KR20190003750A - 암을 치료하기 위한 1-테트라히드로피라닐카르보닐-2,3-디히드로-1h-인돌 화합물 - Google Patents

암을 치료하기 위한 1-테트라히드로피라닐카르보닐-2,3-디히드로-1h-인돌 화합물 Download PDF

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브래들리 얼 리만
알무데나 루비오
대니얼 존 솔
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Abstract

본 발명은 소정의 신규 2,3-디히드로-1H-인돌 화합물, 상기 화합물을 포함하는 제약 조성물, 및 암을 치료하기 위한, 더 구체적으로는 흑색종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 유방암, 폐암, 난소암, 난관 암종, 원발성 복막 암종, 자궁경부암, 위암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 아교모세포종, 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

암을 치료하기 위한 1-테트라히드로피라닐카르보닐-2,3-디히드로-1H-인돌 화합물
본 발명은 트립토판의 키누레닌으로의 전환을 억제하는 신규 2,3-디히드로-1H-인돌 화합물에 관한 것이며, 특정의 상기 화합물이 이인돌아민 2,3-디옥시제나제 (IDO1)에 결합하는 것으로 확인되었다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 포함하는 제약 조성물, 및 생리학적 장애를 치료하기 위한, 더 구체적으로는 흑색종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 신세포 암종, 유방암, 폐암, 난소암, 난관 암종, 원발성 복막 암종, 자궁경부암, 위암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 신경교종, 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종과 같은 암을 치료하기 위한 이러한 화합물의 사용 방법에 관한 것이다.
트립토판은 단백질 생합성, 세포 성장, 신경활성 대사물 예컨대 세로토닌 (5-히드록시트립타민), 멜라토닌 및 조-효소인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD)의 생성에 요구되는 필수 아미노산이다. 트립토판은 이후 탈포르밀화되어 키누레닌을 생성하는 N-포르밀-키누레닌으로의 트립토판 이화작용의 제1 속도-제한 단계를 촉매하는 헴-의존성 효소인 인돌아민 2,3-디옥시제나제 (IDO1)에 의해 이화된다. 감염 도중에는, IDO1의 발현이 인터페론 감마에 의해 유도되어 국소적으로 트립토판을 고갈시키는데, 이는 립토판-의존성 세포내 병원체 예컨대 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii) 및 바이러스의 성장을 억제한다. 추가로, IDO1은 세포에서의 산화성 손상의 방지, 여러 신경병리, 면역 시스템의 조절, 및 암에서 역할을 한다. IDO1 활성이 병원체에 대한 면역 반응의 중요한 구성요소이기는 하지만, 장기간 활성은 세포외 트립토판의 고갈과 동시적인 키누레닌의 생성을 초래하며, 이들 둘 다는 면역억제성이다. 암에서의 IDO1 발현에 대해서는 충분히 기록되어 있는데, IDO1 유전자 발현의 내인성 활성화 및/또는 면역 세포 활성화의 결과인 IFN-γ-대-IDO1 축의 활성화 둘 다를 통하여 이루어진다. 추가로, 염증 및 종양 미세환경의 부위로 동원되는 선천성 면역 세포 예컨대 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포는, 그것이 IDO1을 발현할 경우에 면역억제된다. 트립토판의 IDO1-의존성 고갈과 키누레닌의 생성은 함께, T-세포 활성화 및 증식, 및 NK 세포 기능의 억제와 연관된 바 있다. 또한, 트립토판의 고갈 및 키누레닌의 생성은 면역 세포 활성화를 약화시키도록 기능하는 조절 T 세포 (Treg) 및 골수-유래 억제 세포 (MDSC)의 형성에 중요하다. 이러한 IDO1 의존성 면역억제 기작은 종양이 면역 시스템을 회피하는 것을 가능하게 하는 구성요소가 된다.
IDO1 억제를 통한 키누레닌 생성의 잠재적인 억제제가 이미 문헌에 알려져 있다. 예를 들면, WO2010005958호, WO2012142237호 및 WO2014150646호, 및 문헌 [Journal of Medicinal Chemistry (2016), 59(1), 419-430]을 참조한다. 소정의 2,3-디히드로-1H-인돌 화합물들이 관련 기술분야에 알려져 있다. 예를 들면, CAS 등록 번호 1359420-19-1, 1358912-57-8, 1358648-68-6, 1357815-05-4, 1359035-89-4 및 1359002-77-9를 참조한다.
새로운 암 요법에 대한 필요성이 존재한다. 특히, 흑색종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 신세포 암종, 유방암, 폐암, 난소암, 난관 암종, 원발성 복막 암종, 자궁경부암, 위암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 신경교종, 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종을 위한 새로운 암 요법에 대한 필요성이 존재한다. 암의 치료에 유용한 대안적인 키누레닌 생성 억제제를 제공할 필요성이 남아있다.
바람직하게는, 그와 같은 화합물은 환자에 대하여 허용가능한 내약성을 가지면서도, 종양 세포 성장의 최대 억제에 필요한 최적 투여를 가능하게 하는 특성을 가진다. 바람직하게는, 그와 같은 화합물은 또한 경구로 생체가용하게 된다. 바람직하게는, 그와 같은 화합물은 또한 혈뇌 장벽을 횡단하는 능력을 가지며, 그에 따라 뇌 노출(brain exposure)을 나타내게 된다. 바람직하게는, 그와 같은 화합물은 또한 대안적인 작용 기작을 가지는 것에 의해 기존 키누레닌 억제제에 대한 내성을 잠재적으로 극복하는 능력을 가지게 된다.
본 발명은 키누레닌 생성의 억제제인 소정의 신규 2,3-디히드로-1H-인돌 화합물을 제공한다. 통상의 기술자라면, 키누레닌 생성의 억제제가 여러 유형의 암, 특히 흑색종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 신세포 암종, 유방암, 폐암, 난소암, 난관 암종, 원발성 복막 암종, 자궁경부암, 위암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 신경교종, 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종의 치료에 단일 작용제로서, 또는 다른 항암제와 조합하여, 임상적 효용을 가질 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
본 발명은 또한 하기 화학식의 화합물을 제공한다.
Figure pct00001
여기서,
R1a는 수소, 메틸, 에테닐, 시아노, 플루오로, 클로로, 플루오로메틸 또는 디플루오로메틸이고;
R1b는 수소, 플루오로 또는 클로로이며;
R1c는 수소, 히드록시, 플루오로, 벤질옥시 또는 히드록시에틸아미노이고;
R2는 수소 또는 메틸이고;
R2a는 수소 또는 메틸이고;
R3a는 테트라히드로피라닐이다.
본 발명은 하기 화학식의 화합물을 제공한다.
Figure pct00002
본 발명은 또한 하기 화학식의 화합물을 제공한다.
Figure pct00003
본 발명은 또한 하기 화학식의 화합물을 제공한다.
Figure pct00004
본 발명은 또한 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드인 화합물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 화합물은 결정질 형태의 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드이다. 바람직하게는, 화합물은 12.51°, 15.65°, 16.37°, 17.56°, 21.48° 및 25.23° (2θ±0.2°)로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 조합된 17.38°에 적어도 1개의 피크를 포함하는 X선 분말 회절 패턴 (Cu 방사선, λ-1.54060 Å)을 특징으로 하는 결정질 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드이다.
본 발명은 또한 본 발명의 특정 화합물의 제조 방법에 유용한 하기 화학식의 중간체 또는 그의 염을 제공한다.
Figure pct00005
본 발명은 또한 본 발명의 특정 화합물의 제조 방법에 유용한 하기 화학식의 중간체 또는 그의 염을 제공한다.
Figure pct00006
본 발명은 또한 본 발명의 특정 화합물의 제조 방법에 유용한 하기 화학식의 중간체 또는 그의 염을 제공한다.
Figure pct00007
본 발명은 또한 본 발명의 특정 화합물의 제조 방법에 유용한 하기 화학식의 중간체를 제공한다.
Figure pct00008
본 발명은 또한 본 발명의 특정 화합물의 제조 방법에 유용한 하기 화학식의 중간체를 제공한다.
Figure pct00009
본 발명은 또한 본 발명의 특정 화합물의 제조 방법에 유용한 하기 화학식의 중간체를 제공한다.
Figure pct00010
본 발명은 또한 본 발명의 화합물과, 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 화합물은 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드이다.
본 발명은 흑색종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 신세포 암종, 유방암, 폐암, 난소암, 난관 암종, 원발성 복막 암종, 자궁경부암, 위암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 신경교종, 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암에 걸린 환자에게 유효량의 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 암은 흑색종이다. 바람직하게는, 암은 결장직장암이다. 바람직하게는, 암은 신세포 암종이다. 바람직하게는, 암은 유방암이다. 바람직하게는, 암은 폐암, 특히 비-소세포 폐암이다. 바람직하게는, 암은 난소암이다. 바람직하게는, 암은 신경교종이다. 바람직하게는, 상기 화합물은 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드이다.
본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 또한, 본 발명은 흑색종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 신세포 암종, 유방암, 폐암, 난소암, 난관 암종, 원발성 복막 암종, 자궁경부암, 위암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 신경교종, 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 암은 흑색종이다. 바람직하게는, 암은 결장직장암이다. 바람직하게는, 암은 신세포 암종이다. 바람직하게는, 암은 유방암이다. 바람직하게는, 암은 폐암, 특히 비-소세포 폐암이다. 바람직하게는, 암은 난소암이다. 바람직하게는, 암은 신경교종이다. 바람직하게는, 상기 화합물은 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드이다. 바람직하게는, 상기 화합물은 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드이다.
본 발명은 또한 비-소세포 폐암 및 결장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료에서의 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한, 본 발명의 화합물 및 LY3300054를 포함하는 조합물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 암은 비-소세포 폐암이다. 바람직하게는, 암은 결장암이다. 바람직하게는, 상기 화합물은 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드이다. 바람직하게는, 상기 화합물은 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드이며, 상기 암은 비-소세포 폐암이다. 바람직하게는, 화합물은 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드이며, 암은 결장암이다.
하기 단락에서는 화학식 I의 바람직한 종류에 대해 기술한다:
a) R1a가 수소, 메틸, 시아노, 플루오로 또는 클로로임;
b) R1b가 수소, 플루오로 또는 클로로임;
c) R1c가 수소 또는 히드록시임;
d) R2가 수소 또는 메틸임;
e) R2a가 수소 또는 메틸임;
f) R3a가 테트라히드로피라닐임; 그리고
g) R1a가 플루오로이며, R1b가 수소이고, R1c가 수소이며, R2가 수소이고, R2a가 수소이며, R3가 테트라히드로피라닐임.
본 발명의 화합물 중 어떤 것은 결정질이다. 어떠한 주어진 결정 형태에서도 회절 피크의 상대적인 강도는 결정 형태구조 및 성상(habit)과 같은 인자에 기인하는 선호되는 배향으로 인하여 달라질 수 있다는 것이 결정학 기술분야에 잘 알려져 있다. 선호되는 배향의 효과가 존재하는 경우, 피크 강도는 변경되지만, 특징적인 다형체 중 피크 위치는 변화되지 않는다. 예를 들면, 문헌 [The U. S. Pharmacopeia 38 - National Formulary 35 Chapter <941> Characterization of crystalline and partially crystalline solids by X-ray powder diffraction (XRPD) Official May 1, 2015]을 참조한다. 또한, 어떠한 주어진 결정 형태에서도 각도상 피크 위치는 약간 가변적일 수 있다는 것 역시 결정학 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 피크 위치는 샘플이 분석되는 온도 또는 습도에서의 변이, 샘플 변위(sample displacement), 또는 내부 표준의 존재 또는 부재로 인하여 이동할 수 있다. 본 발명의 경우, 2θ에 있어서의 ±0.2의 피크 위치 가변성으로써 표시되는 결정 형태의 분명한 식별은 방해하지 않으면서 이러한 잠재적 변이를 고려하게 될 것이다. 결정 형태의 확인은 통상적으로 더 두드러지는 피크인 특징적인 피크들의 임의의 고유 조합 (°2θ 단위)을 기준으로 이루어질 수 있다. 주변 온도 및 상대 습도에서 수집된 결정 형태 회절 패턴들은 8.85 및 26.77도 2-세타에서 NIST 675 표준 피크를 기준으로 조정하였다.
본원에서 사용될 때, "치료하다", "치료하는 것" 또는 "치료"는 기존 증상 또는 장애의 진행 또는 중증도를 제약하거나, 느리게 하거나, 중지시키거나 반전시키는 것을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "환자"라는 용어는 특정 질환, 장애 또는 이상에 걸린 온혈 동물 예컨대 포유동물, 특히 인간을 지칭한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 본 발명의 화합물 및 소정 중간체들이 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 본 발명 화합물의 특정 호변이성질체들 중 1종에 대한 본 출원에서의 임의의 언급이 주어지는 경우, 그것은 둘 다의 호변이성질체 형태 및 그들의 모든 혼합물을 포괄하는 것으로 이해된다.
본원에서 개시되는 본 발명의 일부 중간체 또는 화합물은 하나 이상의 키랄(chiral) 또는 입체(stereogenic) 중심을 가질 수 있다. 이러한 모든 상기언급된 본 발명의 화합물 또는 중간체들의 모든 개별 입체이성질체, 거울상이성질체 및 부분입체이성질체는 물론, 거울상이성질체 및 부분입체이성질체 혼합물이 라세미체를 포함하는 것으로 생각된다. 적어도 하나의 키랄 중심을 포함하는 본원에서 개시되는 본 발명의 화합물 또는 중간체는 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체로 존재하는 것이 바람직하다. 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 키랄 반응물을 사용하여 시작함으로써, 또는 입체선택성 또는 입체특이적 합성 기술 (제조예 및 실시예에 예시되어 있는 바와 같음)에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 표준 키랄 크로마토그래피 (제조예 및 실시예에 예시되어 있는 바와 같음) 또는 결정화 기술에 의해 혼합물로부터 단리될 수 있다. 통상의 기술자라면, 일부 상황에서는 상이한 크로마토그래피 컬럼 및 이동상으로 인하여 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체의 용리 순서가 다를 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
화합물 명칭에서의 "이성질체 1"이라는 호명은 본 발명의 상응하는 중간체 또는 화합물이 거울상이성질체 쌍의 혼합물이 키랄 크로마토그래피에 의해 분리될 때의 2종 용리 거울상이성질체 중 첫 번째 것임을 나타낸다. 화합물 명칭에서의 "이성질체 2"라는 호명은 본 발명의 상응하는 중간체 또는 화합물이 거울상이성질체 쌍의 혼합물이 키랄 크로마토그래피에 의해 분리될 때의 2종 용리 거울상이성질체 중 두 번째 것임을 나타낸다.
화합물 명칭에서의 "이성질체 A"라는 호명은 본 발명의 상응하는 중간체 또는 화합물이 미지 절대 배열구조의 키랄 합성으로부터 유래하는 단일 이성질체임을 나타낸다.
본원에서 사용될 때, "LY3300054"는 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하는 인간 PD-L1 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)에 결합하는 항체로써, 여기서 상기 경쇄는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하며, 상기 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, 여기서 LCVR은 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하며, LCDR1의 아미노산 서열은 SGSSSNIGSNTVN (서열식별번호: 5)이고, LCDR2의 아미노산 서열은 YGNSNRPS (서열식별번호: 6)이며, LCDR3의 아미노산 서열은 QSYDSSLSGSV (서열식별번호: 7)이고, 여기서 HCVR은 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하며, 각각 HCDR1의 아미노산 서열은 KASGGTFSSYAIS (서열식별번호: 2)이고, HCDR2의 아미노산 서열은 GIIPIFGTANYAQKFQG (서열식별번호: 3)이며, HCDR3의 아미노산 서열은 ARSPDYSPYYYYGMDV (서열식별번호: 4)이다.
LY3300054의 일부 실시양태에서, LY3300054는 인간 PD-L1에 결합하며, 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하고, 여기서 경쇄는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하며, 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, 여기서 LCVR의 아미노산 서열은 서열식별번호: 9이며, HCVR의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8이다. LY3300054의 일부 실시양태에서, LY3300054는 인간 PD-L1에 결합하며, 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하고, 여기서 LC의 아미노산 서열은 서열식별번호: 10이며, HC는 서열식별번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 가진다. LY3300054의 일 실시양태에서, LY3300054는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하며, 여기서 각 경쇄는 서열식별번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 가지고, 각 중쇄는 서열식별번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 가진다.
본원에서 사용될 때, "경쇄 가변 영역" 또는 "LCVR"이라는 용어는 CDR 및 FR의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 부분을 의미한다.
본원에서 사용될 때, "중쇄 가변 영역" 또는 "HCVR"이라는 용어는 CDR 및 FR의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 중쇄 부분을 의미한다.
본원에서 사용될 때, "상보성 결정 영역" 및 "CDR"이라는 용어는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 LC 및 HC 폴리펩티드 가변 영역 내에서 발견되는 비-연속적인 항원 결합 부위를 의미한다. 이러한 특정 영역에 대해서는 문헌 [Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971)]; [Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)]; [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)]; [Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]; [MacCallum, et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996)]; 및 [North, et al., J. Mol. Biol., 406, 228-256 (2011)]을 포함한 다른 곳에도 기술되어 있는데, 상기 정의는 서로 비교하였을 때 아미노산 잔기들의 중복 및 하위세트를 포함한다.
CDR은 프레임워크 영역 ("FR")로 지칭되는 더 보존된 영역들에 의해 개재된다. 각 LCVR 및 HCVR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서에 따라 배열되는 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 경쇄의 3개 CDR은 "LCDR1, LCDR2 및 LCDR3"로 지칭되며, 중쇄의 3개 CDR는 "HCDR1, HCDR2 및 HCDR3"로 지칭된다. CDR은 항원과 특이적 상호작용을 형성하는 잔기 대부분을 포함한다. LCVR 및 HCVR 영역 내에서의 CDR 아미노산 잔기들의 번호지정 및 위치지정은 알려져 있는 관습 (예컨대 문헌 [Kabat (1991)], [Chothia (1987)] 및/또는 [North (2011)])에 따른다. 본 발명의 여러 실시양태에서, LY3300054의 FR들은 인간 배선(germline) 서열과 동일할 수 있거나, 또는 자연적 또는 인공적으로 변형될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "K D "라는 용어는 특정 항체-항원 또는 항체 단편-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 의미한다.
본원에서 사용될 때, "결합하다"라는 용어는 달리 표시되지 않는 한 본질적으로 본원에서 기술되는 바와 같이 37℃에서의 표면 플라스몬 공명 (SPR) 바이오센서의 사용에 의한 것을 포함하여 관련 기술분야에 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 측정하였을 때, 인간 PD-L1에 대한 항체의 친화도가 KD 약 1×10-6 M 미만, 바람직하게는 약 1×10-9 M 미만이라는 것을 의미하고자 하는 것이다.
