CN109641881A - 用于治疗癌症的1-四氢吡喃基羰基-2,3-二氢-1h-吲哚化合物 - Google Patents

用于治疗癌症的1-四氢吡喃基羰基-2,3-二氢-1h-吲哚化合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及某些新型2,3‑二氢‑1H‑吲哚化合物、包含该化合物的药物组合物、和使用该化合物治疗癌症、更具体地用于治疗选自下述的癌症的方法：黑素瘤、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、胶质瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。

Description

用于治疗癌症的1-四氢吡喃基羰基-2,3-二氢-1H-吲哚化 合物
本发明涉及抑制色氨酸向犬尿氨酸的转化的新型2,3-二氢-1H-吲哚化合物，其中某些化合物已被确认与吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)结合。本发明还涉及包含这些化合物的药物组合物和使用这些化合物来治疗生理病症、更具体地用于治疗癌症的方法，所述癌症诸如黑素瘤、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、胶质瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
色氨酸是蛋白质生物合成、细胞生长、神经活性代谢物诸如血清素(5-羟色胺)、褪黑素和辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)所需的必需氨基酸。色氨酸被吲哚胺2,3-双加氧酶 (IDO1)分解代谢，该吲哚胺2,3-双加氧酶是血红素依赖性酶，其催化色氨酸分解代谢为N-甲酰基-犬尿氨酸(然后将其去甲酰化而产生犬尿氨酸)中的第一和限速步骤。在感染期间，IDO1的表达由干扰素γ诱导而局部地消耗色氨酸，其抑制色氨酸依赖性细胞内病原体诸如沙眼衣原体、刚地弓形虫和病毒的生长。此外，IDO1在预防细胞中的氧化损伤、几种神经病理学、免疫系统调节和癌症方面发挥着重要作用。尽管IDO1活性是对病原体的免疫应答的关键组分，但是延长的活性导致细胞外色氨酸的消耗，同时伴随犬尿氨酸的生成，它们两者都是免疫抑制的。癌症中的IDO1表达已被充分记载，并且是通过IDO1基因表达的内在活化和/或通过IFN-γ-至-IDO1轴的活化(免疫细胞活化的结果)而发生。此外，募集到炎症部位和肿瘤微环境的先天免疫细胞诸如树突细胞、单核细胞和巨噬细胞，当它们表达IDO1时，是免疫抑制的。IDO1依赖性的色氨酸的消耗和犬尿氨酸的生成一起与抑制T细胞活化和增殖以及NK细胞功能有关。另外，色氨酸的消耗和犬尿氨酸的生成对于发挥功能以抑制免疫细胞活化的调节性T细胞(Treg)和髓源性抑制细胞(MDSCs)的形成是关键的。这些IDO1依赖性免疫抑制机制是允许肿瘤绕过免疫系统的组分。
经由IDO1抑制的犬尿氨酸生成的潜在抑制剂在文献中是已知的。参见例如，WO2010005958、WO2012142237和WO2014150646以及Journal of Medicinal Chemistry(2016), 59(1), 419-430。某些2,3-二氢-1H-吲哚化合物在本领域是已知的。参见例如，CAS登记号1359420-19-1、1358912-57-8、1358648-68-6、1357815-05-4、1359035-89-4、和1359002-77-9。
需要新的癌症治疗。特别是需要用于黑素瘤、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、胶质瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的新的癌症治疗。仍需提供可用于治疗癌症的另外的犬尿氨酸生成抑制剂。优选地，此类化合物具有下述性质，其实现肿瘤细胞生长的最大抑制所需的最佳给药，同时具有患者可接受的耐受性。优选地，此类化合物也是口服可生物利用的。优选地，此类化合物还具有穿过血脑屏障的能力，并因此具有脑暴露。优选地，此类化合物还具有通过具有另外的作用机制而潜在克服对现有犬尿氨酸抑制剂的抗性的能力。
本发明提供某些新型2,3-二氢-1H-吲哚化合物，其是犬尿氨酸生成抑制剂。技术人员将理解：犬尿氨酸生成抑制剂可具有下述临床用途，即，作为单一药剂或与其它抗癌剂组合用于治疗不同类型的癌症，特别是黑素瘤、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、胶质瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
本发明还提供下式的化合物：
其中：
R1a是氢、甲基、乙烯基、氰基、氟、氯、氟甲基或二氟甲基；
R1b是氢、氟或氯；
R1c是氢、羟基、氟、苄基氧基或羟乙基氨基；
R2是氢或甲基；
R2a是氢或甲基；且
R3a是四氢吡喃基。
本发明提供下式的化合物：
。
本发明还提供下式的化合物：
。
本发明还提供下式的化合物：
。
本发明还提供化合物，其是4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺。优选地，所述化合物是结晶形式的4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺。优选地，所述化合物是结晶4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺，其特征在于，X射线粉末衍射图 (Cu 辐射, λ-1.54060 Ǻ)包含至少一个在17.38°的峰与一个或多个选自下述的峰的组合：12.51°、15.65°、16.37°、17.56°、21.48°和25.23° (2θ± 0.2º)。
本发明还提供下式的中间体或其盐：
其在制备本发明的某些化合物的方法中有用。
本发明还提供下式的中间体或其盐：
其在制备本发明的某些化合物的方法中有用。
本发明还提供下式的中间体或其盐：
其在制备本发明的某些化合物的方法中有用。
本发明还提供下式的中间体：
其在制备本发明的某些化合物的方法中有用。
本发明还提供下式的中间体：
其在制备本发明的某些化合物的方法中有用。
本发明还提供下式的中间体：
其在制备本发明的某些化合物的方法中有用。
本发明还提供药物组合物，其包含本发明的化合物和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。优选地，所述化合物是4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺。
本发明提供治疗患有癌症的患者的方法，所述癌症选自黑素瘤、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、胶质瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤，所述方法包括对所述患者给予有效量的本发明的化合物。优选地，所述癌症是黑素瘤。优选地，所述癌症是结肠直肠癌。优选地，所述癌症是肾细胞癌。优选地，所述癌症是乳腺癌。优选地，所述癌症是肺癌，特别是非小细胞肺癌。优选地，所述癌症是卵巢癌。优选地，所述癌症是胶质瘤。优选地，所述化合物是4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺。
本发明还提供用于治疗的本发明的化合物。此外，本发明还提供用于治疗癌症的本发明的化合物，所述癌症选自黑素瘤、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、胶质瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。优选地，所述癌症是黑素瘤。优选地，所述癌症是结肠直肠癌。优选地，所述癌症是肾细胞癌，优选地，所述癌症是乳腺癌。优选地，所述癌症是肺癌，特别是非小细胞肺癌。优选地，所述癌症是卵巢癌。优选地，所述癌症是胶质瘤。优选地，所述化合物是4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺。优选地，所述化合物是4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺。
本发明还提供包含本发明的化合物和LY3300054的组合，其用于同时、分别或依次用在癌症的治疗中，所述癌症选自非小细胞肺癌和结肠癌。优选地，所述癌症是非小细胞肺癌。优选地，所述癌症是结肠癌。优选地，所述化合物是4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺。优选地，所述化合物是4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺且所述癌症是非小细胞肺癌。优选地，所述化合物是4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺且所述癌症是结肠癌。
以下段落描述了式I的优选类别：
a)R1a是氢、甲基、氰基、氟或氯；
b)R1b是氢、氟或氯；
c)R1c是氢或羟基；
d)R2是氢或甲基；
e)R2a是氢或甲基；
f)R3a是四氢吡喃基；且
g)R1a是氟，R1b是氢，R1c是氢，R2是氢，R2a是氢，且R3是四氢吡喃基。
某些本发明的化合物是晶体。在结晶学领域中众所周知的是，对于任何给定的晶型，衍射峰的相对强度可能由于诸如晶体形态和习性的因素所致的优选取向而变化。在存在优选取向的影响的情况下，峰值强度改变，但多晶型物的特征峰位置不变。参见例如，美国药典38 - 国家处方集35章 <941> 通过X射线粉末衍射(XRPD)表征结晶和部分结晶固体官方2015年5月1日(The U. S. Pharmacopeia 38 - National Formulary 35 Chapter <941> Characterization of crystalline and partially crystalline solids by X-ray powder diffraction (XRPD)Official May 1, 2015)。另外, 在结晶学领域中还众所周知的是，对于任何给定的晶型，角峰位置可以略微变化。例如，峰位置可能由于分析样品的温度或湿度的变化、样品替换或内标的存在或不存在而移位。在本情况下，以2θ计±0.2的峰位置变化将考虑这些潜在的变化而不妨碍所指示的晶型的明确鉴定。可以基于区别峰(以°2θ的单位)、典型地更突出的峰的任何独特组合来确认晶型。在环境温度和相对湿度下收集的晶型衍射图案基于8.85和26.77°2θ处的NIST 675标准峰来进行调整。
如本文所用，“治疗(treat)”，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指抑制、减缓、停止或逆转现有症状或病症的进展或严重程度。
如本文所用，术语“患者”是指温血动物，诸如哺乳动物、特别是人，其患有特定疾病、病症或病况。
本领域普通技术人员将理解，本发明的化合物和某些中间体可以以互变异构形式存在。当在本申请中提及本发明的化合物的特定互变异构体之一时，应理解为涵盖互变异构形式及其所有混合物。
本文公开的本发明的一些中间体或化合物可具有一个或多个手性或立体中心。考虑了所有这些上述本发明的化合物或中间体的所有单独的立体异构体、对映异构体和非对映异构体、以及对映异构体和非对映异构体的混合物，包括外消旋物。优选的是，本文公开的含有至少一个手性中心的本发明化合物或中间体作为单一对映异构体或非对映异构体存在。单一对映异构体或非对映异构体可以用手性试剂开始制备，或者通过立体选择性或立体特异性合成技术制备(如制备和实施例中所说明)。或者，可以通过标准手性色谱(如制备和实施例中所说明)或结晶技术从混合物中分离单一对映异构体或非对映异构体。技术人员将理解，在一些情况下，由于不同的色谱柱和流动相，对映异构体或非对映异构体的洗脱顺序可以不同。
化合物名称中“异构体1”的命名表示当通过手性色谱分离一对对映异构体的混合物时，本发明的相应中间体或化合物是两种洗脱的对映异构体中的第一种。化合物名称中“异构体2”的命名表示当通过手性色谱分离一对对映异构体的混合物时，本发明的相应中间体或化合物是两种洗脱的对映异构体中的第二种。
化合物名称中“异构体A”的命名表示本发明的相应中间体或化合物是来自未知绝对构型的手性合成的单一异构体。
如本文所用，“LY3300054”是结合人PD-L1(SEQ ID NO: 1)的抗体，其包含轻链(LC)和重链(HC)，其中轻链包含轻链可变区(LCVR)且重链包含重链可变区(HCVR)，并且其中LCVR包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列是SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO:5)，LCDR2的氨基酸序列是YGNSNRPS (SEQ ID NO:6)，且LCDR3的氨基酸序列是QSYDSSLSGSV (SEQ ID NO:7)，并且其中HCVR包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中分别地，HCDR1的氨基酸序列是KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO:2)，HCDR2的氨基酸序列是GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:3)，且HCDR3的氨基酸序列是ARSPDYSPYYYYGMDV (SEQ ID NO:4)。
在LY3300054的一些实施方案中，LY3300054结合人PD-L1，并且包含轻链(LC)和重链(HC)，其中该轻链包含轻链可变区(LCVR)且重链包含重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO: 9，且HCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO: 8。在LY3300054的一些实施方案中，LY3300054结合人PD-L1，包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC的氨基酸序列是SEQ IDNO: 10且HC具有SEQ ID NO: 11中给出的氨基酸序列。在LY3300054的一个实施方案中，LY3300054包含两条轻链和两条重链，其中各轻链具有SEQ ID NO: 11中给出的氨基酸序列，且各重链具有SEQ ID NO: 10中给出的氨基酸序列。
如本文所用，术语“轻链可变区”或“LCVR”意指包括CDR和FR的氨基酸序列的抗体分子的轻链的一部分。
如本文所用，术语“重链可变区”、“HCVR”意指包括CDR和FR的氨基酸序列的抗体分子的重链的一部分。
