JPH10194997A - 新規遺伝子導入法及びこれに用いる複合体 - Google Patents
新規遺伝子導入法及びこれに用いる複合体Info
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- JPH10194997A JPH10194997A JP9000258A JP25897A JPH10194997A JP H10194997 A JPH10194997 A JP H10194997A JP 9000258 A JP9000258 A JP 9000258A JP 25897 A JP25897 A JP 25897A JP H10194997 A JPH10194997 A JP H10194997A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 遺伝子治療、免疫療法、遺伝子ワクチン等を
臨床応用する上で極めて重要であり、再現性の高い安全
且つ高効率な遺伝子の細胞への導入法を提供すること。 【解決手段】 動物培養細胞または動物体を構成する細
胞に遺伝子類を導入する方法に用いる複合体であって、
遺伝子類と高アルギニン含有カチオニックポリペプチド
を含有する複合体及び該複合体を用いて細胞を形質転換
することにより細胞に遺伝子を導入する方法。
臨床応用する上で極めて重要であり、再現性の高い安全
且つ高効率な遺伝子の細胞への導入法を提供すること。 【解決手段】 動物培養細胞または動物体を構成する細
胞に遺伝子類を導入する方法に用いる複合体であって、
遺伝子類と高アルギニン含有カチオニックポリペプチド
を含有する複合体及び該複合体を用いて細胞を形質転換
することにより細胞に遺伝子を導入する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、動物培養細胞また
は動物体を構成する細胞に遺伝子類を導入する方法に用
いる複合体であって、遺伝子類と高アルギニン含有カチ
オニックポリペプチドを含有する複合体及びこれを用い
た新規遺伝子導入法に関する。
は動物体を構成する細胞に遺伝子類を導入する方法に用
いる複合体であって、遺伝子類と高アルギニン含有カチ
オニックポリペプチドを含有する複合体及びこれを用い
た新規遺伝子導入法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子を細胞に導入する技術は、有用物
質（例えば血液凝固因子、エリスロポイエチンや組織型
プラスミノゲン活性化因子など）を産生する細胞を育種
する上で根幹となる技術の一つである。また、近年、遺
伝子の細胞への導入技術は、構造遺伝子を始めとしてア
ンチセンス或いはセンスヌクレオチド、デコイ型ヌクレ
オチド、リボザイム等を細胞に導入する遺伝子治療、免
疫療法、遺伝子ワクチン等を臨床応用する上で極めて重
要であり、再現性の高い安全且つ高効率な遺伝子の細胞
への導入法が望まれている。
質（例えば血液凝固因子、エリスロポイエチンや組織型
プラスミノゲン活性化因子など）を産生する細胞を育種
する上で根幹となる技術の一つである。また、近年、遺
伝子の細胞への導入技術は、構造遺伝子を始めとしてア
ンチセンス或いはセンスヌクレオチド、デコイ型ヌクレ
オチド、リボザイム等を細胞に導入する遺伝子治療、免
疫療法、遺伝子ワクチン等を臨床応用する上で極めて重
要であり、再現性の高い安全且つ高効率な遺伝子の細胞
への導入法が望まれている。
【０００３】一方、遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡあ
るいはＲＮＡとハイブリッドを形成する合成ヌクレオチ
ド、それらの修飾されたものおよびそれらの２つ以上の
混合物、複合体を包含する）を動物細胞へ導入する方法
が数多く研究され、リン酸カルシウム法、細胞融合法、
ＤＥＡＥデキストラン法、レトロウイルス等による感
染、リポソーム法、エレクトロポレーション、マイクロ
インジェクション法、遺伝子−ポリカチオン−リガンド
複合体をレセプターを介したエンドサイトーシスによる
導入法等が知られている。また、カチオニックリピッド
（リポフェクチン法）やポリリジンと遺伝子の複合体も
細胞への遺伝子導入に効果的である事が知られている
（レドリー、Ｆ．Ｄ．(Ledley,F.D.)ヒューマン・ジー
ン・セラピー(Human Gene Therapy)６巻、１１２９ペー
ジ）。
るいはＲＮＡとハイブリッドを形成する合成ヌクレオチ
ド、それらの修飾されたものおよびそれらの２つ以上の
混合物、複合体を包含する）を動物細胞へ導入する方法
が数多く研究され、リン酸カルシウム法、細胞融合法、
ＤＥＡＥデキストラン法、レトロウイルス等による感
染、リポソーム法、エレクトロポレーション、マイクロ
インジェクション法、遺伝子−ポリカチオン−リガンド
複合体をレセプターを介したエンドサイトーシスによる
導入法等が知られている。また、カチオニックリピッド
（リポフェクチン法）やポリリジンと遺伝子の複合体も
細胞への遺伝子導入に効果的である事が知られている
（レドリー、Ｆ．Ｄ．(Ledley,F.D.)ヒューマン・ジー
ン・セラピー(Human Gene Therapy)６巻、１１２９ペー