본원에서 사용될 때, 하기의 용어들은 표시되어 있는 의미를 가지는 바: "ACN"은 아세토니트릴을 지칭하며; "APCI"는 주변 압력 화학 이온화를 지칭하고; "BTI"는 [비스(트리플루오로아세톡시)아이오도]벤젠을 지칭하며; "CDI"는 카르보닐디이미다졸을 지칭하고; "DCM"은 디클로로메탄을 지칭하며; "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 지칭하고; "DMF"는 N,N-디메틸포름아미드를 지칭하며; "DPBS"는 둘베코(Dulbecco) 포스페이트-완충 식염수를 지칭하고; "ES"는 전기분무 이온화를 지칭하며; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "EtOH"는 에탄올을 지칭하며; "FBS"는 소 태아 혈청을 지칭하고; "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 지칭하며; "iPrOH"는 이소프로판올을 지칭하고; "LC/MS-MS"는 액체 크로마토그래피 직렬 질량 분광측정법을 지칭하며; "L-키누레닌-d4"는 (2S)-2-아미노-4-(2-아미노-3,4,5,6-테트라듀테리오-페닐)-4-옥소-부탄산을 지칭하고; "MES"는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산을 지칭하며; "MS"는 질량 분광법을 지칭하고; "MeOH"는 메탄올을 지칭하며; "PBS"는 포스페이트-완충 식염수를 지칭하고; "TFA"는 트리플루오로아세트산을 지칭하며; "TEA"는 트리에틸아민을 지칭하고; "THF"는 테트라히드로퓨란을 지칭하며; "SFC"는 초임계 유체 크로마토그래피를 지칭하고; "UVW"는 자외선 파장을 지칭한다.
본 발명의 화합물은 관련 기술분야에 잘 알려져 있으며 인정되어 있는 방법에 의해 하기의 반응식, 제조예 및 실시예에 따라 제조될 수 있다. 이러한 제조예 및 실시예의 단계들을 위한 적합한 반응 조건에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있으며, 용매 및 공동-반응물들의 적절한 대체는 관련 기술분야의 기술에 속한다. 마찬가지로, 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 필요에 따라 또는 원할 경우, 잘 알려져 있는 다양한 기술에 의해 합성 중간체들이 단리 및/또는 정제될 수 있다는 것, 및 종종 거의 정제하지 않고 또는 정제 없이 다양한 중간체를 이후의 합성 단계에서 바로 사용하는 것이 가능하게 된다는 것을 알고 있을 것이다. 또한, 통상의 기술자라면, 일부 상황에서는 잔기가 도입되는 순서가 중요하지 않다는 것을 알고 있을 것이다. 숙련 화학자라면 잘 알고 있을 바와 같이, 본 발명의 화합물을 제조하는 데에 필요한 단계들의 구체적인 순서는 합성되는 구체적인 화합물, 개시 화합물, 및 치환되는 잔기의 상대적인 성향에 따라 달라진다. 달리 표시되지 않는 한, 모든 치환체는 이전에 정의된 바와 같으며, 모든 반응물은 관련 기술분야에 잘 알려져 있으며 인정되어 있는 것이다.
본 발명의 화합물은 하기의 반응식에 도시되어 있는 바와 같이 합성될 수 있으며, 여기서 R1a, R1b, R1c, R2, R2a 및 R3a는 이전에 정의된 바와 같다.
Figure pct00011
반응식 1: 화학식 I의 화합물의 합성
반응식 1은 R2가 H인 화학식 I의 화합물의 일반적인 합성을 예시하고 있다. 단계 1에서는, 2,3-디히드로-1H-인돌 (화합물 1)이 TEA와 같은 적합한 염기의 존재하에 그리고 DCM 또는 디클로로에탄 (DCE)와 같은 적합한 용매 중에서 0℃ 내지 환류와 같은 적절한 온도로 산 클로라이드와 같은 적절한 활성화된 카르복실산과 반응된다. 통상의 기술자라면, 단계 1의 반응을 달성하기 위한 많은 활성화된 카르복실산 및 제자리에서 카르복실산을 활성화하는 많은 방법들이 존재한다는 것을 알고 있을 것이다. 단계 1의 생성 케톤 (화합물 2)은 이후 EtOH와 같은 극성 양성자성 용매 중에서 실온 내지 환류와 같은 적절한 온도로 히드록실아민으로 처리됨으로써, E 및 Z 이성질체의 혼합물로서 옥심을 생성시킨다 (화합물 3). 단계 3은 아민 (화합물 4)으로의 옥심 (화합물 3)의 환원을 나타낸다. 통상의 기술자라면, 이와 같은 전환에 영향을 주는 데에 가용한 많은 방법들이 존재한다는 것을 알고 있을 것이다. 예를 들면, 옥심 (화합물 3)은 파르(PARR)® 진탕기와 같은 적절한 반응기 내의 MeOH 또는 EtOH와 같은 적절한 용매 중에서 라니(RANEY)® 니켈과 같은 적절한 촉매와 접촉된다. 다음에, 혼합물은 실온 내지 50℃와 같은 적절한 온도에서 1 내지 24시간과 같은 적절한 시간 동안 100-500 kPa와 같은 수소 압력에 적용된다. 반응식 1의 단계 4는 화학식 I의 화합물을 생성시키기 위한 TEA와 같은 적합한 염기의 존재하 그리고 DCM 또는 DCE와 같은 적합한 용매 중에서의 0℃ 내지 환류와 같은 적절한 온도로의 산 클로라이드와 같은 적절한 활성화된 카르복실산과의 아민 (화합물 4)의 아미드 커플링을 도시하고 있다. 통상의 기술자라면, 단계 4의 반응을 달성하기 위한 많은 활성화된 카르복실산 및 제자리에서 카르복실산을 활성화하는 많은 방법들이 존재한다는 것을 알고 있을 것이다. 통상의 기술자라면, 반응식 1의 단계 3 및 단계 4가 키랄 중심을 가지는 생성물을 초래한다는 것 또한 알고 있을 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 선택적 결정화 기술 또는 키랄 크로마토그래피와 같은 방법에 의해 본 발명 화합물 합성의 임의의 편리한 지점에서 개별 거울상이성질체를 분리 또는 해상할 수 있을 것이다 (예를 들면 문헌 [J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981] 및 [E.L. Eliel and S.H. Wilen, "Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994] 참조).
Figure pct00012
반응식 2: 화학식 I의 화합물의 합성
반응식 2는 R2가 H인 화학식 I의 화합물의 대안적인 일반적 합성을 예시하고 있다. 단계 1에서는, 케톤 (화합물 2)이 티타늄(IV) 에톡시드와 같은 적절한 루이스 산의 존재하에 THF와 같은 적절한 용매 중에서 실온 내지 환류와 같은 적절한 온도로 1 내지 24시간과 같은 적절한 시간 동안 적절한 키랄 술핀아미드와 반응됨으로써, 키랄 에틸리덴술핀아미드 (화합물 5)를 생성시킨다. 통상의 기술자라면, 반응물들이 술핀아미드 (화합물 5)의 둘 다의 거울상이성질체를 생성시키는 데에 가용하다는 것을 알고 있을 것이다. 키랄 환원은 에틸리딘술핀아미드 (화합물 5)로부터 에틸술핀아미드 (화합물 6)를 생성시키는 단계 2에 도시되어 있는데, 별표는 명료성을 위하여 키랄 중심을 표시하는 데에 사용된다. 예를 들면, iPrOH와 같은 적절한 용매 중에서 4 Å 분자 체와 같은 수분 스캐빈저의 존재하에 실온 내지 환류와 같은 적절한 온도로 5분 내지 대략 1시간과 같은 적절한 실간 동안 디클로로(p-시멘)루테늄(II) 이량체와 같은 적절한 루테늄 반응물을 2-아미노-2-메틸-1-프로판올과 같은 적절한 아미노에탄올과 혼합하는 것에 의해, 적절한 촉매가 사전-형성된다. 사전형성된 촉매 반응액은 실온 내지 50℃와 같은 적절한 온도로 냉각된 후, 에틸리덴술핀아미드 (화합물 5) 및 적절한 염기 예컨대 포타슘 tert-부톡시드로 처리된다. 반응은 실온 내지 50℃와 같은 적절한 온도에서 1 내지 24시간과 같은 적절한 시간 동안 유지된다. 통상의 기술자라면, 동일한 전환에 영향을 주게 되는 많은 촉매 및 화학량론적 방법들이 존재한다는 것, 및 이러한 방법들이 사용되는 기질 및 반응물의 특성에 따라 단일 부분입체이성질체의 생성으로까지의, 및 그것을 포함하는 부분입체이성질체 농축(diastereomeric enrichment)을 초래할 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 에틸술핀아미드 (화합물 6)의 산 가수분해는 아민 (화합물 4)을 생성시키기 위한 1 내지 8시간과 같은 적절한 시간 동안의 0℃ 내지 실온과 같은 적절한 온도에서의 디옥산, iPrOH, EtOAc 또는 MeOH와 같은 적절한 용매 중에서의 염산 (HCl)과 같은 적절한 산을 사용한 처리에 의해 수행될 수 있다. 통상의 기술자라면, 많은 단리 방법들이 알려져 있으며, 그것이 아민 (화합물 4)의 염 또는 유리 염기 중 어느 하나의 단리를 초래할 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 단계 4는 화학식 I의 화합물을 생성시키기 위한 상기 반응식 1 단계 4와 유사한 적절한 활성화된 카르복실산과의 아민 (화합물 4)의 아미드 커플링을 도시하고 있다.
Figure pct00013
반응식 3: 화학식 I의 화합물의 합성
반응식 3은 R2가 H인 화학식 I의 화합물의 대안적인 일반적 합성을 도시하고 있다. 단계 1은 웨인렙(Weinreb) 아미드 (화합물 8)를 생성시키기 위한 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드와의 카르복실산 (화합물 7)의 아미드 커플링을 도시한다. 통상의 기술자라면, 이와 같은 전환을 수행하기 위한 많은 방법이 존재한다는 것을 알고 있을 것이다. 예를 들면, 카르복실산 (화합물 7)은 N,N-디이소프로필에틸아민과 같은 적절한 염기의 존재하에 DMF와 같은 적절한 용매 중에서 5 내지 10분과 같은 적절한 시간 동안 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄-3-옥시드 헥사플루오로포스페이트 (HATU)와 같은 적절한 커플링 반응물로 처리될 수 있다. 다음에, 혼합물은 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드로 처리되고, 실온 내지 100℃와 같은 적절한 온도에서 3 내지 18시간과 같은 적절한 시간 동안 혼합물이 교반된다. 다음에, 생성되는 웨인렙 아미드 (화합물 8)는 단계 2에서 적절한 그리그나드(Grignard), 알킬 리튬 또는 알킬 아연 반응물로 처리됨으로써, 케톤 (화합물 9)을 생성시킨다. 통상의 기술자라면, 이와 같은 전환을 수행하는 데에 가용한 많은 수의 방법들이 존재한다는 것을 알고 있을 것이다. 예를 들면, 0℃ 내지 -78℃와 같은 적절한 온도에서의 THF와 같은 적절한 용매 중의 웨인렙 아미드 (화합물 8)는 에틸마그네슘 브로마이드와 같은 적절한 알킬 금속 반응물로 처리된다. 첨가 후 1 내지 18시간과 같은 적절한 시간 동안 반응이 계속됨으로써, 케톤 (화합물 9)을 생성시킨다. 반응식 3의 단계 3, 4 및 5는 명료성을 위하여 제시된 것이다. 상기 방법은 각각 반응식 1의 단계 2, 3 및 4에 제시되어 있는 것과 유사하다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 화합물 11이 키랄 중심을 포함한다는 것, 및 화합물 11에 대하여 키랄 정제가 수행될 수 있거나, 또는 라세미 혼합물이 이월될 수 있으며, 이후 단계들 중 어느 것 후에 분리가 수행될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 단계 6은 아민 (화합물 13)을 생성시키기 위한 카르바메이트 (화합물 12)의 tert-부톡시카르보닐 보호 기의 탈보호를 도시하고 있다. 통상의 기술자라면, 이와 같은 전환이 산, 염기 또는 열 조건하에서 수행될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 예를 들면, 카르바메이트 (화합물 12)는 디옥산 또는 DCM 또는 이들의 혼합물과 같은 적절한 용매 중에서 0℃ 내지 환류와 같은 적절한 온도로 1 내지 18시간과 같은 적절한 시간 동안 HCl과 같은 적절한 산과 접촉됨으로써, 아민 (화합물 13)을 생성시킨다. 통상의 기술자라면, 염 또는 유리염기로서 아민을 단리하기 위한 방법들이 존재한다는 것을 알고 있을 것이다. 단계 7은 화학식 I의 화합물을 생성시키기 위한 아민 (화합물 13)과 활성화된 카르복실산의 아미드 커플링을 도시하고 있다. 조건은 반응식 1의 단계 1에 제시되어 있는 것들과 유사하다.
Figure pct00014
반응식 4: 화학식 I의 화합물의 합성
반응식 4는 화학식 I의 화합물의 대안적인 일반적 합성을 도시하고 있다. 단계 1은 카르바메이트 (화합물 14)를 생성시키기 위한 벤질 카르바메이트 보호 기를 사용한 아민 (화합물 11)의 보호를 도시한다. 통상의 기술자라면, 화합물 (14)상에서 tert-부톡시카르보닐 기에 대하여 간섭 보호 기가 될 많은 가용한 아민 보호 기들이 존재한다는 것을 알고 있을 것이다. 예시된 절차에서는, DCM과 같은 적절한 용매 중 그리고 N,N-디이소프로필에틸아민과 같은 적합한 염기 존재하의 아민 (화합물 11)이 0℃ 내지 실온과 같은 적절한 온도에서 1 내지 18시간과 같은 적절한 시간 동안 벤질옥시클로로포르메이트와 접촉된다. 화합물 14의 tert-부톡시카르보닐 보호 기는 선택적으로 탈보호됨으로써, 반응식 3의 단계 6에 대하여 기술된 것과 유사한 아민 (화합물 15) 이용 방법을 제공한다. 생성되는 아민 (화합물 15)은 이후 반응식 1의 단계 1의 것과 유사한 방법에 의해 활성화된 카르복실산과의 아미드 커플링 반응에 적용됨으로써, 아미드 (화합물 16)를 생성시킨다. 단계 4는 아민 (화합물 4)을 생성시키기 위한 화합물 16의 벤질옥시 카르바메이트 보호 기의 탈보호를 도시하고 있다. 통상의 기술자라면, 이와 같은 전환을 수행하는 데에 다양한 방법들이 가용하다는 것을 알고 있을 것이다. 예를 들면, 화합물 16은 EtOH와 같은 적절한 용매 중에서 100 내지 500 kPa와 같은 적절한 수소 압력하에 1 내지 8시간과 같은 적절한 시간 동안 팔라듐 히드록시드와 같은 적절한 촉매를 사용한 촉매 수소화에 적용됨으로써, 아민 (화합물 4)을 생성시킨다. 마지막으로, 화학식 I의 화합물로의 아민 (화합물 4)의 전환은 반응식 1의 단계 4에 기술되어 있는 바와 같다.
Figure pct00015
반응식 5: 화학식 I의 화합물의 합성
반응식 5는 화학식 I의 화합물의 대안적인 일반적 합성을 도시하고 있다. 단계 1은 아미드 (화합물 18)를 생성시키기 위한 아민 (화합물 17)과 활성화된 카르복실산의 아미드 커플링을 도시한다. 조건은 반응식 1의 단계 1에 제시되어 있는 것과 유사하다. 단계 2는 에스테르 에놀레이트와의 브로마이드 (화합물 18)의 촉매 가교 커플링을 통한 알파 아릴 에스테르 (화합물 19)의 형성을 도시한다. 통상의 기술자라면, 이와 같은 전환을 수행할 수 있는 광범위한 조건에 대해 알고 있을 것이다. 예를 들면, 톨루엔과 같은 적절한 용매 중 디시클로헥실아민과 같은 적절한 디알킬 아민의 용액이 0℃ 내지 -78℃와 같은 적절한 온도에서 10분 내지 1시간과 같은 적절한 시간 동안 n-부틸리튬과 같은 적절한 리튬 염기로 처리된다. 이와 같은 용액은 톨루엔과 같은 적절한 용매 중 메틸 2-메틸프로파노에이트와 같은 적절한 에스테르의 용액으로 처리되며, 0℃ 내지-40℃와 같은 적절한 온도에서 10분 내지 1시간과 같은 적절한 시간 동안 생성되는 혼합물이 교반된다. 다음에, 생성 혼합물은 디-μ-브로모비스(트리-t-부틸포스파인)디팔라듐(I)과 같은 적절한 팔라듐 촉매로 처리되며, 알파 아릴 에스테르 (화합물 19)를 생성시키기 위하여 0℃ 내지 실온과 같은 적절한 온도에서 1 내지 18시간과 같은 적절한 시간 동안 혼합물이 교반된다. 에스테르 (화합물 19)는 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해 산 (화합물 20)으로 가수분해될 수 있다. 예를 들면, 에스테르 (화합물 19)는 THF와 같은 적절한 용매 중에서 실온 내지 환류와 같은 적절한 온도로 1 내지 7일과 같은 적절한 시간 동안 포타슘 트리메틸실란올레이트와 같은 적합한 염기와 접촉된다. 단계 4는 카르복스아미드 (화합물 21)를 생성시키기 위한 암모니아와의 카르복실산 (화합물 20)의 아미드 커플링을 도시한다. 통상의 기술자라면, 카르복실산을 활성화함은 물론 암모니아 공급원을 도입하는 데에 가용한 많은 방법을 알고 있을 것이다. 예를 들면, 카르복실산 (화합물 20)은 DCM 또는 DMF 또는 이들의 혼합물과 같은 적절한 용매 중에서 0℃ 내지 환류와 같은 적절한 온도로 30분 내지 8시간과 같은 적절한 시간 동안 1,1'-카르보닐디이미다졸과 접촉된다. 암모늄 히드록시드가 혼합물에 첨가된 후, 1 내지 18시간과 같은 추가적인 시간 동안 반응이 계속된다. 단계 21은 아민 (화합물 4)으로의 카르복스아미드 (화합물 21)의 호프만 재배열(Hoffman rearrangement)을 도시한다. 통상의 기술자라면, 이와 같은 전환을 수행할 수 있는 매우 다양한 반응물 및 조건들을 알고 있을 것이다. 예를 들면, ACN과 물의 혼합물과 같은 적절한 용매 중 카르복스아미드 (화합물 21)의 용액이 실온 내지 환류와 같은 적절한 온도에서 1 내지 18시간과 같은 적절한 시간 동안 [비스(트리플루오로아세톡시)아이오도]벤젠으로 처리된다. 마지막으로, 화학식 I의 화합물로의 아민 (화합물 4)의 전환에 대해서는 반응식 1의 단계 4에 기술되어 있다.