如本文所用，术语“互补决定区”和“CDR”意指在抗体或其抗原结合片段的LC和HC多肽的可变区内发现的非连续抗原组合位点。这些特定区域已经被其他人所描述，包括Kabat,等人, Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971)；Kabat等人, J. Biol.Chem.252:6609-6616 (1977)；Kabat,等人, Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH出版号91-3242 (1991)；Chothia,等人, J. Mol.Biol. 196:901-917 (1987)；MacCallum,等人, J.Mol. Biol., 262:732-745 (1996)；和North,等人, J. Mol.Biol., 406, 228-256(2011)，其中定义包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或亚类。
CDR散布有更保守的区域，称为框架区(“FR”)。每个LCVR和HCVR由3个CDR和4个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR被称为“LCDR1、LCDR2和LCDR3”，重链的3个CDR被称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。CDR包含与抗原形成特异性相互作用的大多数残基。LCVR和HCVR区域内CDR氨基酸残基的编号和定位符合已知惯例(例如，Kabat (1991)、Chothia (1987)和/或North(2011))。在本发明的不同实施方案中，LY3300054的FR可以与人种系序列相同，或者可以是天然的或人工修饰的。
如本文所用，术语“K D ”意指特定抗体-抗原或抗体片段-抗原相互作用的平衡解离常数。
如本文所用，术语“结合”意指抗体对人PD-L1的亲和力旨在意指，除非另有说明，否则为KD小于约1 x10-6 M、优选小于约1 x 10-9 M，如通过本领域已知的常规方法，包括通过基本上如本文所述在37℃使用表面等离子体共振(SPR)生物传感器所测定。
如本文所用，下述术语具有所示含义：“ACN”是指乙腈；“APCI”是指大气压化学电离；“BTI”是指[双(三氟乙酰氧基)碘]苯；“CDI”是指羰基二咪唑；“DCM”是指二氯甲烷；“DMSO”是指二甲基亚砜；“DMF”是指N,N-二甲基甲酰胺；"DPBS"是指杜氏磷酸盐缓冲盐水；“ES”是指电喷雾电离；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“EtOH”是指乙醇；“FBS”是指胎牛血清；“HPLC”是指高效液相色谱；“iPrOH”是指异丙醇；“LC/MS-MS”是指液相色谱串联质谱；“L-犬尿氨酸-d4”是指(2S)-2-氨基-4-(2-氨基-3,4,5,6-四氘代-苯基)-4-氧代-丁酸；"MES"是指2-(N-吗啉代)乙磺酸；“MS”是指质谱；“MeOH”是指甲醇；"PBS"是指磷酸盐缓冲盐水；“TFA”是指三氟乙酸；“TEA”是指三乙胺；“THF”是指四氢呋喃；“SFC”是指超临界流体色谱；且“UVW”是指紫外线波长。
本发明的化合物可通过本领域熟知和理解的方法，根据下述方案、制备和实施例来制备。用于这些制备和实施例的步骤的合适反应条件是本领域熟知的，溶剂和共试剂(co-reagents)的适当替代在本领域的技术范围内。同样地，本领域技术人员将理解，合成中间体可以根据需要或期望通过各种熟知的技术分离和/或纯化，并且通常可以在随后的合成步骤中直接使用各种中间体，其中很少或不进行纯化。另外, 技术人员将理解，在一些情况下，引入部分的顺序并不重要。如有技术化学家所充分理解，产生本发明的化合物所需的特定步骤顺序取决于所合成的具体化合物、起始化合物和取代部分的相对可靠性。除非另有说明，否则所有取代基如之前所定义，并且所有试剂都是本领域所熟知和理解的。
本发明的化合物可以如下述方案所示来合成，其中R1a、R1b、R1c、R2、R2a和R3a如之前所定义。
方案 1：式I化合物的合成
方案 1说明式I化合物(R2是H)的一般合成。在步骤1中，使2,3-二氢-1H-吲哚(化合物1)与合适的活化羧酸诸如酰氯在适当的碱诸如TEA的存在下，在适当的溶剂诸如DCM或二氯乙烷(DCE)中，在合适的温度诸如0℃至回流下进行反应。技术人员将理解，存在许多活化羧酸和许多原位活化羧酸以完成步骤1的反应的方法。然后将步骤1的所得酮(化合物 2)在极性溶剂诸如EtOH中，在合适的温度诸如室温至回流下，用羟胺处理，以E和Z异构体的混合物的形式得到肟(化合物 3)。步骤3显示肟(化合物 3)到胺(化合物 4)的还原。技术人员将理解，有许多方法可用于实现该转化。例如，将肟(化合物 3)与合适的催化剂诸如RANEY® 镍在合适的溶剂诸如MeOH或EtOH中，在合适的反应器诸如PARR® 振荡器中接触。然后将混合物在合适的温度诸如室温至50℃下经受合适的时间诸如1-24小时的氢压诸如100-500kPa。方案1，步骤4描述了胺(化合物4)与合适的活化羧酸诸如酰氯在适当的碱诸如TEA的存在下、在适当的溶剂诸如DCM或DCE中、在合适的温度诸如0℃至回流下的酰胺偶联，得到式I化合物。技术人员将理解，存在许多活化羧酸和许多原位活化羧酸的方法以完成步骤4的反应。技术人员将进一步理解方案1，步骤3和步骤4产生具有手性中心的产物。本领域普通技术人员可以通过诸如选择性结晶技术或手性色谱法的方法在本发明化合物合成中的任何方便点来分离或拆分单独的对映异构体(参见例如，J. Jacques,等人, "Enantiomers,Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, 以及E.L. Eliel和S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience,1994)。
方案2:式I化合物的合成
方案2说明式I化合物(R2是H)的另外的一般合成。在步骤1中，使酮(化合物2)与合适的手性亚磺酰胺在合适的路易斯酸诸如乙醇钛(IV)的存在下、在合适的溶剂诸如THF中、在合适的温度诸如室温至回流下反应合适的时间诸如1-24小时，得到手性亚乙基亚磺酰胺(化合物5)。技术人员将理解，试剂可用于产生亚磺酰胺的任一对映异构体(化合物5)。步骤2中描述了手性还原以由亚乙基亚磺酰胺(化合物5)产生乙基亚磺酰胺(化合物6)，并且为了清楚起见，使用星号表示手性中心。例如，通过将合适的钌试剂诸如二氯(对甲基异丙基苯)钌(II)二聚体与合适的氨基乙醇诸如2-氨基-2-甲基-1-丙醇，在合适的溶剂诸如iPrOH中、在水清除剂诸如4Å分子筛的存在下、在合适的温度诸如室温至回流下混合合适的时间诸如5分钟至大约1小时，来预形成合适的催化剂。将预形成的催化反应冷却至合适的温度诸如室温至50℃，用亚乙基亚磺酰胺(化合物5)和合适的碱诸如叔丁醇钾处理。将反应在合适的温度诸如室温至50℃保持合适的时间诸如1-24小时。技术人员将理解，存在许多催化和化学计量方法将影响相同的转化，并且这些方法可取决于底物和所用试剂的性质而使非对映异构体富集，直至并包括产生单一非对映异构体。通过用合适的酸诸如盐酸(HCl)，在合适的溶剂诸如二氧杂环己烷、iPrOH、EtOAc或MeOH中、在合适的温度诸如0℃至室温下处理合适的时间诸如1-8小时可以实现乙基亚磺酰胺(化合物6)的酸水解，以得到胺(化合物4)。技术人员将理解，许多分离方法是已知的，并且这些可以分离出胺(化合物4)的盐或游离碱。步骤4描述了类似于上述方案1、步骤4的胺(化合物4)与合适的活化羧酸的酰胺偶联，以得到式I化合物。
方案3:式I化合物的合成
方案3描述了式I化合物(R2是H)的另外的一般合成。步骤1描述了羧酸(化合物7)与N,O-二甲基羟胺盐酸盐的酰胺偶联，以得到Weinreb酰胺(化合物8)。技术人员将理解有许多方法实现该转化。例如, 羧酸(化合物7)可以用合适的偶联剂诸如1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓-3-氧化六氟磷酸盐(HATU)，在合适的碱诸如N,N-二异丙基乙胺的存在下、在合适的溶剂诸如DMF中处理合适的时间诸如5-10分钟。然后将混合物用N,O-二甲基羟胺盐酸盐处理，将混合物在合适的温度诸如室温至100℃搅拌合适的时间诸如3-18小时。然后在步骤2中将所得的Weinreb酰胺(化合物8)用合适的格氏试剂，烷基锂或烷基锌试剂处理，以得到酮(化合物9)。技术人员将理解，有大量方法可用于实现该转化。例如，将Weinreb酰胺(化合物8)在合适的溶剂诸如THF中、在合适的温度诸如0℃至-78℃下用合适的烷基金属试剂诸如乙基溴化镁处理。在添加后继续反应合适的时间诸如1-18小时，以得到酮(化合物9)。为清楚起见，给出了方案3的步骤3、4和5。方法分别类似于方案1，步骤2、3和4中给出的方法。本领域技术人员将理解，化合物11含有手性中心，并且可以对化合物11进行手性纯化，或者可以对外消旋混合物进行，并且可以在任何后续步骤之后进行分离。步骤6描述了氨基甲酸酯(化合物12)的叔丁氧基羰基保护基的脱保护，以得到胺(化合物13)。技术人员将理解，该转化可以在酸、碱或热条件下进行。例如，将氨基甲酸酯(化合物12)与合适的酸诸如HCl，在合适的溶剂诸如二氧杂环己烷或DCM或其混合物中，在合适的温度诸如0℃至回流下，接触合适的时间诸如1-18小时，以得到胺(化合物13)。技术人员将理解，存在将胺分离为盐或游离碱的方法。步骤7描述了胺(化合物13)和活化羧酸的酰胺偶联，以得到式I化合物。条件类似于方案1，步骤1中给出的条件。
方案4:式I化合物的合成
方案4描述了式I化合物的另外的一般合成。步骤1描述了用苄基氨基甲酸酯保护基保护胺(化合物11)，以得到氨基甲酸酯(化合物14)。技术人员将理解，存在许多可用的胺保护基，其将是化合物14上的叔丁氧基羰基的正交保护基。在一个实例程序中，将胺(化合物11)在合适的溶剂诸如DCM中，在适当的碱诸如N,N-二异丙基乙胺的存在下，与苄基氧基氯甲酸酯在合适的温度诸如0℃至室温接触合适的时间诸如1-18小时。使用类似于方案3，步骤6中记载的方法，将化合物14的叔丁氧基羰基保护基选择性地脱保护，以得到胺(化合物15)。然后，通过类似于方案1，步骤1中的方法将所得的胺(化合物15)与活化羧酸进行酰胺偶联反应，以得到酰胺(化合物16)。步骤4描述了化合物16的苄基氧基氨基甲酸酯保护基的脱保护，以得到胺(化合物4)。技术人员将理解，各种方法可用于实现该转化。例如，将化合物16用合适的催化剂诸如氢氧化钯，在合适的溶剂诸如EtOH中，在合适的氢压诸如100-500 kPa下，进行催化氢化合适的时间诸如1-8小时，以得到胺(化合物4)。最后，如方案1，步骤4中所述，将胺(化合物4)转化为式I化合物。
方案5:式I化合物的合成
方案5描述了式I化合物的另外的一般合成。步骤1描述了胺(化合物17)和活化羧酸的酰胺偶联，以得到酰胺(化合物18)。条件类似于方案1，步骤1中给出的条件。步骤2描述了通过溴化物(化合物18)与烯醇酯的催化交叉偶联形成α芳基酯(化合物19)。技术人员将理解可以实现该转化的各种各样条件。例如，将合适的二烷基胺诸如二环己基胺在合适的溶剂诸如甲苯中的溶液，在合适的温度诸如0℃至-78℃下，用合适的锂碱诸如正丁基锂处理合适的时间诸如10分钟至1小时。将该溶液用合适的酯诸如2-甲基丙酸甲酯在合适的溶剂诸如甲苯中的溶液处理，将所得混合物在合适的温度诸如0℃至-40℃下搅拌合适的时间诸如10分钟至1小时。然后将所得混合物用合适的钯催化剂诸如二-μ-溴双(三叔丁基膦)二钯(I)处理，将混合物在合适的温度诸如0℃至室温搅拌合适的时间诸如1-18小时，以得到α芳基酯(化合物19)。可以通过本领域熟知的方法将酯(化合物19)水解为酸(化合物20)。例如，将酯(化合物19)与适当的碱诸如三甲基硅醇钾，在合适的溶剂诸如THF中，在合适的温度诸如室温至回流下，接触合适的时间诸如1-7天。步骤4描述了羧酸(化合物20)与氨的酰胺偶联，以得到羧酰胺(化合物21)。技术人员将理解可用于活化羧酸以及引入氨源的许多方法。例如，将羧酸(化合物20)与1,1’-羰基二咪唑在合适的溶剂诸如DCM或DMF或其混合物中，在合适的温度诸如0℃至回流下，接触合适的时间诸如30分钟至8小时。向混合物中添加氢氧化铵并继续反应另外的时间诸如1-18小时。步骤21描述了羧酰胺(化合物21)到胺(化合物4)的霍夫曼重排。技术人员将理解可以实现该转化的各种各样试剂和条件。例如，将羧酰胺(化合物21)在合适的溶剂诸如ACN和水的混合物中的溶液用[双(三氟乙酰氧基)碘]苯在合适的温度诸如室温至回流下处理合适的时间诸如1-18小时。最后，方案1，步骤4中描述了将胺(化合物4)转化为式I化合物。
制备 1
1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙酮的合成
将 TEA (51.9 mL, 372.2 mmol)和四氢吡喃-4-碳酰氯(22.1 g, 148.9 mmol)添加至1-吲哚啉-5-基乙酮(20.0 g, 124.1 mmol)在DCM (496 mL)中的混合物中。将所得混合物在室温搅拌2小时。用DCM (500 mL)稀释反应混合物并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。分离有机层并用DCM (500 mL)萃取水层2次。用饱和氯化钠水溶液洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩滤液，定量地得到作为浅黄色固体的标题化合物。
另外的分离程序:
用庚烷处理产物并浓缩。第二次重复处理和浓缩。用庚烷处理并冷却至0-5℃。通过过滤收集产物并用庚烷冲洗和干燥，得到标题化合物。
制备 2
[5-(N-羟基亚氨代乙酰基(ethanimidoyl))-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基](四氢-2H-吡 喃-4-基)甲酮的合成
将羟胺(50 质量%在水中，22.8 mL, 372 mmol)添加至1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙酮(制备 1)(33.9 g, 124.0 mmol)在EtOH (1240 mL)中的混合物中。将所得混合物在室温搅拌3天。浓缩反应混合物，定量地得到作为E/Z异构体混合物的标题化合物。
制备 3
外消旋[5-(1-氨基乙基)-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基](四氢-2H-吡喃-4-基)甲酮的合成
将RANEY® 镍(EtOH中的浆料, 60 g)添加至2250 mL PARR® 振荡瓶中，用氮气吹扫。添加2M 氨的MeOH (700 mL)溶液，然后添加[5-(N-羟基亚氨代乙酰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基](四氢-2H-吡喃-4-基)甲酮(制备 2)(35.8 g, 124.0 mmol)在2M 氨/MeOH (700mL)中的溶液。根据需要，将可能放热的混合物冷却至室温，密封，并用氮气吹扫，且然后用氢气吹扫。在氢气(60 psi, 或414 kPa)在室温搅拌4小时。滤去固体并浓缩滤液。采用7-26% (7M 氨的MeOH溶液)的EtOAc溶液通过硅胶柱色谱纯化，得到作为灰白色固体的标题化合物(26.5 g, 78%)。
制备4A和B
[5-(1-氨基乙基)-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基](四氢-2H-吡喃-4-基)甲酮，异构体1和 [5-(1-氨基乙基)-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基](四氢-2H-吡喃-4-基)甲酮，异构体2的分离
