CN109641007A - 用功能化纳米颗粒将人类体细胞直接重编程为选定的(预定的)分化细胞 - Google Patents

用功能化纳米颗粒将人类体细胞直接重编程为选定的(预定的)分化细胞 Download PDF

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Abstract

本公开涉及用于重编程初始细胞(例如体细胞)以从人类体细胞产生目的特定细胞类型(例如心脏细胞、肝细胞、血细胞、神经元细胞和其他细胞)的组合物和方法。在一些实施方案中，初始细胞(例如体细胞)是人类细胞，从而产生目的人诱导性细胞类型。在一些实施方案中，所述组合物和方法包括用生物活性分子(RNA、蛋白质、肽和其他小分子)功能化的纳米颗粒。这些新生成的(即，“诱导性”)特定细胞可用于改善器官功能和/或组织再生(心脏、肝脏等)，并且可用于筛选药物的功能活性。

Description

用功能化纳米颗粒将人类体细胞直接重编程为选定的(预定 的)分化细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年6月3日提交的美国临时申请No.62/345360的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及用于细胞重编程和从人类体细胞产生各种人类细胞类型(例如心脏细胞、肝细胞、血细胞、神经元细胞和其他细胞)的方法和组合物。这些新生成的特定细胞可用于改善器官功能和/或组织再生(心脏、肝脏等)，并且可用于筛选药物的功能活性。
政府许可权利声明
本发明是在国家科学基金会授予的小企业创新研究(SBIR)第一阶段IIP-1214943的政府支持下完成的。政府对本发明拥有一定的权利。
背景技术
细胞正常增殖、迁移和分化成各种细胞类型的能力在胚胎发生和成熟细胞(包括但不限于各种遗传性或后天性疾病中心血管和/或造血系统的细胞)的功能中是关键的。干细胞和/或更多分化的特定细胞类型的这种功能性能力在各种病理条件下会发生变化，但是所述功能性能力可以在细胞内引入生物活性成分后正常化，或者可以通过将其他细胞类型转分化为所述需要修复或功能改善的特定细胞类型而正常化。例如，在患有周期性或重症先天性中性粒细胞减少的患者中观察到异常的细胞功能，例如存活受损和/或骨髓干/祖细胞分化成中性粒细胞，所述患者可能遭受严重危及生命的感染且可能进化发展为急性髓性白血病或其他恶性肿瘤(Carlsson等，Blood,103,3355(2004)；Carlsson等，Haematologica,(2006))。另一个例子是巴氏综合征，其中患者可能存在造血细胞的异常存活以及称为心肌病的心脏功能受损(Makaryan等，Eur.J.Haematol.,(2012))。
其他遗传性疾病，如巴氏综合征(一种可能由线粒体TAZ基因中的功能丧失突变诱导的多系统干细胞疾病)，可能与中性粒细胞减少症(血液中性粒细胞水平降低)有关，中性粒细胞减少症可导致复发的严重且有时危及生命的致命性感染和/或心肌病，其可能导致能通过心脏移植解决的心力衰竭。
用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对中性粒细胞减少症患者的治疗诱导位于细胞表面的G-CSF受体分子的构象变化，其随后触发一连串细胞内事件，最终将中性粒细胞的产生恢复至接近正常水平并改善患者的生活质量(Welte and Dale,Ann.Hematol.72,158(1996))。然而，用G-CSF治疗的患者可能进化发展为白血病(Aprikyan等，Exp.Hematol.31,372(2003)；Rosenberg等，Br.J.Haematol.140,210(2008)；Newburger等，Genes.Pediatr.Blood Cancer,55,314(2010),Aprikyan and Khuchua,Br.J.Haematol.161,330(2013))，这就是正在探索替代性细胞治疗方法的原因，如用于治疗中性粒细胞减少症的骨髓或造血干细胞移植，或者人诱导性多能干细胞分化后离体生成心脏细胞，然后将新生成的心脏细胞移植到患者心脏以对抗心力衰竭并恢复或改善心肌功能。
一种替代性细胞治疗方法包括将患者的体细胞(例如成纤维细胞)直接重编程为功能性心肌细胞，其可以支持心肌的结构完整性并使人心脏的功能正常化。最近，这种直接重编程方法包括使用具有各种心脏特异性因子(包括但不限于心脏特异性转录因子、小分子和微小RNA)的逆转录病毒或慢病毒(病毒载体)。这种病毒递送不同组的心脏基因(包括或不包括微小RNA)在将人类成纤维细胞直接重编程为诱导性心肌样细胞(iCM)中是有效的，如通过心脏特异性基因的诱导性表达所证明的(综述于Doppler等，Int.J.Mol.Sci.16,17368-17393(2015))。然而，这种病毒重编程与病毒DNA随机整合到细胞基因组中有关，已知其可诱导各种突变，改变宿主细胞中的正常基因表达模式，并且触发癌基因表达，从而导致癌症或其他有害后果。因此，病毒重编程不是用于细胞重编程和随后在人类中使用的合理方法。
使用明显非整合的功能化纳米颗粒在细胞内递送不同生物活性分子(RNA、微小RNA、蛋白质、肽和其他小分子)的混合物后，可以更有效地影响和调节由直接重编程触发的细胞内事件。尽管细胞膜作为活性屏障保护细胞内事件的级联不受外源刺激的影响，但这些生物活性功能化纳米颗粒能够穿透细胞膜以改变细胞功能，在需要时除掉不需要的细胞，和/或直接将人类体细胞重编程为其他目的细胞类型。
