JP2002338503A - Ｄｎａトランスフェクション用組成物 - Google Patents

Ｄｎａトランスフェクション用組成物

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JP2002338503A JP2001228550A JP2001228550A JP2002338503A JP 2002338503 A JP2002338503 A JP 2002338503A JP 2001228550 A JP2001228550 A JP 2001228550A JP 2001228550 A JP2001228550 A JP 2001228550A JP 2002338503 A JP2002338503 A JP 2002338503A
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シュラエガー エルンスト−ユアゲン
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 DNAトランスフェクション用組成物 【解決手段】 脂質および塩基性の膜傷害性ペプチド
からなる、下記の式Iによって表わされるコンジュゲー
トを含む新規なトランスフェクション試薬が開示され
る： 【化10】 式中R1およびR2は直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和
脂肪族カルボン酸のヒドロカルビル部分、およびにリン
脂質部分からなる群より選択され；R3は逆向きのアミド
主鎖を有する塩基性の膜傷害性ペプチドであり；Yは炭
素数2-10のアルキレンであり；そしてXは-C(O)-NH-、-S
-S-およびそれらの塩からなる群より選択される。特に
好ましい化合物は、R1およびR2がそれぞれ独立して炭素
数12-20のカルボン酸のアシル部分である、特にR1およ
びR2がオレオイルである化合物である。さらに、タンパ
ク質加水分解物の形態のアミノ酸濃縮物と共に本発明の
化合物を使用することによりトランスフェクション効率
およびDNA複合体形成が増強されるトランスフェクショ
ン方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、DNA、RNA、ペプチ
ドおよびタンパク質、等の生物学的に活性な分子の真核
細胞への非ウイルス性導入に有用な新規化合物および試
薬組成物に関する。より具体的には、本発明は脂質トラ
ンスフェクションに有用な化合物および組成物に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子導入技術は大変興味深い分野とな
ってきた。外因性遺伝子の細胞への導入、すなわちトラ
ンスフェクションは、遺伝子操作および組換えタンパク
質の製造から遺伝子治療に至るまで多くの重要な科学的
および医学的用途を有する。いる。
【０００３】ウイルスは進化して遺伝子導入に対する種
々の細胞性障壁を回避してきた。そして実際トランスフ
ェクションのための選り抜きのベクターとなった。現
在、レトロウイルス、アデノウイルスおよびヘルペスウ
イルスを含む多数のウイルスが治療用遺伝子を担持する
ように遺伝子操作され、そして遺伝子治療のためのヒト
臨床トライアルに使用されている。しかし、感染性反応
および免疫学的反応の危険が残っており、またウイルス
の大規模生産は困難で、かつ時間を要する。
【０００４】これらの種々の理由により、DNAを細胞中
に運ぶための非ウイルス性の系が開発された。例えば、
LipofectinTMとして市販されているカチオン性脂質ジオ
レオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムに基づ
くトランスフェクション技法(Felgnerら, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84, 7413-7417, 1987)などである。こ
のトランスフェクション技法が見いだされてから、さら
に多数のカチオン性脂質が合成され、そしてそのうちの
いくつかは実験用トランスフェクション試薬として市販
されている。例としては、DOGS (TransfectamTM)、DOSP
A (LipofectamineTM)およびDOTAP (DOTAPTM)が挙げられ
る。
【０００５】しかし、非ウイルス性遺伝子デリバリー系
の開発における重大な進歩にもかかわらず、さらに効果
的な技法が必要とされている。なぜなら、合成系のトラ
ンスフェクション効率は通常ウイルスベクターのそれよ
りも低いからである。さらに、in vivoにおいて多くの
問題が生じ、また非ウイルス性系の生物学的流体中にお
ける安定性の乏しさはin vivoにおける高レベルで、か
つ再現可能なレベルのトランスフェクションを可能とし
ない。
【０００６】DNAなどのオリゴヌクレオチドによる細胞
のトランスフェクションは、例えば、宿主細胞または生
物中で該宿主細胞または生物によって通常では発現され
ないタンパク質を発現させるために用いることができ
る。例えば、マーカー遺伝子産物を細胞中で発現させる
ため、または組換えタンパク質のような興味のあるタン
パク質（これは後に細胞から回収される）を発現させる
ため、プラスミドと呼ばれるDNA分子を該プラスミドに
よってコードされている遺伝子を通常では含有しない細
胞に導入することができる（Sambrookら, Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Ha
rbor, 1989）。オリゴヌクレオチドの細胞へのトランス
フェクションを治療に用いることも可能である。例え