ジ）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上述のように遺伝子類
を動物細胞に導入する方法としていくつかの方法が知ら
れているが、それらの方法にもそれぞれいくつかの短所
が指摘されており、再現性の高い安全且つ高効率な遺伝
子類の細胞への導入法が望まれている。即ち、ウイルス
等のインフェクションによる細胞への外来遺伝子の導入
（レトロウイルス等による感染）は効率的な手法であ
り、遺伝子及び遺伝子制御の研究、ならびに遺伝子治療
において有用な材料として用いられているが、遺伝子治
療に用いる場合、ウイルスベクターを作製する宿主細胞
に依存する抗原性、ウイルスの安定性、免疫機構による
頻回投与の制限などの問題が推測されている。
を動物細胞に導入する方法としていくつかの方法が知ら
れているが、それらの方法にもそれぞれいくつかの短所
が指摘されており、再現性の高い安全且つ高効率な遺伝
子類の細胞への導入法が望まれている。即ち、ウイルス
等のインフェクションによる細胞への外来遺伝子の導入
（レトロウイルス等による感染）は効率的な手法であ
り、遺伝子及び遺伝子制御の研究、ならびに遺伝子治療
において有用な材料として用いられているが、遺伝子治
療に用いる場合、ウイルスベクターを作製する宿主細胞
に依存する抗原性、ウイルスの安定性、免疫機構による
頻回投与の制限などの問題が推測されている。
【０００５】一方、ウイルスを用いないリポソーム法、
リポフェクチン法等には遺伝子の導入効率等でまだまだ
改良すべき点が多い。さらにポリリジンと遺伝子の複合
体を細胞に導入する方法は、形質転換効率が低いので遺
伝子治療用の複合体としては実用的でない。
リポフェクチン法等には遺伝子の導入効率等でまだまだ
改良すべき点が多い。さらにポリリジンと遺伝子の複合
体を細胞に導入する方法は、形質転換効率が低いので遺
伝子治療用の複合体としては実用的でない。
【０００６】
【課題を解決しょうとするための手段】本発明者らは、
再現性の高い安全且つ高効率な遺伝子類の細胞への導入
法の開発を目指し鋭意研究を重ねた結果、アルギニン含
量が極めて高く（６５％）、ＤＮＡと複合体を形成する
プロタミンとＤＮＡとの複合体が細胞を形質転換する事
を見いだし、またアルギニンのホモポリマー（以下ポリ
アルギニンと称する）とＤＮＡの複合体が高効率に細胞
に取り込まれ、導入されたＤＮＡが細胞内で機能するこ
とを見いだし本発明に至った。更に好ましくは、ＤＮＡ
とこれらの高アルギニン含有カチオニックポリペプチド
との複合体の解析を進めた結果、不溶性複合体の大きさ
と形質転換効率の間の相関を見いだし本発明に至った。
再現性の高い安全且つ高効率な遺伝子類の細胞への導入
法の開発を目指し鋭意研究を重ねた結果、アルギニン含
量が極めて高く（６５％）、ＤＮＡと複合体を形成する
プロタミンとＤＮＡとの複合体が細胞を形質転換する事
を見いだし、またアルギニンのホモポリマー（以下ポリ
アルギニンと称する）とＤＮＡの複合体が高効率に細胞
に取り込まれ、導入されたＤＮＡが細胞内で機能するこ
とを見いだし本発明に至った。更に好ましくは、ＤＮＡ
とこれらの高アルギニン含有カチオニックポリペプチド
との複合体の解析を進めた結果、不溶性複合体の大きさ
と形質転換効率の間の相関を見いだし本発明に至った。
【０００７】即ち本発明の第１は、動物培養細胞または
動物体を構成する細胞に遺伝子類を導入する方法に用い
る複合体であって、遺伝子類と高アルギニン含有カチオ
ニックポリペプチドを含有する複合体に関するものであ
る。また本発明の第２は、動物培養細胞または動物体を
構成する細胞に遺伝子類を導入するにおいて、遺伝子類
と高アルギニン含有カチオニックポリペプチドを含有す
る複合体を用いて細胞を形質転換することにより細胞に
遺伝子類を導入する方法に関するものである。
動物体を構成する細胞に遺伝子類を導入する方法に用い
る複合体であって、遺伝子類と高アルギニン含有カチオ
ニックポリペプチドを含有する複合体に関するものであ
る。また本発明の第２は、動物培養細胞または動物体を
構成する細胞に遺伝子類を導入するにおいて、遺伝子類
と高アルギニン含有カチオニックポリペプチドを含有す
る複合体を用いて細胞を形質転換することにより細胞に
遺伝子類を導入する方法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の遺伝子類とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡあるい
はＲＮＡとハイブリッドを形成する合成ヌクレオチド、
それらの修飾されたものおよびそれらの２つ以上の混合
物、複合体を示す。さらに詳述すると遺伝子類は生体由
来或いは合成した２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖
ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、チオエステル結合を有する合成
ＤＮＡ、合成ＲＮＡなど、天然のＤＮＡあるいはＲＮＡ
とハイブリダイズし、高アルギニン含有カチオニックポ
リペプチドと生理的溶液中で不溶性複合体を形成するも