尽管本领域有所进步，仍然需要一种有效的方法将生物活性分子递送到细胞内部，以便有效地诱导细胞的重编程，同时避免对染色体结构的损害。本发明满足了非整合直接重编程为各种细胞类型和保持完整人类细胞基因组的需求，并为其他相关优点提供了新的手段。
发明概要
在一些实施方案中，本发明涉及将蛋白质、肽和/或RNA分子连接至生物相容性纳米颗粒的功能化方法，所述纳米颗粒用于调节细胞功能和将人类体细胞直接重编程为选定(预定)谱系的功能细胞。此类功能细胞随后可用于研究和开发、药物筛选和治疗应用中以改善人类的细胞和/或器官功能。说明性选定的(预定的)细胞类型包括诱导性心脏细胞、肝细胞、神经细胞等。在一些实施方案中，本发明涉及所述功能化的生物相容性纳米颗粒本身。
当参考下述详细描述时，本发明的这些和其他方面对本领域普通技术人员而言将更显而易见。
发明详细描述
为了在细胞内递送生物活性分子，本发明提供了一种基于组合物的通用平台，所述组合物包含具有共价连接的生物活性分子的细胞膜穿透性纳米颗粒。为此，本文提出了一种确保蛋白质、肽和/或RNA(例如，微小RNA、编码转录因子的RNA、siRNA、shRNA等)分子与纳米颗粒共价连接的功能化方法。本发明的经修饰的细胞渗透性纳米颗粒提供了用于细胞内递送生物活性分子的通用机制，所述生物活性分子通常用于调节细胞功能和/或使细胞功能正常化，并将人类体细胞直接重编程为选定(预定)谱系的功能细胞，其随后可用于研究和开发，药物筛选和治疗应用中以改善人的细胞和/或器官/组织功能。说明性选定的(预定的)细胞类型包括心脏细胞、肝细胞、神经细胞等。
本文公开的方法利用生物相容性纳米颗粒，包括例如，超顺磁性氧化铁或金纳米颗粒，或类似于之前在科学文献中描述的聚合物纳米颗粒(Lewin等，Nat.Biotech.18,410-414,(2000)；Shen等，Magn.Reson.Med.29,599–604(1993)；Weissleder等，Am.J.Roentgeneol.,152,167–173(1989)；每篇参考文献通过引用整体并入本文)。例如，这些纳米颗粒可在骨髓细胞、淋巴结、脾和肝的磁共振成像的临床环境中使用(参见，例如Shen等，Magn.Reson.Med.29,599(1993)；Harisinghani等，Am.J.Roentgenol.172,1347(1999)；每篇参考文献通过引用整体并入本文)。例如，尺寸小于50nm且含有交联的细胞膜渗透性TAT衍生肽的磁性氧化铁纳米颗粒以高达30pg超顺磁性铁纳米颗粒/细胞的量有效地内化至造血细胞和神经祖细胞中(Lewin等，Nat.Biotechnol.18,410(2000))。此外，纳米颗粒掺入不影响人骨髓来源的CD34+早期祖细胞的增殖和分化特征或细胞活力(MaiteLewin等，Nat.Biotechnol.18,410(2000))。因此，所公开的纳米颗粒可用于体内跟踪标记的细胞。
标记的细胞保持其分化能力，并且还可以使用磁共振成像在组织样品中被检测到。本文中我们提出了新的基于纳米颗粒的组合物，将其功能化以携带各种集合的RNA(例如，微小RNA、编码转录因子的RNA、siRNA、shRNA等)、蛋白质、肽和其他小分子，其可作为优秀的载体用于细胞内递送生物活性分子以靶向细胞内事件并且调节将人类体细胞直接重编程为各种目的细胞类型的细胞功能和性质。
纳米颗粒-肽/蛋白质/RNA缀合物的一般性描述：
纳米颗粒可以基于具有包含X/Y官能团的生物相容性聚合物包衣(例如，葡聚糖多糖)的铁或其他材料，其与各种长度的接头连接，并且通过其X/Y官能团进而共价连接至蛋白质，RNA(例如，微小RNA、编码转录因子的RNA、siRNA、shRNA等)分子和/或肽(或其他小分子)。接头结构是众所周知的，并且可以常规地应用于所公开的功能化纳米颗粒设计中。接头可以为所连接的生物活性化合物(例如蛋白质或多核苷酸)提供构象柔性，使得其可以保持适当的三维结构并且旋转以更有效地与其细胞内配偶体相互作用和结合。
可用于交联的官能团的说明性、非限制性实例包括：
-NH2(例如，赖氨酸、a-NH2)；
-SH；
-COOH；
-NH-C(NH)(NH2)；
糖类；
-羟基(OH)；和
接头上通过光化学连接的叠氮基。
交联剂的说明性、非限制性实例包括：
SMCC[4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯]，包括磺基-SMCC，其为用于交联氨基和硫醇基团的磺基琥珀酰亚胺基衍生物；
LC-SMCC(长链SMCC)，包括磺基-LC-SMCC；
SPDP[N-琥珀酰亚胺基-3-(哌啶二硫代)-丙酸酯]，包括与胺反应并提供硫醇基团的磺基-SPDP；
LC-SPDP(长链SPDP)，包括磺基-LC-SPDP；
EDC[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]，其为用于连接-COOH基团与-NH2基团的试剂；
SM(PEG)n，其中n＝1、2、3、4…24个乙二醇单元，包括磺基-SM(PEG)n衍生物；
SPDP(PEG)n，其中n＝1、2、3、4…12个乙二醇单元，包括磺基-SPDP(PEG)n衍生物；
含有羧基和胺基的PEG分子；和
含有羧基和巯基的PEG分子。
封端和封闭试剂的说明性、非限制性实例包括：
特异于NH的柠康酸酐；
特异于SH的乙基马来酰亚胺；和
特异于马来酰亚胺的巯基乙醇。