제조예 1
1-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일카르보닐 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일] 에탄온의 합성
DCM (496 mL) 중 1-인돌린-5-일에탄온 (20.0 g, 124.1 mmol)의 혼합물에 TEA (51.9 mL, 372.2 mmol) 및 테트라히드로피란-4-카르보닐 클로라이드 (22.1 g, 148.9 mmol)을 첨가한다. 생성 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 DCM (500 mL)으로 희석하고, 포화 수성 소듐 비카르보네이트로 세척한다. 유기 층을 단리하고, DCM (500 mL)을 사용하여 수성 층을 2회 추출한다. 포화 수성 소듐 클로라이드를 사용하여 합쳐진 유기 층을 세척하고, 무수 소듐 술페이트상에서 건조한 후, 여과하고, 여과액을 농축함으로써, 옅은 황색의 고체로서 정량으로 표제 화합물을 산출한다. ES/MS (m/z): 274.0 (M+H).
대안적인 단리 절차:
생성물을 헵탄으로 처리한 후, 농축한다. 상기 처리 및 농축을 두 번째로 반복한다. 헵탄으로 처리하고, 0-5℃로 냉각한다. 여과에 의해 생성물을 수집하고, 헵탄을 사용하여 세정한 후, 건조함으로써, 표제 화합물을 산출한다.
제조예 2
[5-(N- 히드록시에탄이미도일 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-1-일]( 테트라히드로 -2H-피란-4-일)메타논의 합성
EtOH (1240 mL) 중 1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에탄온 (제조예 1) (33.9 g, 124.0 mmol)의 혼합물에 히드록실아민 (수중 50 질량%, 22.8 mL, 372 mmol)을 첨가한다. 생성 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반한다. 반응 혼합물을 농축함으로써, E/Z 이성질체 혼합물로서의 정량으로 표제 화합물을 산출한다. ES/MS (m/z): 289.0 (M+H).
제조예 3
라세미 [5-(1- 아미노에틸 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-1-일]( 테트라히드로 -2H-피란-4-일)메타논의 합성
2250 mL 파르® 진탕기 병에 라니® 니켈 (EtOH 중 슬러리, 60 g)을 첨가하고, 질소로 퍼징한다. MeOH (700 mL) 중 2 M 암모니아를 첨가한 다음, MeOH (700 mL) 중 2 M 암모니아에 [5-(N-히드록시에탄이미도일)-2,3-디히드로-1H-인돌-1-일](테트라히드로-2H-피란-4-일)메타논 (제조예 2) (35.8 g, 124.0 mmol)의 용액을 첨가한다. 잠재적으로 발열성인 혼합물을 필요에 따라 실온으로 냉각하고, 밀봉한 후, 질소로 퍼징한 다음, 수소로 퍼징한다. 수소 (60 psi 또는 414 kPa)하에서 4시간 동안 실온으로 교반한다. 고체를 여과 제거하고, 여과액을 농축한다. EtOAc 중 7-26% (MeOH 중 7 M 암모니아)를 사용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 오프-화이트 색상의 고체로서 표제 화합물 (26.5 g, 78%)을 산출한다. ES/MS (m/z): 275.0 (M+H).
제조예 4A 및 B
이성질체 1인 [5-(1- 아미노에틸 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-1-일]( 테트라히드로 -2H-피란-4-일)메타논과 이성질체 2인 [5-(1- 아미노에틸 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-1-일]( 테 트라히드로-2H-피란-4-일)메타논의 분리
키랄 SFC에 의해 라세미 [5-(1-아미노에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-1-일](테트라히드로-2H-피란-4-일)메타논 (제조예 3)을 정제함으로써, 제1 용리 거울상이성질체 (이성질체 1)를 산출한다. ES/MS (m/z): 275.0 (M+H). 정제 조건: 키랄팩(CHIRALPAK)® AD-H, 50×150 cm 컬럼; 이동상: CO2 중 40% EtOH (0.5% N,N-디메틸에틸아민 함유); 컬럼 온도: 40℃; 유량: 300 g/분; UVW: 260 nm. 키랄 분석 SFC (>99% ee, Rt: 1.35 분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6×150 mm; 이동상: CO2 중 40% EtOH (0.5% N,N-디메틸에틸아민 함유); 유량: 5 mL/분; UVW: 260 nm) 또는 키랄 분석 HPLC (97.4% ee, Rt: 6.48 분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6 mm×150 mm; 이동상: 100% EtOH (0.2% 이소프로필아민 함유); 유량: 1 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 농축을 확인한다.
상기 정제는 제2 용리 거울상이성질체 (이성질체 2)도 산출한다. ES/MS (m/z): 275.1 (M+H). 키랄 분석 SFC (97.2% ee, Rt: 1.85 분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6×150 mm; 이동상: CO2 중 40% EtOH (0.5% N,N-디메틸에틸아민 함유); 유량: 5 mL/분; UVW: 260 nm) 또는 키랄 분석 HPLC (97.6% ee, Rt: 5.31 분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6 mm×150 mm; 이동상: 100% EtOH (0.2% 이소프로필아민 함유); 유량: 1 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 농축을 확인한다.
제조예 5
(R)-2- 메틸 -N-{1-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일카르보닐 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일]에틸리덴}프로판-2-술핀아미드의 합성
THF (43.9 mL) 중 1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에탄온 (제조예 1) (3.0 g, 11.0 mmol)과 (R)-2-메틸프로판-2-술핀아미드 (1.6 g, 13.2 mmol)의 혼합물에 티타늄(IV) 에톡시드 (5.0 g, 21.9 mmol)를 첨가한다. 생성 혼합물을 24시간 동안 환류시킨다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각한다. EtOAc (100 mL) 및 포화 수성 소듐 클로라이드 (40 mL)를 사용하여 혼합물을 희석하고, 15분 동안 강하게 교반한다. 유기 층을 단리하고, EtOAc (100 mL)를 사용하여 수성 층을 2회 추출한다. 포화 수성 소듐 클로라이드를 사용하여 합쳐진 유기 층을 세척하고, 무수 소듐 술페이트상에서 건조한 후, 여과하고, 여과액을 농축한다. DCM 중 10-100% ACN을 사용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 옅은 황색의 고체로서 표제 화합물 (3.7 g, 87%)을 산출한다. ES/MS (m/z): 377.0 (M+H).
대안적인 단리 절차:
반응액을 실온으로 냉각하는 대신, 반응 혼합물을 10℃로 냉각한 다음, 여과한다. 톨루엔을 사용하여 고체를 세정하고, 건조함으로써, 표제 화합물을 산출한다.
제조예 6
이성질체 A인 (R)-2- 메틸 -N-{1-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일카르보닐 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일]에틸}프로판-2-술핀아미드의 합성
iPrOH (2 mL) 중 디클로로(p-시멘)루테늄(II) 이량체 (0.021 g, 0.033 mmol), 2-아미노-2-메틸-1-프로판올 (0.006 g, 0.066 mmol) 및 분자 체 (4 Å, 0.5 g)의 혼합물을 환류시까지 가열한 다음, 50℃로 냉각한다. iPrOH (8.8 mL) 중 (R)-2-메틸-N-{1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸리덴}프로판-2-술핀아미드 (제조예 5) (0.5 g, 1.33 mmol)의 용액 및 iPrOH (1.6 mL) 중 포타슘 tert-부톡시드 (0.019 g, 0.17 mmol)의 용액을 첨가한다. 생성 혼합물을 55℃에서 2시간 동안 가열한다. 다음에, iPrOH (2 mL) 중 디클로로(p-시멘)루테늄(II) 이량체 (0.021 g, 0.033 mmol), 2-아미노-2-메틸-1-프로판올 (0.06 g, 0.66 mmol) 및 분자 체 (4 Å, 0.5 g)의 추가적인 혼합물을 환류시까지 가열하고, 50℃로 냉각한 후, 상기 반응 혼합물에 첨가한다. iPrOH (1.6 mL) 중 포타슘 tert-부톡시드 (0.019 g, 0.17 mmol)의 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 55℃에서 20분 동안 가열한다. 반응액을 실온으로 냉각하고, 밤새 교반한다. DCM (20 mL)을 사용하여 반응액을 희석하고, 규조토 패드를 통하여 여과한다. DCM 중 5% MeOH를 사용하여 패드를 세척하고, 여과액을 농축함으로써, 정량으로 표제 화합물을 산출한다. ES/MS (m/z): 379.0 (M+H).
대안적인 단리 절차:
반응액을 실온으로 냉각하는 대신, 반응 혼합물을 28-32℃로 냉각한 다음, 규조토를 통하여 여과한다. 디클로로메탄을 사용하여 여과 고체를 세정한 후, 농축함으로써, 표제 화합물을 산출한다.
제조예 7A 및 7B
이성질체 1인 [5-(1- 아미노에틸 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-1-일]( 테트라히드로 -2H-피란-4-일)메타논의 합성
MeOH (6.6 mL) 중 이성질체 A인 (R)-2-메틸-N-{1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}프로판-2-술핀아미드 (제조예 6) (503 mg, 1.33 mmol)의 혼합물에 염산 (1,4-디옥산 중 4 M, 1.66 mL, 6.64 mmol)을 첨가한다. 생성 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한다. 역상 크로마토그래피 (레디세프(Redisep) Rf 골드(Gold) 고성능 C18 역상 컬럼, 10 mM 수성 암모늄 비카르보네이트 중 0-100% ACN)에 의해 잔류물을 농축 및 정제한다. 농축하여 표제 화합물 (265 mg, 73%)을 산출한다. 키랄 분석 HPLC (98.8% ee, Rt: 6.40 분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6 mm×150 mm; 이동상: 100% EtOH (0.2% 이소프로필아민 함유); 유량: 1 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 거울상이성질체 농축을 확인한다. 제조예 4A의 이성질체 1인 것으로 확인되었다. ES/MS (m/z): 275.0 (M+H).
이성질체 1인 [5-(1- 아미노에틸 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-1-일]( 테트라히드로 -2H-피란-4-일)메타논 히드로클로라이드의 합성
EtOAc (1.2 L) 중 이성질체 A인 (R)-2-메틸-N-{1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}프로판-2-술핀아미드 (162.3 g, 364 mmol)의 5℃ 슬러리에 상공 기계식 교반을 동반하여 염산 (iPrOH 중 5.5 M, 400 mL, 2.20 mol)을 적가한다. 산 용액 100 mL의 첨가 후, 냉각 배스를 제거한다. 첨가를 계속하면서, 생성 혼합물을 실온으로 3시간 동안 교반한다. 3℃로 냉각하고, 여과한다. 1-1.5 L의 EtOAc를 사용하여 세척물이 깨끗해질 때까지 필터 케이크를 세정한다. 가정용 진공 오븐에서 60℃로 수집된 고체를 건조함으로써, 오프 화이트 색상의 고체 (96.4 g, 82.5%)로서 표제 화합물을 산출한다. 키랄 분석 HPLC (98% ee, Rt: 6.45 분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6 mm×150 mm; 이동상: 100% EtOH (0.2% 이소프로필아민 함유); 유량: 1 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 거울상이성질체 농축을 확인한다. 제조예 4A의 이성질체 1인 것으로 확인되었다. ES/MS (m/z): 275.0 (M+H). 제조예 4A의 이성질체 1인 것으로 확인되었다. ES/MS (m/z): 275.1 (M+H).
제조예 1과 본질적으로 유사하게 하기의 화합물들을 제조한다.
Figure pct00016
제조예 10
tert -부틸 5-아세틸-2,3- 디히드로 -1H-인돌-1- 카르복실레이트의 합성
톨루엔 (12 mL) 중 1-인돌린-5-일에탄온 (1.00 g, 6.02 mmol)의 100℃ 용액을 톨루엔 (12 mL) 중 디-tert-부틸 디카르보네이트 (1.97 g, 9.03 mmol)의 용액으로 한 방울씩 20분에 걸쳐 처리한다. 30분 동안 혼합물의 가열을 계속한다. 반응 혼합물을 농축한다. 헥산 중 15-35% (1:1 EtOAc:DCM)를 사용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 백색의 고체로서 표제 화합물 (1.52 g, 97%)을 산출한다. ES/MS (m/z): 262.0 (M+H).
제조예 11
tert -부틸 5-[ 메톡시(메틸)카르바모일 ]-2,3- 디히드로 -1H-인돌-1- 카르복실레이트의 합성
DMF (200 mL) 중 1-(tert-부톡시카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-카르복실산 (14.0 g, 53.2 mmol)과 N,N-디이소프로필에틸아민 (28.0 mL, 161 mmol)의 용액을 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄-3-옥시드 헥사플루오로포스페이트 (23.3 g, 61.1 mmol)로 처리한다. 생성 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반한다. N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (7.26 g, 74.4 mmol)를 첨가한다. 생성 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 포화 수성 소듐 비카르보네이트로 세척한다. 유기 층을 단리하고, EtOAc를 사용하여 수성 층을 2회 추출한다. 합쳐진 유기 층을 물로 2회 세척하고, 포화 수성 소듐 클로라이드를 첨가함으로써, 상 분리를 돕는다. 무수 소듐 술페이트상에서 유기 층을 건조하고, 여과한 후, 여과액을 농축한다. 헥산 중 10-32% 아세톤을 사용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 투명한 무색의 진한 오일로서의 표제 화합물을 정량 수율로 산출한다. ES/MS (m/z): 307.0 (M+H).
제조예 12
tert -부틸 5- 프로파노일 -2,3- 디히드로 -1H-인돌-1- 카르복실레이트의 합성
THF (311 mL, 무수) 중 tert-부틸 5-[메톡시(메틸)카르바모일]-2,3-디히드로-1H-인돌-1-카르복실레이트 (제조예 11) (14.3 g, 46.7 mmol)의 용액을 0℃로 냉각한다. 에틸마그네슘 브로마이드 (디에틸에테르 중 3M, 39.0 mL, 117 mmol)를 25분에 걸쳐 적가한다. 0℃에서 1.5시간 동안 교반한 후, 포화 수성 암모늄 클로라이드 용액을 사용하여 반응 혼합물을 조심스럽게 급랭한다. EtOAc를 사용하여 3회 추출한다. 무수 소듐 술페이트상에서 합쳐진 유기 층을 건조하고, 여과한 후, 여과액을 농축한다. 헥산 중 15-30% (1:1 EtOAc:DCM)를 사용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 백색의 고체로서 표제 화합물 (11.7 g, 91%)을 산출한다. ES/MS (m/z): 276.0 (M+1).
70℃에서의 가열이 반응 속도를 증가시키는 제조예 14를 제외하고는 제조예 2와 본질적으로 유사하게 하기의 화합물들을 제조한다.
Figure pct00017
제조예 3과 본질적으로 유사하게 하기의 화합물들을 제조한다.
Figure pct00018
제조예 17A 및 B
이성질체 1인 tert -부틸 5-[1-아미노프로필]-2,3- 디히드로 -1H-인돌-1- 카르복실레이트와 이성질체 2인 tert -부틸 5-[1-아미노프로필]-2,3- 디히드로 -1H-인돌-1- 카르복실레이트의 분리 (키랄 분리용)
키랄 크로마토그래피에 의해 라세미 tert-부틸 5-[1-아미노프로필]-2,3-디히드로-1H-인돌-1-카르복실레이트 (제조예 16)를 정제함으로써, 제1 용리 거울상이성질체 (이성질체 1)를 산출한다. MS (m/z): 260.0 (M-NH2)+. 정제 조건: 키랄팩® AD, 8×33.5 cm 컬럼; 이동상: 100% MeOH (0.2% N,N-디메틸에틸아민 함유); 유량: 400 mL/분; UVW: 240 nm. 키랄 분석 HPLC (>99% ee, Rt: 9.2 분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6×150 mm; 이동상: 100% MeOH (0.2% N,N-디메틸에틸아민 함유); 유량: 0.6 mL/분; UVW: 280 nm)에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 농축을 확인한다.
상기 정제는 제2 용리 거울상이성질체 (이성질체 2)도 산출한다. ES/MS (m/z): 260.0 (M-NH2)+. 키랄 분석 HPLC (99% ee, Rt: 14.7 분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6×150 mm; 이동상: 100% MeOH (0.2% N,N-디메틸에틸아민 함유); 유량: 0.6 mL/분; UVW: 280 nm)에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 농축을 확인한다.
제조예 18
라세미 tert -부틸 5-{1-[(4- 플루오로벤조일 )아미노]에틸}-2,3- 디히드로 -1H-인돌-1-카르복실레이트의 합성
DCM (57 mL) 중 라세미 tert-부틸 5-[1-아미노에틸]-2,3-디히드로-1H-인돌-1-카르복실레이트 (제조예 15) (3.00 g, 11.4 mmol)의 용액을 N,N-디이소프로필에틸아민 (4.0 mL, 57.2 mmol)으로 처리한다. 4-플루오로벤조일 클로라이드 (1.52 mL, 12.6 mmol)를 첨가하고, 밤새 교반한다. 물을 사용하여 반응 혼합물을 급랭하고, 포화 수성 소듐 비카르보네이트 용액을 첨가한다. 층들을 분리하고, DCM을 사용하여 2회 추출한다. 무수 소듐 술페이트상에서 합쳐진 유기 층을 건조하고, 여과한 후, 여과액을 농축한다. 헥산 중 50-75% (DCM 중 10% 아세톤)를 사용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 옅은 황색의 고체로서 표제 화합물 (4.29 g, 98%)을 산출한다. ES/MS (m/z): 407.0 (M+Na)+, 383.0 (M-H)-.
제조예 18과 본질적으로 유사하게 하기의 화합물을 제조한다.
Figure pct00019
제조예 20
이성질체 A인 tert -부틸 5-[1-{[( 벤질옥시 )카르보닐]아미노}프로필]-2,3- 디히드로 -1H-인돌-1-카르복실레이트의 합성
DCM (47.0 mL) 중 이성질체 2인 tert-부틸 5-[1-아미노프로필]-2,3-디히드로-1H-인돌-1-카르복실레이트 (제조예 17B) (3.25 g, 11.8 mmol)의 용액을 실온에서 N,N-디이소프로필에틸아민 (4.53 mL, 25.9 mmol)로 처리한다. 벤질 클로로포르메이트 (2.12 mL, 14.1 mmol)를 첨가하고, 밤새 교반한다. 반응 혼합물을 추가적인 N,N-디이소프로필에틸아민 (2.06 mL, 11.8 mmol) 및 벤질 클로로포르메이트 (0.707 mL, 4.70 mmol)로 처리한다. 30분 동안 교반한다. 물을 사용하여 반응 혼합물을 급랭하고, 포화 수성 소듐 비카르보네이트 용액을 첨가한다. 층들을 분리하고, DCM을 사용하여 2회 수성 층을 추출한다. 무수 소듐 술페이트상에서 합쳐진 유기 층을 건조하고, 여과한 후, 여과액을 농축한다. 헥산 중 5-35% 아세톤의 구배를 사용하여 용리하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 백색의 발포체로서 표제 화합물 (4.47 g, 93%)을 산출한다. ES/MS (m/z): 433.2 (M+Na)+, 409.0 (M-H)-.