のであれば、どのような遺伝子であっても構わない。
本発明の遺伝子類とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡあるい
はＲＮＡとハイブリッドを形成する合成ヌクレオチド、
それらの修飾されたものおよびそれらの２つ以上の混合
物、複合体を示す。さらに詳述すると遺伝子類は生体由
来或いは合成した２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖
ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、チオエステル結合を有する合成
ＤＮＡ、合成ＲＮＡなど、天然のＤＮＡあるいはＲＮＡ
とハイブリダイズし、高アルギニン含有カチオニックポ
リペプチドと生理的溶液中で不溶性複合体を形成するも
のであれば、どのような遺伝子であっても構わない。
【０００９】また、本発明の遺伝子類の機能としては、
構造遺伝子、アンチセンス遺伝子、センス遺伝子、デコ
イ型遺伝子、リボザイム等、細胞の機能を修飾する遺伝
子が一般に用いられる。本発明に用いる高アルギニン含
有カチオニックポリペプチドは好ましくは分子量４，０
００〜２００，０００であり、分子量が４，０００より
小さいと不溶性複合体を形成しにくく、２００，０００
より大きいと複合体の形状が大きく、細胞に取り込まれ
にくいという不都合が起こる場合がある。
構造遺伝子、アンチセンス遺伝子、センス遺伝子、デコ
イ型遺伝子、リボザイム等、細胞の機能を修飾する遺伝
子が一般に用いられる。本発明に用いる高アルギニン含
有カチオニックポリペプチドは好ましくは分子量４，０
００〜２００，０００であり、分子量が４，０００より
小さいと不溶性複合体を形成しにくく、２００，０００
より大きいと複合体の形状が大きく、細胞に取り込まれ
にくいという不都合が起こる場合がある。
【００１０】もっとも本発明に用いるポリアルギニンは
分子量が４，０００〜２００，０００が好ましいが、さ
まざまな分子量を持つポリアルギニンの混合物であって
もよく、遺伝子類と安定な複合体を形成するポリアルギ
ニンであれば、どのような分子量を持っていても良い。
なおポリアルギニンは従来より抗原性が無いことが知ら
れており（セラ，M.(Sela,M.)、アバンスド・イミュノ
ロジー(Adv.Immunol.)５巻２９ページ １９６６年）、
更にポリアルギニンは生体内あるいは細胞内で分解され
生体にとって安全な天然アミノ酸であるアルギニンに分
解されるために、生体にとって極めて安全である。
分子量が４，０００〜２００，０００が好ましいが、さ
まざまな分子量を持つポリアルギニンの混合物であって
もよく、遺伝子類と安定な複合体を形成するポリアルギ
ニンであれば、どのような分子量を持っていても良い。
なおポリアルギニンは従来より抗原性が無いことが知ら
れており（セラ，M.(Sela,M.)、アバンスド・イミュノ
ロジー(Adv.Immunol.)５巻２９ページ １９６６年）、
更にポリアルギニンは生体内あるいは細胞内で分解され
生体にとって安全な天然アミノ酸であるアルギニンに分
解されるために、生体にとって極めて安全である。
【００１１】また本発明に用いる高アルギニン含有カチ
オニックポリペプチドは好ましくはアルギニン含量が４
４％〜１００％であり、アルギニン含量が４４％より低
いと複合体が形成されにくいという不都合が起こる場合
がある。また本発明に用いる高アルギニン含有カチオニ
ックポリペプチドとしては、化学合成ポリペプチド、組
換えＤＮＡ法によって生物で生産したポリペプチド等が
挙げられるが動物またはヒトのプロタミンを用いるのが
好ましい。天然に存在する高アルギニン含有カチオニッ
クポリペプチドであるプロタミンは全アミノ酸残基の約
４４％がアルギニンであり、分子量は約４，０００であ
る。本発明に使用するプロタミンとしてはどの生物由来
のプロタミンであってもよい。医療に用いる複合体に用
いるプロタミンとしては抗原性の無いヒト由来のプロタ
ミンが好適である。
オニックポリペプチドは好ましくはアルギニン含量が４
４％〜１００％であり、アルギニン含量が４４％より低
いと複合体が形成されにくいという不都合が起こる場合
がある。また本発明に用いる高アルギニン含有カチオニ
ックポリペプチドとしては、化学合成ポリペプチド、組
換えＤＮＡ法によって生物で生産したポリペプチド等が
挙げられるが動物またはヒトのプロタミンを用いるのが
好ましい。天然に存在する高アルギニン含有カチオニッ
クポリペプチドであるプロタミンは全アミノ酸残基の約
４４％がアルギニンであり、分子量は約４，０００であ
る。本発明に使用するプロタミンとしてはどの生物由来
のプロタミンであってもよい。医療に用いる複合体に用
いるプロタミンとしては抗原性の無いヒト由来のプロタ
ミンが好適である。
【００１２】また、本発明に用いる高アルギニン含有カ
チオニックポリペプチドとしてはアルギニンの含量を５
０％以上にした合成ポリペプチドも使用できるが、プロ
タミンの配列中に存在する抗原性の無い配列を持つ合成
ポリペプチドなども使用できる。これらの合成ポリペプ
チドは遺伝子組換えの手法で大腸菌や酵母等の微生物で
