氮气气氛下以室温搅拌3小时。加入三乙胺10mL和水10mL后，进而在室温下搅拌1小时。减压蒸馏去除吡啶、二氯甲烷，在得到的残渣中加入水100mL，用氯仿100mL萃取两次。在得到的有机层中加入三乙胺4mL和水100mL并进行清洗后，减压蒸馏去除了氯仿。在粗产物中加入0.5mL的三乙胺，利用硅胶柱进行目标产物的纯化，对目标馏分进行减压浓缩，由此得到4.23g(收率65％)白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3),σ0.098(6H,d),σ0.907(9H,s),σ1.363(9H,t,J＝7.6Hz),σ2.628-2.754(2H,m),σ3.095(6H,q,J＝7.6Hz),σ3.915(2H,ddd),σ4.341(1H,q),σ4.964-5.007(1H,m),σ5.798(2H,br),σ6.546(1H,dd),σ6.975(1H,d,JPH＝617Hz),σ8.224(1H,s),σ8.324(1H,s).
31P NMR(162MHz,CDCl3),σ3.57
(2)尿苷单体的合成方法
[化学式43]
(2-1)5’-叔丁基二甲基甲硅烷基尿苷的合成
在氮气气氛下、在三口烧瓶(100mL)中加入尿苷4.88g(20mmol)和吡啶40mL，在0℃下进行搅拌。缓慢滴加叔丁基氯二甲基硅烷3.07g(20.4mmol)的二氯甲烷溶液40mL，在氮气气氛下以室温搅拌12小时。减压蒸馏去除吡啶和二氯甲烷，在得到的残渣中加入水100mL，用氯仿100mL萃取两次。减压蒸馏去除氯仿，利用硅胶柱进行纯化，对目标馏分进行减压浓缩，由此得到5.59g(收率78％)白色固体。
(2-2)5’-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-苯甲酰基尿苷-3’-H-磷酸酯的合成
在氮气气氛下、在三口烧瓶(300mL)中加入叔丁基二甲基甲硅烷基保护尿苷3.58g(10mmol)和吡啶100mL，在-40℃下进行搅拌。用30分钟缓慢滴加苯甲酰氯2.11g(15mmol)的二氯甲烷溶液10mL，在氮气气氛下以-40℃搅拌3小时。在反应液中加入二甲胺盐酸盐489mg(6mmol)，拆卸冷却槽并将温度由-40℃升高至室温，添加二甲胺盐酸盐后搅拌2小时。在20℃下缓慢滴加二苯基亚磷酸酯7.03g(30mmol)的吡啶溶液20mL，在氮气气氛下以室温搅拌3小时。加入三乙胺10mL和水10mL，在室温下搅拌1小时。减压蒸馏去除吡啶、二氯甲烷，在得到的残渣中加入水100mL，用氯仿100mL萃取两次。在氯仿层中加入三乙胺4mL和水100mL并进行清洗后，减压蒸馏去除了氯仿。在粗产物中加入0.5mL的三乙胺，利用硅胶柱进行纯化，由此得到6.27g(收率74％)白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3),σ0.101(6H,d,J＝3.2Hz),σ0.902(9H,s),σ1.368(9H,t,J＝7.6Hz),σ2.055(1H,q),σ2.52-2.58(1H,dd),σ3.092(6H,q,J＝7.2Hz),σ3.874(2H,t,J＝12.8Hz),σ4.265(1H,s),σ4.864(1H,t,J＝6.8Hz),σ6.324(1H,t,J＝6.4Hz),σ7.018(1H,d,JPH＝627Hz),σ7.424(1H,br),σ7.158(1H,s),σ8.377(1H,br).