通过手性SFC纯化外消旋[5-(1-氨基乙基)-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基](四氢-2H-吡喃-4-基)甲酮(制备3)，得到第一洗脱对映异构体(异构体1)。ES/MS (m/z):275.0 (M+H)。纯化条件:CHIRALPAK® AD-H, 50 x 150 cm 柱; 流动相:在CO2中的40% EtOH (含 0.5% N,N-二甲基乙胺); 柱温:40℃; 流速:300 g/分钟; UVW:260 nm。通过手性分析SFC确认异构体1的对映异构体富集(>99% ee, Rt:1.35 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H, 4.6 x 150 mm;流动相:在CO2中的40% EtOH (含 0.5% N,N-二甲基乙胺); 流速:5 mL/分钟; UVW:260nm)或通过手性分析HPLC确认异构体1的对映异构体富集 (97.4% ee, Rt:6.48 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H, 4.6 mm x 150 mm; 流动相:100% EtOH (含0.2% 异丙胺); 流速:1mL/分钟; UVW:225 nm)。
上述纯化也产生第二洗脱对映异构体(异构体2)。ES/MS (m/z):275.1 (M+H)。通过手性分析SFC确认异构体2的对映异构体富集(97.2% ee, Rt:1.85 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:在CO2中的40% EtOH (含 0.5% N,N-二甲基乙胺); 流速:5 mL/分钟; UVW:260 nm)或通过手性分析HPLC确认异构体2的对映异构体富集 (97.6%ee, Rt:5.31 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H, 4.6 mm x 150 mm; 流动相:100% EtOH (含0.2% 异丙胺); 流速:1 mL/分钟; UVW:225 nm)。
制备 5
(R)-2-甲基-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]亚乙基} 丙烷-2-亚磺酰胺的合成
将乙醇钛(IV)(5.0 g, 21.9 mmol)添加至1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙酮(制备1)(3.0 g, 11.0 mmol)和(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(1.6g, 13.2 mmol)在THF (43.9 mL)中的混合物中。将所得混合物回流24小时。将反应混合物冷却至室温。用EtOAc (100 mL)和饱和氯化钠水溶液(40 mL)稀释混合物并剧烈搅拌15分钟。分离有机层并用EtOAc (100 mL)萃取水层2次。用饱和氯化钠水溶液洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩滤液。采用10-100% ACN的DCM溶液通过硅胶柱色谱纯化，得到作为浅黄色固体的标题化合物(3.7 g, 87%)。
另外的分离程序:
不是将反应冷却至室温，而是将反应混合物冷却至10℃，然后过滤。用甲苯冲洗固体并干燥，得到标题化合物。
制备 6
(R)-2-甲基-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}丙 烷-2-亚磺酰胺，异构体A的合成
将二氯(对甲基异丙基苯)钌(II)二聚体(0.021 g, 0.033 mmol)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(0.006 g, 0.066 mmol)和分子筛(4Å, 0.5 g)在iPrOH (2 mL)中的混合物加热至回流，然后冷却至50℃。添加(R)-2-甲基-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]亚乙基}丙烷-2-亚磺酰胺(制备5)(0.5 g, 1.33 mmol)在iPrOH (8.8 mL)中的溶液和叔丁醇钾(0.019 g, 0.17 mmol)在iPrOH (1.6 mL)中的溶液。将所得混合物在55℃下加热2小时。然后将另外的二氯(对甲基异丙基苯)钌(II)二聚体(0.021 g, 0.033 mmol)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(0.06 g 0.66 mmol)和分子筛(4Å, 0.5 g)在iPrOH (2 mL)中的混合物加热至回流，冷却至50℃并添加至上述反应混合物中。将叔丁醇钾(0.019 g, 0.17mmol)在iPrOH (1.6 mL)中的溶液添加至上述反应混合物中。将混合物在55℃下加热20分钟。将反应冷却至室温并搅拌过夜。用DCM (20 mL)稀释反应并通过硅藻土垫过滤。将该垫用5% MeOH的DCM溶液洗涤并浓缩滤液，定量地得到标题化合物。
另外的分离程序:
不是将反应冷却至室温，而是将反应混合物冷却至28-32℃，然后通过硅藻土过滤。用二氯甲烷冲洗过滤的固体并浓缩，得到标题化合物。
制备7A和7B
[5-(1-氨基乙基)-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基](四氢-2H-吡喃-4-基)甲酮，异构体1的合 成
将盐酸(4 M 在1,4-二氧杂环己烷中，1.66 mL, 6.64 mmol)添加至(R)-2-甲基-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}丙烷-2-亚磺酰胺，异构体A(制备6)(503 mg, 1.33 mmol)在MeOH (6.6 mL)中的混合物中。将所得混合物在室温搅拌1小时。浓缩并通过反相色谱(Redisep Rf Gold High Performance C18 反相柱, 0-100%ACN的10 mM碳酸氢铵水溶液)纯化残余物。浓缩得到标题化合物(265 mg, 73%)。通过手性分析HPLC确认对映异构体富集 (98.8% ee, Rt:6.40 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H, 4.6mm x 150 mm; 流动相:100% EtOH (含0.2% 异丙胺); 流速:1 mL/分钟; UVW:225 nm)。确认为制备4A，异构体1。
[5-(1-氨基乙基)-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基](四氢-2H-吡喃-4-基)甲酮盐酸盐， 异构体1的合成
在顶部机械搅拌下，将盐酸(5.5 M在iPrOH中, 400 mL, 2.20 mol)滴加至5℃的(R)-2-甲基-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}丙烷-2-亚磺酰胺，异构体A (162.3 g, 364 mmol)在EtOAc (1.2 L)中的浆料中。添加100 mL酸溶液之后移去冷却浴。继续添加并将所得混合物在室温下搅拌3小时。冷却至3℃并过滤。用1-1.5L的EtOAc冲洗滤饼，直到洗涤液澄清。将收集的固体在家用真空烘箱中在60℃下干燥，得到作为灰白色固体的标题化合物(96.4 g, 82.5%)。通过手性分析HPLC确认对映异构体富集(98% ee, Rt:6.45 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H, 4.6 mm x 150 mm; 流动相:100% EtOH(含0.2% 异丙胺); 流速:1 mL/分钟; UVW:225 nm)。确认为制备4A，异构体1。ES/MS (m/z):275.0 (M+H)。确认为制备4A，异构体1。
基本类似于制备1地制备下述化合物。
制备编号 化学名 物理数据
8 [5-溴-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基](四氢-2H-吡喃-4-基)甲酮
9 {1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]丙基}氨基甲酸苄基酯，异构体A
制备 10
5-乙酰基-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯的合成
将100℃的1-吲哚啉-5-基乙酮(1.00 g, 6.02 mmol)在甲苯 (12 mL)中的溶液用二碳酸二叔丁酯 (1.97 g, 9.03 mmol)在甲苯(12 mL)中的溶液滴加处理20分钟。继续加热混合物30分钟。浓缩反应混合物。采用15-35% (1:1 EtOAc:DCM)的己烷溶液通过硅胶柱色谱纯化，得到作为白色固体的标题化合物(1.52 g, 97%)。
制备 11
5-[甲氧基(甲基)氨基甲酰基]-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯的合成
将1-(叔丁氧基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-甲酸(14.0 g, 53.2 mmol)在DMF (200mL)和N,N-二异丙基乙胺(28.0 mL, 161 mmol)中的溶液用1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓-3-氧化六氟磷酸盐(23.3 g, 61.1 mmol)处理。将所得混合物在室温下搅拌5分钟。添加N,O-二甲基羟胺盐酸盐(7.26 g, 74.4 mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。用EtOAc稀释反应混合物并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。分离有机层并用EtOAc萃取水层2次。用水洗涤合并的有机层2次，添加饱和氯化钠水溶液以帮助相分离。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤并浓缩滤液。用10-32%丙酮的己烷溶液通过硅胶柱色谱纯化，以定量收率得到作为透明、无色、浓稠的油的标题化合物。
制备 12
5-丙酰基-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯的合成
将5-[甲氧基(甲基)氨基甲酰基]-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯 (制备11)(14.3g, 46.7 mmol)在THF (311 mL, 无水)中的溶液冷却至0℃。将乙基溴化镁(3M 在二乙醚中, 39.0 mL, 117 mmol)滴加25分钟。在0℃下搅拌1.5小时后，小心地用饱和氯化铵水溶液淬灭反应混合物。用EtOAc萃取3次。用无水硫酸钠干燥合并的有机层，过滤并浓缩滤液。用15-30% (1:1 EtOAc:DCM)的己烷溶液通过硅胶柱色谱纯化，得到作为白色固体的标题化合物(11.7 g, 91%)。
除了制备14中在70℃下加热以增加反应速率, 基本类似于制备2地制备下述化合物。
制备编号 化学名 物理数据
13 5-(N-羟基亚氨代乙酰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯
14 5-(N-羟基亚氨代丙酰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯
基本类似于制备3地制备下述化合物。
制备编号 化学名 物理数据
15 外消旋5-[1-氨基乙基]-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯
16 外消旋5-[1-氨基丙基]-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯
制备17A和B
5-[1-氨基丙基]-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯，异构体1和5-[1-氨基丙基]-2,3- 二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯，异构体2的制备
(用于手性分离)
通过手性色谱纯化外消旋5-[1-氨基丙基]-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯(制备16)，得到第一洗脱对映异构体(异构体1)。MS (m/z):260.0 (M-NH2)+。纯化条件:CHIRALPAK® AD, 8 x 33.5 cm 柱; 流动相:100% MeOH (含 0.2% N,N-二甲基乙胺); 流速:400 mL/分钟; UVW:240 nm。通过手性分析HPLC确认异构体1的对映异构体富集(>99%ee, Rt:9.2 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:100% MeOH (含 0.2%N,N-二甲基乙胺); 流速:0.6 mL/分钟; UVW:280 nm)。
上述纯化也产生第二洗脱对映异构体(异构体2)。ES/MS (m/z):260.0 (M-NH2)+。通过手性分析HPLC确认异构体2的对映异构体富集(99% ee, Rt:14.7 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:100% MeOH (含 0.2% N,N-二甲基乙胺); 流速:0.6 mL/分钟; UVW:280 nm)。
制备 18
外消旋5-{1-[(4-氟苯甲酰基)氨基]乙基}-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯的合成
将外消旋5-[1-氨基乙基]-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯(制备15)(3.00 g, 11.4mmol)在DCM (57 mL)中的溶液用N,N-二异丙基乙胺(4.0 mL, 57.2 mmol)处理。添加4-氟苯甲酰氯(1.52 mL, 12.6 mmol)并搅拌过夜。用水淬灭反应混合物并添加饱和碳酸氢钠水溶液。分层并用DCM萃取2次。用无水硫酸钠干燥合并的有机层，过滤并浓缩滤液。用50-75%(10% 丙酮的DCM溶液)的己烷溶液通过硅胶柱色谱纯化，得到作为淡黄色固体的标题化合物(4.29 g, 98%)。
基本类似于制备18地制备下述化合物。
制备编号 化学名 物理数据
19 外消旋5-{1-[(4-氟苯甲酰基)氨基]丙基}-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯
制备 20
5-[1-{[(苄基氧基)羰基]氨基}丙基]-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯，异构体A的 合成