제조예 21
라세미 N-[1-(2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일)에틸]-4- 플루오로벤즈아미드의 합성
DCM (112 mL) 중 라세미 tert-부틸 5-{1-[(4-플루오로벤조일)아미노]에틸}-2,3-디히드로-1H-인돌-1-카르복실레이트 (제조예 18) (4.29 g, 11.2 mmol)의 혼합물에 1,4-디옥산 중 4 M 염산 (27.9 mL, 112 mmol)을 첨가한다. 생성 혼합물을 40℃에서 6시간 동안 가열한다. 2N 수성 NaOH 용액을 사용하여 중화한다. 4:1 CHCl3:IPA를 첨가하여 고무질 고체를 용해시키고, 층을 분리한다. 염수를 사용하여 유기 층을 세척하고, 무수 소듐 술페이트상에서 건조한 후, 여과하고, 여과액을 농축한다. 헥산 중 30-60% (DCM 중 25% 아세톤) 구배를 사용하여 용리하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 약간 오프-화이트 색상인 발포체로서 표제 화합물 (2.48 g, 78%)을 산출한다. ES/MS (m/z): 285.0 (M+H).
제조예 21과 본질적으로 유사하게 하기의 화합물들을 제조한다.
Figure pct00020
제조예 24A 및 B
이성질체 1인 N-[1-(2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일)에틸]-4- 플루오로벤즈아미드와 이성질체 2인 N-[1-(2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일)에틸]-4- 플루오로벤즈아미드의 분리 (키랄 분리용)
키랄 SFC에 의해 라세미 N-[1-(2,3-디히드로-1H-인돌-5-일)에틸]-4-플루오로벤즈아미드 (제조예 21)를 정제함으로써, 제1 용리 거울상이성질체 (이성질체 1)를 산출한다. ES/MS (m/z): 285.0 (M+H). 정제 조건: 키랄팩® AS-H, 5×15 cm 컬럼; 이동상: CO2 중 15% iPrOH; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 300 g/분; UVW: 250 nm. 키랄 분석 SFC (>99% ee, Rt: 1.47 분; 컬럼: 키랄팩® AS-H, 4.6×150 mm; 이동상: CO2 중 25% iPrOH; 유량: 5 mL/분; UVW: 300 nm)에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 농축을 확인한다.
상기 정제는 제2 용리 거울상이성질체 (이성질체 2)도 산출한다. ES/MS (m/z): 285.0 (M+H). 키랄 분석 SFC (98.5% ee, Rt: 2.08 분; 컬럼: 키랄팩® AS-H, 4.6×150 mm; 이동상: CO2 중 25% iPrOH; 유량: 5 mL/분; UVW 300 nm)에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 농축을 확인한다.
제조예 25
이성질체 A인 {5-[1-아미노프로필]-2,3- 디히드로 -1H-인돌-1-일}( 테트라히드로 -2H-피란-4-일)메타논의 합성
파르® 진탕기 병에서, EtOH (35 mL) 중 20% 탄소상 팔라듐 히드록시드 (2.12 g)의 질소 퍼징된 현탁액에 EtOH (35 mL) 중 이성질체 A인 벤질 {1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]프로필}카르바메이트 (제조예 9) (2.12 g, 5.02 mmol)의 용액을 첨가한다. 밀봉하고, 질소로 퍼징한 다음, 수소로 퍼징한다. 414 kPa (60 psi)의 수소 분위기하에서 실온으로 3.6시간 동안 진탕한다. 규조토를 통하여 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축함으로써, 회색을 띤 백색의 고체로서 표제 화합물 (1.36 g, 94%)을 산출한다. ES/MS (m/z): 289.2 (M+H), 272.0 (M-NH2)+.
제조예 26
메틸 2- 메틸 -2-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일카르보닐 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일]프로파노에이트의 합성
질소하에 톨루엔 (25 mL) 중 디시클로헥실아민 (1.9 mL, 9.6 mmol)의 교반되는 0℃ 용액에 n-부틸리튬 (3.6 mL, 8.9 mmol, 헥산 중 2.2 M)을 첨가하고, 20분 동안 교반한다. 미리 제조된 상기 혼합물에 톨루엔 (5 mL) 중 메틸 이소부티레이트 (0.83 g, 8.2 mmol)의 용액을 적가하고, 0℃에서 30분 동안 교반한다. [5-브로모-2,3-디히드로-1H-인돌-1-일](테트라히드로-2H-피란-4-일)메타논 (제조예 8) (2.3 g, 7.4 mmol)을 첨가하고, 질소를 사용하여 생성 혼합물을 탈기한다. 디-μ-브로모비스(트리-t-부틸포스파인)디팔라듐(I) (50 mg, 0.06 mmol)을 첨가하고, 생성 혼합물을 질소하에서 실온으로 가온시킨다. 2시간 후, 디-μ-브로모비스(트리-t-부틸포스파인)디팔라듐(I) (50 mg, 0.06 mmol)의 두 번째 부분을 첨가하고, 질소하에서 실온으로 밤새 교반한다. EtOAc 및 수성 1 N HCl 용액을 사용하여 희석하고, 10분 동안 교반한다. 여과하고, EtOAc를 사용하여 고체를 세정한다. 여과액 층을 분리하고, 포화 수성 소듐 비카르보네이트 용액 및 염수를 사용하여 유기 층을 세척한다. 무수 소듐 술페이트상에서 유기 층을 건조하고, 여과한 후, 여과액을 농축한다. 헥산 중 20-60% EtOAc를 사용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 백색의 고체로서 표제 화합물 (2.3 g, 94% 수율, 89% 순도)을 산출한다. ES/MS (m/z): 332.2 (M+H).
제조예 27
2- 메틸 -2-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일카르보닐 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일] 프로판산의 합성
메틸 2-메틸-2-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]프로파노에이트 (제조예 26) (2.2 g, 6.6 mmol)를 THF (66 mL)에 용해시키고, 포타슘 트리메틸실란올레이트 (1.1 g, 8.6 mmol)를 첨가한다. 실온에서 4일 동안 교반한다. 고체를 여과하고, THF로 세척한다. 고체를 물에 용해시키고, 수성 5 N HCl 용액을 사용하여 산성화한다. 냉장고에서 30분 동안 냉각한다. 여과함으로써, 백색의 고체로서 표제 화합물 (1.20 g, 57%)을 수집한다. ES/MS (m/z): 318.0 (M+H).
제조예 28
2- 메틸 -2-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일카르보닐 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일] 프 로판아미드의 합성
DCM (6.4 mL) 중 2-메틸-2-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]프로판산 (제조예 27) (202 mg, 0.636 mmol)의 교반 용액에 1,1'-카르보닐디이미다졸 (126 mg, 0.763 mmol)을 첨가하고, 질소하에 실온에서 45분 동안 교반한다. 암모늄 히드록시드 (1 mL, 9.55 mmol, 수중 25% w/v)를 첨가하고, 질소하에 실온에서 90분 동안 교반한다. 가용성을 돕기 위하여 DMF (3 mL)를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 교반을 계속한다. DCM 중 0-10% EtOH를 사용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 농축 및 정제함으로써, 백색의 고체로서 표제 화합물 (180 mg, 89%)을 수득한다. ES/MS (m/z): 317.0 (M+H).
제조예 29
[5-(1-아미노-1- 메틸에틸 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-1-일]( 테트라히드로피란 -4-일)메타논의 합성
ACN (0.25 mL) 중 2-메틸-2-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]프로판아미드 (제조예 28) (81 mg, 0.26 mmol) 및 물 (0.25 mL)의 교반 혼합물에 [비스(트리플루오로아세톡시)아이오도]벤젠 (115 mg, 0.26 mmol)을 첨가하고, 질소하에 실온에서 밤새 교반한다. 농축함으로써, 옅은 분홍색의 고체로서 표제 화합물 (140 mg, 94%, 50% 순수 물질)을 수득한다. ES/MS (m/z): 289.2 (M+H), 272.0 (M-NH2)+.
제조예 30
메틸 4- 플루오로 -2-[(2- 히드록시에틸 )아미노] 벤조에이트의 합성
메틸-2-아미노-4-플루오로벤조에이트 (2.81 g, 15.9 mmol)와 2-아이오도에탄올 (0.879 mL, 11.2 mmol)의 혼합물을 90℃로 6시간 동안 가열한 다음, 실온으로 냉각한다. 순수한 상기 혼합물을 EtOAc에 용해시키고, 수성 1 N NaOH 용액으로 3회 세척한 후, 염수로 세척한다. 무수 마그네슘 술페이트상에서 유기 층을 건조하고, 여과한 후, 여과액을 농축함으로써, 2.94 g의 옅은 갈색 오일을 수득한다. 2-아이오도에탄올 (1.26 mL, 15.9 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 100℃에서 밤새 가열한다. 추가적인 2-아이오도에탄올 (0.314 mL, 3.99 mmol)을 첨가하고, 100℃에서 2시간 동안 가열을 계속한다. 실온으로 냉각한다. 순수한 혼합물을 EtOAc에 용해시키고, 수성 1 N NaOH 용액으로 3회 세척한 후, 염수로 세척한다. 무수 마그네슘 술페이트상에서 유기 층을 건조하고, 여과한 후, 여과액을 농축함으로써, 2.50 g의 갈색 고체를 수득한다. 헥산 중 20-40% EtOAc를 사용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 백색의 고체로서 표제 화합물 (1.12 g, 33%)을 산출한다. ES/MS (m/z): 214.0 (M+H).
제조예 31
4- 플루오로 -2-[(2- 히드록시에틸 )아미노]벤조산의 합성
1,4-디옥산 (2.4 mL) 중 메틸 4-플루오로-2-[(2-히드록시에틸)아미노]벤조에이트 (제조예 30) (104 mg, 0.488 mmol)의 교반 용액에 소듐 히드록시드 (0.49 mL, 2.4 mmol, 수중 5 M)를 첨가한다. 실온에서 30분 동안 캡핑하여 교반한 다음, 70℃로 2시간 동안 가열한다. 농축한 후, 수성 1 N HCl을 사용하여 대략 pH 1-2로 산성화하고, DCM으로 2회 추출한다. 무수 마그네슘 술페이트상에서 합쳐진 유기 층을 건조하고, 여과한 후, 여과액을 농축함으로써, 황갈색의 고체로서 표제 화합물 (89 mg, 92%)을 수득한다. ES/MS (m/z): 200.0 (M+H).
참조 제조예 1
1-(2,4- 디플루오로페닐 )-3-(2,3- 디히드로 -1H-인돌-5- 일메틸 ) 우레아의 합성
DCM (100 mL) 중 tert-부틸 5-(아미노메틸)인돌린-1-카르복실레이트 (4.1 g, 17 mmol) 및 2,4-디플루오로-1-이소시아네이토벤젠 (3 mL, 24 mmol)의 혼합물을 1시간 동안 교반한다. MeOH 및 물을 사용하여 반응을 급랭하고, 농축한다. 잔류물을 DCM (30 mL)에 용해시키고, TFA (15 mL)를 첨가한 후, 실온에서 2시간 동안 방치시킨다. 농축하고, 포화 수성 소듐 비카르보네이트를 첨가한다. MeOH/DCM (1/5, v/v)을 사용하여 혼합물을 추출한다. 무수 마그네슘 술페이트상에서 유기 층을 건조하고, 여과한 후, 여과액을 농축한다. EtOH로부터 재결정화함으로써, 2개의 수확물을 산출한다. 수확물들을 합쳐 표제 화합물 (3.5 g, 68%)을 산출한다. ES/MS (m/z): 304.0 (M+H).
참조 제조예 2
1-(2,4- 디플루오로페닐 )-3-{[1-(3,4,5- 트리브로모벤조일 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일]메틸}우레아의 합성
DMF (2 mL) 중 1-(2,4-디플루오로페닐)-3-(2,3-디히드로-1H-인돌-5-일메틸)우레아 (참조 제조예 1) (70 mg, 0.23 mmol), 3,4,5-트리브로모벤조산 (170 mg, 0.24 mmol) 및 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트 (134 mg, 0.35 mmol)의 용액을 탈기한다 (N2). TEA (0.08 mL, 0.6 mmol)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반한다. 역상 정제 (컬럼: 레디세프 Rf 골드 고성능 C18 역상 컬럼; 용리액: A: 5% MeOH를 포함하는 수중 10 mM 암모늄 비카르보네이트 (pH 10), B: ACN; 구배: 5분 동안의 40% B 이후 15분에 걸친 40-95% B; 유량 60 mL/분, UVW 219/254 nM)에 의해 반응 혼합물을 바로 정제한 후, 동결건조에 의해 생성물을 단리함으로써, 표제 화합물 (149 mg, 54%)을 산출한다. ES/MS (m/z, 79Br/81Br): 644.0/646.0 (M+H).
실시예 1
라세미 4- 플루오로 -N-{1-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일카르보닐 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드
Figure pct00021
DCM (15 mL) 중에서 라세미 [5-(1-아미노에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-1-일](테트라히드로-2H-피란-4-일)메타논 (제조예 3) (420 mg, 1.53 mmol) 및 4-플루오로벤조산 (257 mg. 1.84 mmol)을 합친다. 교반 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (534 μL, 3.06 mmol) 및 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄-3-옥시드 헥사플루오로포스페이트 (890 mg, 2.30 mmol)를 첨가한다. 생성 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한다. 용매를 증발시키고, 역상 컬럼 크로마토그래피 (레디세프 Rf 골드 고성능 C18 역상 컬럼, 10 mM 수성 암모늄 비카르보네이트 중 25-100% ACN)에 의해 정제함으로써, 표제 화합물 (372 mg, 61%)을 산출한다. ES/MS (m/z): 397.2 (M+H). 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.73 (d, J=8 Hz, 1H), 7.98 (d, J=8 Hz, 1H), 7.93-7.89 (m, 2H), 7.28-7.23 (m, 2H), 7.22 (s, 1H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1H), 5.07 (오중선(quin), J=8 Hz, 1H), 4.14 (t, J=8 Hz, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.36 (m, 2H), 3.09 (t, J=8 Hz, 2H), 2.80 (m, 1H), 1.57-1.66 (m, 4H), 1.41 (d, J=7 Hz, 3H).
실시예 1A
4- 플루오로 -N-{(1R)-1-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일카르보닐 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드
합성 방법 1:
Figure pct00022
키랄 SFC에 의해 라세미 4-플루오로-N-{1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드 (실시예 1)를 정제함으로써, 제1 용리 거울상이성질체를 표제 화합물로서 산출한다. ES/MS (m/z): 397.0 (M+H). 정제 조건: 키랄팩® AD-H, 21×150 mm; 이동상: CO2 중 40% MeOH; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 70 g/분; UVW: 225 nm. 키랄 분석 SFC (>99% ee, Rt: 1.72 분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6×150 mm; 이동상: CO2 중 40% MeOH; 유량: 5 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 농축을 확인한다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.73 (d, J=8 Hz, 1H), 7.98 (d, J=8 Hz, 1H), 7.93-7.89 (m, 2H), 7.28-7.23 (m, 2H), 7.22 (s, 1H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1H), 5.07 (오중선, J=8 Hz, 1H), 4.14 (t, J=8 Hz, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.36 (m, 2H), 3.09 (t, J=8 Hz, 2H), 2.80 (m, 1H), 1.57-1.66 (m, 4H), 1.41 (d, J=7 Hz, 3H).
합성 방법 2:
DCM (176 mL) 중 이성질체 1인 [5-(1-아미노에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-1-일](테트라히드로-2H-피란-4-일)메타논 (제조예 4A) (9.65 g, 35.2 mmol)의 용액에 0℃에서 TEA (9.8 mL, 70.3 mmol)를 첨가한 다음, 4-플루오로벤조일 클로라이드 (5.85 g, 36.9 mmol)를 첨가한다. 생성 혼합물을 실온으로 가온시키고, 밤새 교반한다. EtOAc (300 mL)를 사용하여 반응 혼합물을 희석하고, 실리카 겔 패드를 통하여 여과한 후, EtOAc로 세척한다. 여과액을 농축하고, DCM 중 구배 25-30%의 ACN을 사용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 오프-화이트 색상의 고체로서 표제 화합물 (9.4 g, 67.1%)을 산출한다. MS (m/z): 397.2 (M+H). 키랄 분석 SFC (>99% ee, Rt: 1.74분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6×150 mm; 이동상: CO2 중 40% MeOH; 유량: 5 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 거울상이성질체 농축을 확인한다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.73 (d, J=8 Hz, 1H), 7.98 (d, J=8 Hz, 1H), 7.93-7.89 (m, 2H), 7.28-7.23 (m, 2H), 7.22 (s, 1H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1H), 5.07 (오중선, J=8 Hz, 1H), 4.14 (t, J=8 Hz, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.36 (m, 2H), 3.09 (t, J=8 Hz, 2H), 2.80 (m, 1H), 1.57-1.66 (m, 4H), 1.41 (d, J=7 Hz, 3H).
합성 방법 3:
DCM (700 mL) 중 이성질체 1인 [5-(1-아미노에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-1-일](테트라히드로-2H-피란-4-일)메타논 히드로클로라이드 (제조예 7B) (70 g, 225 mmol)의 혼합물에 0-5℃에서 TEA (65 mL, 468 mmol)를 첨가한다. 4-플루오로벤조일 클로라이드 (37.85 g, 239 mmol)를 적가한다. 혼합물을 실온으로 가온하고, 2시간 동안 교반한다. 30℃ 미만으로 온도를 유지하는 속도로 물을 적가하고, 20-30℃에서 1시간 동안 혼합물을 교반한다. 층을 분리하고, 18% 수성 H2SO4를 사용하여 유기 층을 세척한다. 층을 분리하고, 7% 수성 NaHCO3를 사용하여 유기 층을 세척한다. 층을 분리하고, 물을 사용하여 유기 층을 세척한다. 층을 분리한 다음, 유기 용액을 탄소 필터로 통과시킨다. SI-티올 (7 g)을 사용하여 용액을 처리하고, 혼합물을 40℃로 가열한다. 생성 혼합물을 12시간 동안 교반한다. 혼합물을 실온으로 냉각하고, 규조토를 통하여 혼합물을 여과한다. 유기 층을 200 mL (~3 부피)로 농축한다. 아세톤 (140 mL, 2 부피)을 첨가하고, 생성 혼합물을 200 mL (~3 부피)로 농축한다. 추가적인 아세톤 (280 mL, 4 부피) 및 물 (280 mL, 4 부피)로 처리한다. 반응액이 투명 용액이 될 때까지 65℃로 2시간 동안 가열한다. 3시간에 걸쳐 천천히 30℃로 냉각한다. 30℃에서 1시간 동안 교반한다. 물 (140 mL, 2 부피)을 적가하고, 30℃에서 1시간 동안 교반을 계속한다. 대략 2시간에 걸쳐 천천히 3-8℃로 냉각한다. 이와 같은 온도에서 6시간 동안 교반한다. 여과하고, 물 (140 mL, 2 부피)을 사용하여 고체를 세정한다. 55℃에서 4 내지 6시간 동안 고체를 건조한다. 백색의 고체로서 원하는 생성물을 수득한다 (55 g, 61.6%).