可用于此目的的纳米颗粒可含有如氧化铁或金的金属核，或者可以是不含金属核但含有捕获于其中的生物活性分子的聚合物纳米颗粒，所述生物活性分子随时间释放，导致长效作用。
鉴于前述内容，我们已经在表面上用功能性胺处理生物相容性纳米颗粒以化学结合蛋白质、核酸和短肽，如在U.S.2004/0342004中所述的，其通过引用整体并入本文。简而言之，所述超顺磁性或替代性纳米颗粒的尺寸可小于50nm或更大，且1015-1020纳米颗粒/毫升，每个纳米颗粒具有10个或更多个胺基。
SMCC(例如来自ThermoFisher)可以以1mg/ml的浓度溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中，所述二甲基甲酰胺例如，获自ACROS(密封小瓶和无水的)。将样品密封并几乎立即使用。
将十(10)微升所述溶液加入到200微升体积的纳米颗粒中。这为存在的可用胺基提供了大大过量的SMCC，并使反应进行约1-2小时。可以使用具有3,000道尔顿截止值的离心过滤柱(例如来自Amicon)除去过量的SM和DMF。通常需要五次体积交换以确保适当的缓冲液交换。重要的是在此阶段除去过量的SMCC。
可以将任何基于RNA或肽的分子，例如市售的绿色荧光蛋白(GFP)或纯化的重组GFP，或任何其他目的蛋白质添加到活化的纳米颗粒中。使所述生物活性分子-纳米颗粒溶液反应，并通过具有适当MW截止值(在使用GFP的实施例中，截止值为50,000道尔顿或更大)的离心过滤单元除去未反应的分子。将所述样品储存在-80℃冰箱中或在4℃下。也可以使用含有固体尺寸过滤组分的小型旋转柱，例如Bio Rad P尺寸排阻柱，来代替Amicon离心过滤柱。还应注意，SMCC也可以以磺基衍生物(磺基-SMCC)的形式购买，使其更易溶于水。DMSO(二甲基亚砜)也可以代替DMF作为标记试剂的溶剂载体；此外，它应该是无水的。
所有其他交联剂可以以类似的方式应用。SPDP也以与SMCC相同的方式应用于蛋白质/适用的肽。其易溶于DMF。通过与DTT反应一小时或更长时间将二硫醇切断。在除去副产物和未反应的材料后，通过使用具有3,000MW截止值的Amicon离心过滤柱纯化。
另一种用肽、RNA(例如，微小RNA、编码转录因子的RNA、siRNA、shRNA等)或蛋白质分子标记纳米颗粒的方法是使用两种不同的双功能偶联试剂，如在US 2014/0342004中所述的，其通过引用整体并入本文。
在纳米颗粒上连接肽、RNA(例如，微RNA、编码转录因子的RNA、siRNA、shRNA等)和蛋白质。在一个实施方案中，将各种比例的SMCC标记的蛋白质和肽加入到珠子中并使其反应。以下更详细地描述示例性蛋白质和肽。
另一方面，本发明还涉及一种递送连接至功能化纳米颗粒的生物活性分子的方法，用于调节旨在将人类体细胞直接重编程为其他细胞类型(例如iCM)的细胞内活性。例如，将可商业获得的或使用标准或改良的实验方法获得的人类细胞、成纤维细胞或其他细胞类型首先在无菌条件下在固体表面上铺板，所述固体表面包含或不包含细胞粘附的底物(饲养细胞、明胶、基质胶、纤连蛋白、层粘连蛋白等)。将铺板的细胞与特定因子组合培养一段时间，所述特定因子组合允许细胞分裂/增殖或维持可接受的细胞活力。实例为适合于该细胞类型的血清和/或各种生长因子/细胞因子，其随后可以被取出或更新并且培养继续进行。在功能化生物相容的细胞渗透性纳米颗粒的存在下培养铺板的细胞，所述纳米颗粒具有共价连接的细胞特异性重编程因子(对目的细胞类型特异的重编程因子，例如心脏、肝细胞和神经特异性重编程因子)，在存在或不存在磁场的情况下，使用本文和其他地方(参见，例如US 2014/0342004，其通过引用整体并入本文)简要描述的各种方法进行连接。在超顺磁性纳米颗粒的情况下使用磁铁使得细胞和纳米颗粒之间的接触表面积显着增加，从而进一步改善了用肽、蛋白质或RNA分子功能化的纳米颗粒穿过细胞膜的渗透性。必要时，用功能化的纳米颗粒反复处理细胞群，以细胞内递送生物活性分子。
将细胞保持附着或悬浮在培养基中，并且可以通过离心或细胞分离除去未掺入的纳米颗粒，保留作为簇存在的细胞。然后将所述细胞在新鲜培养基中重新悬浮并再培养一段合适的时间。可以通过分离、重悬和再培养的多个循环来获取细胞，直至观察到由与功能化纳米颗粒连接的特定生物活性分子触发的随之而来的直接重编程效应。本发明不仅适用于将一种细胞直接重编程为另一种细胞，而且还可以在保留原始细胞类型的情况下用作控制或调节细胞命运的新手段。可以使用多种细胞类型，例如人类成纤维细胞、血细胞、上皮细胞、间充质细胞等。
细胞重编程，无论是直接的还是间接的，都是基于用生物活性分子处理各种细胞类型或组织，所述生物活性分子包括各种蛋白质、肽、小分子、RNA(例如微小RNA、编码转录因子的RNA、siRNA、shRNA)等。这种生物活性分子不能有效地穿透细胞膜或完全不穿透细胞膜，并且在没有特殊的递送载体和/或专门的实验条件下可能无法到达细胞核。此外，这些生物活性分子具有短的半衰期并且可能在暴露于各种蛋白酶和核酸酶后经历降解。这些缺点导致生物活性分子的功效降低，并且需要更高剂量或重复剂量的治疗以实现显著的细胞重编程效果(如果有的话)。因此，在本发明中，使用功能化的纳米颗粒来克服上述缺点。更具体地说，当与所述纳米颗粒相连并与原始的“裸露”状态相比时，这些生物活性分子获得新的物理、化学、生物功能性质，其赋予了细胞穿透和细胞核靶向能力、更大的尺寸和改变的整体三维构象以及获得的调节目的靶基因表达的能力。