将5-[1-氨基丙基]-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯，异构体2 (制备17B)(3.25 g,11.8 mmol)在DCM (47.0 mL)中的溶液在室温用N,N-二异丙基乙胺(4.53 mL, 25.9 mmol)处理。添加氯甲酸苄基酯 (2.12 mL, 14.1 mmol)并搅拌过夜。将反应混合物用另外的N,N-二异丙基乙胺(2.06 mL, 11.8 mmol)和氯甲酸苄基酯(0.707 mL, 4.70 mmol)处理。搅拌30分钟。用水淬灭反应混合物并添加饱和碳酸氢钠水溶液。分层并用DCM萃取水层2次。用无水硫酸钠干燥合并的有机层，过滤并浓缩滤液。通过用5-35%丙酮在己烷中的梯度洗脱的硅胶柱色谱纯化，得到作为白色泡沫的标题化合物(4.47 g, 93%)。
制备 21
外消旋N-[1-(2,3-二氢-1H-吲哚-5-基)乙基]-4-氟苯甲酰胺的合成
将4M 盐酸的1,4-二氧杂环己烷(27.9 mL, 112 mmol)溶液添加至外消旋5-{1-[(4-氟苯甲酰基)氨基]乙基}-2,3-二氢-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯(制备18)(4.29 g, 11.2 mmol)在DCM (112 mL)中的混合物中。将所得混合物在40℃下加热6小时。用2N NaOH水溶液中和。添加4:1 CHCl3:IPA以溶解胶粘固体并分层。用盐水洗涤有机层，用无水硫酸钠干燥, 过滤并浓缩滤液。通过用30-60% (25% 丙酮的DCM溶液)于己烷中大的梯度洗脱的硅胶柱色谱纯化，得到作为浅灰白色泡沫得标题化合物(2.48 g, 78%)。
基本类似于制备21地制备下述化合物。
制备编号 化学名 物理数据
22 外消旋N-[1-(2,3-二氢-1H-吲哚-5-基)丙基]-4-氟苯甲酰胺
23 [1-(2,3-二氢-1H-吲哚-5-基)丙基]氨基甲酸苄基酯，异构体A
制备24A和B
N-[1-(2,3-二氢-1H-吲哚-5-基)乙基]-4-氟苯甲酰胺，异构体1和N-[1-(2,3-二氢- 1H-吲哚-5-基)乙基]-4-氟苯甲酰胺，异构体2的分离
(用于手性分离)
通过手性SFC纯化外消旋N-[1-(2,3-二氢-1H-吲哚-5-基)乙基]-4-氟苯甲酰胺(制备21)，得到第一洗脱对映异构体(异构体1)。ES/MS (m/z):285.0 (M+H)。纯化条件:CHIRALPAK® AS-H, 5 x 15 cm 柱; 流动相:在CO2中的15% iPrOH; 柱温:40℃; 流速:300 g/分钟; UVW:250 nm。通过手性分析SFC确认异构体1的对映异构体富集(>99% ee,Rt:1.47 分钟; 柱:CHIRALPAK® AS-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:在CO2中的25% iPrOH; 流速:5 mL/分钟; UVW:300 nm)。
上述纯化也产生第二洗脱对映异构体(异构体2)。ES/MS (m/z):285.0 (M+H)。通过手性分析SFC确认异构体2的对映异构体富集(98.5% ee, Rt:2.08 分钟; 柱:CHIRALPAK® AS-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:在CO2中的25% iPrOH; 流速:5 mL/分钟; UVW 300nm)。
制备 25
{5-[1-氨基丙基]-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基}(四氢-2H-吡喃-4-基)甲酮，异构体A的合 成
将{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]丙基}氨基甲酸苄基酯，异构体A (制备9)(2.12 g, 5.02 mmol)在EtOH (35 mL)中的溶液添加至PARR® 振荡瓶中的氮气吹扫的20% 氢氧化钯/碳(2.12 g)在EtOH (35 mL)中的悬浮液中。密封，用氮气吹扫，然后用氢气吹扫。在室温下，在414 kPa (60 psi)的氢气氛下振摇3.6小时。通过硅藻土过滤反应混合物，浓缩滤液，得到作为浅灰白色固体的标题化合物(1.36 g, 94%)。
制备 26
2-甲基-2-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]丙酸甲酯的合成
在氮气下，将正丁基锂 (3.6 mL, 8.9 mmol, 2.2 M的己烷溶液)添加至搅拌的0℃的二环己基胺(1.9 mL, 9.6 mmol)在甲苯(25 mL)中的溶液中并搅拌20分钟。将异丁酸甲酯(0.83 g, 8.2 mmol)在甲苯(5 mL)中的溶液滴加至之前制备的混合物中并在0℃搅拌30分钟。添加[5-溴-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基](四氢-2H-吡喃-4-基)甲酮(制备8)(2.3 g, 7.4mmol)并用氮气脱气所得混合物。添加二-µ-溴双(三叔丁基膦)二钯(I)(50 mg, 0.06mmol)并使所得混合物在氮气下温热至室温。2小时后，添加第二部分的二-µ-溴双(三叔丁基膦)二钯(I)(50 mg, 0.06 mmol)并在室温在氮气下搅拌过夜。用EtOAc和1N HCl水溶液稀释并搅拌10分钟。过滤并用EtOAc冲洗固体。分离滤液层，并用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤有机层。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤并浓缩滤液。用20-60% EtOAc的己烷溶液通过硅胶柱色谱纯化，得到作为白色固体的标题化合物(2.3 g, 94% 收率, 89% 纯度)。
制备 27
2-甲基-2-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]丙酸的合成
将 2-甲基-2-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]丙酸甲酯(制备26)(2.2 g, 6.6 mmol)溶解于THF (66 mL)中并添加三甲基硅醇钾(1.1 g, 8.6 mmol)。在室温搅拌4天。过滤固体并用THF洗涤。将固体溶解于水中并用5N HCl水溶液酸化。在冰箱中冷却30分钟。过滤收集作为白色固体的标题化合物(1.20 g, 57%)。
制备 28
2-甲基-2-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]丙酰胺的合成
将1,1'-羰基二咪唑(126 mg, 0.763 mmol)添加至搅拌的2-甲基-2-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]丙酸(制备27)(202 mg, 0.636 mmol)在DCM (6.4mL)中的溶液中，并在室温在氮气下搅拌45分钟。添加氢氧化铵(1 mL, 9.55 mmol, 25% w/v 在水中)并在氮气下在室温搅拌90分钟。添加DMF (3 mL)以帮助溶解性并在室温继续搅拌2小时。浓缩并用0-10% EtOH的DCM溶液通过硅胶柱色谱纯化，得到作为白色固体的标题化合物(180 mg, 89%)。
制备 29
[5-(1-氨基-1-甲基乙基)-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基](四氢吡喃-4-基)甲酮的合成
将[双(三氟乙酰氧基)碘]苯(115 mg, 0.26 mmol)添加至搅拌的2-甲基-2-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]丙酰胺(制备28)(81 mg, 0.26 mmol)在ACN(0.25 mL)和水(0.25 mL)中的混合物中，在氮气下在室温搅拌过夜。浓缩，获得作为浅粉色固体的标题化合物(140 mg, 94%, 50% 纯的材料)。
制备 30
4-氟-2-[(2-羟基乙基)氨基]苯甲酸甲酯的合成
将甲基-2-氨基-4-氟苯甲酸酯(2.81 g, 15.9 mmol)和2-碘乙醇(0.879 mL, 11.2mmol)的混合物加热至90℃持续6小时，然后冷却至室温。将净混合物溶解在EtOAc中，用1NNaOH水溶液洗涤3次，然后用盐水洗涤。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤并浓缩滤液，得到2.94 g的浅棕色油。添加2-碘乙醇(1.26 mL, 15.9 mmol)并在100℃加热混合物过夜。添加另外的2-碘乙醇(0.314 mL, 3.99 mmol)并继续在100℃加热2小时。冷却至室温。将净混合物溶解在EtOAc中，用1N NaOH水溶液洗涤3次，然后用盐水洗涤。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤并浓缩滤液，得到2.50 g棕色固体。用20-40% EtOAc的己烷溶液通过硅胶柱色谱纯化，得到作为白色固体的标题化合物(1.12 g, 33%)。
制备 31
4-氟-2-[(2-羟基乙基)氨基]苯甲酸的合成
将氢氧化钠(0.49 mL, 2.4 mmol, 5M 在水中)添加至搅拌的4-氟-2-[(2-羟基乙基)氨基]苯甲酸甲酯(制备30)(104 mg, 0.488 mmol)在1,4-二氧杂环己烷(2.4 mL)中的溶液中。在室温加盖搅拌30分钟，然后加热至70℃持续2小时。浓缩并用1N HCl水溶液酸化至大约pH 1-2，用DCM萃取2次。用无水硫酸钠干燥合并的有机层，过滤并浓缩滤液，得到作为棕褐色固体的标题化合物(89 mg, 92%)。
参考制备1
1-(2,4-二氟苯基)-3-(2,3-二氢-1H-吲哚-5-基甲基)脲的合成
将5-(氨基甲基)吲哚啉-1-甲酸叔丁酯(4.1 g, 17 mmol)和2,4-二氟-1-异氰酸根合苯(3 mL, 24 mmol)在DCM (100 mL)中的混合物搅拌1小时。用MeOH和水淬灭反应并浓缩。将残余物溶于DCM (30 mL)中，添加TFA (15 mL)并使之在室温静置2小时。浓缩并添加饱和碳酸氢钠水溶液。用MeOH/DCM (1/5, v/v)萃取混合物。将有机层用无水硫酸镁干燥，过滤并浓缩滤液。由EtOH重结晶，得到两次收获物。合并收获物，得到标题化合物(3.5 g, 68%)。
参考制备2
1-(2,4-二氟苯基)-3-{[1-(3,4,5-三溴苯甲酰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]甲基}脲 的合成
将1-(2,4-二氟苯基)-3-(2,3-二氢-1H-吲哚-5-基甲基)脲(参考制备1)(70 mg, 0.23mmol)、3,4,5-三溴苯甲酸(170 mg, 0.24 mmol)和1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓 3-氧化物六氟磷酸盐(134 mg, 0.35 mmol)在DMF (2 mL)中的溶液脱气(N2)。添加TEA (0.08 mL, 0.6 mmol)并在室温搅拌1小时。通过反相纯化直接纯化反应混合物(柱:Redisep Rf Gold High Performance C18 反相柱; 洗脱液:A:含有5% MeOH的水中的10mM碳酸氢铵 (pH 10), B:ACN; 梯度:40% B 持续5分钟，然后40-95% B 经15分钟; 流速60 mL/分钟, UVW 219/254 nM)，通过冷冻干燥分离产物，得到标题化合物(149mg, 54%)。
实施例1
外消旋4-氟-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯 甲酰胺
将外消旋[5-(1-氨基乙基)-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基](四氢-2H-吡喃-4-基)甲酮(制备3)(420 mg, 1.53 mmol)和4-氟苯甲酸(257 mg. 1.84 mmol)合并于DCM (15 mL)中。向正在搅拌的溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(534 μL, 3.06 mmol)和1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓-3-氧化六氟磷酸盐(890 mg, 2.30 mmol)。将所得混合物在室温搅拌16小时。蒸发溶剂并通过反相柱色谱纯化(Redisep Rf Gold HighPerformance C18 反相柱, 10 mM 碳酸氢铵水溶液中的25-100% ACN)，得到标题化合物(372 mg, 61%)。
实施例 1A
4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲 酰胺
合成方法 1:
通过手性SFC纯化外消旋4-氟-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺(实施例1)，得到作为标题化合物的第一洗脱对映异构体。ES/MS(m/z):397.0 (M+H)。纯化条件:CHIRALPAK® AD-H, 21 x 150 mm; 流动相:在CO2中的40%MeOH; 柱温:40℃; 流速:70 g/分钟; UVW:225 nm。通过手性分析SFC确认异构体1的对映异构体富集(>99% ee, Rt:1.72 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:在CO2中的40% MeOH; 流速:5 mL/分钟; UVW:225 nm)。
合成方法 2:
在0℃将TEA (9.8 mL, 70.3 mmol)、然后4-氟苯甲酰氯(5.85 g, 36.9 mmol)添加至[5-(1-氨基乙基)-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基](四氢-2H-吡喃-4-基)甲酮，异构体1 (制备4A)(9.65 g, 35.2 mmol)在DCM (176 mL)中的溶液中。使所得混合物温热至室温并搅拌过夜。用EtOAc (300 mL)稀释反应混合物，通过硅胶垫过滤并用EtOAc洗涤。浓缩滤液并用25-30% ACN在DCM中的梯度通过硅胶柱色谱纯化，得到作为灰白色固体的标题化合物(9.4 g,67.1%)。MS (m/z):397.2 (M+H)。通过手性分析SFC确认对映异构体富集(>99% ee, Rt:1.74 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:在CO2中的40% MeOH; 流速:5 mL/分钟; UVW:225 nm)。
合成方法 3:
在0-5℃将TEA (65 mL, 468 mmol)添加至 [5-(1-氨基乙基)-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基](四氢-2H-吡喃-4-基)甲酮盐酸盐，异构体1 (制备7B)(70 g, 225 mmol)在DCM (700mL)中的混合物中。滴加4-氟苯甲酰氯(37.85 g, 239 mmol)。将混合物温热至室温并搅拌2小时。以保持温度低于30℃的速率滴加水并将混合物在20-30℃搅拌1小时。分层并用18%H2SO4水溶液洗涤有机层。分层并用7% NaHCO3水溶液洗涤有机层。分层并用水洗涤有机层。分层，然后将有机溶液通过碳过滤器。用SI-Thiol (7 g)处理溶液，并将混合物加热至40℃。将所得混合物搅拌12小时。将混合物冷却至室温并通过硅藻土过滤混合物。将有机层浓缩至200 mL (~3体积)。添加丙酮(140 mL, 2体积)并将所得混合物浓缩至200 mL (~3体积)。用另外的丙酮(280 mL, 4体积)和水(280 mL, 4体积)处理。在65℃加热2小时直至反应为澄清溶液。经3小时慢慢冷却至30℃。在30℃搅拌1小时。滴加水(140 mL, 2体积)并在30℃继续搅拌1小时。经大约2小时慢慢冷却至3-8℃。在该温度搅拌6小时。过滤并用水(140mL, 2体积)冲洗固体。在55℃干燥固体4-6小时。得到作为白色固体的期望的产物(55 g,61.6%)。
实施例 1A的X射线粉末衍射收集程序
结晶固体的XRD图案在Bruker D4 Endeavor X射线粉末衍射仪上获得，该衍射仪配备有CuKa源(λ = 1.54060 Å)和Vantec检测器，在35 kV和50 mA下操作。用以2θ计0.0087°的步长和0.5 秒/步的扫描速率，并在0.6 mm发散、5.28mm固定抗散射和9.5 mm检测器狭缝的条件下在以2θ计4和40°之间对样品进行扫描。将干燥粉末装在石英样品架上，使用载玻片获得平滑表面。在环境温度和相对湿度下收集晶型衍射图案。
1A 方法 3的X射线粉末衍射收集程序
实施例1A的制备样品(合成方法3)的特征在于使用CuKa辐射的XRD图案，其具有如下表1中所述的衍射峰(2θ值)。具体而言，该图案包含17.38°的峰与选自12.51°、15.65°、16.37°、17.56°、21.48°和25.23°的一个或多个峰的组合，其中衍射角的公差为0.2 度(2θ±0.2°)。
表1。实施例 1A 方法3的X射线粉末衍射峰
实施例1A的绝对构型的确定
通过将10 mg的4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺悬浮在1:1 EtOH/庚烷(1.75 mL)中并在轨道振荡器上浆化3天，制备4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺的单晶。将大约为0.020 mm x 0.080 mm x 0.300 mm的尺寸的4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺的无色叶片状样本用于X射线晶体学分析。使用Iµ CuKα辐射源(λ＝1.54178 Å)和装备有Photon 100 SL区域检测器的基于Bruker D8 Venture的三圆测角仪衍射仪来测量X射线强度数据。共收集8840帧。用Bruker SAINT软件包使用窄帧算法对各帧进行积分。使用单斜晶胞对数据进行积分，得到总计7242次反射至最大θ角为68.28° (0.83 Å 分辨率)，其中3059次是独立的(平均冗余量2.367, 完整性 = 95.9%, Rint = 5.83%, Rsig = 6.58%)且2893 次(94.57%)大于2σ(F2)。最终晶胞常数a = 5.5831(13)Å, b = 5.1082(9)Å, c = 35.013(6)Å, β = 90.578(17)°, 体积 = 998.5(3)Å3, 基于对超过20 σ(I)的6280次反射的XYZ-形心(centroid)进行的优化，其中10.09° < 2θ < 136.8°。使用多重扫描法(SADABS)将数据针对吸收效应进行校正。最小与最大表观透过率的比率是0.784。计算出的最小和最大透过系数(基于晶体尺寸)为0.8020和0.9850。使用Bruker SHELXTL软件包采用空间群P 21来解析结构并进行优化，其中对于式单位 C23H25FN2O3，Z = 2。对F2进行的最终各向异性全矩阵最小二乘法优化，其中264个变量针对观察到的数据以R1 = 9.17%收敛，并且针对所有数据以wR2 =23.48%收敛。拟合优度是1.141。最终差异电子密度合成中的最大峰值为0.506 e-/Å3并且最大空穴是-0.358 e-/Å3，其中RMS偏差为0.088 e-/Å3。基于最终模型，计算的密度是1.319g/cm3和F(000), 420 e-。绝对结构参数优化为0.12(16)，验证了手性中心的立体化学。绝对结构被确定为立体中心处的R-构型。
实施例 1B
4-氟-N-{(1S)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲 酰胺，异构体2
通过手性色谱纯化外消旋4-氟-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺(实施例1)，得到作为标题化合物的第二洗脱对映异构体。ES/MS(m/z):397.0 (M+H)。纯化条件:柱:CHIRALPAK® AD-H, 21 x 150 mm; 流动相:在CO2中的40% MeOH; 柱温:40℃; 流速:70 g/分钟; UVW:225 nm。通过手性分析SFC确认异构体2的对映异构体富集(98.3% ee, Rt:2.37 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:在CO2中的40% MeOH; 流速:5 mL/分钟; UVW:225 nm)。
使用来自制备3的起始材料，基本类似于实施例1地制备实施例2。
实施例编号 化学名 结构 物理数据
2 外消旋4-氯-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺
实施例2A和2B
4-氯-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺， 异构体1和4-氯-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲 酰胺，异构体2
通过手性SFC纯化外消旋4-氯-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺(实施例2)，得到第一洗脱对映异构体(异构体1)。ES/MS (m/z):413.0 (M+H)。纯化条件:CHIRALPAK® AD-H, 21 x 150 mm; 流动相:在CO2中的40%iPrOH; 流速:70 g/分钟; UVW:260 nm。通过手性分析SFC确认异构体1的对映异构体富集(>99% ee, Rt=1.97 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:在CO2中的40%iPrOH; 柱温:40℃; 流速:5 mL/分钟; UVW:225 nm)。
上述纯化也产生第二洗脱对映异构体(异构体2)。ES/MS (m/z):413.0 (M+H)。通过手性分析SFC确认异构体2的对映异构体富集(>99% ee, Rt:3.04 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:在CO2中的40% iPrOH; 流速:5 mL/分钟; UVW:225nm)。
基本类似于实施例1，使用来自制备3的起始原料制备实施例3至实施例9。
实施例编号 化学名 结构 物理数据
3 外消旋4-氰基-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺
4 外消旋N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺
5 外消旋4-甲基-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺
6 外消旋4-氯-3-氟-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺
7 外消旋3-氯-4-氟-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺
8 外消旋4-乙烯基-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺
9 外消旋2,4-二氟-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺
实施例9A和B
2,4-二氟-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲 酰胺，异构体1和2,4-二氟-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基] 乙基}苯甲酰胺，异构体2
通过手性SFC纯化外消旋2,4-二氟-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺(实施例9)，得到第一洗脱对映异构体(异构体1)。ES/MS (m/z):415.0 (M+H)。纯化条件:CHIRALPAK® AD-H, 21 x 150 mm; 流动相:在CO2中的40%MeOH; 柱温:40℃; 流速:70 g/分钟; UVW:225 nm。通过手性分析确认异构体1的对映异构体富集(98.6% ee, Rt:1.72 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:在CO2中的40% MeOH; 流速:5 mL/分钟; UVW:225 nm)。
上述纯化也产生第二洗脱(异构体2)。ES/MS (m/z):415.2 (M+H)。通过手性分析SFC确认异构体2的对映异构体富集(98.5% ee, Rt:2.60 分钟; 柱:CHIRALPAK® AD-H,4.6 x 150 mm; 流动相:在CO2中的40% MeOH; 流速:5 mL/分钟; UVW:225 nm)。
基本类似于实施例1，使用来自制备7的起始原料制备实施例10至实施例13。
实施例编号 化学名 结构 物理数据
10 4-(二氟甲基)-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺，异构体A
11 4-(氟甲基)-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺，异构体A
12 2-(苄基氧基)-4-(氟)-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺，异构体A
13 4-氟-2-[(2-羟基乙基)氨基]-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺，异构体A
基本类似于实施例1A, 合成方法 2地制备实施例14和15。
实施例编号 化学名 结构 物理数据
14 4-氟-N-{2-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]丙-2-基}苯甲酰胺
15 4-氰基-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]丙基}苯甲酰胺，异构体A
实施例 16
非对映异构体4-氟-N-[1-{1-[四氢-2H-吡喃-3-基羰基]-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基}乙 基]苯甲酰胺(2种非对映异构体的混合物)
将N-[1-(2,3-二氢-1H-吲哚-5-基)乙基]-4-氟苯甲酰胺，异构体1 (制备24A)(150mg, 0.528 mmol)、外消旋四氢吡喃-3-甲酸(100 mg. 0.739 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.277 mL, 1.58 mmol)在DCM (5.28 mL)中的混合物用1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓-3-氧化六氟磷酸盐(304 mg, 0.791 mmol)处理。在室温搅拌45分钟。用DCM稀释反应混合物。添加水和饱和碳酸氢钠水溶液。分层并用DCM萃取水层2次。将合并的有机层通过疏水性玻璃料(ISOLUTE®相分离器筒)并浓缩滤液。通过用20-55%丙酮在己烷中的梯度洗脱的硅胶柱色谱纯化，得到作为白色固体的标题化合物(184 mg,88%)。
实施例16A和B
4-氟-N-[1-{1-[四氢-2H-吡喃-3-基羰基]-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基}乙基]苯甲酰胺， 异构体1和4-氟-N-[1-{1-[四氢-2H-吡喃-3-基羰基]-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基}乙基]苯甲 酰胺，异构体2
通过手性色谱纯化非对映异构体4-氟-N-[1-{1-[四氢-2H-吡喃-3-基羰基]-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基}乙基]苯甲酰胺(实施例16)，得到第一洗脱非对映异构体(异构体1)。MS(m/z):397.2 (M+H)。纯化条件:CHIRALCEL® OJ-H, 30 x 250 mm; 流动相:100% MeOH;流速:30 mL/分钟; UVW:225 nm。通过手性分析HPLC确认异构体1的对映异构体富集(>99%de, Rt:3.42 分钟; 柱:CHIRALCEL® OJ-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:100% MeOH (含0.2% 异丙胺); 流速:1 mL/分钟; UVW:225 nm)。
上述纯化也产生第二洗脱(异构体2)。ES/MS (m/z):397.2 (M+H)。通过手性分析HPLC确认异构体2的对映异构体富集(97.8% de, Rt:4.66 分钟; Column CHIRALCEL®OJ-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:100% MeOH (含 0.2% 异丙胺); 流速:1 mL/分钟; UVW:225 nm)。
实施例 17
4-氟-2-羟基-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯 甲酰胺，异构体A
将10% Pd/C (10 mg)添加至氮气冲洗的2-(苄基氧基)-4-氟-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺，异构体A (实施例12)(96.0 mg, 0.19mmol)在乙醇(2 mL)中的溶液中，并用1 atm (101 kPa)的氢气在室温氢化1小时。用硅藻土过滤并浓缩滤液，得到作为白色固体的期望的化合物(66 mg, 84%)。
实施例 18
外消旋4-氟-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]丙基}苯 甲酰胺