ば、細胞または細胞核内で、アンチセンスオリゴヌクレ
オチドは、標的である１本鎖核酸分子にワトソン・クリ
ック塩基対合によって、または２本鎖核酸にフーグステ
ィーン塩基対合によって一旦結合し、そしてそのように
結合しながら標的核酸の機能を(a) 正常な転写、スプラ
イシング、または翻訳に必要な因子の結合を妨げること
によって、(b) RNアーゼHによるmRNAの酵素的分解の引
き金を引くことによって、または (c)該アンチセンスオ
リゴヌクレオチドに直接結合した反応性の基によって標
的を破壊することによって、標的の機能を破壊する(Zam
ecnicら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 280-284, 1
978)。他の治療的用途には遺伝子治療またはDNAベース
のワクチン接種が挙げられる。
【０００７】タンパク質および他の巨大分子は、治療お
よびスクリーニングの目的で細胞中にトランスフェクト
される。例えば、免疫原性タンパク質をそれがより効率
的にプロセシングされて細胞表面に提示されるように細
胞中に導入し、それによって免疫原性応答を増大させる
ことによって、免疫感作が増強される。細胞内で作用す
る陰性に荷電した巨大分子は、細胞膜を通って該分子が
その効果を発揮する細胞質へと輸送される。DNAの転写
を促進する、または妨げる因子をスクリーニング試験に
用いて、目的の遺伝子の転写を確かめることができる。
化合物をスクリーニングして特定の巨大分子（例えば、
細胞受容体）に対する化合物の効果を測定するために使
用されるこれらの転写アッセイは周知である。
【０００８】膜の障壁機能を妨害することによって作用
する細胞溶解性抗菌性ペプチドがSaberwalらによって B
iochim. Biophys. Acta 1197, 109-131, 1994に総論さ
れている。抗菌活性を有する、ある種の脂肪酸を担持す
る塩基性ペプチドがVolgerら, Helv. Chim. Acta 47, 5
26-543, 1964に開示されている。オリゴヌクレオチドを
細胞中に輸送するためのキャリアーとして使用されるポ
リ（リシン-セリン）ランダムポリマーがヨーロッパ特
許公開EP-A-727 223号に開示されている。
【０００９】ヨーロッパ特許公開EP-A-784 984号および
Legendreら, Bioconjugate Chem. 8, 57-63, 1997は、
ポリヌクレオチドおよびアニオン性巨大分子に結合す
る、そして細胞のトランスフェクションに用いることが
できる、脂質および塩基性の膜傷害性ペプチドからなる
コンジュゲートを記述している。該コンジュゲートのペ
プチド部分は、天然のアミド結合によって連結された天
然のアミノ酸からなる。
【００１０】しかしながら、非ウイルス性遺伝子デリバ
リー系の開発における重大な進歩にもかかわらず、より
効果的な技法がなお必要とされている。なぜなら、合成
系のトランスフェクション効率は通常ウイルスベクター
のそれよりも低いからである。さらに、部分的には非ウ
イルス性系の生物学的流体中における安定性の乏しさが
原因でin vivoおよびin vitroにおいて多くの問題が生
じ、また培養培地は高レベルで、かつ再現可能なレベル
のトランスフェクションを可能としない。
【００１１】トランスフェクション実験に用いられてい
る多くの公知化合物は真核細胞に対して毒性である。さ
らに、ならし培地が公知のトランスフェクション剤の効
果を低下させる場合、生産規模の拡大において問題が起
こりうる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、公知のトラ
ンスフェクション剤に関連する不都合な点を回避する新
規化合物に向けられている。
【００１３】
【問題を解決するための手段】その１つの態様におい
て、本発明は、脂質および改変された、塩基性の、膜傷
害性ペプチドからなるコンジュゲートである新規化合物
に関する。この化合物は、該ペプチドが逆向きのアミド
主鎖を有することによって特徴づけられる。
【００１４】「コンジュゲート」という用語は、ペプチ
ドと化学的に結合した脂質からなる化合物を意味する。
この化学的結合とは、例えば、上記脂質中に存在する、
もしくはそれに結合した硫黄原子と上記ペプチド中に存
在する、もしくはそれに結合した硫黄原子の間に形成さ
れたジスルフィド結合、または上記脂質中に存在する、
もしくはそれに結合したカルボキシル基と上記ペプチド
のアミノ基の間に形成されたアミド結合によるものであ
る。
【００１５】本明細書に用いる「脂質」という用語は、
直鎖、分枝鎖、飽和または不飽和の脂肪族カルボン酸、
およびリン脂質を含む。脂肪族カルボン酸の例として
は、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイ
ン酸、および(CH3(CH2)n)2CHCOOH（式中、nは3から19の
整数）が挙げられる。リン脂質の例としては、ジオレオ
イルホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチ
ジルエタノールアミンが挙げられる。
【００１６】「塩基性ペプチド」という用語は、少なく
とも１つの塩基性アミノ酸を含有するペプチドを意味す
る。そのような塩基性アミノ酸の例としては、α-およ
びβ-ジアミノプロピオン酸、α-およびγ-ジアミノブ
チル酸、等の天然および非天然のジアミノモノカルボン
酸、リシン、アルギニン、オルニチン、およびp-アミノ
フェニルアラニンが挙げられる。
【００１７】「膜傷害性ペプチド」という用語は、膜の
障壁機能を乱す細胞溶解性または抗菌性ペプチドを意味
する(G. SaberwalおよびR. Nagaraj, BBA 1197, 109-13