실시예 1A에 대한 X선 분말 회절 수집 절차
CuKa 공급원 (λ = 1.54060 Å) 및 반텍(Vantec) 검출기가 장착되어 있으며, 35 kV 및 50 mA에서 가동되는 브루커(Bruker) D4 엔데버(Endeavor) X선 분말 회절측정기에서 결정질 고체의 XRD 패턴을 수득한다. 2θ 중 0.0087°의 단계 크기 및 0.5 초/단계의 스캔 속도, 및 0.6 mm의 디버전스(divergence), 5.28 mm의 고정 안티-스캐터(anti-scatter) 및 9.5 mm의 검출기 슬릿을 사용하여, 2θ 중 4 내지 40° 사이에서 샘플을 스캔한다. 건조 분말을 석영 샘플 홀더에 충진하고, 유리 슬라이드를 사용하여 평활 표면을 수득한다. 주변 온도 및 상대 습도에서 결정 형태 회절 패턴을 수집한다.
1A 방법 3에 대한 X선 분말 회절 수집 절차
CuKa 방사선을 사용한 XRD 패턴에 의해 하기 표 1에 기술되어 있는 바와 같은 회절 피크들 (2-세타 값들)을 가지는 것으로 실시예 1A (합성 방법 3)의 제조 샘플을 특성화한다. 구체적으로, 상기 패턴은 0.2 도의 회절 각도 공차로 (2θ±0.2°) 12.51°, 15.65°, 16.37°, 17.56°, 21.48° 및 25.23°로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 조합된 17.38°에 피크를 포함한다.
표 1. 실시예 1A 방법 3의 X선 분말 회절 피크
Figure pct00023
실시예 1A의 절대 배열구조의 측정
1:1 EtOH/헵탄 (1.75 mL)에 10 mg의 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드를 현탁시킨 후 궤도 진탕기에서 3일 동안 슬러리화함으로써, 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드의 단일 결정을 제조한다. X선 결정학 분석에는, 대략적인 치수가 0.020 mm×0.080 mm×0.300 mm인 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드의 무색 칼날-유형 시편을 사용한다. Iμ CuKα 방사선 공급원 (λ = 1.54178 Å), 및 포톤(Photon) 100 SL 면적 검출기가 장착된 브루커 D8 벤투레(Venture) 기반 3-원 각도계 회절측정기를 사용하여 X선 강도 데이터를 측정한다. 총 8840개의 프레임을 수집한다. 협소-프레임 알고리즘(narrow-frame algorithm)을 사용하여 프레임들을 브루커 세인트(SAINT) 소프트웨어 패키지와 통합한다. 모노클리닉(monoclinic) 단위 셀을 사용한 데이터의 통합은 최대 θ 각도 68.28° (0.83 Å의 해상도)까지의 총 7242개 반사를 산출하였는데, 그 중 3059개는 독립성이었으며 (평균 중복도(redundancy) 2.367, 완전도 (completeness) = 95.9%, 린트(Rint) = 5.83%, Rsig = 6.58%), 2893개 (94.57%)는 2σ(F2)를 초과하였다. a = 5.5831(13) Å, b = 5.1082(9) Å, c = 35.013(6) Å, β = 90.578(17) °, 부피 = 998.5(3) Å3의 최종 셀 상수는 10.09°< 2θ < 136.8°인 20 σ(I)를 상회하는 6280개 반사의 XYZ-센트로이드(centroid)의 정제를 기반으로 한다. 다중-스캔법 (SADABS)을 사용하여 흡수 효과에 대한 데이터를 보정한다. 최소 대 최대 겉보기 투과도의 비는 0.784이다. 계산된 최소 및 최대 투과 계수 (결정 크기 기준)은 0.8020 및 0.9850이다. 화학식 단위 C23H25FN2O3에 대하여 Z=2와 함께 공간 군 P 21을 사용하는 브루커 SHELXTL 소프트웨어 패키지를 사용하여 구조를 해상하고 정제한다. 264개의 변수를 사용한 F2에서의 최종 비등방성 풀-매트릭스 최소-자승 정제는 관찰된 데이터의 경우 R1 = 9.17%에, 전체 데이터의 경우 wR2 = 23.48%에 수렴한다. 적합도(goodness-of-fit)는 1.141이다. 최종 시차 전자 밀도 합성에서의 최대 피크는 0.506 e-/Å3이며, 최대 홀은 -0.358 e-/Å3이고, RMS 편차는 0.088 e-/Å3이다. 최종 모델 기준으로, 계산된 밀도는 1.319 g/cm3 및 F(000), 420 e-이다. 절대 구조 파라미터는 0.12(16)으로 정제됨으로써, 키랄 중심의 입체화학을 입증하고 있다. 절대 구조는 입체중심에서 R-배열구조인 것으로 측정된다.
실시예 1B
이성질체 2인 4- 플루오로 -N-{(1S)-1-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일카르보닐 )-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드
Figure pct00024
키랄 크로마토그래피에 의해 라세미 4-플루오로-N-{1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드 (실시예 1)를 정제함으로써, 표제 화합물로서 제2 용리 거울상이성질체를 산출한다. ES/MS (m/z): 397.0 (M+H). 정제 조건: 컬럼: 키랄팩® AD-H, 21×150 mm; 이동상: CO2 중 40% MeOH; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 70 g/분; UVW: 225 nm. 키랄 분석 SFC (98.3% ee, Rt: 2.37 분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6×150 mm; 이동상: CO2 중 40% MeOH; 유량: 5 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 농축을 확인한다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.73 (d, J=8 Hz, 1H), 7.98 (d, J=8 Hz, 1H), 7.93-7.89 (m, 2H), 7.28-7.23 (m, 2H), 7.22 (s, 1H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1H), 5.07 (오중선, J=8 Hz, 1H), 4.14 (t, J=8 Hz, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.36 (m, 2H), 3.09 (t, J=8 Hz, 2H), 2.80 (m, 1H), 1.57-1.66 (m, 4H), 1.41 (d, J=7 Hz, 3H).
제조예 3으로부터의 출발 물질을 사용하여 실시예 1과 본질적으로 유사하게 실시예 2를 제조한다.
Figure pct00025
실시예 2A 및 2B
이성질체 1인 4- 클로로 -N-{1-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일카르보닐 )-2,3- 디히드 로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드, 및 이성질체 2인 4- 클로로 -N-{1-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드
Figure pct00026
키랄 SFC에 의해 라세미 4-클로로-N-{1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드 (실시예 2)를 정제함으로써, 제1 용리 거울상이성질체 (이성질체 1)를 산출한다. ES/MS (m/z): 413.0 (M+H). 정제 조건: 키랄팩® AD-H, 21×150 mm; 이동상: CO2 중 40% iPrOH; 유량: 70 g/분; UVW: 260 nm. 키랄 분석 SFC (>99% ee, Rt=1.97 분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6×150 mm; 이동상: CO2 중 40% iPrOH; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 농축을 확인한다.
상기 정제는 제2 용리 거울상이성질체 (이성질체 2)도 산출한다. ES/MS (m/z): 413.0 (M+H). 키랄 분석 SFC (>99% ee, Rt: 3.04 분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6×150 mm; 이동상: CO2 중 40% iPrOH; 유량: 5 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 농축을 확인한다.
제조예 3으로부터의 출발 물질을 사용하여 실시예 1과 본질적으로 유사하게 실시예 3 내지 실시예 9를 제조한다.
Figure pct00027
실시예 9A 및 B
이성질체 1인 2,4- 디플루오로 -N-{1-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일카르보닐 )-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드, 및 이성질체 2인 2,4- 디플루오로 -N-{1-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드
Figure pct00028
키랄 SFC에 의해 라세미 2,4-디플루오로-N-{1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드 (실시예 9)를 정제함으로써, 제1 용리 거울상이성질체 (이성질체 1)를 산출한다. ES/MS (m/z): 415.0 (M+H). 정제 조건: 키랄팩® AD-H, 21×150 mm; 이동상: CO2 중 40% MeOH; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 70 g/분; UVW: 225 nm. 키랄 분석 (98.6% ee, Rt: 1.72 분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6×150 mm; 이동상: CO2 중 40% MeOH; 유량: 5 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 농축을 확인한다.
상기 정제는 제2 용리물 (이성질체 2)도 산출한다. ES/MS (m/z): 415.2 (M+H). 키랄 분석 SFC (98.5% ee, Rt: 2.60 분; 컬럼: 키랄팩® AD-H, 4.6×150 mm; 이동상: CO2 중 40% MeOH; 유량: 5 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 농축을 확인한다.
제조예 7로부터의 출발 물질을 사용하여 실시예 1과 본질적으로 유사하게 실시예 10 내지 실시예 13을 제조한다.
Figure pct00029
실시예 1A의 합성 방법 2와 본질적으로 유사하게 실시예 14 및 15를 제조한다.
Figure pct00030
실시예 16
부분입체이성질체성 4- 플루오로 -N-[1-{1-[ 테트라히드로 -2H-피란-3- 일카르보닐 ]-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일}에틸]벤즈아미드 (2종 부분입체이성질체의 혼합물)
Figure pct00031
DCM (5.28 mL) 중 이성질체 1인 N-[1-(2,3-디히드로-1H-인돌-5-일)에틸]-4-플루오로벤즈아미드 (제조예 24A) (150 mg, 0.528 mmol), 라세미 테트라히드로피란-3-카르복실산 (100 mg. 0.739 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.277 mL, 1.58 mmol)의 혼합물을 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄-3-옥시드 헥사플루오로포스페이트 (304 mg, 0.791 mmol)로 처리한다. 실온에서 45분 동안 교반한다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석한다. 물 및 포화 수성 소듐 비카르보네이트 용액을 첨가한다. 층을 분리하고, DCM을 사용하여 2회 수성 층을 추출한다. 합쳐진 유기 층을 소수성 프릿 (이솔루트(ISOLUTE)® 상 분리제 카트리지)으로 통과시키고, 여과액을 농축한다. 헥산 중 20-55% 아세톤의 구배로 용리하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 백색의 고체로서 표제 화합물 (184 mg, 88%)을 산출한다. ES/MS (m/z): 397.2 (M+H).
실시예 16A 및 B
이성질체 1인 4- 플루오로 -N-[1-{1-[ 테트라히드로 -2H-피란-3- 일카르보닐 ]-2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일}에틸]벤즈아미드, 및 이성질체 2인 4- 플루오로 -N-[1-{1-[ 테트라히드로 -2H-피란-3-일카르보닐]-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일}에틸]벤즈아미드
Figure pct00032
키랄 크로마토그래피에 의해 부분입체이성질체성 4-플루오로-N-[1-{1-[테트라히드로-2H-피란-3-일카르보닐]-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일}에틸]벤즈아미드 (실시예 16)를 정제함으로써, 제1 용리 부분입체이성질체 (이성질체 1)를 산출한다. MS (m/z): 397.2 (M+H). 정제 조건: 키랄셀(CHIRALCEL)® OJ-H, 30×250 mm; 이동상: 100% MeOH; 유량: 30 mL/분; UVW: 225 nm. 키랄 분석 HPLC (>99% de, Rt: 3.42분; 컬럼: 키랄셀® OJ-H, 4.6×150 mm; 이동상: 100% MeOH (0.2% 이소프로필아민 함유); 유량: 1 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 농축을 확인한다.
상기 정제는 제2 용리물 (이성질체 2)도 산출한다. ES/MS (m/z): 397.2 (M+H). 키랄 분석 HPLC (97.8% de, Rt: 4.66 분; 컬럼 키랄셀® OJ-H, 4.6×150 mm; 이동상: 100% MeOH (0.2% 이소프로필아민 함유); 유량: 1 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 농축을 확인한다.
실시예 17
이성질체 A인 4- 플루오로 -2-히드록시-N-{1-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일카르보닐 )-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드
Figure pct00033
에탄올 (2 mL) 중 이성질체 A인 2-(벤질옥시)-4-플루오로-N-{1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드 (실시예 12) (96.0 mg, 0.19 mmol)의 질소 플러싱되는 용액에 10% Pd/C (10 mg)을 첨가하고, 1 atm (101 kPa)의 수소를 사용하여 실온에서 1시간 동안 수소화한다. 규조토상에서 여과하고, 여과액을 농축함으로써, 백색의 고체로서 목적 화합물 (66 mg, 84%)을 산출한다. ES/MS (m/z): 413.0 (M+H).
실시예 18
라세미 4- 플루오로 -N-{1-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일카르보닐 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일]프로필}벤즈아미드
Figure pct00034
DCM (6.5 mL) 중 라세미 N-[1-(2,3-디히드로-1H-인돌-5-일)프로필]-4-플루오로벤즈아미드 (제조예 22) (200 mg, 0.650 mmol)의 혼합물을 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.228 mL, 1.30 mmol)으로 처리한다. 테트라히드로피란-4-카르보닐 클로라이드 (110 mg, 0.715 mmol)를 첨가하고, 30분 동안 교반한다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석한다. 물 및 포화 수성 소듐 비카르보네이트 용액을 첨가한다. 층을 분리하고, DCM을 사용하여 2회 수성 층을 추출한다. 합쳐진 유기 층을 소수성 프릿 (이솔루트® 상 분리제 카트리지)으로 통과시키고, 여과액을 농축한다. 헥산 중 20-60% 아세톤의 구배로 용리하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 옅은 복숭아-색상의 발포체 (244 mg, 91%)로서 표제 화합물을 산출한다. ES/MS (m/z): 411.2 (M+H).
실시예 18A 및 B
이성질체 1인 4- 플루오로 -N-{1-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일카르보닐 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일]프로필}벤즈아미드 및 이성질체 2인 4- 플루오로 -N-{1-[1-( 테트라히드로 -2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]프로필}벤즈아미드
Figure pct00035
키랄 SFC 크로마토그래피에 의해 라세미 4-플루오로-N-{1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]프로필}벤즈아미드 (실시예 18)를 정제함으로써, 제1 용리 거울상이성질체 (이성질체 1)를 산출한다. ES/MS (m/z): 411.2 (M+H). 정제 조건: 키랄팩® AS-H, 21×150 mm 컬럼; 이동상: CO2 중 25% MeOH; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 80 g/분; UVW: 260 nm. 키랄 분석 SFC (>99% ee, Rt: 0.92 분; 컬럼: 키랄팩® AS-H, 4.6×150 mm; 이동상: CO2 중 25% MeOH; 유량: 5 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 농축을 확인한다.
상기 정제는 제2 용리 거울상이성질체 (이성질체 2)도 산출한다. ES/MS (m/z): 411.2 (M+H). 키랄 분석 SFC (>99% ee, Rt: 1.53 분; 컬럼: 키랄팩® AS-H, 4.6×150 mm; 이동상: CO2 중 25% MeOH; 유량: 5 mL/분; UVW: 225 nm)에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 농축을 확인한다.
참조 실시예 1
1-(2,4- 디플루오로페닐 )-3-{[1-(3,4,5- 트리트리티오벤조일 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일]메틸}우레아
Figure pct00036
삼중수소화 플라스크에서, 3Ci의 삼중수소하에 3시간 동안 DMF (1 mL) 중 1-(2,4-디플루오로페닐)-3-{[1-(3,4,5-트리브로모벤조일)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]메틸}우레아 (3 mg, 0.005 mmol), 팔라듐 (탄소상 10%, 3 mg) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10 μL, 0.06 mmol)을 교반한다. 반응액을 여과하고, 여과액을 EtOH와 함께 공동-증발시킴으로써, 불안정한 삼중수소를 제거한다. 잔류물을 EtOH에 용해시키고, 역상 컬럼 크로마토그래피 (컬럼: 제미니(GEMINI)® C18 250×10 mm; 이동상: A: 물/TFA (1000:1), B: ACN/TFA (1000:1); 구배: 60분에 걸쳐 20-70% B; 유량 3 mL/분)에 의해 정제함으로써, EtOH에 용해된 표제 화합물을 산출한다. MS: 414.19 (M+H) 및 74 Ci/mmol.
참조 실시예 2
1-(2,4- 디플루오로페닐 )-3-{[1-( 페닐카르보닐 )-2,3- 디히드로 -1H-인돌-5-일] 메틸 } 우레아
Figure pct00037
DCM (20 mL)에 1-(2,4-디플루오로페닐)-3-(2,3-디히드로-1H-인돌-5-일메틸)우레아 (300 mg, 0.99 mmol)를 용해시키고, 벤조일 클로라이드 (0.13 mL, 1.1 mmol) 및 TEA (0.27 mL, 1.9 mmol)를 첨가한다. 실온에서 2시간 동안 반응 혼합물을 교반한다. 역상 정제 (컬럼: 레디세프 Rf 골드 고성능 C18 역상 컬럼; 이동상: A: 수중 0.1% 포름산, B: ACN; 구배: 30분에 걸쳐 0-80% B; 유량: 60 mL/분, UVW: 219/254 nm)에 의해 잔류물을 농축 및 정제하고, 동결건조에 의해 생성물을 단리함으로써, 표제 화합물 (403 mg, 79%)을 산출한다. ES/MS (m/z): 408.2 (M+H).
면역 시스템은 종양 발생을 제약하는 중요한 저지점이다. 따라서, 암은 면역 시스템을 회피하거나, 억제하거나 또는 달리 파괴하는 많은 기작들을 진화시켜 왔다. 트립토판이 암 세포 성장에 절대 필수적이기는 하지만, 다수의 암의 경우에서 암 세포 자체 (내인성), 또는 미세환경 또는 종양 배출 림프절 (TDLN)의 세포 (외인성) 중 어느 하나에 의한 인돌아민 2,3 디옥시제나제 (IDO1)의 발현을 통하여 그의 분해가 선택된다. 빠른 세포 성장에 맞서는 동안의 종양 미세환경에서의 IDO1의 선택적인 활성화는 암 발생 및 요법에 대한 내성의 중요한 저지점인 면역감시를 회피하는 효과적인 전략을 종양에 제공한다. IDO1의 면역억제 활성은, 둘 다 면역억제성인 국소적 트립토판 고갈과 동시적인 키누레닌 생성의 직접적인 결과이다.
세포 억제 [T-세포 (문헌 [Frumento, et al. (2002) J Exp Med 196(4): 459-468]; [Terness, et al. (2002) J Exp Med 196(4): 447-457]) 및 NK 세포 (문헌 [Della Chiesa, et al. (2006) Blood 108(13): 4118-4125])], 세포 발생 [조절 T-세포 (문헌 [Sharma, et al. (2007) J Clin Invest 117(9): 2570-2582]; [Chen, et al. (2008) J Immunol 181(8): 5396-5404]; [Baban, et al. (2009) J Immunol 183(4): 2475-2483])] 및 억제성 항원 제시 세포 [억제성 수지상 세포 및 대식세포 (문헌 [Munn, et al. (2004) J Clin Invest 114(2): 280-290]; [Munn, et al. (2005) Immunity 22(5): 633-642]; [Sharma, et al. (2007) J Clin Invest 117(9): 2570-2582])], 및 동원 및 증식 [골수-유래 억제 세포 (문헌 [Yu, et al. (2014) J Immunol 193(5): 2574-2586]; [Holmgaard, et al. (2015) Cell Rep 13(2): 412-424])]을 포함하여, IDO1 활성의 면역억제 역할은 다수의 세포 유형에 영향을 준다. IDO1 활성은 종양, 종양 미세환경 및 TDLN에서의 트립토판의 고갈 및 동시적인 키누레닌의 증가를 통하여 이러한 효과들을 나타낸다.