も生産可能である。
チオニックポリペプチドとしてはアルギニンの含量を５
０％以上にした合成ポリペプチドも使用できるが、プロ
タミンの配列中に存在する抗原性の無い配列を持つ合成
ポリペプチドなども使用できる。これらの合成ポリペプ
チドは遺伝子組換えの手法で大腸菌や酵母等の微生物で
も生産可能である。
【００１３】また本発明に用いる遺伝子類と高アルギニ
ン含有カチオニックポリペプチドを含有する複合体は以
下のように作製することが出来る。すなわち、遺伝子類
と高アルギニン含有カチオニックポリペプチドを適切な
溶媒（例えばリン酸緩衝液や細胞培養用の培地）中で混
合し適切な温度（例えば２０℃）で適切な時間（例えば
３０分間）処理することにより調製できる。
ン含有カチオニックポリペプチドを含有する複合体は以
下のように作製することが出来る。すなわち、遺伝子類
と高アルギニン含有カチオニックポリペプチドを適切な
溶媒（例えばリン酸緩衝液や細胞培養用の培地）中で混
合し適切な温度（例えば２０℃）で適切な時間（例えば
３０分間）処理することにより調製できる。
【００１４】また本発明の複合体は不溶性の微細複合体
のみが細胞を形質転換する能力を有し、また形質転換は
一般に生理的溶液あるいは生理的条件下で行われるとい
う理由から生理的溶液に不溶性であることが好ましい。
ここでいう生理的溶液とは、生理的食塩水、等張リン酸
緩衝液、血清蛋白を含む等張リン酸緩衝液、動物細胞の
培養用培地等が挙げられる。
のみが細胞を形質転換する能力を有し、また形質転換は
一般に生理的溶液あるいは生理的条件下で行われるとい
う理由から生理的溶液に不溶性であることが好ましい。
ここでいう生理的溶液とは、生理的食塩水、等張リン酸
緩衝液、血清蛋白を含む等張リン酸緩衝液、動物細胞の
培養用培地等が挙げられる。
【００１５】また本発明の複合体の遺伝子類のヌクレオ
チド：カチオニックポリペプチドのアルギニン残基のモ
ル比は１：１〜１：５．３であるのが好ましい。この範
囲を外れると、遺伝子類とカチオニックポリペプチドの
形成が不完全であったり、細胞の形質転換効率が低下す
るという不都合が起こる可能性があるからである。本発
明の複合体は遺伝子治療、遺伝子免疫療法あるいは遺伝
子ワクチン等に使用され、遺伝性疾患、感染症、癌、そ
の他の疾病の治療や予防に使用され得る。
チド：カチオニックポリペプチドのアルギニン残基のモ
ル比は１：１〜１：５．３であるのが好ましい。この範
囲を外れると、遺伝子類とカチオニックポリペプチドの
形成が不完全であったり、細胞の形質転換効率が低下す
るという不都合が起こる可能性があるからである。本発
明の複合体は遺伝子治療、遺伝子免疫療法あるいは遺伝
子ワクチン等に使用され、遺伝性疾患、感染症、癌、そ
の他の疾病の治療や予防に使用され得る。
【００１６】本発明の複合体には遺伝子類と高アルギニ
ン含有カチオニックポリペプチド以外の物質を含んでい
てもよい。複合体の細胞への取り込みと遺伝子の機能の
発現には、一般に複合体の細胞あるいは細胞表面上のレ
セプターへの結合、エンドサイトーシス、細胞質から核
への移行、遺伝子機能の発現など多くの段階を含む。従
って本発明の複合体にはこれらの段階を促進する第３の
物質を含んでいてもよい。それらの物質としてはペプチ
ダーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、細胞
のレセプターに対するリガンド、細胞とアフィニティー
を有する物質、核移行物質などが用いられる。
ン含有カチオニックポリペプチド以外の物質を含んでい
てもよい。複合体の細胞への取り込みと遺伝子の機能の
発現には、一般に複合体の細胞あるいは細胞表面上のレ
セプターへの結合、エンドサイトーシス、細胞質から核
への移行、遺伝子機能の発現など多くの段階を含む。従
って本発明の複合体にはこれらの段階を促進する第３の
物質を含んでいてもよい。それらの物質としてはペプチ
ダーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、細胞
のレセプターに対するリガンド、細胞とアフィニティー
を有する物質、核移行物質などが用いられる。
【００１７】本発明の複合体を用いた細胞の形質転換方
法は以下の通りである。即ち、適切な培養液で培養した
動物培養細胞の培地を遺伝子類と高アルギニン含有カチ
オニックポリペプチドを含有する複合体を含む生理的溶
液に置換し、適切な温度で適切な時間、適切な条件下で
処理することによって行われる。例えば、細胞の培地を
遺伝子と高アルギニン含有カチオニックポリペプチドと
の複合体を含む生理的溶液に置換し、３７℃、５％ＣＯ
2中でインキュベートすることによって行われる。
法は以下の通りである。即ち、適切な培養液で培養した
動物培養細胞の培地を遺伝子類と高アルギニン含有カチ
オニックポリペプチドを含有する複合体を含む生理的溶
液に置換し、適切な温度で適切な時間、適切な条件下で
処理することによって行われる。例えば、細胞の培地を
遺伝子と高アルギニン含有カチオニックポリペプチドと
の複合体を含む生理的溶液に置換し、３７℃、５％ＣＯ
2中でインキュベートすることによって行われる。
【００１８】本発明の複合体による細胞の形質転換効率