迄今为止，已报道许多基因产物和生物活性分子显示出重编程效应，并且该列表在不断增长。例如，据报道，不同组的生物活性分子和/或基因产物诱导人类成纤维细胞直接重编程为心肌细胞。一个这样的组代表一组转录因子。另一个组包括这些因子中的一些和其他基因以及微小RNA分子(miR1和miR133)。然而，其他组包括所报道的生物活性分子的不同组合(Fu JD等，Direct Reprogramming of Human Fibroblasts toward aCardiomyocyte-like State.Stem Cell Reports,1,235-247(2013)；Nam YJ等，Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiacfate.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.110,5588-5593(2013)；Wada R等，Induction of humancardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.110,12667–12672,(2013)；和Cao N等，Conversion of human fibroblasts intofunctional cardiomyocytes by small molecules.Science.352,1216-1220(2016)；每篇文献都通过引用整体并入本文)。如心脏特异性标记物的存在(其不存在于原始成纤维细胞中)所证明的，用含有这些生物活性分子的病毒转导的人类成纤维细胞已被直接重编程为诱导性心肌样细胞(iCM)。然而，所得的重编程细胞具有偏移的基因表达模式，这是由病毒DNA和编码基因产物的DNA插入细胞基因组所导致。此外，这种直接重编程的效率非常低，这在某种程度上是由于这些生物活性分子的半衰期较短。本公开解决了这些问题，其提供了使用另外的降解保护化合物，例如用非整合肽、蛋白质和RNA分子功能化的纳米颗粒或PEG或其他化合物或分子，从而保持细胞基因组的完整。在一些实施方案中，所述RNA分子可以是，例如微小RNA、编码转录因子的RNA、siRNA、shRNA等。
除了成纤维细胞直接重编程为心肌细胞之外，已经报道了使用不同组的生物活性分子的直接重编程可能产生肝细胞和神经细胞。例如，当使用慢病毒载体在人类成纤维细胞中表达时，FOXA3、HNF1A和HNF4A基因导致该细胞的直接重编程和功能性肝细胞的产生，如在急性肝功能衰竭的动物模型中肝基因的表达和肝功能的恢复所证明的。与病毒介导的直接心脏重编程类似，这种方法可能由于病毒DNA随机整合到人类细胞基因组中而导致有害的后果，以及癌症的发生。本发明通过纳米颗粒的产生和使用克服了该问题，所述纳米颗粒用作为非整合分子的上述和/或其他重编程因子进行功能化，从而保持细胞基因组完整无缺。
据报道，在用单一因子(Sox-2)处理胎儿成纤维细胞后，成功将成纤维细胞直接重编程为神经细胞(Ring等，Cell Stem Cell,11,100-109,(2012)；通过引用整体并入本文)。所得的新重编程细胞表现出神经细胞表型和基因表达模式，具有进一步分化成其他神经细胞类型如寡突胶质细胞和星形胶质细胞的能力。最近，据报道Sox2和Pax6基因的表达在将成人成纤维细胞重编程为神经细胞中是有效的(Connor等，Direct Conversion of AdultHuman Fibroblasts into Induced Neural Precursor Cells by Non-ViralTransfection.Protocol Exchange(2015),doi:10.1038/protex.2015.034；通过引用整体并入本文)。存在将人类体细胞如成纤维细胞直接重编程为神经细胞的各种因子或它们的组合(参见，例如Son et al.Cell Stem Cell.,9,205-218(2011)；Pfisterer等，Proc.Natl.Acad.Sci.,108,10343-10348(2011)；Ambasudhan等，Cell Stem Cell.,9,113-118,(2011)；每篇参考文献通过引用整体并入本文)。
与其他关于转分化的报道类似，上述直接重编程方法也基于基因产物的表达，所述基因产物使用慢病毒或逆转录病毒载体或质粒DNA递送至细胞。同样，DNA的使用易于引发核苷酸不可预测的随机插入至宿主细胞的基因组DNA中，从而潜在地导致有害后果或使表型偏移。然而，与病毒递送目的基因相比，使用重编程因子(例如与具有细胞穿透能力的TAT样肽融合的用于细胞重编程的蛋白质)进行细胞重编程的尝试的效率非常低(Kim等，Cell Stem Cell.,4,472-476(2009)；Zhou等，Cell Stem Cell.,4,381-384(2009)；每篇参考文献通过引用整体并入本文)，这是这种方法被放弃而未被采用的主要原因。
迄今为止，已经报道了对直接重编程有效的不同因子或其各种组合，并且具有相似性质的潜在因子的列表不断增长。下表1包含适合用于根据本发明的直接重编程的各种生物活性因子或其组合的几个说明性和非限制性实例：
表1：说明性的重编程因子和组合。每篇参考文献通过引用整体并入本文。
本发明通过使用用任何上述或其他生物活性分子功能化的纳米颗粒(无论是金属核的(例如，基于超顺磁性铁或基于金的纳米颗粒)还是非核的(例如聚合物纳米颗粒))克服了插入诱变和偏移的基因型/表型的问题，暴露于所述其他生物活性分子可能导致一种细胞重编程为另一种细胞类型。所列举的细胞类型、因子和/或因子的组合不是限制性的，并且将会新发现其他因子和/或组合，且这些组合将以本申请中描述的相同方式起作用。