종양 미세환경 또는 TDLN에서의 IDO1 발현에 의한 트립토판의 국소적 고갈 및 키누레닌의 생성 둘 다는 모두 종양 성장을 지지하는 면역억제성 역할을 하는 Treg (문헌 [Sharma, et al. (2007) J Clin Invest 117(9): 2570-2582]), MDSC (문헌 [Holmgaard, et al. (2015) Cell Rep 13(2): 412-424]) 및 조절 수지상 세포 (문헌 [Sharma, et al. (2007) J Clin Invest 117(9): 2570-2582])의 발생 및 활성화를 지지한다. 트립토판의 고갈은 비충전 tRNA의 축적에 반응하여 자극되는 스트레스 반응 키나제 GCN2의 활성화를 통하여 Treg 발생을 지지한다. GCN2가 결핍되어 있는 T-세포는, 무력성 표현형의 증식 또는 유도의 IDO1-매개 억제에 감수성이 아니다 (문헌 [Munn, et al. (2005) Immunity 22(5): 633-642]). 트립토판 고갈 이외에도, IDO1 활성은 중요한 면역억제 분자인 하류 대사물 키누레닌의 높은 농도로 이어진다. 트립토판 고갈과 유사하게, 키누레닌에 의한 아릴 탄화수소 수용체 (AHR)의 활성화는 조절 T-세포의 생성에 필수적이며 (문헌 [Mezrich, et al. (2010) J Immunol 185(6): 3190-3198]), 키누레닌 생성 및 AHR 발현의 상승은 인간 뇌암에서의 저조한 예후와 상관된다 (문헌 [Opitz, et al. (2011) Nature 478(7368): 197-203]). 키누레닌은 T-세포 및 NK 세포 증식을 차단하며 (문헌 [Boyland, et al. (1956) Biochem J 64(3): 578-582]), IL-1β, IL-6 및 IL-21과 같은 시토카인의 선천성 면역-매개 생성을 조절하는 전사 인자인 AHR 수용체의 작용제이고 (문헌 [Mezrich, et al. (2010) J Immunol 185(6): 3190-3198]; [Opitz, et al. (2011) Nature 478(7368): 197-203]), 그것이 종양 진행 및 요법에 대한 내성을 촉진한다고 여겨지는 수종의 암에서 과발현된다 (문헌 [Julliard, et al. (2014) Front Immunol 5: 458]). 사실, 암에서의 IDO1의 내인성 발현은 부분적으로 IDO1의 발현을 강제하고 T-세포 증식을 억제하는 AHR-IL-6-STAT3 신호전달 루프의 키누레닌-매개 활성화에 의해 조절된다. 이와 같은 IDO1 신호전달 축의 발현은 폐암 환자에서의 무재발 생존의 감소와 연관된다 (문헌 [Litzenburger, et al. (2014) Oncotarget 5(4): 1038-1051]). 또한, IDO1-매개 IL-6 생성은 전구-종양원성 MDSC의 발생 및 IDO1 감소 IL-6 생성의 붕괴, MDSC 억제 활성의 감쇠, 종양 성장의 지연 및 KRAS-유도 폐암 모델에서의 생존 증가를 지지하는 데에 중요한 역할을 한다 (문헌 [Smith, et al. (2012) Cancer Discov 2(8): 722-735]). 트립토판의 IDO1-의존성 고갈과 AHR의 키누레닌-의존성 활성화 사이의 연결은 어째서 트립토판 이화작용이 암 진행을 제약하는 중요한 저지점인 면역 회피(immune escape)와 밀접하게 연관되는지를 설명하는 근간을 제공한다.
종양 미세환경에서의 IDO1 발현의 조절은 복잡하다. IDO1은 처음으로 발견된 IFN-γ-조절 유전자이었다 (문헌 [Yoshida, et al. (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78(1): 129-132]). 사실, 모든 암 조직학에 있어서 IFN-γ와 IDO1 발현 사이에는 강한 상관관계가 존재한다 (http://cancergenome.nih.gov/). 또한, IDO1 발현은 유형 I 인터페론, TLR 리간드, TNF, IL-1, CTLA-4, CD200, GITR, CD40 및 TGF-β에 의해 상향조절되는데, 이들 모두 면역 시스템, 및 암 발생, 진행 및 요법에 대한 반응에서 중요한 역할을 한다. IDO1 발현, 트립토판 고갈 및/또는 키누레닌의 증가로 측정되는 바와 같은 높은 IDO1 활성은 매우 다양한 종양 유형의 저조한 예후, 감소된 생존율 및 증가된 전이 잠재력과 연관되어 있다. 이에 따라, 유방암, 결장직장암, 두부 및 경부암, 폐암 및 전립선암에서 동시적인 트립토판의 감소를 동반한 혈청 키누레닌 농도의 증가가 입증되어 있다 (문헌 [Liu, et al. (2010) Blood 115(17): 3520-3530]). 또한, IDO1은 흑색종 (문헌 [Weinlich, et al. (2007) Dermatology 214(1): 8-14]), 급성 골수성 백혈병 (문헌 [Chamuleau, et al. (2008) Haematologica 93(12): 1894-1898]; [Corm, et al. (2009) Leuk Res 33(3): 490-494]), 유방암 및 자궁경부암 (문헌 [Inaba, et al. (2010) Gynecol Oncol 117(3): 423-428]; [Yu, et al. (2011) Clin Dev Immunol 2011: 469135]; [Yu, et al. (2013) J Immunol 190(7): 3783-3797]; [Chen, et al. (2014) Breast Cancer Res 16(4): 410): Clin Cancer Res. 2007 Dec 1;13(23):6993-7002]; [Trott, et al. (2016). Oncotarget, 7(41), 66540-66557]), 결장직장암, 신세포 암종, 피부 흑색종, 미만성 대형 B-세포 림프종, 자궁내막암, 위암, 신경교종, 간세포 암종, 호지킨 림프종, 후두 편평 세포 암종, 폐암, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 식도 및 구강 편평 세포 암종, 골육종, 난소암, 췌장관 암종, T-세포 백혈병 및 갑상선 암종을 포함한 수종의 암에서 광범위한 질환 (문헌 [Huang, et al. (2002) Br J Cancer 86(11): 1691-1696]), 저조한 결과 및/또는 표준 화학요법에 대한 내성과 연관되어 있는 암 환자에서 만성적으로 활성화된다 (문헌 [Schrocksnadel, et al. (2006) Clin Chim Acta 364(1-2): 82-90]). IFN-γ는 활성화된 NK 및 T-세포로부터 분비되는 중요한 이펙터(effector) 시토카인이다. 전신적인 것 (CTLA-4) 또는 국소적인 것 (PD-L1/L2) 중 어느 하나로 T-세포 활성을 제약하는 것과 연관되는 음성의 조절 회로는 현재 그것이 T-세포-매개 종양 성장 억제를 강화하는 경우 항암제로서의 용도로 승인되고 있다. CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1과 같은 저지점의 유전적 녹아웃(knockout)은 면역억제성 IFN-γ-대-IDO1 축을 연관시킬 수 있는 IFN-γ 생성의 현저한 강화를 초래한다 (문헌 [Latchman, et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101(29): 10691-10696]; [Pandiyan, et al. (2007) J Immunol 178(4): 2132-2140]). 마우스 흑색종 모델에서의 1-메틸 트립토판을 사용한 내인성 IDO1 발현의 억제는 CTLA-4 차단 항체인 이필리무맙의 효능을 상당히 향상시켰다 (문헌 [Holmgaard, et al. (2013) J Exp Med 210(7): 1389-1402]). 이필리무맙의 이와 같은 강화된 효능은 CD8 이펙터 세포의 증가 및 Treg의 감소와 연관되었다. 이러한 관찰은 IDO1의 억제가 그의 항암 활성을 강화하였던 PD1, PD-L1 및 GITR을 표적으로 하는 다른 항체로 확장되었다. 기계적으로, IDO1은 종양에서의 면역억제성 환경을 창출하는 이후의 MDSC의 동원을 동반한 Treg의 유도를 통하여 이러한 저지점 억제제들의 효능을 방해하는 것으로 나타났다 (문헌 [Holmgaard, et al. (2015) Cell Rep 13(2): 412-424]). 암을 치료하기 위한 면역치료 접근법, 예컨대 IFN-γ 자체, 선천성 면역 활성화제 예컨대 CpG-ODN, 항-4-1BB (CD137), 항-OX40, 항-PD-1/PD-L1/PD-L2, 항-CTLA 4 모두는 임상에서의 그의 장기 효능을 제약하는 IDO1 발현을 활성화하는 잠재력을 가지고 있다. 따라서, IDO1 억제제를 이러한 작용제들과 조합하는 것에는 상당한 치료 잠재력이 있을 수 있다. 구체적으로, 항-PD1 항체 (피딜리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙), 항-PD-L1 항체 (두르발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙), 항-CTLA-4 항체 (이필리무맙), 항-OX40 항체 (MEDI6469, KHK4083) 및 항-4-1BB (CD137) 항체 (PF-05082566)와의 IDO1 억제제의 조합은 광범위한 종양 유형에서 상당한 치료 잠재력을 가진다.
합쳐보면, 이러한 데이터는 IDO1 억제제와 같은 트립토판 고갈 및 동시적인 키누레닌의 생성의 억제제가 치료 미접촉은 물론 치료 내성인 암 환자 모두에 있어서 단일 작용제로서, 또는 다양한 암 유형에서의 조합으로서 유용할 수 있다는 것을 암시하고 있다. 이와 같은 효용은 에파카도스타트 (INCB024360) 및 NLG919와 같은 알려져 있는 IDO1 억제제들에 의해 입증되어 있다. 에파카도스타트는 시험관내 및 생체내 모두에서 IDO1에 결합하여 트립토판의 이화작용 및 이어지는 키누레닌의 생성을 차단하는 것으로 알려져 있다. 또한, 에파카도스타트는 전-임상 마우스 모델인 CT26 및 PAN02에서 T-세포의 존재에 의존성인 효과인 단일 작용제 효능을 입증하고 있다 (문헌 [Yue, et al. (2009) J Med Chem 52(23): 7364-7367]; [Koblish, et al. (2010) Mol Cancer Ther 9(2): 489-498]; [Liu, et al. (2010) Blood 115(17): 3520-3530]; [Jochems, et al. (2016) Oncotarget, Advance Publications]). 에파카도스타트의 전-임상 효능은 인간 임상 시험 결과로 연결되어 있다 (NCT01195311).
하기 검정들의 결과는 본원에서 예시된 화합물들이 IDO1 억제제와 같은 키누레닌 생성 억제제로서 유용하며 암을 치료하는 데에 유용할 수 있다는 증거를 나타내고 있다. 또한, 하기 검정들의 결과는 소정의 예시된 화합물들이 IDO1에 결합한다는 것, 및 모든 예시된 화합물들이 시험관내 및 생체내 모두에서 암 세포에서의 트립토판의 키누레닌으로의 전환을 억제한다는 것을 입증하고 있다.
IDO1에 대한 결합 검정
본 검정의 목적은 시험관 내에서 소정의 예시되는 화합물들이 IDO1에 결합한다는 것을 입증하는 것이다. 구체적으로, 본 검정은 삼중수소화된 스파이 분자 1-(2,4-디플루오로페닐)-3-[[1-(3,4,5-트리트리티오벤조일)인돌린-5-일]메틸]우레아와 경쟁하는 시험 화합물의 능력을 평가함으로써, 결합 친화도 IC50의 계산을 가능하게 한다.
IDO1에 대한 1-(2,4- 디플루오로페닐 )-3-[[1-(3,4,5- 트리트리티오벤조일 ) 인돌린 -5-일]메틸]우레아의 경쟁적 결합
DPBS에 희석된 300 nM His6-IDO1 (프로테로스(Proteros) 사, 스위스프로트(SwissProt)ID P14902, Cat# PR-0278, 배치 19/59, 25 mM MES pH 6.5 중 98 mg/mL, 150 mM KCl, 순도 >95%)을 니켈 코팅된 플레이트 (시그마(Sigma) 사, Cat# S5563)의 각 웰에 적재하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 바이오텍(BIOTEK)® 마이크로플레이트 세척기에서 300 μL DPBS를 사용하여 4회 플레이트를 세척함으로써, 비결합 단백질을 제거한다. 웰 당 100 μL의 차단 완충제 (0.05% 트윈(TWEEN)® 20/DPBS)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써, 비특이적 결합을 감소시킨다. 플레이트를 차단하는 동안, DPBS 중에 희석시킴으로써 50 nM 1-(2,4-디플루오로페닐)-3-[[1-(3,4,5-트리트리티오벤조일)인돌린-5-일]메틸]우레아 (바이오케어(Biocair) 사, Cat# TRQ41455)를 제조하고, 비표지 모용액을 DMSO 중에 2.5-배로 연속 희석함으로써 11 점의 희석 곡선을 생성시킨다. 95 μL의 50 nM 1-(2,4-디플루오로페닐)-3-[[1-(3,4,5-트리트리티오벤조일)인돌린-5-일]메틸]우레아에 5 μL의 연속 희석 비표지 화합물을 첨가하고, 혼합물을 플레이트의 웰에 첨가한 후, 약하게 진탕하면서 실온으로 4시간 동안 인큐베이션한다. 삼중수소화-스파이 분자 (1-(2,4-디플루오로페닐)-3-[[1-(3,4,5-트리트리티오벤조일)인돌린-5-일]메틸]우레아)의 최대 치환을 확인하기 위하여, 과량의 비표지 1-(2,4-디플루오로페닐)-3-{[1-(페닐카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]메틸}우레아 (켐디브(ChemDiv) 사, Cat# G714-0242) 100 μM을 50 nM 1-(2,4-디플루오로페닐)-3-[[1-(3,4,5-트리트리티오벤조일)인돌린-5-일]메틸]우레아에 첨가한 후, 플레이트의 비-특이적 결합 대조 웰에 첨가한다. 4시간의 인큐베이션 후, 멀티멕(MultiMek)96을 사용하여 웰을 흡인하고, 바이오텍® 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 300 μL의 빙-냉 DPBS로 빠르게 1회 플레이트를 세척한다. PBS pH 7.5 중 100 μL의 100 mM 이미다졸을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션함으로써, 니켈-코팅된 플레이트로부터 IDO1-리간드 복합체를 치환한다. 멀티멕96을 사용하여 치환된 IDO1-리간드 복합체를 웰 당 200 μL의 마이크로신트(Microscint)-20 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 사, Cat# 6013621)를 포함하는 96-웰 백색 투명 저부 플레이트 (코스타(Costar) 사, Cat# 3632)로 옮긴다. 트리룩스 마이크로베타(Trilux Microbeta) 계수기를 사용하여 1-(2,4-디플루오로페닐)-3-[[1-(3,4,5-트리트리티오벤조일)인돌린-5-일]메틸]우레아 리간드의 총 결합 및 비-특이적 결합 (NSB)를 정량한다. 총 결합 및 NSB 값을 사용하고 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)에서 비선형 회귀 분석을 사용하여 비표지 화합물에 대한 IC50을 계산한다. 이와 같은 검정의 결과는 소정의 예시된 화합물이 IDO1에 결합한다는 것을 입증하고 있다. 예를 들면, 실시예 1A 및 1B는 1.5 μM 미만의 IC50 값을 나타낸다. 구체적으로, 실시예 1A의 IC50은 0.033 μM ± 0.0028 (n=2)이다.
키누레닌 생성 검정 ( SKOV3 )
본 검정의 목적은 IDO1 발현 암 세포에서의 키누레닌, N-포르밀-키누레닌의 생성 그리고 트립토판의 고갈의 억제를 평가하고, 화합물이 이러한 세포에 대하여 명맥하게 독성인자를 평가하는 것이다. 내인성으로 IDO1을 발현하는 난소암 세포주인 SKOV3 (ATCC, Cat# HTB-77)에서 IDO1 활성의 억제에 대하여 예시 화합물들을 시험한다. IDO1 발현으로 인하여, SKOV3 세포는 동시적인 키누레닌의 생성을 동반하여 트립토판을 분해하기 때문에, 키누레닌, N-포르밀-키누레닌의 생성 그리고 트립토판의 고갈을 억제하는 그의 능력에 대하여 화합물들을 시험한다. 임의적으로, 세포 생존율을 모니터링함으로써, 화합물의 명백한 독성이 평가될 수 있다.
내부 표준의 합성
N-포르밀 L-키누레닌-d4 (2S)-2-아미노-4-옥소-4-(2,3,4,5-테트라듀테리오-6-포름아미도-페닐)부탄산의 합성
Figure pct00038
포름산 (0.052 mL, 1.32 mmol) 중 아세트산 무수물 (0.026 mL, 0.264 mmol)의 사전형성된 혼합물을 포름산 (0.132 mL) 중 L-키누레닌-d4 (56 mg, 0.264 mmol)의 혼합물에 첨가한다. 생성 혼합물을 실온에서 질소하에 2시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 ACN으로 희석하고, 질소 스트림하에서 농축한다. 역-상 HPLC (컬럼: 페노메넥스(PHENOMENEX)® 루나(LUNA)® 5 μm C18 (2) 100Å AXIA, 30×75 mm; 용리액: A: 0.1% 포름산/물, B: 0.1% 포름산/ACN; 구배: 2분 동안 0% B 이후 5분에 걸쳐 22% B까지 구배; 유량: UVW 231/214 nm에서 85 mL/분)에 의해 잔류물을 정제함으로써, 동결건조 후 솜털같은(fluffy) 백색 고체로서 표제 화합물 29 mg을 산출한다. ES/MS (m/z): 241.0 (M+H).
세포 처리 및 세포 생존율
96 웰 조직 배양 플레이트 (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences) 사)에서, 비-필수 아미노산 (기브코(Gibco) 사, Cat# 11140-050), 1 mM 소듐 피루베이트 (기브코 사, Cat#11360-070) 및 완전 배지인 10% 소 태아 혈청이 보충된 맥코이(McCoy) 5A 배지 (기브코 사, Cat# 16600-082) 100 μL에 웰 당 20,000개 세포로 IDO1-발현 난소암 세포주인 SKOV3 세포를 플레이팅한다. 다음에, 5% CO2를 포함하는 37℃ 인큐베이터에서 16시간 동안 세포를 인큐베이션한다. DMSO 중에서 10 mM 모액 시험 화합물로부터 화합물 일련 희석물들을 제조한다. DMSO 중에서 모용액을 연속 3-배 희석하고, 95 μL의 완전 배지를 포함하는 중간 투여 플레이트로 5 μL의 화합물을 옮김으로써, 1 μM 내지 0.5 pM 또는 10 μM 내지 0.5 nM 중 어느 하나 범위의 최종 화합물 농도를 가지는 10-점 희석 곡선을 생성시킨다. 세포를 포함하는 플레이트로부터 배지를 따라내고, 종이 타월상에 블롯팅한다. 웰 당 90 μL의 완전 배지를 사용하여 플레이트를 2회 세척하고, 90 μL의 완전 배지로 최종 세척을 대체한다. 세척 후, 플레이트(들)의 각 웰에 중간 투여 플레이트로부터의 연속 희석 화합물 10 μL를 첨가하고, 5% CO2를 포함하는 37℃ 인큐베이터에서 18시간 동안 인큐베이션한다. 검정에서의 최종 DMSO 농도는 0.5%이다. 18시간 인큐베이션 종료시, 각 웰로부터의 배지 50 μL를 96 웰 v-바닥 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 사)로 옮기고, 플레이트를 밀봉한 후, 이후의 키누레닌, N-포르밀-키누레닌 및 트립토판의 질량 분광측정-기반 측정을 위하여 -80℃에서 저장한다. 임의적으로, 원래의 플레이트(들)를 추가 24시간 동안 인큐베이터로 복귀시키고, 동일 부피의 셀타이터-글로(CELLTITER-GLO)® (프로메가(Promega) 사)를 첨가하고 퍼킨 엘머® 엔비전(EnVision) 플레이트 해독기에서 발광을 측정함으로써, 세포의 생존율을 측정한다.