1, 1994)。塩基性、細胞溶解性ペプチドの例としては、
メリチン、ヘモリシン、マストパラン(mastoparan)、ボ
ンボリチン(bombolitin)、クラブロリン(crabrolin)お
よびそれらの誘導体が挙げられる。塩基性、抗菌性ペプ
チドの例としては、セクロピン(cecropin)、マゲイニ
ン、グラミシジンＳ、チロシジンおよびそれらの誘導体
が挙げられる。
【００１８】「誘導体」という用語は、１つ以上のアミ
ノ酸残基が、元のペプチドの生物学的活性を実質的に変
えることなく欠失している、付加されている、または他
のアミノ酸残基と置換されているペプチドをいう。すな
わち、誘導体は巨大分子、好ましくはポリヌクレオチド
の細胞へのトランスフェクションを可能とする。「誘導
体」という用語はまた、末端カルボキシル基がエステル
化されて特にメチルおよびエチルエステル等の低級アル
キルエステルを形成している、またはアミド、低級アル
キルアミドもしくはジ低級アルキルアミドまたはヒドラ
ジドに変換されているペプチドをもいう。「誘導体」と
いう用語はまた、Ｎ末端のNH2基がアシル化されてアミ
ドまたは低級アルキルアミドを形成していてもよいペプ
チドに関する。特に、該NH2基はアセチル化される。
「低級」という用語は、1-6個の炭素原子を含有する基
を意味する。
【００１９】「逆向きのアミド主鎖」という用語は、特
徴的に親ペプチドと同一の組成を有するが、配列が逆に
なっている（すなわち、ＮからＣ方向に配列を読んだ場
合、１、２、３、．．．ｎとなる代わりにｎ、．．．
３、２、１となっている）レトロペプチド(retro-pepti
de)をいう。両者は正常なペプチド結合を有する。
【００２０】 本出願においては、アミノ酸を示すために以下の標準的略語を用いる： アラニン Ala D-アラニン D-Ala グルタミン酸 Glu D-グルタミン酸 D-Glu グルタミン Gln D-グルタミン D-Gln アスパラギン酸 Asp D-アスパラギン酸 D-Asp アスパラギン Asn D-アスパラギン D-Asn ロイシン Leu D-ロイシン D-Leu グリシン Gly リシン Lys D-リシン D-Lys セリン Ser D-セリン D-Ser バリン Val D-バリン D-Val アルギニン Arg D-アルギニン D-Arg トレオニン Thr D-トレオニン D-Thr プロリン Pro D-プロリン D-Pro イソロイシン Ile D-イソロイシン D-Ile メチオニン Met D-メチオニン D-Met フェニルアラニン Phe D-フェニルアラニン D-Phe チロシン Tyr D-チロシン D-Tyr システイン Cys D-システイン D-Cys トリプトファン Trp D-トリプトファン D-Trp ヒスチジン His D-ヒスチジン D-His オルニチン Orn D-オルニチン D-Orn
【００２１】
【発明の実施の形態】好ましい実施形態において、本発
明の新規化合物は下記の式Iで表される化合物である：
【化４】 式中、R1およびR2は、直鎖および分枝鎖の、飽和および
不飽和脂肪族カルボン酸のヒドロカルビル部分ならびに
リン脂質部分からなる群より選択され、R3は逆向きのア
ミド主鎖を有する塩基性の膜傷害性ペプチドであり、Y
は炭素数2-10のアルキレンであり、Xは−C(O)−NH−、
−S−S−およびそれらの塩から選択される。
【００２２】特に好ましい化合物は、式中R1およびR2が
独立して、炭素数2-10のカルボン酸のアシル部分である
化合物である。「炭素数2-10」という用語は、12〜20個
の炭素原子数を意味する。アシル部分R1およびR2は、直
鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和部分でありうる。
このような部分の例としては、ラウロイル、パルミトイ
ル、ステアロイルおよびオレオイルがある。好ましい態
様において、R1およびR2はオレオイルである。好ましく
は、Yはエチレン、プロピレンまたはデカメチレンであ
る。好ましくは、Xは−S−S−である。
【００２３】R3は、逆向きのアミド主鎖を有する塩基性
の膜傷害性ペプチドである。例えば、R3は、Gln−Gln−
Arg−Lys−Arg−Lys−Ile−Trp−Ser−Ile−Leu−Ala−
Pro−Leu−Gly−Thr−Thr−Leu−Val−Lys−Leu−Val−
Ala−Gly−Ile−NH−CH[CONH2]−(CH2)−である。該ペ
プチドは逆向きのアミド主鎖を有する。R3は、好ましく
は少なくとも50％、より好ましくは65％、そして更によ
り好ましくは80％のD−アミノ酸またはそれらの誘導体
を含む。最も好ましい実施形態では、全てのアミノ酸が
D−アミノ酸である。「D−アミノ酸」という用語は、天
然および非天然のD−α−アミノ炭酸およびそれらの誘
導体を指す。更に、R3はまた、マガイニン、セクロピ
ン、デフェンシンなどの膜傷害性ペプチド配列、または
例えば、以下に記載する方法、特に実施例１および２の
様式と同じように、レトロ−インベルソペプチド(retro
-inverso peptide)として合成され、脂質にコンジュゲ
ートするように誘導体化された、セクロピン−メリチン
（Hancockら、TIBTECH, vol.16, 82-88, 1998）などの
キメラを含む。
【００２４】「レトロ−インベルソペプチド」という用
語は、全てのL−レトロペプチドの全てのD−類似体を意
味する。
【００２５】更に好ましい実施形態では、R3は、D-Gln
−D-Gln−D-Arg−D-Lys−D-Arg−D-Lys−D-Ile−D-Trp
−D-Ser−D-Ile−D-Leu−D-Ala−D-Pro−D-Leu−D-Gly