本发明的一个用途是筛选/测试生物活性分子(化合物)对细胞重编程的影响。这涉及使用本文公开的方法将连接至纳米颗粒的化合物与目的细胞群(无论是成纤维细胞、血细胞、间充质细胞等)结合，培养适当的时期，然后确定由该化合物产生的任何调节作用。这包括直接细胞重编程和产生目的特定细胞类型(specialized cell types ofinterest)，例如心脏细胞、肝细胞或神经细胞，检查细胞的毒性，代谢变化或对收缩活性和/或其他功能的影响。
本发明的另一个用途是将特定细胞配制为药物或在可用于人体或动物体治疗的递送装置中。这使得临床医生能够在受损器官(例如心脏、脑或肝)组织中或周围将功能化纳米颗粒由脉管系统或直接施用到肌肉或器官组织中，从而允许该特定细胞移植，限制损伤，并参与组织肌肉系统的再生/再生长和特定功能的恢复。或者，如本文所述的诱导性心肌细胞(iCM)或其他细胞类型可以用所述功能化纳米颗粒离体产生，然后施用于受试者的患病或受损组织周围的区域。
本公开的另一个应用是产生和/或使用如本文所述的iCM作为筛选支架，以测试一种或多种候选组合物在心脏疾病背景下的治疗或药理学作用。例如，可以在体外产生和培养所述iCM(或目的细胞类型，例如肝细胞和神经细胞)并与候选药剂接触，然后可针对效果观察该细胞。在一些实施方案中，iCM或其他细胞类型可以由源自患有心脏病或其他疾病的受试者的体细胞产生。因此，可以针对需要的受试者的特定遗传背景进行关于心脏病症的药物活性筛选，以评估该受试者对该药剂的反应性。
除非本文中具体定义，否则本文使用的所有术语具有与本发明所属领域的普通技术人员理解的相同的含义。从业者特别涉及Sambrook J.等，(eds.)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Press,Plainsview,New York(2001)；和Ausubel F.M.等，(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York(2010)，各自通过引用并入本文。
权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出其仅指替代方案或所述替代方案是相互排斥的，尽管本公开支持仅指替代方案以及“和/或”的定义。
根据长期存在的专利法，除非特别说明，否则当词语“a”和“an”与权利要求书或说明书中的“comprising(包含)”一词一起使用时，表示一个或多个。
除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“comprise(包括)”、“comprising(包含)”等应以包含性意义解释，而不是以排他性或穷举性意义解释；即表示“including,but not limited to(包括但不限于)”。使用单数或复数的单词也分别包括复数和单数。另外，当在本申请中使用时，术语“herein(本文)”，“above(上述)”和“below(下述)”以及类似含义的词语应当指代本申请的整体而不是本申请的任何特定部分。
公开了这样的材料，组合物和组分，其可用于所公开的方法和组合物，可以与所公开的方法和组合物一起使用，可以用于制备或者是所公开的方法和组合物的产品。应当理解，当这些材料的组合、子集、相互作用、基团等被公开时，各种个体和集合性组合中的每一种都被特别地设想到，即使具体参考这些化合物的每一个和每一种单一组合和排列可能并没有被明确公开。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于所述方法中的步骤。因此，任何前述实施方案的特定要素可以组合或替换其他实施方案中的要素。例如，如果存在可以实施的各种附加步骤，则应理解，这些附加步骤中的每一个可以利用所公开方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来实施，并且每个这样的组合或组合的子集是特别设想到的并且应该被认为是公开的。另外，应当理解，本文描述的实施方案可以使用任何合适的材料来实施，例如本文其他地方描述的那些或本领域已知的那些。
本文引用的出版物和其被引用的主题在此特别通过引用整体并入。
以进一步说明而非限制的方式，下述实施例公开了本发明的其他方面。
实施例
实施例1
用一组心脏特异性转录因子(例如，包括最近描述的Gata4、MEF2C、TBX5、MESP1和MYOCD的组1)对非整合纳米颗粒进行功能化(Nam等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.110,5588-5593,(2010)，其通过引用整体并入本文)。简言之，用功能化的纳米颗粒处理人类体细胞一次或多次(2次或更多次)，这导致心脏特异性因子递送至经处理细胞的细胞质和细胞核中。将所述细胞在适当的培养基中维持一段较长的时间，并使用各种分子生物学、生物化学和细胞生物学技术监测人类体细胞直接重编程为功能性心脏细胞的结果。具体地，心脏特异性肌钙蛋白T或原肌球蛋白的表达可以通过RNA分离，然后进行实时或逆转录PCR，使用适当的抗体对细胞进行免疫染色，或通过对培养的细胞进行流式细胞术分析来确定。
实施例2