트립토판, N- 포르밀 - 키누레닌 및 키누레닌의 질량 분광측정 (MS) 측정
얼음상에서의 SKOV3 세포-기반 검정으로부터 수집된 샘플을 해동하고, 4℃에서 3220×g로 1분 동안 플레이트를 원심분리함으로써 임의의 세포 잔사를 청소한다. 2.5 μg/mL의 L-트립토판-2',4',5',6',7'-d5 (CDN 동위원소, Cat# D-1522), L-키누레닌 술페이트-고리-d4,3,3-d2 (캠브리지 동위원소 실험실, Cat# DLM-7842-0.01) 및 내부적으로 제조된 N-포르밀 L-키누레닌-d4로 구성되는 내부 표준 12.5 μL를 첨가한다. 이지 필(Easy Peel) 밀봉재 (써모사이언티픽 사)를 사용하여 모든 플레이트를 열 밀봉하고, 1-2분 동안 보르텍싱함으로써 혼합한 다음, 4℃에서 3220×g로 1분 동안 원심분리한다. 각각 물에 용해시켜 1 mg/mL의 최종 농도를 산출하는 것에 의해, 키누레닌 및 N-포르밀키누레닌의 정량을 위한 표준 보정 용액을 생성시킨다. 해당 각 1 mg/mL 모액으로부터 20.8 μL의 키누레닌 및 23.6 μL N-포르밀키누레닌을 분취하고, 맥코이 5A 배지를 사용하여 1 mL로 희석함으로써, 100 μM의 각 표준을 위한 최종 농도를 산출한다. 완전 배지 중에서 보정 용액을 2-배로 연속 희석함으로써, 5 μM 내지 0.313 μM (키누레닌) 및 2 μM 내지 0.125 μM (N-포르밀키누레닌)의 최종 농도를 가지는 5-점 표준 곡선을 수득한다. 시마즈(SHIMADZU)® 프로미넌스(Prominence) 30A HPLC 시스템 및 AB 사이엑스(SCIEX)® 5500 삼중 사극자 질량 분광측정기로 구성되는 LC/MS-MS 시스템상에 1 μL의 배지 샘플 (미지) 또는 표준 보정 용액을 주사한다. 35℃로 유지되는 엑스브릿지(XBridge)™ C18 컬럼, 2.1×50 mm, 3.5 μm (워터스(Waters) 사, Cat#186003021)에서 0.7 mL/분의 이동상 유량을 사용하여 피분석물을 분리한다. 이동상 A는 수중 0.1% 포름산이며, 이동상 B는 MeOH이다. 구배 프로파일은 하기이다: 0분, 0.5% B; 0.8분, 98% B; 1.10분, 98% B; 1.11분, 0.5% B; 1.7분, 및 이후 중지. 질량 분광측정기는 APCI 양성 다중 반응 모니터링 모드로 가동한다. 표준 곡선 샘플로부터의 데이터를 사용하고 멀티콴(MultiQuan)™ 소프트웨어를 사용하여 각 피분석물에 대하여 선형 정합 보정 곡선을 생성시킨다. 생성된 표준 곡선을 사용하여, 미지에 대한 피분석물 농도를 계산한다.
100% 억제로서의 500 μM의 참조 표준 처리 및 0% 억제로서의 DMSO를 제외한 무화합물 처리를 함유하는 배지로부터의 키누레닌의 질량 분광측정 측정을 사용하여 화합물 IC50 값을 계산한다. N-포르밀키누레닌 및 트립토판의 측정치를 사용하여 동시적인 트립토판 농도의 감소를 동반한 키누레닌과 N-포르밀-키누레닌 생성 사이의 직접적인 관계를 나타냄으로써 생성되는 데이터의 유효성을 평가한다. 이와 같은 검정의 결과는, 모든 예시 화합물들이 IDO1 발현 암 세포에서의 키누레닌 및 N-포르밀-키누레닌의 생성을 0.9 μM 미만의 키누레닌 및 N-포르밀-키누레닌 둘 다를 억제함에 있어서의 IC50 값으로 억제하며, 세포 생존율에서 시험된 것들 (실시예 1-9) 중, 모든 화합물이 적어도 1 μM까지는 세포에 대하여 명백하게 독성이지 않으면서 억제한다는 것을 입증하고 있다. 예를 들면, 키누레닌 및 N-포르밀-키누레닌을 억제함에 있어서의 실시예 1A의 IC50은 각각 0.007 μM ± 0.002 (n=6) 및 0.007 μM ± 0.002 (n=6)이다. 또한, 실시예 1A는 10 μM까지는 세포 증식을 억제하지 않는다.
생체내 표적 억제 검정
본 검정의 목적은 생체내 암 세포에서의 키누레닌 생성 및 트립토판 고갈의 억제를 평가하는 것이다. 난소암 세포주인 SKOV3X (인디애나 대학교 연구 기술 센터)는 내인성으로 IDO1를 발현하며, 무흉선 누드-Foxn1nu 마우스 (하를란(Harlan) 사)의 복강에서 용이하게 종양을 형성한다. IDO1 발현의 결과로서, SKOV3X 종양은 종양 미세환경에서의 동시적인 고농도 키누레닌의 생성을 동반하여 국소적으로 트립토판을 고갈시킨다. 본 검정의 목적은 종양에서의 키누레닌 농도의 분명한 감소로 입증되는 시험 화합물의 IDO1을 억제하는 능력을 측정하는 것이다.
생(live) 단계
비-필수 아미노산 (기브코 사, Cat# 11140-050), 1 mM 소듐 피루베이트 (기브코 사, Cat#11360-070) 및 10% FBS가 보충된 맥코이 5A 배지 (기브코 사, Cat# 16600-082)에서 SKOV3X를 배양하고, 5% CO2 중에서 37℃로 인큐베이션한다. 배양물로부터의 세포를 트립신처리 및 단리한 후, 행크(Hank) 평형 염 용액 (HBSS)에 세포를 재현탁한다. 각 무흉선 누드-Foxn1nu 마우스 (하를란 사)의 복강내에 2×106개의 SKOV3X 세포를 이식한다. 이식-후 대략 3주에, 동물을 촉진하여 종양 형성을 확인하고, 종양-보유 마우스들을 비히클 대조군 및 화합물 처리군으로 무작위화한다. 경구 급식에 의해, 1%의 히드록시에틸셀룰로스 (HEC) 및 0.025%의 트윈® 80 및 0.05%의 소포제를 함유하는 비히클 중에 배합된 화합물, 또는 비히클 단독을 투여한다. 종양-보유 동물에 단일 투여분을 투여함으로써 시간-경과 억제 프로파일을 생성시키고, 투여 후 2, 4, 8, 12 및 24시간에 혈장, 간 및 종양 샘플을 수집한다. EDTA-함유 혈액 수집 튜브 (그레이너 바이오-원(Greiner bio-one) 사, Cat# 450474)로 혈액을 수집하고, 2365×g로 원심분리한 후, 혈장을 단리하여, -80℃에서 냉동시킨다. 간 및 종양 단편을 단리하고, 중량을 기록한 후, 급속 냉동시켜, -80℃에서 저장한다.
표준 곡선의 생성, 조직 처리 및 표적 억제
먼저 투석에 의해 L-키누레닌 및 L-트립토판이 고갈되어 있는 혈장 및 조직 균질물인 탈거된 매트릭스를 생성시키는 것에 의해, L-키누레닌 및 L-트립토판을 위한 보정 표준을 제조한다. 다음에, 알려져 있는 양의 L-키누레닌 및 L-트립토판을 사용하여 탈거된 매트릭스를 강화한다. 10 mL의 EDTA 처리된 마우스 혈장 (바이오리클라메이션(Bioreclamation)IVT 사, Cat# MSEPLEDTA3)을 스펙트라/포르(SPECTRA/POR)® 플로트-어-라이저(FLOAT-A-LYZER)® G2 (스펙트럼 랩스(Spectrum Labs) 사, Cat# G235063)에 첨가하고 이와 같은 투석 장치를 1000 mL의 포스페이트 완충 식염수에 위치시키는 것에 의해, 탈거된 마우스 혈장을 생성시킨 후, 밤새 투석한다. 이후, 이와 같은 장치를 새로운 1000 mL의 포스페이트 완충 식염수로 옮기고, 투석을 반복한다. 탈거된 마우스 혈장을 깨끗한 용기로 옮기고, 향후 사용을 위해 -20℃로 저장한다. 대조 마우스의 간 매 그램마다 3 mL의 MeOH/물 (1:1, v/v)을 첨가함으로써 대조 간 균질물을 제조하고, 초음파 프로브를 사용하여 균질화한다. 종양 조직을 균질화하는 데에 조직 그라인더를 사용하는 것 이외에는 동일한 방식으로 대조 종양 균질물을 제조한다. 별개의 스펙트라/포르® 플로트-어-라이저® G2 장치에 10 mL의 대조 조직 균질물, 간 및 종양을 첨가하고, 각각 1000 mL의 MeOH/물 (1:1, v/v)에서 밤새 투석한 다음, 각각 새로운 1000 mL의 MeOH/물 (1:1, v/v)로 옮기고, 투석을 반복한다. 탈거된 조직 균질물을 별개의 용기로 옮기고, 향후 사용을 위해 -20℃로 저장한다.
ACN/물 (1:1, v/v)에 용해시킨 L-키누레닌-술페이트 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 사, Cat# K3750) 및 N-메틸-2-피롤리돈/물 (4:1, v/v)에 용해시킨 L-트립토판 (시그마 알드리치 사)의 표준 모용액을 제조함으로써, 1 mg/mL의 최종 유리 염기 농도를 산출한다. 50 μL의 각 모용액을 분취하고, MeOH/물 (1:1, v/v)로 희석하여 합쳐진 50 ㎍/mL의 작용 용액을 산출한다. 50,000 ng/mL 용액의 연속 희석에 의해 6개의 추가적인 MeOH/물 (1:1, v/v) 중 보정 작용 용액을 제조함으로써, 25 ng/mL 내지 50 ㎍/mL의 최종 농도를 가지는 7-점 보정 곡선을 수득한다.
시험 대상체로부터 획득한 간 샘플을 조직 1 그램 대 용매 3 mL의 비율로 MeOH/물 (1:1, v/v)과 혼합하고, 초음파 프로브를 사용하여 균질화한다. 조직 그라인더를 사용하여 동일한 MeOH/물 (1:1, v/v) 비율로 종양 샘플을 균질화한다. 시험 대상체로부터의 혈장 샘플을 해동한 후, 균질성을 위하여 혼합한다.
96-웰 플레이트의 별개의 웰로 25 μL의 각 샘플을 옮김으로써, L-키누레닌 및 L-트립토판의 상기 7-점 연속 희석물이었던 보정 작용 용액의 취출을 수행하고, 시험 샘플의 기원 조직에 따라 이러한 웰에 적절한 탈거된 대조 매트릭스 (혈장, 간 또는 종양 균질물) 25 μL를 첨가한다. 별개의 웰에 25 μL의 MeOH/물 (1:1, v/v)을 첨가한 후, 각 시험 샘플 25 μL를 첨가한다. 다음에, 모든 웰에 250 ng/mL의 L-트립토판-2',4',5',6',7'-d5 (시그마 알드리치 사, Cat# 615862) 및 L-키누레닌 술페이트-고리-d4,3,3-d2 (캠브리지 동위원소 실험실, Cat# DLM-7842-0.005)를 함유하는 180 μL의 ACN/MeOH (1:1, v/v)를 첨가하고, 혼합함으로써 샘플 중 단백질을 침전시킨다. 96-웰 플레이트를 원심분리하여 침전된 단백질 물질을 펠렛화한 다음, 물/TFA (100:2, v/v)를 사용하여 각 상청액 일부를 적어도 10-배 희석한다. 시마즈® LC-10ADvp HPLC 펌프가 구비된 시마즈® SCL-10A 컨트롤러, CTC-PAL 자동샘플러 및 AB 사이엑스® 4000 삼중 사극자 질량 분광측정기로 구성되는 LC/MS-MS 시스템상에 10 μL의 각 취출 샘플 및 보정 표준을 주사한다. 주변 조건으로 유지되며 1.5 mL/분의 이동상 유량을 가지는 어드밴티지(Advantage)™ 에첼론(Echelon)™ C18 컬럼, 2.1×20 mm, 4 μm (애널리티칼 세일즈 앤드 서비스(Analytical Sales and Service) 사, Cat# 스프라이트(Sprite) AE1822)에서 피분석물을 분리한다. 이동상 A는 물/TFA/1 M 암모늄 비카르보네이트 (1000:4:1, v/v/v)이며, 이동상 B는 ACN/TFA/1 M 암모늄 비카르보네이트 (1000:4:1, v/v/v)이다. 구배 프로파일은 하기이다: 0분, 0.3% B; 0.03 내지 0.2분, 7% B; 0.3 내지 0.4분, 36% B; 0.41 분, 98% B, 이후 0.7분에 중지하여 원래의 조건으로 복귀. 질량 분광측정기는 터보이온스프레이(TURBOIONSPRAY)® 양성 다중 반응 모니터링 모드에서 가동한다. 보정 표준 곡선 샘플로부터의 데이터를 사용하고 애널리스트(Analyst)™ 소프트웨어를 사용하여 각 피분석물에 대하여 이차방정식 적합 보정 곡선(quadratic fit calibration curve)을 생성시킨다. 생성된 표준 곡선을 사용하여, 연구 샘플에 대한 피분석물 농도를 계산한다.
비히클로 처리된 비-종양-보유 동물로부터의 키누레닌의 간 농도를 키누레닌의 최대 억제 또는 최저 농도로 사용한다. 키누레닌의 최소 억제 또는 최고 농도로는 비히클-처리된 종양-보유 마우스로부터의 키누레닌의 SKOV3X 종양 농도를 사용한다. 비히클-처리된 종양에서의 최소 IDO1 억제와 대비하여 화합물 처리군의 % 억제를 계산한다. 이와 같은 검정의 결과는 실시예 1A가 생체내 IDO1 발현 암 세포에서 키누레닌 및 N-포르밀-키누레닌의 생성을 억제한다는 것을 입증하고 있다. 구체적으로, 75 mg/kg, 25 mg/kg 및 5 mg/kg으로 투여된 실시예 1A는 투여 12시간 후에 각각 79%, 59% 및 37% 억제를 초래하였다.
결장암용 마우스 동계 Colon26 모델에서의 실시예 1A의 항종양 효과 및 확립된 L55 인간화 마우스 모델에서의 LY3300054와의 조합으로서의 항종양 효과
마우스 동계 Colon26 모델:
10 mM 헤페스(HEPES), 1 nM 소듐 피루베이트 및 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 마우스 BALB/c-유래 Colon26 결장암 세포주를 성장시킨다. 트립신을 사용하여 전면생장 미만(sub-confluent) 세포를 수확하고, 혈청이 없는 완전 성장 배지를 사용하여 2회 세정한다. HBSS에 재현탁된 1×106개의 세포를 면역-적격 BALB/c 마우스 (엔비고(Envigo) 사, 인디애나 인디애나폴리스 소재)의 후방 옆구리에 주사함으로써, 피하 종양을 개시한다. 종양 이식 6일 후, 체중을 기준으로 동물들을 무작위화하고, 표시되어 있는 바와 같은 군 당 동물 수를 사용하여 해당 각 처리군에 위치시킨다.
L55 인간화 종양 모델, hPBMC 접종 및 처리:
10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 인간 NSCLC 세포주 L55를 성장시킨다. 트립신을 사용하여 전면생장 미만 세포를 수확하고, 혈청이 없는 성장 배지를 사용하여 2회 세정한다. HBSS와 매트리겔(MATRIGEL)® (BD 바이오사이언시즈(Biosciences) 사, 뉴저지 프랭클린 레이크 소재)의 1:1 혼합물 중 5×106개를, 더 일반적으로는 T 세포, B 세포, NK 세포가 없으며 시토카인 신호전달에 결함이 있는 NOD scid 감마 사슬 녹아웃 마우스 (NSG 마우스) (더 잭슨 라보래토리(The Jackson Laboratory) 사, 메인 바 하버 소재)로 알려져 있는 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ 마우스의 후방 옆구리에 주사함으로써, 피하 종양의 성장을 개시한다. 평균 종양 부피가 대략 200-300 mm3에 도달하였을 때, 종양 크기 및 체중에 의해 동물들을 무작위화하고, 표시되어 있는 바와 같은 해당 각 처리군에 위치시킨다. 무작위화 후, 수용자의 꼬리 정맥에 PBS 단독 (PBMC 없음) 또는 1×107개의 인간 PBMC를 함유하는 PBS를 종양-보유 마우스에게 챌린징한다.
데이터 포착, 화합물 제제 및 비히클 대조군 (둘 다의 모델)
스터디 디렉터(Study Director)를 사용하여 종양 크기 및 체중을 포착한다. L = 더 크게 측정되는 직경이고 W = 수직 직경 중 더 작은 것인 수학식 V=.536×L×W2를 사용하여, 종양 부피 (V)를 추정한다. 종양 부피 데이터를 log 규모로 전환함으로써, 시간 및 처리군에 따른 분산을 균일화한다. SAS 소프트웨어 (버전 9.2)의 MIXED 절차를 사용하는 시간 및 처리에 의한 분산의 2-원 반복 측정 분석으로 log 부피 데이터를 분석한다. 반복 측정을 위한 상관 모델은 스페이셜 파워(Spatial Power)이다. 각 시점에 처리군을 대조군에 비교한다. 또한, 각 처리군에 대하여 개별적으로 MIXED 절차를 사용하여, 각 시점의 조정된 평균 및 표준 오차를 계산한다. 둘 다의 분석은 각 동물 내의 자기상관, 및 대형 종양을 가지는 동물이 조기에 연구로부터 제거될 때 발생하는 데이터의 손실을 고려한다. 실시예 1A를 사용한 최종 투여일에 가장 가깝게 취득한 종양 부피 측정치를 사용하고 수학식 %T/C = 100×ΔT/ΔC를 사용하여 종양 부피의 상대적 변화 (%T/C)를 계산하는 바, 여기서 T = 화합물 처리군의 평균 종양 부피이고, ΔT = 화합물 처리군의 평균 종양 부피 빼기 기준일의 평균 종양 부피이고, C = 대조군 (비히클)의 평균 종양 부피이고, ΔC = 대조군의 평균 종양 부피 빼기 기준일의 평균 종양 부피이다. ΔT<0인 경우라면, %T/C 대신 종양 회귀 값을 계산하는데, 그에 따르면 %회귀 = 100×ΔT/T초기이며, T초기 = 기준일의 평균 종양 부피이다.