−D-Thr−D-Thr−D-Leu−D-Val−D-Lys−D-Leu−D-Val
−D-Ala−D-Gly−D-Ile−NH−CH[CONH2]−CH−(CH2)−
である。
【００２６】最も好ましい化合物は以下のものである。
【００２７】
【化５】 本発明の更なる実施形態は、逆向きのアミド主鎖を有
し、少なくとも50％、より好ましくは65％、そして更に
より好ましくは80％のD−アミノ酸およびその誘導体か
らなる、R3のペプチド部分、特に中間体ペプチドGln−G
ln−Arg−Lys−Arg−Lys−Ile−Trp−Ser−Ile−Leu−A
la−Pro−Leu−Gly−Thr−Thr−Leu−Val−Lys−Leu−V
al−Ala−Gly−Ile−Cys−NH2、およびその誘導体、そ
れらの塩ならびにそれらの溶媒和物に関する。最も好ま
しい実施形態では、全てのアミノ酸がD−アミノ酸であ
る。「D−アミノ酸」という用語は、天然および非天然
のD−α−アミノ炭酸およびそれらの誘導体を指す。
【００２８】好ましい実施形態において、前記ペプチド
は、D-Gln−D-Gln−D-Arg−D-Lys−D-Arg−D-Lys−D-Il
e−D-Trp−D-Ser−D-Ile−D-Leu−D-Ala−D-Pro−D-Leu
−D-Gly−D-Thr−D-Thr−D-Leu−D-Val−D-Lys−D-Leu
−D-Val−D-Ala−D-Gly−D-Ile−D-Cys−NH2である。
【００２９】他の態様において、本発明は、上記で定義
された新規化合物、すなわち脂質と塩基性の膜傷害性ペ
プチド（該ペプチドは逆向きのアミド主鎖を含む）との
コンジュゲート、ならびに、少なくとも一つのそのよう
な化合物、ポリヌクレオチドまたは任意の他のアニオン
性巨大分子、および任意にヘルパー脂質、短鎖リン脂
質、またはカチオン性脂質および任意に本発明のコンジ
ュゲート（すなわち式IまたはIIの化合物）以外に追加
の既知トランスフェクション剤を含む組成物、の製造方
法に関する。更に他の態様において、本発明は、脂質と
塩基性の膜傷害性ペプチドとのコンジュゲート、ならび
にヘルパー脂質、短鎖リン脂質、またはカチオン性脂質
そして任意に本発明のコンジュゲート（例えば式Iの化
合物）以外に追加の既知トランスフェクション剤を含む
組成物に関する。更に本発明は、ポリヌクレオチドまた
は任意の他のアニオン性巨大分子による細胞のトランス
フェクションに、前記新規化合物をキャリヤーとして使
用することに関する。さらにまた、本発明は、DNA複合
体形成をさらなるアミノ酸、特にタンパク質加水分解物
の形態のアミノ酸の存在下にて実施する場合において、
トランスフェクション効率の向上に関する。
【００３０】本発明により提供される化合物を、式R3NH
2のペプチドと式IIの脂質とを反応させることにより、
【化６】 または式R3SHと、式IIIの脂質とを反応させることによ
り、調製することができる。
【００３１】
【化７】 式中、R1、R2、R3およびYは上記で定義される通りであ
り、Zは2−ピリジンチオ（pyridinethio）などの脱離基
である。これらの反応は本質的に既知の方法で実施しう
る。
【００３２】式R3NH2の化合物（式中、ペプチド部分は
逆向きのアミド主鎖を含む）は、当業者に公知の方法で
調製しうる。対応する方法は、例えば、合成メリチン、
そのエナンチオ、レトロおよびレトロエナンチオ異性体
ならびにその誘導体の調製について記載されている（Ju
vvadiら、J. Am. Chem. Soc. 118, 8989-8997, 199
6）。
【００３３】前記ペプチドを、固相合成法により調製し
てもよい。この方法では、ペプチドがポリマー性支持体
に結合している間に合成が起こるので、洗浄ステップに
よって生成物と副生成物とを分離させることができる。
アシル化反応の完了を、過剰量の可溶性試薬を使用して
確認する。合成には、配列中の最初のアミノ酸の固体支
持体への共有結合性固着、その次に、続いて行う後継の
（incoming）アミノ酸誘導体への結合のための、保護さ
れているアミノ機能の脱保護が含まれる。脱保護および
結合をnサイクル行った後、化学的切断反応により、ペ
プチドを固相から解離する。好ましい実施形態では、D
−アミノ酸を使用する。
【００３４】従って、式R3SHのペプチドと式IIの脂質と
のカップリングは、ペプチド結合を生成させる公知方法
に類似し、反応するアミノ酸以外のアミノ酸を保護した
化合物を適切な溶媒中でジシクロヘキシルカルボジイミ
ドのような縮合剤の存在下で反応させることによって達
成できる。
【００３５】式R3SHのペプチドと式R−SZの化合物との
反応を、両方の反応物が溶解できる適切な溶媒または溶
媒混合物中で行うことができる。式R−SZの化合物は、
例えばクロロホルムなどの有機溶媒中に溶解させること
ができる。ペプチドR3SHを、アセトニトリルなどの水と
混和できる有機溶媒の適切な量を含有する、リン酸バッ
ファーなどの水性バッファー溶液中に適切に溶解し、単
一相反応系の形成を達成する。
【００３６】式IIおよびIIIの化合物は既知であるか、
または例えばBiochim. Biophys. Acta, 862, 435-439,
1986に記載のような既知の方法で調製することができ
る。例えば、下記の式の化合物
【化８】 （式中、R1およびR2はオレオイル、およびYはエチレ
ン、プロピレンまたはデカメチレンである）、および下
記の式の化合物
【化９】 （式中、R1およびR2はオレオイルであり、Yはエチレン
である。Zは2−ピリジンチオである）、これらの化合物
は、Avanti Polar Lipids, Alabaster, AlabamaよりN−