将外消旋N-[1-(2,3-二氢-1H-吲哚-5-基)丙基]-4-氟苯甲酰胺(制备22)(200 mg,0.650 mmol)在DCM (6.5 mL)中的混合物用N,N-二异丙基乙胺(0.228 mL, 1.30 mmol)处理。添加四氢吡喃-4-碳酰氯(110 mg, 0.715 mmol)并搅拌30分钟。用DCM稀释反应混合物。添加水和饱和碳酸氢钠水溶液。分层并用DCM萃取水层2次。将合并的有机层通过疏水性玻璃料(ISOLUTE®相分离器筒)并浓缩滤液。通过用20-60%丙酮在己烷中的梯度洗脱的硅胶柱色谱纯化，得到作为浅桃色泡沫的标题化合物(244 mg, 91%)。
实施例18A和B
4-氟-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]丙基}苯甲酰胺， 异构体1和4-氟-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]丙基}苯甲 酰胺，异构体2
通过手性SFC色谱纯化外消旋4-氟-N-{1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]丙基}苯甲酰胺(实施例18)，得到第一洗脱对映异构体(异构体1)。ES/MS(m/z):411.2 (M+H)。纯化条件:CHIRALPAK® AS-H, 21 x 150 mm 柱; 流动相:在CO2中的25% MeOH; 柱温:40℃; 流速:80 g/分钟; UVW:260 nm。通过手性分析SFC确认异构体1的对映异构体富集(>99% ee, Rt:0.92 分钟; 柱:CHIRALPAK® AS-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:在CO2中的25% MeOH; 流速:5 mL/分钟; UVW:225 nm)。
上述纯化也产生第二洗脱对映异构体(异构体2)。ES/MS (m/z):411.2 (M+H)。通过手性分析SFC确认异构体2的对映异构体富集(>99% ee, Rt:1.53 分钟; 柱:CHIRALPAK® AS-H, 4.6 x 150 mm; 流动相:在CO2中的25% MeOH; 流速:5 mL/分钟; UVW:225 nm)。
参考实施例1
1-(2,4-二氟苯基)-3-{[1-(3,4,5-三氚代苯甲酰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]甲基} 脲
在氚化烧瓶中，在3Ci的氚下，对DMF (1 mL)中的1-(2,4-二氟苯基)-3-{[1-(3,4,5-三溴苯甲酰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]甲基}脲(3 mg, 0.005 mmol)、钯(10%，在碳上，3mg)和N,N-二异丙基乙胺(10 μL, 0.06 mmol)进行搅拌3小时。过滤反应，并将滤液与EtOH共蒸发以除去不稳定的氚。将残余物溶解于EtOH并通过反相柱色谱进行纯化(柱:GEMINI® C18250 x 10 mm; 流动相:A: 水/TFA (1000:1), B:ACN/TFA (1000:1); 梯度:经60 分钟 20-70% B; 流速 3 mL/分钟)，得到溶解于EtOH中的标题化合物。
参考实施例2
1-(2,4-二氟苯基)-3-{[1-(苯基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]甲基}脲
将1-(2,4-二氟苯基)-3-(2,3-二氢-1H-吲哚-5-基甲基)脲(300 mg, 0.99 mmol)溶解于DCM (20 mL)并添加苯甲酰氯(0.13 mL, 1.1 mmol)和TEA (0.27 mL, 1.9 mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时。浓缩并通过反相纯化对残余物进行纯化(柱:Redisep Rf GoldHigh Performance C18 反相柱; 流动相:A:水中的0.1% 甲酸, B:ACN; 梯度:经30 分钟0-80% B; 流速:60 mL/分钟, UVW:219/254 nm)，通过冷冻干燥分离产物，得到标题化合物(403 mg, 79%)。
免疫系统是抑制肿瘤发展的关键检查点。因此，癌症已经进化出许多机制来逃避、抑制或以其他方式破坏免疫系统。虽然色氨酸对癌细胞的生长至关重要，但通过由癌细胞本身(内在)或者微环境中的细胞或肿瘤引流淋巴结(TDLNs)(外在)表达吲哚胺2,3双加氧酶(IDO1)，其降解被选择用于广泛的癌症中。与快速的细胞生长相反，肿瘤微环境中IDO1的选择性活化为肿瘤提供了避免免疫监视的有效策略，所述免疫监视是癌症发展和治疗抗性的关键检查点。IDO1的免疫抑制活性是色氨酸局部消耗和同时产生犬尿氨酸(这两者都是免疫抑制剂)的直接结果。
IDO1活性的免疫抑制作用影响多种细胞类型，包括细胞抑制[T-细胞(Frumento,等人(2002)J Exp Med 196(4):459-468; Terness,等人(2002)J Exp Med 196(4):447-457)和NK细胞(Della Chiesa,等人(2006)Blood 108(13):4118-4125)]，细胞发育[调节性T-细胞(Sharma,等人(2007)J Clin Invest 117(9):2570-2582; Chen,等人(2008)JImmunol 181(8):5396-5404; Baban,等人(2009)J Immunol 183(4):2475-2483)]和抑制性抗原呈递细胞[抑制性树突细胞和巨噬细胞 (Munn,等人(2004)J Clin Invest 114(2):280-290; Munn,等人(2005)Immunity 22(5):633-642; Sharma,等人(2007)J ClinInvest 117(9):2570-2582)]，以及募集和扩张[骨髓来源的抑制细胞 (Yu,等人(2014)JImmunol 193(5):2574-2586; Holmgaard,等人(2015)Cell Rep 13(2):412-424)]。IDO1活性通过肿瘤、肿瘤微环境和TDLN中色氨酸的消耗和犬尿氨酸的同时增加而表现出这些效果。
通过IDO1在肿瘤微环境或TDLN中的表达，色氨酸的局部消耗和犬尿氨酸的产生都支持Tregs的发育和活化(Sharma,等人(2007)J Clin Invest 117(9):2570-2582), MDSCs(Holmgaard,等人(2015)Cell Rep 13(2):412-424)和调节树突细胞的发育和活化(Sharma,等人(2007)J Clin Invest 117(9):2570-2582)，所有这些都起到支持肿瘤生长的免疫抑制作用。色氨酸的消耗通过活化应激反应激酶GCN2来支持Treg发育，应激反应激酶GCN2响应于不带电荷的tRNA的积累而被刺激。缺乏GCN2的T细胞不易受IDO1介导的增殖抑制或无反应性表型的诱导的影响(Munn,等人(2005)Immunity 22(5):633-642)。除色氨酸消耗外，IDO1活性还导致高浓度的下游代谢产物犬尿氨酸，一种重要的免疫抑制分子。与色氨酸消耗相似，犬尿氨酸活化芳烃受体(AHR)对于调节性T细胞的产生至关重要(Mezrich,等人(2010)J Immunol 185(6):3190-3198)，升高的犬尿氨酸的产生和AHR的表达与人脑癌预后不良有关(Opitz,等人(2011)Nature 478(7368):197-203)。犬尿氨酸阻断T细胞和NK细胞增殖 (Boyland,等人(1956)Biochem J 64(3):578-582)并且是AHR受体的激动剂(Mezrich,等人(2010)J Immunol 185(6):3190-3198; Opitz,等人(2011)Nature478(7368):197-203), 调节先天免疫介导的诸如IL-1β、IL-6和IL-21的细胞因子的产生的转录因子，并且在几种癌症中过度表达，其被认为在这些癌症中促进肿瘤进展和对治疗的抗性(Julliard,等人(2014)Front Immunol 5:458)。事实上，IDO1在癌症中的内在表达部分地受到犬尿氨酸介导的AHR-IL-6-STAT3信号传导回路的活化的调节，所述AHR-IL-6-STAT3信号传导回路执行IDO1的表达并抑制T细胞增殖。该IDO1信号传导轴的表达与肺癌患者的无复发存活期的减少有关(Litzenburger,等人(2014)Oncotarget 5(4):1038-1051)。IDO1介导的IL-6产生在KRAS诱导的肺癌模型中在支持促肿瘤发生的MDSC的发育和IDO1减少的IL-6产生的破坏、减弱的MDSC抑制活性、延迟的肿瘤生长和增加的存活期中也起重要作用(Smith,等人(2012)Cancer Discov 2(8):722-735)。IDO1依赖性的色氨酸消耗和AHR的犬尿氨酸依赖性活化之间的联系提供了为何色氨酸分解代谢与免疫逃逸密切相关的关键解释，该免疫逃逸是限制癌症进展的关键检查点。
肿瘤微环境中IDO1表达的调节是复杂的。IDO1是发现的第一个IFN-γ调节的基因(Yoshida,等人(1981)Proc Natl Acad Sci USA 78(1):129-132)。事实上，在所有癌症组织学中，IFN-γ和IDO1表达之间存在强烈的相关性(http://cancergenome.nih.gov/)。此外，IDO1表达被下述所上调：I型干扰素、TLR配体、TNF、IL-1、CTLA-4、CD200、GITR、CD40和TGF-β，所有这些都在免疫系统和癌症发展、进展以及治疗应答中发挥重要作用。通过IDO1表达、色氨酸消耗和/或犬尿氨酸的增加所测量的高IDO1活性与多种肿瘤类型的不良预后、降低的存活率和增加的转移潜力有关。因此，在乳腺癌、结肠直肠癌、头颈癌、肺癌和前列腺癌中确认了伴随着色氨酸减少的犬尿氨酸的血清水平中的增加(Liu,等人(2010)Blood115(17):3520-3530)。此外，IDO1在癌症患者中长期活化(Schrocksnadel,等人(2006)ClinChim Acta 364(1-2):82-90), 与广泛的疾病(Huang,等人(2002)Br J Cancer 86(11):1691-1696)、在几种癌症中的标准化疗效果不佳和/或耐受性差有关，所述癌症包括黑素瘤(Weinlich,等人(2007)Dermatology 214(1):8-14)、急性髓性白血病(Chamuleau,等人(2008)Haematologica 93(12):1894-1898; Corm,等人(2009)Leuk Res 33(3):490-494)、乳腺癌和宫颈癌(Inaba,等人(2010)Gynecol Oncol 117(3):423-428; Yu,等人(2011)Clin Dev Immunol 2011:469135; Yu,等人(2013)J Immunol 190(7):3783-3797; Chen,等人(2014)Breast Cancer Res 16(4):410):Clin Cancer Res.2007 Dec 1;13(23):6993-7002; Trott,等人(2016). Oncotarget, 7(41), 66540-66557)、结肠直肠癌、肾细胞癌、皮肤黑素瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、胃癌、胶质瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、喉鳞状细胞癌、肺癌、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、食管和口腔鳞状细胞癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺导管癌、T细胞白血病和甲状腺癌。IFN-γ是由活化的NK和T细胞分泌的关键效应细胞因子。用于全身(CTLA-4)或局部(PD-L1/L2)抑制T细胞活性的负调节回路目前被批准用作抗癌剂，其中它们增强T细胞介导的肿瘤生长抑制。检查点诸如CTLA-4、PD-1或PD-L1的基因敲除导致IFN-γ产生的显著增强 (Latchman,等人(2004)Proc Natl AcadSci USA 101(29):10691-10696; Pandiyan,等人(2007)J Immunol 178(4):2132-2140),其可以参与免疫抑制性IFN-γ-至-IDO1轴。在小鼠黑素瘤模型中用1-甲基色氨酸抑制内在IDO1表达显著提高了伊匹单抗(CTLA-4阻断抗体)的功效(Holmgaard,等人(2013)J ExpMed 210(7):1389-1402)。伊匹单抗的这种增强的功效与CD8效应细胞的增加和Tregs的减少有关。这些观察结果扩展到靶向PD1、PD-L1和GITR的其他抗体，其中IDO1的抑制增强了它们的抗癌活性。机理上IDO1显示通过诱导Treg、随后募集MDSC、在肿瘤处产生免疫抑制环境来阻碍这些检查点抑制剂的功效(Holmgaard,等人(2015)Cell Rep 13(2):412-424)。治疗癌症的免疫治疗方法诸如IFN-γ本身、先天免疫活化剂诸如CpG-ODNs、抗4-1BB(CD137)、抗OX40、抗PD-1/PD-L1/PD-L2、抗CTLA 4，所有都有可能活化IDO1表达，抑制其在临床中的长期疗效。因此，将IDO1抑制剂与这些药剂组合可能具有显著的治疗潜力。具体地，IDO1抑制剂与抗PD1抗体(pidilizumab、纳武单抗、派姆单抗)、抗PD-L1抗体(度伐单抗、阿特珠单抗、avelumab)、抗CTLA-4抗体(伊匹单抗)、抗OX40抗体(MEDI6469、KHK4083)和抗4-1BB(CD137)抗体(PF-05082566)的组合在广泛的肿瘤类型中具有显著的治疗潜力。
总之，这些数据暗示了色氨酸消耗和犬尿氨酸的同时产生的抑制剂诸如IDO1抑制剂可以在多种癌症类型中作为单一药剂或组合用于治疗初治癌症患者以及治疗抗性癌症患者。已经通过已知的IDO1抑制剂诸如epacadostat(INCB024360)和NLG919证明了该用途。已知Epacadostat在体外和体内均与IDO1结合并阻断色氨酸的分解代谢以及随后的犬尿氨酸产生。另外，epacadostat已经在临床前小鼠模型CT26和PAN02中证明了单一药剂功效，这种效应取决于T细胞的存在。(Yue,等人(2009)J Med Chem 52(23):7364-7367; Koblish,等人(2010)Mol Cancer Ther 9(2):489-498; Liu,等人(2010)Blood 115(17):3520-3530; Jochems,等人(2016)Oncotarget, Advance Publications)。epacadostat的临床前功效已转化为人类临床试验结果(NCT01195311)。
以下测定的结果证明了本文示例性化合物可用作犬尿氨酸生成抑制剂(诸如IDO1抑制剂)，并且可用于治疗癌症。此外，以下测定的结果证明了某些示例性化合物与IDO1结合，并且所有示例性化合物在体外和体内均抑制癌细胞中色氨酸向犬尿氨酸的转化。
IDO1的结合测定
该测定的目的是证明某些示例性化合物在体外与IDO1结合。具体地，该测定评估测试化合物与氚代侦察分子1-(2,4-二氟苯基)-3-[[1-(3,4,5-三氚代苯甲酰基)吲哚啉-5-基]甲基]脲竞争的能力并允许计算结合亲和力IC50。