はレポーター遺伝子の発現効率を測定することにより定
量化が可能である。レポーター遺伝子としてはβ−ガラ
クトシダーゼを含むプラスミドｐＬＺＲＮ（リー,Ｘ.(L
i,X.)ら、ビロロジー(Virology)、１７１巻、３３１ペ
ージ、１９８９年）等が用いられる。形質転換を行う標
的細胞はどのような細胞でもよい。例えば、株化細胞、
生体より分離した細胞、臓器或いは培養細胞などがあげ
られる。
はレポーター遺伝子の発現効率を測定することにより定
量化が可能である。レポーター遺伝子としてはβ−ガラ
クトシダーゼを含むプラスミドｐＬＺＲＮ（リー,Ｘ.(L
i,X.)ら、ビロロジー(Virology)、１７１巻、３３１ペ
ージ、１９８９年）等が用いられる。形質転換を行う標
的細胞はどのような細胞でもよい。例えば、株化細胞、
生体より分離した細胞、臓器或いは培養細胞などがあげ
られる。
【００１９】また、本発明の複合体は直接生体に接種さ
れ、取り込んだ細胞の機能を修飾するために用いられ
る。
れ、取り込んだ細胞の機能を修飾するために用いられ
る。
【００２０】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、これらの実施例は本発明を制限するものではな
い。 （実施例１） ＤＮＡとポリーアルギニン複合体作製と
同複合体形成の確認方法 ＤＮＡとポリーアルギニンの複合体は、β−ガラクトシ
ダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）をレポータ
ー遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）として持つプ
ラスミッドｐＬＺＲＮのＤＮＡ ３０μＭ（リン酸とし
て）とポリアルギニン（平均分子量１３９，２００、シ
グマ社製） ０〜１００μＭ（アルギニン残基として）
をリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））中で混合し２０℃で３
０分間処理することにより調製した。同複合体形成の確
認は蛍光顕微鏡観察にて行った。
るが、これらの実施例は本発明を制限するものではな
い。 （実施例１） ＤＮＡとポリーアルギニン複合体作製と
同複合体形成の確認方法 ＤＮＡとポリーアルギニンの複合体は、β−ガラクトシ
ダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）をレポータ
ー遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）として持つプ
ラスミッドｐＬＺＲＮのＤＮＡ ３０μＭ（リン酸とし
て）とポリアルギニン（平均分子量１３９，２００、シ
グマ社製） ０〜１００μＭ（アルギニン残基として）
をリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））中で混合し２０℃で３
０分間処理することにより調製した。同複合体形成の確
認は蛍光顕微鏡観察にて行った。
【００２１】すなわち、同複合体に蛍光色素（４’，６
−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌ
ｅ：ＤＡＰＩ；和光純薬株式会社製；３０μＭ）と抗酸
化剤（２ーｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ；２−Ｍ
Ｅ；和光純薬株式会社製；４％（ｖ／ｖ））を添加し
た。この条件下ではＤＡＰＩが２０塩基に１分子結合す
る。複合体の大きさは、蛍光顕微鏡下でランダムに選択
した５０乃至１００視野で測定した最大複合体の長径の
平均値とした。
−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌ
ｅ：ＤＡＰＩ；和光純薬株式会社製；３０μＭ）と抗酸
化剤（２ーｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ；２−Ｍ
Ｅ；和光純薬株式会社製；４％（ｖ／ｖ））を添加し
た。この条件下ではＤＡＰＩが２０塩基に１分子結合す
る。複合体の大きさは、蛍光顕微鏡下でランダムに選択
した５０乃至１００視野で測定した最大複合体の長径の
平均値とした。
【００２２】実施例１に記載した方法により、ＤＮＡと
ポリアルギニン複合体を形成した。結果を図１に示す。
図１の縦軸はＤＮＡとポリアルギニン複合体の長径の平
均を示し、横軸はＤＮＡ３０μＭ（リン酸として）に対
するにポリアルギニンの濃度（アルギニン残基として）
を示す。図１よりＤＮＡとポリアルギニンは、モル濃度
比１：１．３以上（濃度３０μＭ：４０μＭ以上）で一
定の長さの複合体を形成していることがわかる。 （実施例２） ＤＮＡとポリアルギニン複合体の細胞内
での発現試験方法 ラット繊維芽細胞由来の接着細胞株２０８Ｆ（ビロロジ
ー(Virology)、９８巻４６１〜４６５ページ、１９７９
年）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むイスコフ修
飾ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ,ＩＭＤＭ：