スクシニル−PE、N−グルタリル−PE、N−ドデカニル−
PEおよびN−PDP−PEとして市販されている。
【００３７】任意のアニオン性巨大分子を、式Iの化合
物を用いて細胞中にトランスフェクトしうる。「アニオ
ン性巨大分子」は、1分子当り少なくとも1の負電荷を有
する巨大分子である。本発明に従ってトランスフェクト
しうるアニオン性巨大分子の例としては、デオキシリボ
核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）などのポリヌクレオ
チド、ならびにリボヌクレオタンパク質および免疫に使
用されるタンパク質（例えばウイルス性タンパク質）な
どのタンパク質が含まれる。本発明において使用するDN
Aの例としては、プラスミドおよび遺伝子があり、特
に、嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（CFTR）、アデ
ノシンデアミナーゼ（ADA）、チミジンキナーゼ（TK）
およびHLA B7などの、遺伝子治療プロトコルが開始され
ているDNA、ならびにβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェ
ラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、クロラムフェニ
コールトランスフェラーゼおよびα−1アンチトリプシ
ンなどのレポーター遺伝子がある。DNAの他の例とし
て、アンチセンス、アプタマーまたは「三重らせん」剤
として使用される、オリゴデオキシヌクレオチドおよび
それらの類似体がある。RNAの例としては、リボザイム
またはオリゴヌクレオチドアンチセンス分子がある。
【００３８】トランスフェクトしようとする細胞の性質
は、厳密に決定的ではない。該細胞は、原核細胞または
真核細胞、哺乳動物細胞または植物細胞でありうる。
【００３９】例えば式Iの化合物などの本発明のコンジ
ュゲートを使用して細胞をトランスフェクトするには、
適切な量の該化合物の存在下で、細胞をアニオン性巨大
分子と接触させる。一定の量のアニオン性巨大分子に対
する適切な量のコンジュゲート（例えば式Iの化合物）
は、それぞれの有する電荷によって変化する。コンジュ
ゲートとトランスフェクトしようとする分子との間の＋
／−電荷比は、一般的には0.1〜10、好ましくは0.5〜5
の間で変化する。「＋／−電荷比」の値は、R3基内のア
ミノ酸における陽性に荷電する基の数を、トランスフェ
クトしようとする分子の負電荷の数で割って計算する。
トランスフェクトしようとする分子がポリヌクレオチド
である場合、例えば、負電荷の数は、主鎖における陰性
に荷電したリン酸の数を意味する。これらの範囲内の最
適比は、トランスフェクトしようとする細胞により左右
し、本発明の属する技術分野における当業者であれば容
易に確定しうる。
【００４０】細胞数に対するアニオン性巨大分子の量
は、104個の細胞をトランスフェクトするためのアニオ
ン性巨大分子量が、0.1μg〜10μg、好ましくは0.2μg
〜2μgであるような量である。アニオン性巨大分子がDN
Aである場合、104個の細胞をinvitroでトランスフェク
トするための好ましいDNA量は、0.1μg〜10μgである。
細胞がin vivoでトランスフェクトされる場合、好まし
いDNA量は0.1μg〜1μgである。
【００４１】本発明の好ましい態様において、ヘルパー
脂質、短鎖リン脂質、カチオン性脂質または本発明のコ
ンジュゲート以外に任意のその他既知のトランスフェク
ション能力のある分子の存在下で、更にトランスフェク
ションを実施する。通常のどんなヘルパー脂質も使用す
ることができる。「ヘルパー脂質」は、既知のトランス
フェクション能力のある分子と共に使用した場合に、細
胞への巨大分子の送達を増大させることが知られている
リン脂質である。ヘルパー脂質の例としては、ホスファ
チジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンな
どのリン脂質あるいはそれらの混合物がある。好ましい
ヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノー
ルアミンなどのホスファチジルエタノールアミンであ
る。通常のどんな短鎖リン脂質も使用することができ
る。「短鎖リン脂質」は、脂肪酸残基を含むリン脂質で
あり、該脂肪酸残基は6〜12個の炭素原子を主鎖に含有
する。短鎖リン脂質の例としては、2つの炭素数6〜12の
脂肪酸残基を有するホスファチジルコリンがある。好ま
しい短鎖リン脂質は、ジカプリル−およびジカプリルオ
イル（dicapryloyl）・ホスファチジルコリンである。
【００４２】トランスフェクション能力のある分子の例
としては、Behr（Bioconjugate Chem., 1994, 5, 382-3
89）ならびにGaoら（Gene Ther., 1995, 2, 710-722）
により記載されているカチオン性脂質、Kabanovら（Bio
conjugate Chem., 1995, 6,7-20）により記載されてい
るポリカチオン、ペプチドおよびポリマーならびにLedl
ey（Human Gene Therapy, 1995, 6, 1129-1144）により
記載されているような他の非ウイルス性遺伝子送達系が
含まれる。
【００４３】ヘルパー脂質、短鎖リン脂質、カチオン性
脂質ならびに任意に本発明のコンジュゲート以外に付加
的なその他既知のトランスフェクション能力のある分子
は、適切に、リポソーム、ミセル、有機分散液もしくは
水性分散液、または有機溶液もしくは水溶液の形態であ
る。式Iの化合物とヘルパー脂質との最適モル比は、0.