1-(2,4-二氟苯基)-3-[[1-(3,4,5-三氚代苯甲酰基)吲哚啉-5-基]甲基]脲与 IDO1的竞争性结合
将在DPBS中稀释的300 nM His6-IDO1 (Proteros, SwissProtID P14902, Cat# PR-0278, 批次 19/59, 98 mg/mL 在25 mM MES pH 6.5, 150 mM KCl中，纯度 >95%)加载于镀镍板(Sigma, Cat# S5563)的各孔中并在4℃孵育过夜。通过在BIOTEK® 微孔板洗涤器中用300 µL DPBS洗涤板4次以除去未结合的蛋白。每孔加入100 µL封闭缓冲液(0.05%TWEEN® 20/DPBS)并在室温孵育1小时以减少非特异性结合。在封闭板的同时，通过在DPBS中稀释来制备50 nM 1-(2,4-二氟苯基)-3-[[1-(3,4,5-三氚代苯甲酰基)吲哚啉-5-基]甲基]脲(Biocair, Cat# TRQ41455)，在DMSO中2.5倍系列稀释未标记的储液以产生11点稀释曲线。将5 µL 系列稀释的未标记化合物添加至95 µL的50 nM 1-(2,4-二氟苯基)-3-[[1-(3,4,5-三氚代苯甲酰基)吲哚啉-5-基]甲基]脲中，将混合物添加至板中的各孔中，在室温孵育4小时，同时轻轻振摇。为了确定氚代侦察分子(1-(2,4-二氟苯基)-3-[[1-(3,4,5-三氚代苯甲酰基)吲哚啉-5-基]甲基]脲)的最大置换，将过量的未标记 1-(2,4-二氟苯基)-3-{[1-(苯基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]甲基}脲(ChemDiv, Cat# G714-0242))100 μM添加至50 nM 1-(2,4-二氟苯基)-3-[[1-(3,4,5-三氚代苯甲酰基)吲哚啉-5-基]甲基]脲中，并加入板中的非特异性结合对照孔中。孵育4小时后，使用MultiMek96吸出孔，并使用BIOTEK®微孔板洗涤器用300μL冰冷的DPBS快速洗涤板一次。向各孔中加入100 µL 的100mM 咪唑的PBS(pH 7.5)溶液，在室温孵育10分钟以从镀镍板中置换IDO1-配体复合物。使用MultiMek96将置换的IDO1-配体复合物转移到每孔含有200 µL 的Microscint-20 (PerkinElmer, Cat# 6013621)的96孔白色透明底板(Costar, Cat# 3632)中。使用TriluxMicrobeta计数器定量1-(2,4-二氟苯基)-3-[[1-(3,4,5-三氚代苯甲酰基)吲哚啉-5-基]甲基]脲配体的总结合和非特异性结合(NSB)。使用总结合和NSB值利用GraphPad Prism中的非线性回归分析来计算未标记化合物的IC50。该测定的结果证明某些示例性化合物与IDO1结合。例如，实施例1A和1B证明IC50值小于1.5 μM。具体地，实施例1A的IC50是0.033 μM± 0.0028 (n=2)。
犬尿氨酸产生测定(SKOV3)
该测定的目的是对表达IDO1的癌细胞中的犬尿氨酸、N-甲酰基-犬尿氨酸的产生和色氨酸的消耗的抑制进行评价，并评估化合物是否对这些细胞具有明显的毒性。测试示例性化合物抑制SKOV3(ATCC，Cat＃HTB-77)中的IDO1活性，SKOV3是一种内在表达IDO1的卵巢癌细胞系。由于IDO1表达，SKOV3细胞在产生犬尿氨酸的同时降解色氨酸，并且对化合物抑制犬尿氨酸、N-甲酰基-犬尿氨酸的产生和色氨酸消耗的能力进行了测试。任选地，可以通过监测细胞活力来评估化合物的明显毒性。
内标的合成
N-甲酰基L-犬尿氨酸-d4的合成
(2S)-2-氨基-4-氧代-4-(2,3,4,5-四氘代-6-甲酰胺基-苯基)丁酸
将预制的乙酸酐(0.026 mL, 0.264 mmol)在甲酸(0.052 mL, 1.32 mmol)中的混合物添加至L-犬尿氨酸-d4 (56 mg, 0.264 mmol)在甲酸(0.132 mL)中的混合物中。在氮气下将所得混合物在室温搅拌2小时。用ACN稀释反应混合物并在氮气流下浓缩。将残余物通过反相HPLC纯化 (柱:PHENOMENEX® LUNA® 5 μm C18 (2)100Å AXIA, 30 x 75 mm; 洗脱液:A:0.1% 甲酸/水, B:0.1% 甲酸/ACN; 梯度:0% B 2分钟，然后用经5分钟至22% B的梯度; 流速:85 mL/分钟，在UVW 231/214 nm下)，冷冻干燥后得到作为蓬松白色固体的标题化合物29 mg。
细胞处理和细胞活力
在96孔组织培养板(BD Biosciences)中，以每孔20,000个细胞在补充有非必需氨基酸(Gibco, Cat# 11140-050), 1 mM 丙酮酸钠(Gibco, Cat#11360-070),和10%胎牛血清的100 µL的McCoys 5A培养基(Gibco, Cat# 16600-082)完全培养基中，将SKOV3细胞(表达IDO1的卵巢癌细胞系)铺板。然后，在含有5% CO2的37℃培养箱中孵育细胞16小时。由10mM测试化合物的DMSO储液制备化合物系列稀释液。在DMSO中将储液3倍系列稀释，将5 µL的化合物转移至含有95 µL完全培养基的中间给药板中，以产生10点稀释曲线，其中最终化合物浓度为1 µM至0.5 pM，或者10 µM至0.5 nM的范围。从含有细胞的板中倒出培养基并印迹至纸巾上。以每孔90μL完全培养基洗涤板两次，并用90μL完全培养基替换最终洗涤液。洗涤后，将10μL系列稀释的化合物从中间给药板加入板的每个孔中，并在含有5% CO2的37℃培养箱中孵育18小时。测定中的最终DMSO浓度为0.5%。在18小时孵育结束时，将50μL培养基从各孔转移到96孔v底板(Thermo Scientific)中，密封该板，并在-80℃下储存，用于随后基于质谱的犬尿氨酸、N-甲酰基-犬尿氨酸和色氨酸的测量。任选地，将原始板返回培养箱另外24小时，并通过添加等体积的CELLTITER-GLO®(Promega)测量细胞的活力，并在PERKINELMER®EnVision读板器中测量发光。
色氨酸、N-甲酰基-犬尿氨酸和犬尿氨酸的质谱(MS)测量
在冰上解冻从基于SKOV3细胞的测定中收集的样品，并通过在4℃下以3220xg离心板1分钟来清除任何细胞碎片。添加12.5 µL内标，其由2.5 µg/mL L-色氨酸-2’,4’,5’,6’,7’-d5 (CDN Isotopes, Cat# D-1522), L-犬尿氨酸硫酸盐环-d4,3,3-d2 (CambridgeIsotope Laboratories, Cat# DLM-7842-0.01)以及内部制备的N-甲酰基L-犬尿氨酸-d4组成。用Easy Peel密封物(ThermoScientific)热封所有板，涡旋混合1-2分钟，然后在4℃下以3220xg离心1分钟。通过将各自溶解在水中而得到1mg/mL的终浓度，产生用于定量犬尿氨酸和N-甲酰基犬尿氨酸的标准校准溶液。从它们各自的1mg/mL储液中分装20.8μL犬尿氨酸和23.6μL的N-甲酰基犬尿氨酸，并使用McCoys 5A培养基稀释至1mL，得到每种标准品100μM的终浓度。在完全培养基中2倍系列稀释校准溶液以获得5点标准曲线，其中终浓度为5μM至0.313μM(犬尿氨酸)和2μM至0.125μM(N-甲酰基犬尿氨酸)。将1μL培养基样品(未知)或标准校准溶液注入LC/MS-MS系统上，该系统由SHIMADZU®Prominence 30A HPLC系统和ABSCIEX®5500三重四极杆质谱仪组成。在保持于35℃的XBridge™ C18 柱, 2.1 x 50 mm,3.5 µm (Waters, Cat#186003021)上分离分析物，其中流动相流速为0.7 mL/分钟。流动相A是0.1% 甲酸/水，流动相B是MeOH。梯度概况是:0分钟, 0.5% B; 0.8分钟, 98% B; 1.10分钟, 98% B; 1.11分钟, 0.5% B; 1.7分钟, 然后停止。在APCI正多反应监测模式下操作质谱仪。使用来自标准曲线样品的数据，并使用MultiQuan™软件为各分析物生成线性拟合校准曲线。使用生成的标准曲线来计算未知的分析物浓度。
使用来自含有500μM参比标准处理的培养基的犬尿氨酸的质谱测量作为百分百抑制并且使用无化合物、但DMSO处理作为百分之零抑制来计算化合物IC50值。使用N-甲酰基-犬尿氨酸和色氨酸的测量来评估通过显示犬尿氨酸和N-甲酰基-犬尿氨酸产生与伴随的色氨酸水平的降低之间的直接关系而生成的数据的有效性。该测定的结果表明，所有示例性化合物抑制在表达IDO1的癌细胞中的犬尿氨酸和N-甲酰基-犬尿氨酸的产生(用于抑制犬尿氨酸和N-甲酰基-犬尿氨酸两者的IC50值均小于0.9 μM)，和在细胞活力方面测试的那些(实施例 1-9)，所有所述化合物均如此，最高达至少1 μM对细胞无明显毒性。例如，用于抑制犬尿氨酸和N-甲酰基-犬尿氨酸的实施例1A的IC50分别是0.007 μM ± 0.002 (n=6)和0.007 μM ± 0.002 (n=6)。进而，最高达10 μM的实施例1A并不抑制细胞增殖。
体内靶标抑制测定
该测定的目的是评价体内癌细胞中犬尿氨酸产生和色氨酸消耗的抑制。SKOV3X(印第安纳大学研究和技术中心)(一种卵巢癌细胞系)固有地表达IDO1并且容易在AthymicNude-Foxn1nu小鼠(Harlan)的腹膜腔中形成肿瘤。作为IDO1表达的结果，SKOV3X肿瘤局部地消耗色氨酸，伴随肿瘤微环境中高水平的犬尿氨酸的产生。该测定的目的是测量测试化合物抑制IDO1的能力，其通过肿瘤中犬尿氨酸水平的明显降低得到证明。
存活阶段
在补充有非必需氨基酸(Gibco, Cat# 11140-050), 1 mM 丙酮酸钠(Gibco, Cat#11360-070)和10% FBS的McCoys 5A培养基(Gibco, Cat# 16600-082)中培养SKOV3X，并在37℃、5% CO2下孵育。从培养物中胰蛋白酶消化并分离细胞，将细胞重悬于Hank's平衡盐溶液(HBSS)中。将2 x 106个SKOV3X 细胞植入各Athymic Nude-Foxn1nu 小鼠(Harlan)的腹膜腔中。植入后大约三周，触诊动物以确保肿瘤形成并将携带肿瘤的小鼠随机分成媒介物对照组和化合物治疗组。通过口服强饲法给予配制在含有1%羟乙基纤维素(HEC)和0.025%TWEEN® 80和0.05% 消泡剂的媒介物或单独的媒介物中的化合物。通过对携带肿瘤的动物给予单次剂量并在给药后2、4、8、12和24小时收集血浆、肝脏和肿瘤样品以生成时间-进程抑制曲线。将血液收集到含有EDTA的血液收集管(Greiner bio-one，Cat＃450474)中，并以2365xg离心，分离血浆，并在-80℃冷冻。分离肝脏和肿瘤碎片，记录重量并快速冷冻和储存在-80℃。
生成标准曲线，组织处理和靶标抑制
通过首先产生剥离的基质来制备L-犬尿氨酸和L-色氨酸的校准标准，所述基质是通过透析耗尽L-犬尿氨酸和L-色氨酸的血浆和组织匀浆。然后，用已知量的L-犬尿氨酸和L-色氨酸强化剥离的基质。通过将10mL EDTA处理的小鼠血浆(BioreclamationIVT，Cat＃MSEPLEDTA3)添加至SPECTRA/POR®FLOAT-A-LYZER®G2(Spectrum Labs，Cat＃G235063)中并将该透析装置置于1000mL磷酸盐缓冲盐水中来产生剥离的小鼠血浆并透析过夜。然后，将该装置转移至新鲜的1000mL磷酸盐缓冲盐水中并重复透析。将剥离的小鼠血浆转移到干净的容器中，在-20℃保存用于将来使用。对每克对照小鼠肝脏加入3mL MeOH/水(1：1，v/v)，制备对照肝匀浆，并用超声探头进行均质化。除了使用组织研磨机使肿瘤组织均质化之外，以相同的方式制备对照肿瘤匀浆。将10 mL对照组织匀浆、肝脏和肿瘤添加至分别的SPECTRA/POR®FLOAT-A-LYZER®G2装置中，并在1000 mL MeOH/水(1：1，v/v)中透析过夜，然后将各自转移到新鲜的1000mL MeOH/水(1：1，v/v)中并重复透析。将剥离的组织匀浆转移到分别的容器中，在-20℃下保存用于将来使用。
制备溶于ACN/水(1：1，v/v)中的L-犬尿氨酸硫酸盐(Sigma Aldrich，Cat＃K3750)和溶于N-甲基-2-吡咯烷酮/水(4：1，v/v)中的L-色氨酸(Sigma Aldrich)的标准储液，得到最终游离碱浓度为1mg/mL。将50μL 各储液等分，并用MeOH/水(1：1，v/v)稀释，得到合并的50μg/mL工作溶液。通过系列稀释50,000 ng/mL溶液，制备MeOH/水(1：1，v/v)中的六种另外的校准工作溶液，得到7点校准曲线，其中终浓度为25 ng/mL至50 μg/mL。
将从测试对象获得的肝样品与MeOH/水(1：1，v/v)按照1克组织与3mL溶剂的比例混合，并用超声探头均质化。将肿瘤样品使用组织研磨机用相同比例的MeOH/水(1：1，v/v)均质化。解冻来自测试对象的血浆样品并混合均匀。
通过将25μL的各样品转移到96孔板的各孔中，进行校准工作溶液(L-犬尿氨酸和L-色氨酸的7点稀释系列)的提取，并根据测试样品的来源组织将25μL合适的剥离对照基质(血浆、肝或肿瘤匀浆)添加至这些孔。将25 µL 的MeOH/水 (1:1, v/v)添加至各孔中，然后添加25 µL的各测试样品。接下来，向所有孔中添加含有250 ng/mL L-色氨酸-2',4',5',6',7'-d5(Sigma Aldrich, Cat# 615862)和L-犬尿氨酸硫酸盐环-d4,3,3-d2(CambridgeIsotope Laboratories，Cat＃DLM-7842-0.005)的180 µL的ACN/MeOH (1:1, v/v)并进行混合以沉淀样品中的蛋白质。离心96孔板以使沉淀的蛋白材料沉淀，然后用水/TFA(100：2，v/v)将各上清液的一部分稀释至少10倍。将10μL的各提取的样品和校准标准注入LC/MS-MS系统，该系统由SHIMADZU®SCL-10A控制器和SHIMADZU®LC-10ADvp HPLC泵、CTC-PAL自动进样器和ABSCIEX®4000三重四极杆质谱仪组成。在保持在环境条件下的Advantage™Echelon™ C18 柱, 2.1 x 20 mm, 4 µm (Analytical Sales and Service, Cat#Sprite AE1822)上分离分析物，其中流动相流速为1.5 mL/分钟。流动相 A是水/TFA/1 M碳酸氢铵, (1000:4:1, v/v/v)，流动相 B是ACN/TFA/1 M 碳酸氢铵 1000:4:1, v/v/v)。梯度概况是:0分钟, 0.3% B; 0.03-0.2分钟, 7% B; 0.3-0.4分钟, 36% B; 0.41分钟,98% B, 然后在0.7分钟停止以恢复到初始条件。在TURBOIONSPRAY®正多反应监测模式下操作质谱仪。使用来自校准标准曲线样品的数据，并使用Analyst™软件为各分析物生成二次拟合校准曲线。使用生成的标准曲线来计算研究样品的分析物浓度。
使用来自用媒介物处理的非肿瘤携带动物的犬尿氨酸的肝浓度作为最大抑制或犬尿氨酸的最低水平。使用来自媒介物处理的肿瘤携带小鼠的犬尿氨酸的SKOV3X肿瘤浓度作为最小抑制或犬尿氨酸的最高水平。计算化合物处理组相对于媒介物处理的肿瘤中的最小IDO1抑制的抑制百分比。该测定的结果表明，实施例1A在体内抑制表达IDO1的癌细胞中犬尿氨酸和N-甲酰基-犬尿氨酸的产生。具体地，以75 mg/kg、25 mg/kg和5 mg/kg给药的实施例1A在给药后12小时分别导致79%、59%和37%抑制。