用于人类体细胞的直接重编程的心脏特异性因子的一个不同的组可包括用心脏特异性转录因子和微小RNA功能化的纳米颗粒。例如，组2含有四种蛋白质(Gata4、Hand2、TBX5和MYOCD)和两种微小RNA(miR-1和miR-133)。使用病毒载体将生物活性分子的这种组合引入细胞中在将人类成纤维细胞直接重编程以产生功能上有活性和收缩性的心肌样细胞方面是有效的(Wada等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.110,12667–12672,(2013))。此处，采用经重组蛋白和微小RNA的组2功能化的纳米颗粒处理人类成纤维细胞，并培养以诱导人iCM的产生。这些的替代性组合和/或心脏特异性因子的其他组一起触发人类体细胞重编程为心脏细胞。
这些非整合的功能化纳米颗粒的制备不涉及任何可以整合到细胞基因组中并破坏正常基因表达模式的DNA分子。在不脱离本发明的精神或其基本特征的情况下，本发明可以以其他特定形式实施。
所列举的细胞类型、因子和/或因子的组合是说明性的，而不是限制性的。其他因子和/或组合(包括新发现的那些)包括在本发明中，并且将以与本文所述相同的方式起作用。
实施例3
用一组肝细胞重编程转录因子对非整合的纳米颗粒进行功能化，所述组包括，例如最近描述的FOXA3、HNF1A和HNF4A(Huang等，Cell Stem Cell.,14,370-384,(2014),其通过引用整体并入本文)。简言之，用功能化的纳米颗粒处理人类体细胞一次或多次(2次或更多次)，这导致肝特异性因子递送至经处理细胞的细胞质和细胞核中。将所述细胞在适当的培养基中维持一段较长的时间，并使用各种分子生物学、生物化学和细胞生物学技术监测人类体细胞直接重编程为功能性肝细胞的结果。具体而言，白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)和细胞色素P450(CYP)酶的表达可以通过RNA分离，然后进行实时或逆转录PCR，使用适当的抗体对细胞进行免疫染色，或通过对培养的细胞进行流式细胞术分析来确定。此外，还可以通过使用液相色谱-质谱串联法评估诱导性CYP酶的代谢活性来确认新产生的肝细胞的功能性。尽管使用慢病毒载体重编程，但这些类型的肝细胞在急性肝功能衰竭的动物模型中显示出肝功能恢复(Huang等，Cell Stem Cell.,14,370-384(2014))。
所列举的细胞类型、因子和/或因子的组合是说明性的，而不是限制性的。其他因子和/或组合(包括新发现的那些)包括在本发明中，并且将以与本文所述相同的方式起作用。
实施例4
用一组神经重编程转录因子(最近描述的PAX6和/或SOX2)对非整合纳米颗粒进行功能化(Connor,Protocol Exchange doi:10.1038/protex.2015.034(2015),其通过引用整体并入本文)。简言之，用功能化的纳米颗粒处理人类体细胞一次或多次(2次或更多次)，这导致重编程因子递送至经处理细胞的细胞质和细胞核中。将所述细胞在适当的培养基中维持一段较长的时间，并使用各种分子生物学、生物化学和细胞生物学技术监测人类体细胞直接重编程为神经祖细胞的结果。具体地，神经元特异性TUJ1、MAP2或NSE表型标志物与酪氨酸羟化酶(TH)、vGlut1、GAD65/67和DARPP32一起在新生成的神经细胞中的表达可以通过RNA分离，然后进行实时或逆转录PCR，和/或使用适当的抗体对细胞进行免疫染色，或通过对从人类成纤维细胞直接重编程的培养的神经细胞进行流式细胞术分析来确定。
所列举的细胞类型、因子和/或因子的组合是说明性的，而不是限制性的。其他因子和/或组合(包括新发现的那些)包括在本发明中，并且将以与本文所述相同的方式起作用。
实施例5
众所周知，人们对药物的反应不同。这些差异可以在细胞水平上表现出来，因为基于个体间基因型或细胞的不同发展历史，他们的细胞对药物的反应不同(Turner RM等，Parsing interindividual drug variability:an emerging role for systemspharmacology.Rev Syst Biol Med.2015 7(4),221-41,其通过引用整体并入本文)。种系变体是遗传变异并且通常与药物的药代动力学行为相关，包括药物处置和最终药物功效和/或毒性，而体细胞突变通常可用于预测药物的药效学反应。药物种族特性或在药物反应或毒性中的种族多样性是一个日益公认的因素，其可解释药物反应的个体间差异。药物种族特性通常由种系药物基因组学因素和不同人群中单核苷酸多态性的分布来决定(PatelJN,Cancer pharmacogenomics:implications on ethnic diversity and drugresponse.Pharmacogenet Genomics.2015 25(5),223-30,其通过引用整体并入本文)。
因此，利用患者体细胞直接重编程后产生的患者特异性心脏细胞的药物筛选将反映由于个体对药物的独特反应而产生的偏差。也许初始药物筛选可以用来自一个来源或个体的细胞进行，但是将药物的应用性扩大到一般人群；需要对来自不同个体的细胞进行更广泛的选择。来源个体的数量越大，药物在一般人群中具有一致反应的可能性越大。如果没有这种更广泛的筛选工作，该药物可能仅对一定百分比的人群有效，例如50％，40％或20％，这一百分比降低了药物的利益率。在药物筛选中使用的用于产生心脏细胞的源个体数量越多，用给定药物有效治疗的人的百分比越大。