1：50、好ましくは1：10である。ヘルパー脂質と短鎖リ
ン脂質との最適モル比は2：20である。式IまたはIIの化
合物と付加的なトランスフェクション能力のある分子と
の最適モル比は0.1：10である。
【００４４】本発明の特に好ましい態様においては、タ
ンパク質加水分解物の形をとる濃縮アミノ酸混合物の存
在下でDNA複合体形成がなされる場合に、トランスフェ
クション効率が顕著な程度に高められる。好ましいタン
パク質加水分解物はトリプシンによる肉消化物であるPr
imatone RL (Sheffield Products, Quest Internationa
l, Germany)である。Primatone RLは、アミノ酸、オリ
ゴペプチド、鉄塩、いつくかの脂質および他の微量低分
子物質の供給源として役立つ、複雑な性質の培地補充物
である。哺乳動物および昆虫の細胞培養培地にPrimaton
e RLを添加すると、多数の細胞系の細胞増殖特性を向上
させることが知られている。しかし、Primatone RLを本
発明のDNA複合体形成培地に添加すると複合体形成を顕
著な程度まで増大させることは全く驚くべき発見であっ
た。この効果は、部分的には、本発明の属する技術分野
においては、脂質-核酸複合体が血清（すなわちタンパ
ク質、ペプチド、脂質、など複合体形成を妨げることが
知られているものを含有する複雑な培地補充物）の不存
在下で形成されるのが必須であるということが十分受け
入れられているために、驚くべきものであった(FAQS fo
r Transfections and Cationic Lipid Reagents, Life
Technologies, http://www.lifetech.com)。他の好ま
しいタンパク質加水分解物としては、Primatone RL-UF
（限外濾過されている）および Primatone HSが含まれ
る。
【００４５】また本発明は、上述の組成物を、in vivo
またはin vitroにおいてアニオン性巨大分子、好ましく
はポリヌクレオチドで真核細胞または原核細胞をトラン
スフェクトするのに使用することを含む。
【００４６】本発明はまた、上述の式Iの化合物を、in
vivoまたはin vitroにおいてアニオン性巨大分子、好ま
しくはポリヌクレオチドで真核細胞または原核細胞をト
ランスフェクトするのに使用することを含む。
【００４７】本発明の更なる実施形態は、in vivoまた
はin vitroにおいてアニオン性巨大分子、好ましくはポ
リヌクレオチドで細胞をトランスフェクトする方法であ
り、ここで該方法は、in vivoまたはin vitroにおいて
式(I)の化合物の存在下で、細胞をアニオン性巨大分子
に、あるいは上述の組成物に接触させることを含む。
【００４８】更に、本発明は、in vivoまたはin vitro
において生物学的に活性なアニオン性分子を、アニオン
性巨大分子を用いて細胞中に導入する方法を意図し、該
方法は、in vivoまたはin vitroにおいて上述の組成物
または化合物の存在下で、アニオン性巨大分子に細胞を
接触させることを含む。
【００４９】トランスフェクションのために、適切な量
の本発明のコンジュゲート（例えば式Iの化合物）を、
水溶液中で適切に、トランスフェクトしようとする分子
（例えばプラスミドDNA）に添加する。続いて、任意に
ヘルパー脂質、および所望であれば短鎖リン脂質、カチ
オン性脂質、ならびに任意に本発明のコンジュゲート以
外に付加的なその他既知のトランスフェクション能力の
ある分子を添加してもよい。それらは、リポソーム、ミ
セルまたは有機溶液もしくは水性分散液のいずれかの形
態である。あるいは、トランスフェクトしようとする分
子を、本発明の化合物、ヘルパー脂質および所望であれ
ば短鎖リン脂質、カチオン性脂質ならびに任意に本発明
のコンジュゲート以外に付加的なその他既知のトランス
フェクション能力のある分子を含有する組成物に添加し
てもよい。該組成物は、固体、液体、半固体またはエー
ロゾルの形態であることができ、適切に、リポソーム、
ミセルまたは有機溶液もしくは水性分散液の形態であ
る。
【００５０】動物またはヒト患者の細胞をトランスフェ
クトするために、前記組成物を、経口、非経口、経皮、
肺、鼻、直腸、眼、心室、脈管および腫瘍内（intratum
oral）経路により投与することができる。更に、該組成
物を、皮膚表面への高速衝突（high velocity impactio
n）投与により投与しうる。トランスフェクションの経
過は、当業者に公知の適当な試験プロトコルにより判断
することができる。
【００５１】本発明はまた、上述の化合物の少なくとも
1つおよびヘルパー脂質、短鎖リン脂質、カチオン性脂
質または任意に付加的な他のトランスフェクション能力
のある分子を含む組成物に関する。該組成物は、アニオ
ン性巨大分子、好ましくはポリヌクレオチドを更に含ん
でもよい。またこれらの組成物は、ポリカチオン性ポリ
マー、好ましくはポリエチレンイミン（PEI）を含んで
もよい。これらの組成物の構成成分は、水溶液もしくは
有機溶液、水性分散液もしくは有機分散液、またはリポ
ソームもしくはミセルの形態でありうる。
【００５２】「ポリエチレンイミン（PEI）」という用
語は、高カチオン性電荷／密度ポテンシャルを有し、好
ましくは約25kDAの分子量を有する、一般的に分枝状ま
たは直鎖である合成有機巨大分子を指す。
【００５３】本発明はまた、アニオン性巨大分子、好ま
しくはポリヌクレオチドでの細胞のトランスフェクショ
ンに上述の化合物を使用することに関する。
【００５４】本発明によって、脂質と、逆向きのアミド
結合を有する塩基性の膜傷害性ペプチドとがコンジュゲ
ートすることにより、ポリヌクレオチドおよび他のアニ
オン性巨大分子に結合し、かつ細胞のトランスフェクシ
ョンに使用しうる新規化合物が得られることが見出され
た。従って本発明は、アニオン性巨大分子での細胞のト
ランスフェクション方法に関し、該方法は、上述の化合