31P NMR(162MHz,CDCl3),σ2.99
(3)胞苷单体的合成方法
[化学式44]
(3-1)5’-叔丁基二甲基甲硅烷基胞苷的合成
在氮气气氛下、在三口烧瓶(500mL)中加入胞苷4.86g(20mmol)和吡啶400mL，在0℃下进行搅拌。缓慢滴加叔丁基氯二甲基硅烷3.07g(20.4mmol)的二氯甲烷溶液40mL，在氮气气氛下以室温搅拌12小时。减压蒸馏去除吡啶和二氯甲烷，在得到的残渣中加入水100mL，用氯仿100mL萃取两次。减压蒸馏去除有机层，利用硅胶柱进行纯化，由此得到4.93g(收率69％)白色固体。
(3-2)5’-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-苯甲酰基胞苷-3’-H-磷酸酯的合成
在氮气气氛下、在三口烧瓶(300mL)中加入叔丁基二甲基甲硅烷基保护胞苷3.57g(10mmol)和吡啶100mL，在-40℃下进行搅拌。用30分钟缓慢滴加苯甲酰氯2.11g(15mmol)的二氯甲烷溶液10mL，在氮气气氛下以-40℃搅拌3小时。在反应液中加入二甲胺盐酸盐489mg(6mmol)，拆卸冷却槽并将温度由-40℃升高至室温，添加二甲胺盐酸盐后搅拌2小时。在20℃下缓慢滴加二苯基亚磷酸酯7.03g(30mmol)的吡啶溶液20mL，在氮气气氛下以室温搅拌3小时。加入三乙胺10mL和水10mL，在室温下搅拌1小时。减压蒸馏去除吡啶、二氯甲烷，在得到的残渣中加入水100mL，用氯仿100mL萃取两次。在有机层中加入三乙胺4mL和水100mL并进行清洗。减压蒸馏去除氯仿，在粗产物中加入0.5mL的三乙胺，利用硅胶柱进行纯化，由此得到4.32g(收率69％)白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3),σ0.167(6H,d,J＝9.2Hz),σ0.958(9H,s),σ1.241(9H,t,J＝7.2Hz),σ2.955(6H,q,J＝7.2Hz),σ3.963(2H,s),σ4.544(1H,s),σ4.97-5.02(1H,m),σ5.411(1H,t,J＝5.6Hz),σ5.713(1H,d,J＝8.0Hz),σ6.480(1H,d,J＝6.8Hz),σ6.897(1H,d,JPH＝628Hz),σ7.416(2H,t,J＝7.2Hz),σ7.551(1H,t,J＝7.2Hz),σ8.005(1H,d,J＝8.0Hz),σ8.058(2H,d,J＝8.0Hz).
31P NMR(162MHz,CDCl3),σ4.05
(4)鸟苷单体的合成
(4-1)N,N-二甲基甲脒保护鸟苷的合成
[化学式45]
在氮气气氛下、在三口烧瓶(300mL)中加入鸟苷5.66g(20mmol)和甲醇200mL，在室温下进行搅拌。加入二甲基甲酰胺二甲基缩醛20mL和甲醇20mL的混合溶液，在氮气气氛下以室温搅拌16小时。过滤生成的固体并用甲醇清洗，进行减压干燥，由此得到6.36g(收率94％)白色固体。
(4-2)5’-叔丁基二甲基甲硅烷基·N,N-二甲基甲脒保护鸟苷的合成
[化学式46]
在氮气气氛下、在三口烧瓶(100mL)中加入N,N-二甲基甲脒保护鸟苷3.38g(10mmol)、脱水吡啶40mL，在0℃下进行搅拌。缓慢滴加叔丁基氯二甲基硅烷2.26g(15mmol)的脱水吡啶溶液20mL，在氮气气氛下以室温搅拌24小时。减压蒸馏去除吡啶，在得到的残渣中加入氯仿100mL、甲醇50mL、水100mL并进行萃取。减压蒸馏去除氯仿、甲醇后，利用硅胶柱进行纯化，由此得到4.11g(收率91％)白色固体。
(4-3)5’-叔丁基二甲基甲硅烷基·N,N-二甲基甲脒保护-2-苯甲酰基鸟苷-3’-H-磷酸酯的合成
[化学式47]
在安装有氯化钙管的三口烧瓶中加入经保护的鸟苷4.53g(10mmol)和脱水吡啶60mL，在-40℃下进行搅拌。用30分钟滴加苯甲酰氯2.11g(15mmol)的脱水二氯甲烷溶液20mL，在-40℃下搅拌30分钟。用15分钟滴加二苯基亚磷酸酯7.03g(30mmol)的脱水吡啶溶液20mL，滴加结束后拆卸冷却槽并浸渍于冰水中，在0℃下搅拌1小时。加入三乙胺10mL和水10mL，在0℃下进行搅拌而使反应停止。减压蒸馏去除吡啶、二氯甲烷，在得到的残渣中加入水，用氯仿萃取两次。在氯仿层中加入三乙胺和水并进行清洗而去除了亚磷酸和酚类。蒸馏去除氯仿，进行减压干燥并尽量去除三乙胺后利用硅胶柱对目标产物进行粗纯化。进而，将得到的粗产物5g溶解于甲醇/氯仿的混合溶剂，用5wt％柠檬酸水溶液清洗有机层，去除了氯仿层的副产物。再次用氯仿清洗水层并去除副产物，然后在水层中加入三乙胺而制成碱性，用氯仿萃取目标产物。蒸馏去除氯仿，进行减压干燥并尽量去除三乙胺后利用硅胶柱进行纯化，得到5.70g(收率79％)白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3),σ0.121(6H,d,J＝4.8Hz),σ0.938(9H,s),σ1.234(9H,t,J＝7.2Hz),σ2.964(6H,q,J＝7.2Hz),σ3.077(3H,s),σ3.233(3H,s),σ3.482(3H,s),σ3.952(2H,q,J＝10.0Hz),σ4.478(1H,s),σ5.166(1H,q,J＝4.8Hz),σ5.932(1H,t,J＝5.2Hz),σ6.330(1H,d,J＝5.6Hz),σ6.904(1H,d,JPH＝624Hz),σ7.392(2H,t,J＝7.6Hz),σ7.539(1H,t,J＝7.6Hz),σ7.959(1H,s),σ8.040(2H,d,J＝7.2Hz),σ8.725(1H,br),σ8.763(1H,s).