实施例1A在结肠癌的小鼠同系Colon26模型中的抗肿瘤作用以及实施例1A与 LY3300054的组合在建立的L55人源化小鼠模型中的抗肿瘤作用
小鼠同系Colon26模型:
在补充有10mM HEPES，1nM丙酮酸钠和10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基中使小鼠BALB/c衍生的Colon26结肠癌细胞系生长。用胰蛋白酶收获亚融合细胞，并用缺乏血清的完全生长培养基冲洗2次。通过在免疫活性BALB/c小鼠(Envigo，Indianapolis，IN)的后胁腹侧中注射重悬于HBSS中的1×106个细胞来启动皮下肿瘤。在肿瘤植入后6天，基于体重使动物随机化，并使用所示的每组动物的数量置于它们各自的治疗组中。
L55人源化肿瘤模型，hPBMC挑战和治疗：
在补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中使人NSCLC细胞系L55生长。用胰蛋白酶收获亚融合细胞，并用缺乏血清的生长培养基冲洗2次。通过在NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ小鼠的后胁腹侧中注射HBSS和MATRIGEL® (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)的1:1混合物中的5 x 106 个细胞来启动皮下肿瘤的生长，所述小鼠更通常称为NOD scidγ链敲除小鼠(NSG)小鼠(The Jackson Laboratory, Bar Harbour, Maine)，其缺乏T细胞、B细胞、NK细胞，并且缺乏细胞因子信号传导。当平均肿瘤体积达到约200-300 mm3时，通过肿瘤大小和体重随机化动物，并如所示置于它们各自的治疗组中。随机化后，用单独的PBS(无PBMC)或含有1×107个人PBMC的PBS注入受体的尾静脉中来挑战携带肿瘤的小鼠。
数据采集、化合物配制和媒介物对照(两种模型)
使用Study Director采集肿瘤大小和体重。使用下式估计肿瘤体积(V):V=.536 x L xW2，其中，L = 较大的测量直径，并且W = 垂直直径的较小者。将肿瘤体积数据转换为对数标度，以平衡时间和治疗组的偏差。使用SAS软件(版本9.2)中的MIXED程序，利用根据时间和处理的偏差的双向重复测量分析来分析体积对数数据。重复测量的相关模型是空间功率(Spatial Power)。在每个时间点将治疗组与对照组进行比较。对每个治疗组也分别使用MIXED程序来计算每个时间点的调整平均值和标准误差。两种分析均负责每只动物内的自相关性以及早期从研究中移除具有大肿瘤的动物时发生的数据丢失。使用最接近于用实施例1A给药的最后一天取得的肿瘤体积测量值，使用式%T/C = 100×ΔT/ΔC (其中T =化合物治疗组的平均肿瘤体积，ΔT=化合物治疗组的平均肿瘤体积减去基线日的平均肿瘤体积，C =对照(媒介物)组的平均肿瘤体积，ΔC=对照组的平均肿瘤体积减去基线日的平均肿瘤体积)来计算肿瘤体积的相对变化(%T/C)。如果ΔT<0，则计算肿瘤回归值而不是%T/C，由此%回归= 100×ΔT/T初始，使得T初始 =基线日的平均肿瘤体积。
通过在研究过程期间每周2次通过三维测径器测量来测量肿瘤体积，评价单独或组合的实施例1A和LY3300054的抗肿瘤功效。在研究过程期间每周测量2次体重，作为耐受性的一般指标。
实施例1A和LY3300054的配制：在1% HEC/0.25% Tween 80/0.05%消泡剂中每周配制实施例1A并在4℃下保存。将LY3300054溶解于磷酸盐缓冲盐水中，并在4℃下保存。
对照组:对于单一药剂功效研究，单独给予实施例1A的媒介物。对于组合研究，分别根据每种化合物的相同时间表给予用于实施例1A和LY3300054的两种媒介物。对于组合功效研究中的单一疗法组，按照非给药化合物的时间表，用所需化合物和不被给药的化合物的媒介物来处理动物。
Colon26同系模型, 处理和结果:
单一疗法实施例1A
通过口服强饲法以10、50和100 mg/kg的剂量用实施例1A每天2次对携带Colon26肿瘤的雌性BALB/c 小鼠 (n=10)进行21天处理。在肿瘤植入后6天开始给予实施例1A，并且在治疗期的持续时间每周2次监测肿瘤生长和体重。
结果：10、50和100 mg/kg的实施例1A的处理导致对肿瘤生长的剂量响应性作用，其中仅50和100 mg/kg 剂量在第20天显示出统计学上(p<.001)相关的生长抑制。对于10、50和100mg/kg剂量，在第20天观察到的肿瘤体积的变化(%T/C)分别为17.5%、31.2%和62.6%。与媒介物处理的小鼠相比，在用实施例1A测试的任何剂量下，相对于治疗过程中的体重变化，没有显著的耐受性问题。体重减轻被测量为与每组肿瘤植入后6天在基线时记录的平均体重的百分比变化。在第20天，与基线相比，媒介物处理的小鼠平均显示体重减少5.5%，其中10、50和100mg/kg给药组分别显示2.5%、8%和2.5%的减少。虽然剂量方面体重减轻存在剂量依赖性趋势，但与媒介物处理的小鼠无统计学差异。
L55人源化肿瘤模型，治疗和结果：
hPBMC对L55肿瘤生长的作用
L55 NCLC人癌细胞系本质上耐受与注射hPBMC相关的同种异体反应(allo-response)。这些研究的目的是评价化合物加强同种异体反应的能力，该同种异体反应允许人T细胞靶向并限制缺乏适应性免疫系统的小鼠(NSG小鼠)中人L55肿瘤的生长。为了评价hPBMC对L55肿瘤的肿瘤生长抑制的贡献，用缺乏hPBMC的PBS或含有1x107个hPBMC的PBS模拟注射携带已经达到约250 mm3的建立的L55肿瘤的NSG小鼠(n = 10)。在治疗期的持续时间每周两次测量肿瘤体积和体重。
结果：与在研究过程中未接受hPBMC的动物相比，并无统计学上显著的L55肿瘤生长的抑制。在研究过程中用人PBMC注射没有观察到显著的耐受性问题，这通过与基线相比缺乏显著的体重减轻得到证明，其在第41天比基线低0.1%。
单一疗法实施例1A
为了评估实施例1A增强由hPBMC介导的L55肿瘤生长抑制的能力，携带已经达到约250mm3的建立的L55肿瘤的NSG小鼠(n = 10)用缺乏hPBMC的PBS模拟注射，并且另一组(n=10)用含有1x107个hPBMC的PBS注射。通过口服强饲法用75mg/kg的实施例1A每天2次治疗两组21天。在治疗期的持续时间每周两次测量肿瘤体积和体重。
结果：在不存在hPBMC的情况下，与不含PBMC的单独的媒介物相比，用实施例1A治疗L55肿瘤在治疗过程中没有导致显著的肿瘤生长抑制。与缺乏hPBMC的媒介物对照组相比，在hPBMC存在下用实施例1A治疗携带L55肿瘤的动物导致肿瘤生长抑制。统计学上相关的肿瘤生长的抑制在较晚时间点最明显，其中第41天的%T/C为47.6%(P<.001)。通过与基线测量值相比，在使用hPBMC、实施例1A和组合的研究过程中没有明显的显著耐受性问题，这通过体重减轻缺乏统计学显著性降低得到证明。
单一疗法LY3300054
为了评估LY3300054增强由hPBMC介导的L55肿瘤生长抑制的能力，用含有hPBMC的PBS注射两组携带已经达到约250 mm3的建立的L55肿瘤的NSG小鼠(n=10/组)。通过腹膜内注射，4周每周1次用10mg/kg IgG-效应物无效(IgG-EN)对照抗体处理一组，另一组用10mg/kgLY3300054处理。在治疗期的持续时间每周两次测量肿瘤体积和体重。
结果：与单独的媒介物(有或没有hPBMC)相比，用10mg/kg IgG-EN治疗注射hPBMC的携带L55肿瘤的小鼠没有改变肿瘤生长或进展。与含有或缺乏hPBMC的媒介物处理对照相比，用10mg/kg LY3300064治疗已经注射hPBMC的携带L55肿瘤的动物导致统计学上显著的肿瘤生长抑制。与缺乏PBMC的单独的媒介物(第37天)相比，在给药期结束时观察到的肿瘤体积的变化(%T/C)为75.7%。与基线测量值相比，在使用或不使用hPBMC的LY3300054的研究过程中没有明显的显著的耐受性问题，这通过体重减轻缺乏统计学显著性降低得到证明。
实施例1A和LY3300054的组合
用hPBMC注射携带已达到约250mm3的L55肿瘤的NSG小鼠(n = 10)，并且通过口服强饲法每天2次用75mg/kg实施例1A治疗21天，和通过腹膜内注射每周一次用10mg/kgLY3300054治疗4周。在治疗期的持续时间每周两次测量肿瘤体积和体重。
结果：与单独的单一疗法组相比，75mg/kg实施例1A和10mg/kg LY3300054的联合治疗导致抗肿瘤功效的改善。肿瘤体积显著低于媒介物单独组，所述媒介物单独组缺乏PBMC或注射hPBMC(在所有测量中P <.001)。第30、34、37和41天的肿瘤体积分别为9.6%T/C、19.8%T/C、13.3%T/C和27.3%T/C。单一疗法组相比于联合治疗组之间的抗肿瘤功效的差异是统计学显著的(p <.001)。为了评价该组合是加合性还是协同性，基本上如下所述分析数据：
统计学分析(两种模型)：
肿瘤体积数据的统计学分析从数据转换到对数标度开始，以平衡时间和治疗组的偏差。使用SAS软件(版本9.3)中的MIXED程序，利用根据时间和处理的偏差的双向重复测量分析来分析体积对数数据。重复测量的相关模型是空间功率。在每个时间点将治疗组与对照组进行比较。对每个治疗组也分别使用MIXED程序来计算每个时间点的调整平均值和标准误差。两种分析负责每只动物的自相关性以及早期从研究中移除具有大肿瘤的动物时发生的数据丢失。针对每个治疗组相对于时间绘制调整平均值和标准误差(s.e.)。
组合分析方法 (IVEF研究的Bliss独立性(Bliss Independence)):
利用重复测量分析的结果，对比陈述(contrast statements)用于检验每个时间点的相互作用效应，将媒介物和组合组的平均值与两个单一药剂组的平均值进行比较。这相当于用于测试加合性的Bliss独立性(Bliss Independence)方法。组合的预期加合性响应(EAR)在肿瘤体积标度上计算为：EAR体积 = V1 * V2/V0, 其中，V0、V1和V2分别是媒介物对照、单独治疗1和单独治疗2的估计的平均肿瘤体积。如果相互作用检验是显著的，则根据观察到的组合平均体积分别小于或大于EAR体积，在统计学上声明组合效果大于加合性或小于加合性。否则，统计学结论是加合性的。
使用这种分析方法，肿瘤生长抑制并不好于加合性，直到第34天和第37天，此时肿瘤生长抑制是协同性的，分别具有P<0.008和p<0.001。与基线测量值相比，在用实施例1A和LY3300054的组合的研究过程中没有明显的显著的耐受性问题，这通过体重减轻缺乏统计学显著性降低得到证明。
优选将本发明化合物配制成通过各种途径给药的药物组合物。最优选地，这种组合物用于口服或静脉内给药。这种药物组合物及其制备方法是本领域熟知的。参见例如，REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (D. Troy,等人, 编, 第21版,Lippincott Williams & Wilkins, 2005)。
如本文所用，术语“有效量”是指本发明的化合物或其药学上可接受的盐在向患者施用单次剂量或多次剂量后在接受诊断或治疗的患者中提供所需的效果的量或剂量。
如本领域技术人员通过使用已知技术并通过观察在类似情况下获得的结果，主治诊断医师可以容易地确定有效量。在确定用于患者的有效量时，主治诊断医师会考虑许多因素，包括但不限于：哺乳动物的物种；其体型、年龄和一般健康状况；所涉及的特定疾病或病症；疾病或病症的程度或参与程度或严重程度；个体患者的反应；给予的具体化合物；给予方式；所给予制剂的生物利用度特征；选择的剂量方案；同时用药的使用；和其他相关情况。
本发明化合物通常在很宽泛的剂量范围内有效。例如，每日剂量通常在每日约0.05-1000mg的范围内。优选地，此类剂量在每日0.1-500mg的范围内。更优选地，此类剂量在每日1-200mg的范围内。在一些情况下，低于上述范围下限的剂量水平可能是绰绰有余的，而在其他情况下，可以采用仍更大的剂量而不会引起任何有害的副作用，因此上述剂量范围并不旨在以任何方式限制本发明的范围。应当理解，实际给药的化合物的量将由医生根据相关情况确定，所述相关情况包括待治疗的病况、所选择的给药途径、实际给予的一种或多种化合物、年龄、体重、个体患者的反应以及患者症状的严重程度。

Claims (11)

1.下式的化合物:
其中：
R1a是氢、甲基、乙烯基、氰基、氟、氯、氟甲基或二氟甲基；
R1b是氢、氟或氯；
R1c是氢、羟基、氟、苄基氧基或羟乙基氨基；
R2是氢或甲基；
R2a是氢或甲基；且
R3a是四氢吡喃基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其是
。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其是
。
4.根据权利要求1或2所述的化合物，其是
。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其是结晶4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺。
6.根据权利要求5所述的化合物，其是结晶4-氟-N-{(1R)-1-[1-(四氢-2H-吡喃-4-基羰基)-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基]乙基}苯甲酰胺，其特征在于，X射线粉末衍射图案 (Cu 辐射, λ-1.54060 Å)包含至少一个在17.38°的峰与一个或多个选自下述的峰的组合：12.51°、15.65°、16.37°、17.56°、21.48°和25.23° (2θ± 0.2º)。
7.药物组合物，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的化合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
8.治疗患有癌症的患者的方法，所述癌症选自黑素瘤、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、胶质瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤，所述方法包括对所述患者给予有效量的根据权利要求1-6中任一项所述的化合物。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物，其用于治疗。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物，其用于癌症。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中所述癌症选自黑素瘤、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、胶质瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
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