物の存在下で細胞をアニオン性巨大分子と接触させ、細
胞をアニオン性巨大分子でトランスフェクトすることを
含む。
【００５５】本発明はまた、PEIが媒介してトランスフ
ェクトした細胞中において、組換えタンパク質を大量に
生産する方法に関する。例えば、セムリキ森林熱ウイル
ス（Semliki Forest virus：SFV）を使用することによ
り、Gタンパク質共役型受容体およびリガンド依存性イ
オンチャネルの両方の高レベル発現が実現した。一般的
に、タンパク質1mg当りの受容体が50pmolより大きいB
max値、および細胞1個当りの受容体が3×106個より大き
い受容体濃度が達成された。更に大規模なタンパク質製
造を促進するために、哺乳動物無血清懸濁培養物の最適
条件を得た。これらの条件にBHK細胞、CHO細胞およびHE
K293細胞を適用することにより、SFVベクターでの効率
的な感染が可能になり、大量の、組換えタンパク質を発
現する細胞培養物が生成された。
【００５６】意外にも、細胞培養物の増殖温度は、組換
えタンパク質の発現期間および発現レベルに劇的な効果
を及ぼしうる。BHK細胞およびCHO細胞の増殖温度を37℃
から33℃に低くすることにより、組換えルシフェラーゼ
の発現は5〜10倍増加する。発現時間は33℃で非常に長
く、感染後65時間でもなお高発現である。
【００５７】さらに、２つの7TM 受容体、すなわちヒト
ニューロキニン-1受容体およびラット代謝型グルタミン
酸受容体-2、ならびに5-HT3リガンド依存性イオンチャ
ンネルの発現に及ぼす温度の効果を示すことができるで
あろう。ルシフェラーゼについて観察されたものと類似
の効果が上記受容体についても得られた。37℃で増殖さ
せた細胞に較べて、33℃で増殖させた細胞においては受
容体密度がはるかに高い。SFVに感染した細胞では受容
体の発現時間は通常24時間に限定されるが、細胞を33℃
で培養すると65時間まで延ばすことが可能である。この
改善は組換えタンパク質の大量産生を大幅に促進するこ
とができる。さらに、接着細胞(CFU)および懸濁細胞に
ついて、異種タンパク質の迅速な大規模発現(12リット
ル、23リットルおよび60リットルの発酵槽を用いる）の
ための本発明のトランスフェクションの有用性が認識さ
れた。特に、PEIと組み合わせたヘルパー脂質は、HEK29
3細胞および他の哺乳動物細胞系において低いDNA濃度で
高い一過性遺伝子発現を示す。さらに、頻繁に発生する
ならし培地の抑制効果（これは大規模発現法にとって深
刻な問題である）が大幅に減少する。
【００５８】タンパク質発現のための一般的な方法は、
(a)適切な培地中で懸濁培養すべき細胞系および発現ベ
クターを適合させ、増殖させる、(b)トランスフェクシ
ョンの準備のため、細胞を洗浄してヘパリン／デキスト
ラン硫酸を除去する、(c)細胞を数え、トランスフェク
ションに適した培地に再懸濁する、(d)トランスフェク
ション試薬、すなわちDNA複合体を調製し、該複合体を
成熟させ、細胞に添加する、そして(d)インキュベート
し、タンパク質発現を２〜10日間モニターする、ことを
含む。
【００５９】
【実施例】以下の実施例は本発明を限定するものではな
く、本発明をさらに説明するものである。
【００６０】実施例１．レトロ-インベルソペプチドR 3 S
Hの調製 PioneerTM Peptide Synthesis Systemを用いて、Athert
onおよびSheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: A
Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1989)に記
述されている方法に従ってTenta Gel S RAM樹脂(0.25 m
mol/g [Rapp Polymere GmbH, Tubingen, Germany]から
開始して連続固相合成を実施した。α-アミノ基を保護
するため、塩基に不安定なFmoc基を用いた。側鎖は以下
の保護機によって保護した。すなわち、D-Arg(Pbf)、D-
Cys(Trt)、D-Gln(Trt)、D-Lys(Boc)、D-Ser(But)、D-Th
r(But)およびD-Trp(Boc)である。Fmoc-アミノ酸(2.5当
量）を等価量のTATU (L.A. Carpino, J. Am. Chem. So
c. 115, 4397-4398, 1993)、およびDIPEAを用いて活性
化した。DMFに溶解した20%ピペリジンを用いてFmoc脱保
護を実施した。 Tenta Gel S樹脂(2.0 g)を90% TFA、2% EDT、5% H2O、3
%トリイソプロピルシランからなる混合物(100 ml)で６
時間処理した。この反応混合物を濃縮し、ジエチルエー
テルに注いだ。沈降物を濾過によって回収し、水から凍
結乾燥した。粗製ペプチドを分取RP-HPLCによって精製
した。その結果、ホモジニアスな を得た。
【００６１】実施例２．式IVによって表される化合物の
調製 実施例１で得たホモジニアスなペプチド(24.2 mg, 7 mm
ol)を、2 mlの100 mM酢酸アンモニウムバッファー、pH
6.5および2 mlのアセトニトリルからなる混合物に溶解
した。この溶液に0.5 mlのクロロホルムに溶解した7.4
mgの1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノー
ルアミン-N-[3-(2-ピリジルジチオ）プロピオナート］
を添加した。この混合物を室温で1時間撹拌し、有機溶
剤を蒸発により除去した。残った溶液を酢酸エチルで３
回洗浄し、水相を凍結乾燥した。その結果、R1およびR2
がオレオイルであり、R3が である式IVによって表される化合物28.5 mgを得た。ISP
-MS:M=3722。
【００６２】実施例３．式IVの化合物を用いたトランス
フェクション 実施例２で得た化合物1 mgを500μlのアセトニトリルに