31P NMR(162MHz,CDCl3),σ3.51
(实施例2)RNA低聚物的合成
使用上述合成的单体，通过液相合成合成了RNA低聚物。
[表2]
表2
在上述的反应条件下进行延伸反应，在各延伸时进行醚沉淀，由此进行了纯化。
[表3]
表3.20碱基延伸时的合成结果
表征
得到延伸至第20碱基的5’-TBDMS-rU19dT-3’-O-suc-O-PEG后，用乙二胺进行2’位的苯甲酰基保护和3’-suc-O-PEG的脱保护，然后进行HPLC纯化，由此得到5’-TBDMS-rU19dT-3’-OH。进而，通过TBAF进行5’位TBDMS基的脱保护，再次对进行了HPLC纯化的样品进行LC-MS分析，由此确认了与5’-HO-rU19dT-3’-OH的分子量一致的m/z＝6058.90(理论值：6059.38)(参照图1)。
导入了各种碱基的延伸反应
[表4]
表4.10碱基延伸时的反应条件
将边导入各碱基种边延伸至10碱基的结果示于下述表5。
[表5]
表5.10碱基延伸时的合成结果
与延伸至20碱基的情况同样地、得到5’-TBDMS-rU3rCrGrArU3dT-3’-O-suc-O-PEG后，用乙二胺进行2’位的苯甲酰基保护和3’-suc-O-PEG的脱保护。进行HPLC纯化，得到5’-TBDMS-rU3rCrGrArU3dT-3’-OH。进而，通过TBAF进行5’位TBDMS基的脱保护，再次对进行了HPLC纯化的样品进行LC-MS分析，由此确认了与5’-HO-rU3rCrGrArU3dT-3’-OH的分子量一致的m/z＝3058.60(理论值：3058.82)(参照图2)。
如上所述，使用本发明的优选的实施方式而示例了本发明，但应理解为本发明仅基于权利要求书来解释其范围。还应理解为本说明书中引用的专利、专利申请和其它文献其内容本身以与具体记载于本说明书中内容同样地方式作为针对本说明书的参考引用至本发明中。
产业上的可利用性
本发明在使用核酸药物等的制药产业和试剂产业中是有用的。
序列号1：表3中的碱基数10的序列
序列号2：表3中的碱基数15的序列
序列号3：表3中的碱基数19的序列
序列号4：表3中的碱基数20的序列
序列号5：表5中的碱基数10的序列
序列表
<110> 基因设计有限公司(GeneDesign, Inc.）
国立研究开发法人产业技术综合研究所(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)
<120> 核糖核酸H-磷酸酯单体的合成方法和使用了该单体的寡核苷酸合成
<130> JD003PCT
<150> JP 2016-122554
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<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列( artificial sequence)
<220>
<223> 组合DNA / RNA分子
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<220>
<221> DNA
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<400> 5
uuucgauuut 10
Claims (19)
1.一种制造以下的通式所示的化合物或其盐或其溶剂化物的方法，
[化学式1]
式(1)中，R1表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，R2表示氢原子或羟基的保护基，B表示任选具有保护基的核酸碱基，
该方法包括工序1和工序2，
工序1是使[化学式2]与[化学式3]反应而得到[化学式4]的工序，
[化学式2]
[化学式3]
式(3)中，X为卤素原子，
[化学式4]
工序2是使[化学式5]与P(OR3)(OR3’)OH反应而得到[化学式6]的工序，
[化学式5]
[化学式6]
式P(OR3)(OR3’)OH中，R3和R3’分别独立地表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，
该工序1和该工序2在1个反应容器内进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述任选具有保护基的核酸碱基选自由如下组成的组，
[化学式7]