연구 과정 동안 주당 2회 3차원 캘리퍼 측정에 의해 종양 부피를 측정함으로써, 단독 또는 조합으로서의 실시예 1A 및 LY3300054의 항종양 효능을 평가한다. 내약성의 일반적인 지표로서, 연구 과정 동안 주당 2회 체중을 측정한다.
실시예 1A 및 LY3300054의 제제: 매주 기준으로 1% HEC/0.25% 트윈 80/0.05% 소포제에 실시예 1A를 배합하고, 4℃에서 저장한다. 포스페이트 완충 식염수에 LY3300054를 가용화하고, 4℃에서 저장한다.
대조군(들): 단일 작용제 효능 연구를 위하여, 실시예 1A 단독용 비히클을 투여한다. 조합 연구용으로는, 각각 매 화합물과 동일한 일정에 따라 실시예 1A 및 LY3300054에 사용된 양 비히클을 투여한다. 조합 효능 연구에서의 단독요법 군에 대해, 비-투여 화합물을 위한 스케줄에 따라 동물들을 목적 화합물, 및 화합물이 투여되지 않는 경우에는 비히클로 처리한다.
Colon26 동계 모델, 처리 및 결과:
단독요법 실시예 1A
10, 50 및 100 mg/kg의 투여량으로 경구 급식에 의해 21일 동안 하루에 2회, 실시예 1A를 사용하여 Colon26 종양을 보유하는 암컷 BALB/c 마우스 (n=10)를 처리한다. 종양 이식 6일 후에 실시예 1A의 투여를 개시하고, 처리 기간 동안 주당 2회 종양 성장 및 체중을 모니터링한다.
결과: 10, 50 및 100 mg/kg의 실시예 1A를 사용한 처리는 50 및 100 mg/kg의 투여량만이 20일차에 통계적으로 의의가 있는 성장 억제를 나타냄 (p<.001)으로써, 종양 성장에 대한 투여량-반응성 효과를 초래하였다. 20일차에 관찰된 종양 부피의 변화 (%T/C)는 10, 50 및 100 mg/kg의 투여량에 대하여 각각 17.5%, 31.2% 및 62.6%이었다. 비히클-처리 마우스와 비교할 때, 치료 과정 동안 체중 변화와 관련하여 실시예 1A를 사용하여 시험된 어떤 투여량에서도 심각한 내약성 문제는 없었다. 체중 감소는 각 군에 대한 종양 이식 6일 후의 기준선에 기록된 평균 체중으로부터의 % 변화로 측정하였다. 20일차에, 평균 비히클 처리 마우스는 기준선에 비해 체중의 5.5% 감소를 나타내었으며, 10, 50 및 100 mg/kg 투여군은 각각 2.5%, 8% 및 2.5% 감소를 나타내었다. 투여량과 관련한 체중 감소에 투여량-의존성 경향이 있기는 하였지만, 그것이 비히클-처리 마우스와 통계적으로 차이나지는 않았다.
L55 인간화 종양 모델, 처리 및 결과:
L55 종양 성장에 대한 hPBMC 효과
L55 NCLC 인간 암 세포주는 hPBMC의 주사와 연관되어 있는 동종-반응(allo-response)에 대하여 본질적으로 내성이다. 본 연구의 목표는 인간 T 세포가 적응성 면역 시스템이 결핍되어 있는 마우스 (NSG 마우스)에서 인간 L55 종양의 성장을 표적화하여 억제하는 것을 가능하게 하는 동종 반응을 강화하는 화합물의 능력을 평가하는 것이다. L55 종양의 종양 성장 억제에 대한 hPBMC의 기여를 평가하기 위하여, 대략 250 mm3에 도달한 확립된 L55 종양을 보유하는 NSG 마우스 (n=10)에 hPBMC가 없는 PBS 또는 1×107개의 hPBMC를 함유하는 PBS를 모의 주사한다. 처리 기간 동안 주당 2회 종양 부피 및 체중을 측정한다.
결과: 연구 과정 동안 hPBMC를 투여받지 않은 동물과 비교하였을 때, L55 종양 성장의 통계적으로 유의성 있는 억제는 존재하지 않았다. 연구 과정 동안의 인간 PBMC의 주사는 41일차에 기준선에서의 것에 비해 0.1% 더 낮아서, 기준선과 비교하였을 때 심각한 체중 감소가 없는 것으로 입증됨으로써, 심각한 내약성 문제는 관찰되지 않았다.
단독요법 실시예 1A
hPBMC에 의해 매개되는 L55 종양 성장 억제를 강화하는 실시예 1A의 능력을 평가하기 위하여, 대략 250 mm3에 도달한 확립된 L55 종양을 보유하는 NSG 마우스 (n=10)에 hPBMC가 결핍되어 있는 PBS를 모의 주사하고, 또 다른 군 (n=10)에 1×107개의 hPBMC를 함유하는 PBS를 모의 주사한다. 21일 동안 하루에 2회 경구 급식에 의해, 양 군을 75 mg/kg의 실시예 1A로 처리한다. 처리 기간 동안 주당 2회 종양 부피 및 체중을 측정한다.
결과: hPBMC의 부재하에서는, 실시예 1A를 사용한 L55 종양의 처리가 PBMC가 없는 비히클 단독과 비교하였을 때 처리 과정 동안 유의성 있는 종양 성장 억제를 초래하지 않았다. hPBMC 존재하에서의 실시예 1A를 사용한 L55 종양-보유 동물의 처리는 hPBMC가 결핍되어 있는 비히클 대조군과 비교하였을 때 종양 성장 억제를 초래하였다. 통계적으로 의의가 있는 종양 성장의 억제는 41일차에 47.6%의 %T/C (P<.001)로써 후기 시점에 가장 분명하였다. hPBMC, 실시예 1A 또는 조합은 기준선 측정치와 비교하였을 때 체중 감소에 있어서의 통계적으로 유의성 있는 감소가 없는 것으로 증명됨으로써, 연구 과정 동안 심각한 내약성 문제는 나타나지 않았다.
단독요법 LY3300054
hPBMC에 의해 매개되는 L55 종양 성장 억제를 강화하는 LY3300054의 능력을 평가하기 위하여, 대략 250 mm3에 도달한 확립된 L55 종양을 보유하는 NSG 마우스 2개 군 (n=10/군)에 hPBMC를 함유하는 PBS를 주사한다. 4주 동안 주당 1회 복막내 주사에 의해, 하나의 군은 10 mg/kg의 IgG-이펙터 무효화 (IgG-EN) 대조 항체로 처리하고, 다른 군은 10 mg/kg의 LY3300054로 처리한다. 치료 기간 동안 주당 2회 종양 부피 및 체중을 측정한다.
결과: 10 mg/kg의 IgG-EN을 사용한 hPBMC가 주사된 L55 종양-보유 마우스의 처리는, hPBMC가 있거나 없는 비히클 단독과 비교하였을 때 종양 성장 또는 진행을 변경시키지 않았다. 10 mg/kg의 LY3300064를 사용한 hPBMC가 주사되었던 L55 종양-보유 동물의 처리는, hPBMC를 함유하거나 그것이 결핍되어 있는 비히클-처리 대조군과 비교하였을 때 통계적으로 유의성 있는 종양 성장 억제를 초래하였다. PBMC가 결핍되어 있는 비히클 단독과 비교하였을 때의 투여 기간 종료시에 관찰된 종양 부피의 변화 (%T/C) (37일차)는 75.7%이었다. hPBMC가 있거나 없는 LY3300054는 기준선 측정치와 비교하였을 때 체중 감소에 있어서의 통계적으로 유의성 있는 감소가 없는 것으로 증명됨으로써, 연구 과정 동안 심각한 내약성 문제는 나타나지 않았다.
실시예 1A와 LY3300054의 조합
대략 250 mm3에 도달한 L55 종양을 보유하는 NSG 마우스 (n=10)에 hPBMC를 주사한 후, 21일 동안 경구 급식에 의해 하루에 2회 75 mg/kg의 실시예 1A로 처리하고, 4주 동안 주당 1회 복막내 주사에 의해 10 mg/kg의 LY3300054로 처리한다. 처리 기간 동안 주당 2회 종양 부피 및 체중을 측정한다.
결과: 75 mg/kg 실시예 1A와 10 mg/kg LY3300054의 조합 처리는 단독요법 군 단독 중 어느 하나와 비교하였을 때 항종양 효능의 향상을 초래하였다. 종양 부피는, PBMC가 결핍되어 있거나 hPBMC가 주사된 것 중 어느 하나인 비히클 단독 군에 비해 상당히 더 작았다 (모든 측정치에서 P<.001). 30, 34, 37 및 41일차의 종양 부피는 각각 9.6%T/C, 19.8%T/C, 13.3%T/C 및 27.3%T/C이었다. 조합 군과 비교되는 단독요법 군들 사이의 항종양 효능의 차이는 통계적으로 유의성이 있었다 (p<.001). 조합이 상가성 또는 상승작용성인지의 여부를 평가하기 위하여, 본질적으로 하기와 같이 데이터를 분석한다:
통계 분석 (둘 다의 모델):
종양 부피 데이터의 통계 분석은, 시간 및 처리군에 따른 분산을 균일화하기 위한 log 규모로의 데이터 변환으로 시작한다. SAS 소프트웨어 (버전 9.3)의 MIXED 절차를 사용하는 시간 및 처리에 의한 분산의 2-원 반복 측정 분석으로 log 부피 데이터를 분석한다. 반복 측정을 위한 상관 모델은 스페이셜 파워이다. 각 시점에 처리군을 대조군에 비교한다. 또한, 각 처리군에 대하여 개별적으로 MIXED 절차를 사용하여, 각 시점의 조정된 평균 및 표준 오차를 계산한다. 양 분석은 각 동물 내의 자기상관, 및 대형 종양을 가지는 동물이 조기에 연구로부터 제거될 때 발생하는 데이터의 손실을 고려한다. 각 처리군에 대한 조정된 평균 및 표준 오차 (s.e.)를 시간에 대하여 플로팅한다.
조합 분석법 ( IVEF 연구를 위한 블리스 독립성)
반복 측정 분석의 결과에 따라, 비히클 및 조합 군의 평균을 2종의 단일 작용제 군의 평균에 비교함으로써, 대조 설명을 사용하여 각 시점에서의 상호작용 효과에 대하여 시험한다. 이는 상가성을 시험하기 위한 블리스 독립성 방법(Bliss Independence method)에 상당한다. 조합에 대한 예상 상가성 반응 (EAR)은 하기와 같이 종양 부피 기준으로 계산한다: EAR 부피 = V1*V2/V0, 여기서 V0, V1 및 V2는 각각 비히클 대조군, 처리 1 단독 및 처리 2 단독의 추정 평균 종양 부피임. 상호작용 시험이 유의성이 있는 경우, 조합 효과는 관찰되는 조합 평균 부피가 EAR 부피 미만이지 또는 그것을 초과하는지에 따라 각각 통계적으로 상가성 초과 또는 상가성 미만으로 선언된다. 아니면, 통계적 결론은 상가성이다.
이와 같은 분석 방법을 사용하였을 때, 종양 성장 억제는, 각각 P<0.008 및 p<0.001로 종양 성장 억제가 상승작용성이었던 34 및 37일차까지는 상가성을 초과하지 못하였다. 실시예 1A와 LY3300054의 조합은 기준선 측정치와 비교하였을 때 체중 감소에 있어서의 통계적으로 유의성 있는 감소가 없는 것으로 증명됨으로써, 연구 과정 동안 심각한 내약성 문제는 나타나지 않았다.
본 발명의 화합물은 바람직하게는 다양한 경로로 투여되는 제약 조성물로 제제화된다. 가장 바람직하게는, 해당 조성물은 경구 또는 정맥내 투여용이다. 그와 같은 제약 조성물 및 그의 제조 방법에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 [REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (D. Troy, et al., eds., 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005)]을 참조한다.
본원에서 사용될 때, "유효량"이라는 용어는 환자에 대한 단일 또는 다수 투여량 투여시 진단 또는 치료하에 있는 환자에서 원하는 효과를 제공하는 본 발명 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 투여량을 지칭한다.
유효량은 공지의 기술을 사용하여, 및 유사한 상황하에서 수득되는 관찰 결과에 의해, 관련 기술분야의 통상의 기술자로서의 진단 주치의에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 환자를 위하여 유효량을 측정하는 데에는, 동물의 종; 그의 크기, 연령 및 일반적인 건강; 연관되어 있는 구체적인 질환 또는 장애; 질환 또는 장애의 연관도 또는 중증도; 개별 환자의 반응; 투여되는 구체적인 화합물; 투여 양식; 투여되는 제제의 생체이용률 특성; 선택되는 투여 처방계획; 동시적인 약제 사용; 및 기타 관련 상황을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 수많은 인자들이 진단 주치의에 의해 고려된다.
본 발명의 화합물은 일반적으로 광범위한 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들면, 1일 투여량은 보통 약 0.05-1000 mg의 1일 범위에 속한다. 바람직하게는, 그와 같은 투여량은 0.1-500 mg의 1일 범위에 속한다. 더욱 바람직하게는, 그와 같은 투여량은 1-200 mg의 1일 범위에 속한다. 일부 경우에는 전술한 범위의 하위 한계 미만인 투여량 수준이면 충분할 수 있는 반면, 다른 경우에는 훨씬 더 큰 투여량이 어떠한 유해한 부작용도 야기하지 않으면서 사용될 수 있으므로, 상기 투여량 범위는 어떠한 방식으로도 본 발명의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니다. 실제로 투여되는 화합물의 양은 치료될 이상, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물 또는 화합물들, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 및 환자 증상의 중증도를 포함한 관련 상황에 비추어 의사에 의해 결정될 것임이 이해될 것이다.
[서열 목록]
아미노산 및 뉴클레오티드 서열
서열식별번호: 1 (인간 PD-L1)
Figure pct00039
서열식별번호: 2 (LY3300054의 HCDR1)
Figure pct00040
서열식별번호: 3 (LY3300054의 HCDR2)
Figure pct00041
서열식별번호: 4 (LY3300054의 HCDR3)
Figure pct00042
서열식별번호: 5 (LY3300054의 LCDR1)
Figure pct00043
서열식별번호: 6 (LY3300054의 LCDR2)
Figure pct00044
서열식별번호: 7 (LY3300054의 LCDR3)
Figure pct00045
서열식별번호: 8 (LY3300054의 HCVR)
Figure pct00046
서열식별번호: 9 (LY3300054의 LCVR)
Figure pct00047
서열식별번호: 10 (LY3300054의 HC)
Figure pct00048
Figure pct00049
서열식별번호: 11 (LY3300054의 LC)
Figure pct00050
서열식별번호: 12 (LY3300054 HC의 DNA)
Figure pct00051
서열식별번호: 13 (LY3300054 LC의 DNA)
Figure pct00052
Figure pct00053
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> 2,3-DIHYDRO-1H-INDOLE COMPOUNDS <130> X21056 <150> 62/348457 <151> 2016-06-10 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 225 230 235 240 Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser 325 330 335 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn 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Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 <210> 12 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 12 caggtccagc tggtccagtc aggggccgag gtcaaaaagc cagggtcatc tgtcaaagtg 60 tcttgtaagg catccggggg cacattttcc agctacgcta tctcctgggt gagacaggca 120 ccagggcagg gtctggagtg gatgggcgga atcattccca tcttcgggac cgccaactac 180 gctcagaagt ttcagggaag ggtcactatt accgccgaca aaagcacatc tactgcttat 240 atggagctgt ctagtctgag gtctgaagat accgcagtgt actattgcgc ccggagtccc 300 gactatagcc cttactatta ctatggcatg gatgtctggg gccagggaac cacagtgaca 360 gtctcatccg ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 660 gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc 720 gagggggcac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840 ttcaactggt atgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca agactggctg 960 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccatcctc catcgagaaa 1020 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080 cgggaggaga tgaccaagaa ccaagtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctatt ccaagctcac cgtggacaag 1260 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggcaaa 1359 <210> 13 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 13 cagtccgtcc tgacacagcc accctcagcc tctggcaccc ctgggcagcg agtgacaatc 60 tcttgttctg ggagttcctc aaatattggt agtaacaccg tgaattggta ccagcagctg 120 cccggcacag cacctaagct gctgatctat ggaaactcaa ataggccatc cggagtcccc 180 gaccggttct ctggtagtaa atcaggcact tccgccagcc tggctattag cgggctgcag 240 tctgaggacg aagccgatta ctattgccag tcttacgatt ccagcctgtc tggaagtgtg 300 tttggcggag ggatcaagct gaccgtcctg ggccagccta aggctgcccc ctcggtcact 360 ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420 agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480 gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540 tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600 catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctgcag aatgctct 648

Claims (11)

  1. 하기 화학식의 화합물.
    Figure pct00054

    여기서,
    R1a는 수소, 메틸, 에테닐, 시아노, 플루오로, 클로로, 플루오로메틸 또는 디플루오로메틸이고;
    R1b는 수소, 플루오로 또는 클로로이고;
    R1c는 수소, 히드록시, 플루오로, 벤질옥시 또는 히드록시에틸아미노이고;
    R2는 수소 또는 메틸이고;
    R2a는 수소 또는 메틸이고;
    R3a는 테트라히드로피라닐이다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화합물.
    Figure pct00055
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 화합물.
    Figure pct00056
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 화합물.
    Figure pct00057
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 결정질 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드인 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 12.51°, 15.65°, 16.37°, 17.56°, 21.48° 및 25.23° (2θ±0.2°)로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 조합된 17.38°에 적어도 1개의 피크를 포함하는 X선 분말 회절 패턴 (Cu 방사선, λ-1.54060 Å)을 특징으로 하는 결정질 4-플루오로-N-{(1R)-1-[1-(테트라히드로-2H-피란-4-일카르보닐)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일]에틸}벤즈아미드인 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물과, 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
  8. 흑색종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 신세포 암종, 유방암, 폐암, 난소암, 난관 암종, 원발성 복막 암종, 자궁경부암, 위암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 신경교종, 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암에 걸린 환자에게 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 암에 사용하기 위한 화합물.
  11. 제10항에 있어서, 암이 흑색종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 신세포 암종, 유방암, 폐암, 난소암, 난관 암종, 원발성 복막 암종, 자궁경부암, 위암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 신경교종, 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
KR1020187035215A 2016-06-10 2017-05-31 암을 치료하기 위한 1-테트라히드로피라닐카르보닐-2,3-디히드로-1h-인돌 화합물 KR102241258B1 (ko)

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