Ｄｉｆｃｏ社製）を用い３７℃、５％ＣＯ2中で培養し
た。細胞数が２４穴の培養容器１穴あたり５×１０4個
になったものを使用した。導入する遺伝子はプラスミド
ｐＬＢＺ（β−ガラクトシダーゼをレポーター遺伝子と
して有する）のＤＮＡを用い、導入量を発現したβ−ガ
ラクトシダーゼ活性として測定した。ｐＬＢＺのＤＮＡ
（２μｇ）とＩＭＤＭで段階希釈したポリアルギニン
１０〜１６０μＭ（アルギニン残基として）を混合し
（最終液量２００μｌ）、ＤＮＡ−ポリアルギニン複合
体を調製した。トランスフェクションはラット繊維芽細
胞由来の接着細胞株２０８ＦをＰＢＳ中でＤＮＡ−ポリ
アルギニン複合体と混合し、３７℃で２時間処理するこ
とにより行った。細胞を１００μＭ クロロキン，１０
％ ＦＢＳを含むＩＭＤＭ中に３時間移した後、ＩＭＤ
Ｍで洗浄置換した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現
はβ−ガラクトシダーゼ・エンザイム・アッセイ・シス
テム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ
2中で２４時間インキュベーションすることにより測定
した。
ポリアルギニン複合体を形成した。結果を図１に示す。
図１の縦軸はＤＮＡとポリアルギニン複合体の長径の平
均を示し、横軸はＤＮＡ３０μＭ（リン酸として）に対
するにポリアルギニンの濃度（アルギニン残基として）
を示す。図１よりＤＮＡとポリアルギニンは、モル濃度
比１：１．３以上（濃度３０μＭ：４０μＭ以上）で一
定の長さの複合体を形成していることがわかる。 （実施例２） ＤＮＡとポリアルギニン複合体の細胞内
での発現試験方法 ラット繊維芽細胞由来の接着細胞株２０８Ｆ（ビロロジ
ー(Virology)、９８巻４６１〜４６５ページ、１９７９
年）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むイスコフ修
飾ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ,ＩＭＤＭ：
Ｄｉｆｃｏ社製）を用い３７℃、５％ＣＯ2中で培養し
た。細胞数が２４穴の培養容器１穴あたり５×１０4個
になったものを使用した。導入する遺伝子はプラスミド
ｐＬＢＺ（β−ガラクトシダーゼをレポーター遺伝子と
して有する）のＤＮＡを用い、導入量を発現したβ−ガ
ラクトシダーゼ活性として測定した。ｐＬＢＺのＤＮＡ
（２μｇ）とＩＭＤＭで段階希釈したポリアルギニン
１０〜１６０μＭ（アルギニン残基として）を混合し
（最終液量２００μｌ）、ＤＮＡ−ポリアルギニン複合
体を調製した。トランスフェクションはラット繊維芽細
胞由来の接着細胞株２０８ＦをＰＢＳ中でＤＮＡ−ポリ
アルギニン複合体と混合し、３７℃で２時間処理するこ
とにより行った。細胞を１００μＭ クロロキン，１０
％ ＦＢＳを含むＩＭＤＭ中に３時間移した後、ＩＭＤ
Ｍで洗浄置換した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現
はβ−ガラクトシダーゼ・エンザイム・アッセイ・シス
テム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ
2中で２４時間インキュベーションすることにより測定
した。
【００２３】なお、陽性対照として１０μｌのリポフェ
クチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）をポリアルギニンの代
わりに用いた。図２にＤＮＡとポリアルギニン複合体の
細胞内での発現の結果を示す。図２に於ける縦軸は導入
したＤＮＡの相対的発現率を示し、横軸はＤＮＡ３０μ
Ｍ（リン酸として）に対するポリアルギニンの濃度（ア
ルギニン残基として）を示す。
クチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）をポリアルギニンの代
わりに用いた。図２にＤＮＡとポリアルギニン複合体の
細胞内での発現の結果を示す。図２に於ける縦軸は導入
したＤＮＡの相対的発現率を示し、横軸はＤＮＡ３０μ
Ｍ（リン酸として）に対するポリアルギニンの濃度（ア
ルギニン残基として）を示す。
【００２４】図２より最大の遺伝子発現量を観察したモ
ル濃度比は１：２．７（ポリアルギニン濃度は８０μ
Ｍ）で、陽性対照のリポフェクチンの約５倍の導入，発
現を示した。さらにポリアルギニン濃度を増加すると遺
伝子の発現量がしだいに減少する。この減少は遺伝子の
導入効率が低下したためではなく、多量の遺伝子が導入
されたため、導入された細胞（ラット繊維芽細胞由来の
接着細胞株２０８Ｆ）に対して細胞毒性的に作用したた
めである。 （実施例３） ＤＮＡとプロタミン複合体細胞内での発
現試験方法 実施例２と同様にｐＬＢＺのＤＮＡ（２μｇ）とＩＭＤ
Ｍ培地で段階希釈した鮭精子プロタミン（清水製薬株式
会社製）１０〜１６０μＭ（アルギニン残基として）を
混合し（最終液量２００μｌ）、ＤＮＡ−プロタミン複
合体を調製した。トランスフェクションはラット繊維芽
細胞由来の接着細胞株２０８ＦをＰＢＳ中でＤＮＡ−プ