类似地，临床试验的参与者可以用细胞检测进行临床试验的资格预审，所述细胞检测使用由该候选参与者的体细胞直接重编程产生的心脏细胞。如果所述细胞对临床试验中评估的药物反应良好，则将该个体包括在临床试验中。如果所述细胞反应不好，可以将该个体排除在试验之外。通过对参与者进行预验证，可以确保更好的临床试验结果。
因此，尽管本领域有所进步，本公开提供了实施用于心血管和其他病症的药物的全面药物筛选和在临床试验中对参与者进行资格预审的组合物和技术，使得结果更准确地反映作为一个整体的整个目标群体并且避免个体反应偏差。
因此，前述实施方案被认为是说明性的而不是对本文所述发明的限制。因此，本发明的范围由所附权利要求而非前面的描述所表示，并且在权利要求等效的含义和范围内的所有变化均意图包含在中本文中。
此外，根据本公开范围的一些方法和组合物的说明性、非排他性实例的描述在以下编号的段落中给出。以下段落并非是这些描述的穷尽集合，并且不意图限定本公开的最小或最大范围或所需的要素或步骤。相反，提供它们作为在本公开范围内的所选方法和组合物的说明性实例；对更大或更窄范围或其组合的其他描述，虽然未在本文中具体列出，但仍然在本公开的范围内。
A1.一种诱导体细胞分化为目的特定细胞类型的组合物，其包含至少一种与中心纳米颗粒缀合的特定细胞类型诱导剂。
A2.A1段的组合物，其中所述至少一种特定细胞类型诱导剂通过所述中心纳米颗粒上的第一官能团与所述纳米颗粒缀合。
A3.A1和A2段中任一项的组合物，其中所述特定细胞类型为心肌样细胞(iCM)、肝细胞、神经细胞、β细胞、血液祖细胞、肌细胞、成骨细胞或其他细胞类型。
A4.A1至A3段中任一项的组合物，其中所述至少一种特定细胞类型诱导剂包含表1所列试剂中的至少一种或其功能结构域。
A5.A1至A4段中任一项的组合物，其中所述至少一种特定细胞类型诱导剂包含表1所列分子中的两种、三种、四种、五种或更多种，或其功能结构域。
A6.A1至A5段中任一项的组合物，其中所述至少一种特定细胞类型诱导剂包含表1所列的一种或多种蛋白或RNA，或其功能结构域。
A7.A1至A6段中任一项的组合物，其中所述特定细胞类型为心肌样细胞(iCM)，并且所述一种或多种特定细胞类型诱导剂选自Gata4、MEF2C、TBX5、MESP1、Hand2、MYOCD、miR-1和miR-133。
A8.A1至A7段中任一项的组合物，进一步包含穿透肽(CPP)，其通过所述纳米颗粒上的第二官能团与所述纳米颗粒缀和。
A9.A1至A8段中任一项的组合物，其中所述纳米颗粒的直径小于约100nm。
A10.A1至A9段的组合物，其中所述纳米颗粒的直径小于约75、50、40或30nm。
A11.A1至A10段中任一项的组合物，其中所述中心纳米颗粒包含铁或金分子。
A12.A1至A11段中任一项的组合物，其中所述中心纳米颗粒包含聚合分子。
A13.A1至A12段中任一项的组合物，其中所述纳米颗粒包含聚合物包衣。
A14.A8至A13段中任一项的组合物，其中所述纳米颗粒包含聚合物包衣，并且所述第一和/或第二官能团与所述聚合物包衣连接。
A15.A2至A14段中任一项的组合物，进一步包含第一接头分子，所述第一接头分子连接所述第一官能团和表1中列出的所述至少一种特定细胞类型诱导剂。
A16.A8至A15段中任一项的组合物，进一步包含连接所述第二官能团和所述CPP的第二接头分子。
A17.A18段的组合物，其中所述第一接头分子具有第一长度，其中所述第二接头分子具有第二长度，并且其中所述第二长度大于所述第一长度。
A18.A8至A17段中任一项的组合物，其中所述CPP包含至少五个碱性氨基酸。
A19.A8至A18段中任一项的组合物，其中所述CPP包含约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个碱性氨基酸。
A20.A8至A19段中任一项的组合物，其中所述CPP包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续碱性氨基酸。
B1.一种细胞，包含A1至A20段中任一项的组合物。
B2.B1段的细胞，其中所述细胞来源于体细胞。
B3.B1和B2段中任一项的细胞，其中所述细胞来源于成纤维细胞。
B4.B1至B3段中任一项的细胞，其中所述细胞为目的诱导性特定细胞类型。
B5.B4段的细胞，其中所述目的诱导性特定细胞类型为心肌样细胞(iCM)、肝细胞、神经细胞、β细胞、血液祖细胞、肌细胞、成骨细胞或其他细胞类型。
B6.B1至B5段中任一项的细胞，其中所述细胞是人类细胞。
C1.一种诱导体细胞分化为表1所列的目的特定细胞类型的方法，包括将所述体细胞与A1-A20段中任一项的组合物接触。
C2.C1段的方法，其中所述目的诱导性特定细胞类型为心肌样细胞(iCM)、肝细胞、神经细胞、β细胞、血液祖细胞、肌细胞、成骨细胞或其他细胞类型。
C3.C1和C2段中任一项的方法，其中所述体细胞是成纤维细胞。
C4.C1至C3段中任一项的方法，其中在足以允许所述体细胞分化的培养条件下体外接触所述体细胞。
C5.C1至C4段中任一项的方法，其中所述体细胞是人类细胞。
D1.一种体外筛选候选药物组合物在目的诱导性特定细胞类型中活性的方法，包括：
将所述诱导性特定细胞与所述候选药物组合物接触；以及
观察所述诱导性特定细胞的活性指标。
D2.D1段的方法，其中所述诱导性特定细胞选自表1所列的细胞类型之一。
D3.D1和D2段中任一项的方法，其中所述诱导性特定细胞为心肌样细胞(iCM)、肝细胞、神经细胞、β细胞、血液祖细胞、肌细胞、成骨细胞或其他细胞类型。