式(7)中，R3a、R3b和R3c分别独立地表示选自由氢原子、取代或未取代的直链或支链烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，或者R3a与R3b一起形成脒型保护基的基团。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述脒型保护基为N,N-二甲基甲脒基或N,N-二甲基乙脒基。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，R1为取代或未取代的芳基。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述取代或未取代的芳基为苯基。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述羟基的保护基为选自由醚系保护基、甲硅烷基醚系保护基、缩醛系保护基和酰基系保护基组成的组的保护基。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述醚系保护基为：
[化学式8]
式(R2a)中，R4a1、R4a2、R4a3、R4a4、R4a5、R4b1、R4b2、R4b3、R4b4、R4b5、R4c1、R4c2、R4c3、R4c4和R4c5分别独立地为选自由氢原子、取代或未取代的直链或支链烷氧基和取代或未取代的直链或支链烷基组成的组的基团。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述取代或未取代的直链或支链烷氧基为直链或支链全氟烷氧基。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述取代或未取代的直链或支链烷基为直链或支链全氟烷基。
10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述甲硅烷基醚系保护基为：
[化学式9]
式(R2b)中，R4d、R4e和R4f分别独立地为选自由取代或未取代的直链或支链烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的烯基组成的组的基团。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述取代或未取代的烯基为烯丙基。
12.根据权利要求6所述的方法，其中，所述甲硅烷基醚系保护基为：
[化学式10]
式(R2c)中，R4g、R4h和R4i分别独立地为选自由取代或未取代的烃基、取代或未取代的甲硅烷基和取代或未取代的甲硅烷基氧基烷基组成的组的基团。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述甲硅烷基被1～3个烷基取代。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述取代或未取代的烃基为选自由取代或未取代的直链或支链烷基、取代或未取代的直链或支链烯基、取代或未取代的直链或支链炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的直链或支链芳基烷基组成的组的基团。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述取代或未取代的直链或支链烷基为直链或支链卤代烷基。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述直链或支链卤代烷基为直链或支链全氟烷基。
17.一种用于制造以下通式所示的化合物的试剂盒，其中，所述通式为：
[化学式13]
其中，式(13)中，各记号与前述含义相同，
所述试剂盒包含：
[化学式11]
[化学式12]
和
P(OR3)(OR3’)OH，
式(11)中，R2表示氢原子或羟基的保护基，B表示任选具有保护基的核酸碱基，
式(12)中，R1表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，X为卤素原子，
式P(OR3)(OR3’)OH中，R3和R3’分别独立地表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团。
18.一种用于选择性地制造以下通式所示的化合物或其盐或其溶剂化物的磷试剂，其中，所述通式为：
[化学式14]
式(14)中，R1表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，R2表示氢原子或羟基的保护基，B表示任选具有保护基的核酸碱基，
所述磷试剂包含P(OR3)(OR3’)OH，
上式中，R3和R3’分别独立地表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团。
19.一种P(OR3)(OR3’)OH在用于选择性地制造如下通式所示的化合物或其盐或其溶剂化物中的应用，其中，所述通式为：
[化学式15]
式(15)中，R1表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团，R2表示氢原子或羟基的保护基，B表示任选具有保护基的核酸碱基，
式P(OR3)(OR3’)OH中，R3和R3’分别独立地表示选自由取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基组成的组的基团。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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