ロタミン複合体と混合し、３７℃で２時間処理すること
により行った。細胞を１００μＭクロロキン，１０％Ｆ
ＢＳを含むＩＭＤＭ中に３時間移した後、ＩＭＤＭで洗
浄置換した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現はβ−
ガラクトシダーゼ・エンザイム・アッセイ・システム
（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ2中
で２４時間インキュベーションすることにより測定し
た。
ル濃度比は１：２．７（ポリアルギニン濃度は８０μ
Ｍ）で、陽性対照のリポフェクチンの約５倍の導入，発
現を示した。さらにポリアルギニン濃度を増加すると遺
伝子の発現量がしだいに減少する。この減少は遺伝子の
導入効率が低下したためではなく、多量の遺伝子が導入
されたため、導入された細胞（ラット繊維芽細胞由来の
接着細胞株２０８Ｆ）に対して細胞毒性的に作用したた
めである。 （実施例３） ＤＮＡとプロタミン複合体細胞内での発
現試験方法 実施例２と同様にｐＬＢＺのＤＮＡ（２μｇ）とＩＭＤ
Ｍ培地で段階希釈した鮭精子プロタミン（清水製薬株式
会社製）１０〜１６０μＭ（アルギニン残基として）を
混合し（最終液量２００μｌ）、ＤＮＡ−プロタミン複
合体を調製した。トランスフェクションはラット繊維芽
細胞由来の接着細胞株２０８ＦをＰＢＳ中でＤＮＡ−プ
ロタミン複合体と混合し、３７℃で２時間処理すること
により行った。細胞を１００μＭクロロキン，１０％Ｆ
ＢＳを含むＩＭＤＭ中に３時間移した後、ＩＭＤＭで洗
浄置換した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現はβ−
ガラクトシダーゼ・エンザイム・アッセイ・システム
（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ2中
で２４時間インキュベーションすることにより測定し
た。
【００２５】なお、陽性対照として１０μｌのリポフェ
クチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）をプロタミンの代わり
に用いた。β−ガラクトシダーゼの発現試験は実施例２
と同一とした。ＤＮＡとプロタミン複合体の細胞内での
発現を、実施例２と同様に調べた結果、相対的β−ガラ
クトシダーゼ活性は２．４であった。
クチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）をプロタミンの代わり
に用いた。β−ガラクトシダーゼの発現試験は実施例２
と同一とした。ＤＮＡとプロタミン複合体の細胞内での
発現を、実施例２と同様に調べた結果、相対的β−ガラ
クトシダーゼ活性は２．４であった。
【００２６】本発明に関する実施例１〜３の結果を表１
に示す。
に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】（実施例４） 安定形質転換株の確認 ＤＮＡ−ポリアルギニン複合体によるβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子の安定形質転換株は、次のように確認した。
すなわち、ｐＬＢＺのＤＮＡ２μｇとＩＭＤＭで希釈し
たポリアルギニン ８０μＭ（アルギニン残基として）
を混合し（最終液量２００μｌ）、ＤＮＡ−ポリアルギ
ニン複合体を調製した。トランスフェクションはラット
繊維芽細胞由来の接着細胞株２０８ＦをＰＢＳ中でＤＮ
Ａ−ポリアルギニン複合体と混合し、３７℃で２時間処
理することにより行った。細胞を１００μＭクロロキ
ン，１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ中に３時間移した後、
ＩＭＤＭで洗浄置換した。更に、１０％ＦＢＳを含むＩ
ＭＤＭ培地に移し、３７℃、５％ＣＯ2中で１４日間培
養した。更にＧ４１８（４００μｇ／ｍｌ：和光純薬工
業株式会社製）を含む選択培地で１４日間培養しＧ４１
８に耐性な細胞を選択した。選択された細胞のβ−ガラ
クトシダーゼの発現試験は実施例２と同一とした。
ーゼ遺伝子の安定形質転換株は、次のように確認した。
すなわち、ｐＬＢＺのＤＮＡ２μｇとＩＭＤＭで希釈し
たポリアルギニン ８０μＭ（アルギニン残基として）
を混合し（最終液量２００μｌ）、ＤＮＡ−ポリアルギ
ニン複合体を調製した。トランスフェクションはラット
繊維芽細胞由来の接着細胞株２０８ＦをＰＢＳ中でＤＮ
Ａ−ポリアルギニン複合体と混合し、３７℃で２時間処
理することにより行った。細胞を１００μＭクロロキ
ン，１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ中に３時間移した後、
ＩＭＤＭで洗浄置換した。更に、１０％ＦＢＳを含むＩ
ＭＤＭ培地に移し、３７℃、５％ＣＯ2中で１４日間培
養した。更にＧ４１８（４００μｇ／ｍｌ：和光純薬工
業株式会社製）を含む選択培地で１４日間培養しＧ４１
８に耐性な細胞を選択した。選択された細胞のβ−ガラ
クトシダーゼの発現試験は実施例２と同一とした。
【００２９】形質転換後、実施例４によって選択された