D4.D1至D3段中任一项的方法，进一步包括诱导从体细胞产生所述特定细胞。
D5.D1至D4段中任一项的方法，其中根据C1-C5段中任一项所述的方法诱导所述特定细胞。
D6.D4至D5段中任一项的方法，其中所述体细胞获自正常受试者或具有特定病理状态的受试者，并且所述活性指标为所述药物组合物用于治疗所述受试者中所述病理状态的活性指标。

Claims (38)

1.要求排他性权利或特权的本发明的实施方案定义如下：
一种诱导体细胞分化为目的特定细胞类型的组合物，其包含至少一种与中心纳米颗粒缀合的特定细胞类型诱导剂。
2.权利要求1的组合物，其中所述至少一种特定细胞类型诱导剂通过所述中心纳米颗粒上的第一官能团与所述纳米颗粒缀合。
3.权利要求1的组合物，其中所述特定细胞类型为心肌样细胞(iCM)、肝细胞、神经细胞、β细胞、血液祖细胞、肌细胞、成骨细胞或其他细胞类型。
4.权利要求1的组合物，其中所述至少一种特定细胞类型诱导剂包含表1所列试剂中的至少一种或其功能结构域。
5.权利要求1至4中任一项的组合物，其中所述至少一种特定细胞类型诱导剂包含表1所列分子中的两种、三种、四种、五种或更多种，或其功能结构域。
6.权利要求1至4中任一项的组合物，其中所述至少一种特定细胞类型诱导剂包含表1所列的试剂或其功能结构域。
7.权利要求1至4中任一项的组合物，其中所述至少一种特定细胞类型诱导剂包含表1所列的一种或多种蛋白或RNA，或其功能结构域。
8.权利要求4至7中任一项的组合物，其中所述特定细胞类型为心肌样细胞(iCM)，并且所述一种或多种特定细胞类型诱导剂选自Gata4、MEF2C、TBX5、MESP1、Hand2、MYOCD、miR-1和miR-133。
9.权利要求1至8中任一项的组合物，进一步包含穿透肽(CPP)，其通过所述纳米颗粒上的第二官能团与所述纳米颗粒缀和。
10.权利要求1至9中任一项的组合物，其中所述纳米颗粒的直径小于约100nm。
11.权利要求10的组合物，其中所述纳米颗粒的直径小于约75、50、40或30nm。
12.权利要求1至11中任一项的组合物，其中所述中心纳米颗粒包含铁或金分子。
13.权利要求1至12中任一项的组合物，其中所述中心纳米颗粒包含聚合分子。
14.权利要求1至13中任一项的组合物，其中所述纳米颗粒包含聚合物包衣。
15.权利要求9至14中任一项的组合物，其中所述纳米颗粒包含聚合物包衣，并且所述第一和/或第二官能团与所述聚合物包衣连接。
16.权利要求2至15中任一项的组合物，进一步包含第一接头分子，所述第一接头分子连接所述第一官能团和表1中列出的所述至少一种特定细胞类型诱导剂。
17.权利要求9至16中任一项的组合物，进一步包含连接所述第二官能团和所述CPP的第二接头分子。
18.权利要求17的组合物，其中所述第一接头分子具有第一长度，其中所述第二接头分子具有第二长度，并且其中所述第二长度大于所述第一长度。
19.权利要求9至18中任一项的组合物，其中所述CPP包含至少五个碱性氨基酸。
20.权利要求19的组合物，其中所述CPP包含约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个碱性氨基酸。
21.权利要求19和20中任一项的组合物，其中所述CPP包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续碱性氨基酸。
22.一种细胞，包含权利要求1-21中任一项的组合物。
23.权利要求22的细胞，其中所述细胞来源于体细胞。
24.权利要求23的细胞，其中所述细胞来源于成纤维细胞。
25.权利要求22的细胞，其中所述细胞为目的诱导性特定细胞类型。
26.权利要求25的细胞，其中所述目的诱导性特定细胞类型为心肌样细胞(iCM)、肝细胞、神经细胞、β细胞、血液祖细胞、肌细胞、成骨细胞或其他细胞类型。
27.权利要求22至26中任一项的细胞，其中所述细胞为人类细胞。
28.一种诱导体细胞分化为表1所列的目的特定细胞类型的方法，包括将所述体细胞与权利要求1至21中任一项的组合物接触。
29.权利要求28的方法，其中所述目的诱导性特定细胞类型为心肌样细胞(iCM)、肝细胞、神经细胞、β细胞、血液祖细胞、肌细胞、成骨细胞或其他细胞类型。
30.权利要求28和29中任一项的方法，其中所述体细胞是成纤维细胞。
31.权利要求28至30中任一项的方法，其中在足以允许所述体细胞分化的培养条件下体外接触所述体细胞。
32.权利要求28至31中任一项的方法，其中所述体细胞为人类细胞。
33.一种体外筛选候选药物组合物在目的诱导性特定细胞类型中活性的方法，包括：
将所述诱导性特定细胞与所述候选药物组合物接触；以及
观察所述诱导性特定细胞的活性指标。
34.权利要求33的方法，其中所述诱导性特定细胞选自表1所列的细胞类型之一。
35.权利要求33和34中任一项的方法，其中所述诱导性特定细胞为心肌样细胞(iCM)、肝细胞、神经细胞、β细胞、血液祖细胞、肌细胞、成骨细胞或其他细胞类型。
36.权利要求33至35中任一项的方法，进一步包括诱导从体细胞产生所述特定细胞。
37.权利要求33至36中任一项的方法，其中根据权利要求28至32中任一项所述的方法诱导所述特定细胞。
38.权利要求36至37中任一项的方法，其中所述体细胞获自正常受试者或具有特定病理状态的受试者，并且所述活性指标为所述药物组合物用于治疗所述受试者中所述病理状态的活性指标。
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