ＤＮＡ−ポリアルギニン複合体によるβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子の安定形質転換株は、一過性発現に比較して
高いβ−ガラクトシダーゼ活性を有していた。
ＤＮＡ−ポリアルギニン複合体によるβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子の安定形質転換株は、一過性発現に比較して
高いβ−ガラクトシダーゼ活性を有していた。
【００３０】
【発明の効果】カチオニックなポリアルギニンは遺伝子
類と再現性良く不溶性複合体を形成する。この複合体
は、生理的溶液中で安定であり、生体内(in vivo)およ
び生体外(in vitro)の標的細胞に効率的に導入、発現さ
せることができ、遺伝子治療、遺伝子ワクチン或いは有
用物質の産生細胞の育種等に利用可能である。またウイ
ルスをベクターとする場合より抗原性が無い、または低
下させているため安全且つ再現性良く使用できる。
類と再現性良く不溶性複合体を形成する。この複合体
は、生理的溶液中で安定であり、生体内(in vivo)およ
び生体外(in vitro)の標的細胞に効率的に導入、発現さ
せることができ、遺伝子治療、遺伝子ワクチン或いは有
用物質の産生細胞の育種等に利用可能である。またウイ
ルスをベクターとする場合より抗原性が無い、または低
下させているため安全且つ再現性良く使用できる。
【図１】ＤＮＡとポリアルギニン複合体の形成を示す図
である。
である。
【図２】ＤＮＡとポリアルギニン複合体の細胞内での発
現を示す図である。
現を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Claims (12)
- 【請求項１】 動物培養細胞または動物体を構成する細
胞に遺伝子類を導入する方法に用いる複合体であって、
遺伝子類と高アルギニン含有カチオニックポリペプチド
を含有する複合体。 - 【請求項２】 カチオニックポリペプチドの４４〜１０
０％がアルギニン残基である請求項１記載の複合体。 - 【請求項３】 カチオニックポリペプチドの分子量が
４，０００〜２００，０００である請求項１、２記載の
複合体。 - 【請求項４】 カチオニックポリペプチドが動物または
ヒトのプロタミンである請求項１記載の複合体。 - 【請求項５】 複合体が生理的溶液に不溶性である請求
項１、２、３、４記載の複合体。 - 【請求項６】 複合体の遺伝子類のヌクレオチド：カチ
オニックポリペプチドのアルギニン残基のモル比が１：
１〜１：５．３である請求項５記載の複合体。 - 【請求項７】 動物培養細胞または動物体を構成する細
胞に遺伝子類を導入するにおいて、遺伝子類と高アルギ
ニン含有カチオニックポリペプチドを含有する複合体を
用いて細胞を形質転換することにより細胞に遺伝子類を
導入する方法。 - 【請求項８】 カチオニックポリペプチドの４４〜１０
０％がアルギニンである請求項７記載の細胞に遺伝子類
を導入する方法。 - 【請求項９】 カチオニックポリペプチドの分子量が
４，０００〜２００，０００である請求項７、８記載の
細胞に遺伝子類を導入する方法。 - 【請求項１０】 カチオニックポリペプチドが動物また
はヒトのプロタミンである請求項７記載の細胞に遺伝子
類を導入する方法。 - 【請求項１１】 複合体が生理的溶液に不溶性である請
求項７、８、９、１０記載の細胞に遺伝子類を導入する
方法。 - 【請求項１２】 複合体の遺伝子類のヌクレオチド：カ
チオニックポリペプチドのアルギニン残基のモル比が
１：１〜１：５．３である請求項１１記載の細胞に遺伝
子類を導入する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9000258A JPH10194997A (ja) | 1997-01-06 | 1997-01-06 | 新規遺伝子導入法及びこれに用いる複合体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9000258A JPH10194997A (ja) | 1997-01-06 | 1997-01-06 | 新規遺伝子導入法及びこれに用いる複合体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10194997A true JPH10194997A (ja) | 1998-07-28 |
Family
ID=11468902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9000258A Pending JPH10194997A (ja) | 1997-01-06 | 1997-01-06 | 新規遺伝子導入法及びこれに用いる複合体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10194997A (ja) |
-
1997
- 1997-01-06 JP JP9000258A patent/JPH10194997A/ja active Pending
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