溶解し、500μlの滅菌純水で希釈し(1 mg/ml)、４℃で
保存した。可溶性ヒト腫瘍壊死因子受容体p55遺伝子を
コードするプラスミド溶液(1 mg/ml)の15μlを1.5 mlの
培地に導入し、混合した。実施例１で得た化合物を種々
の量でこれに添加し、混合し、室温で10分間放置した
後、この混合物を懸濁したHEK293-EBNA細胞(15 ml)に導
入した。
【００６３】表１は実施例２に記述する化合物のトラン
スフェクション効率および無血清懸濁培養における細胞
の生存率を示す。
【表１】 上記データは、本発明の化合物によって媒介されるトラ
ンスフェクションが、HEK293-EBNA細胞の無血清懸濁培
養において検出可能な細胞毒性効果を示すことなく達成
されうることを明確に示している。
【００６４】実施例４．式IVの化合物およびPEIを用い
たトランスフェクション 実施例２の化合物1 mgを500μlのアセトニトリルに溶解
し、500μlの滅菌純水で希釈し(1 mg/ml)、４℃で保存
した。分子量25 kDaのポリエチレンイミン(PEI)90 mgを
滅菌純水に溶解し(0.9 mg/ml)、HClで中和し、滅菌濾過
し、室温で保存した。
【００６５】可溶性ヒト腫瘍壊死因子受容体p55遺伝子
をコードするプラスミド溶液(1 mg/ml)の3μlを1.5 ml
の培養培地で希釈し、混合した。実施例２に記述する化
合物(1mg/ml)を種々の量でこれに添加し、混合し、次に
8.3 μlの PEI (0.9 mg/ml)を添加した。混合し、室温
で10分間インキュベートした後、この混合物を懸濁した
HEK293-EBNA細胞(15 ml)に導入した。無血清懸濁培養で
増殖した細胞は、上記複合体の添加に先立って新鮮な培
地に移した。放出された受容体タンパク質をトランスフ
ェクションの72時間後に培養培地を用いて測定し、培養
物mlあたりの受容体の量(ng)として表現した。
【表２】 この結果は、本発明の化合物とPEIとによる効率の相乗
的増強を明確に示している。DNAに最初に化合物を加
え、次にPEIを加える、またはこれを逆にすることはト
ランスフェクション効率に検出可能な影響を何ら及ぼさ
ない。10%血清の存在下で細胞を培養した場合、発現レ
ベルに重大な変化は観察されなかった。
【００６６】実施例５．種々の細胞系におけるトランス
フェクション効率の尺度としてのルシフェラーゼ 実施例２の化合物1 mgを500μlの滅菌純水に溶解し(1 m
g/ml)、４℃で保存した。分子量25 kDaのポリエチレン
イミン90 mgを滅菌純水に溶解し(0.9 mg/ml)、HClで中
和し、滅菌濾過し、室温で保存した。
【００６７】ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラス
ミド溶液(1 mg/ml)の3μlを1.5 mlの培養培地で希釈
し、混合した。2.25μlの実施例２に記述する化合物(1
mg/ml)をこれに添加し、混合し、次に8.3 μlの PEI
(0.9 mg/ml)を添加した。混合し、室温で10分間インキ
ュベートした後、この混合物を種々の細胞(15 ml)に導
入した。無血清懸濁培養で増殖した細胞は、上記複合体
の添加に先立って新鮮な培地に移した。24時間インキュ
ベートした後の可溶性細胞抽出物中のルシフェラーゼ活
性を測定し、タンパク質mgあたりの相対光単位(RLU)と
して表現した。
【００６８】表３は、無血清懸濁培養におけるルシフェ
ラーゼ活性を測定することによって、PEIと組み合わせ
た実施例２の化合物のトランスフェクション効率を示
す。
【表３】 これらの結果は、種々の細胞系における本発明の化合物
とPEIとによる効率の相乗的増強を明確に示している。
【００６９】実施例６．種々の細胞系におけるトランス
フェクション効率の尺度としてのGFP 実施例２の化合物1 mgを50μlのアセトニトリルに溶解
し、500μlの滅菌純水で希釈し(1 mg/ml)、４℃で保存
した。分子量25 kDaのポリエチレンイミン90 mgを滅菌
純水に溶解し(0.9 mg/ml)、HClで中和し、滅菌濾過し、
室温で保存した。
【００７０】グリーン蛍光タンパク質をコードするプラ
スミド溶液(1 mg/ml)の3 mlを1.5 mlの培養培地で希釈
し、混合した。2.25μlの上記化合物(1 mg/ml)をこれに
添加し、混合し、次に8.3 μlの PEI (0.9 mg/ml)を添
加した。混合し、室温で10分間インキュベートした後、
この混合物を種々の細胞(15 ml)に導入した。無血清懸
濁培養で増殖した細胞は、上記複合体の添加に先立って
新鮮な培地に移した。24時間インキュベートした後、蛍
光性細胞の数をカウントすることによってトランスフェ
クション効率を測定し、トランスフェクトされた細胞の
百分率として表現した。
【００７１】表４は、無血清懸濁培養下における種々の
細胞系内のグリーン蛍光を測定することによって、PEI
と組み合わせた実施例２の化合物のトランスフェクショ
ン効率を示す。
【表４】 実施例７．式IVの化合物による種々の細胞系におけるト
ランスフェクション効率の増強 実施例２の化合物1 mgを500μlのアセトニトリルに溶解
し、500μlの滅菌純水で希釈し(1 mg/ml)、４℃で保存
した。分子量25 kDaのポリエチレンイミン 90 mgを滅菌
純水に溶解し(0.9 mg/ml)、HClで中和し、滅菌濾過し、
室温で保存した。
【００７２】ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラス
ミド溶液(1 mg/ml)の3 mlを1.5 mlの培養培地で希釈
し、混合した。2.25μlの上記化合物(1 mg/ml)をこれに
添加し、混合し、次に8.3 μlの PEI (0.9 mg/ml)を添
加した。混合し、室温で10分間インキュベートした後、
この混合物の0.1 mlを種々の接着細胞系を入れた12ウエ
ルプレートの、1 mlの培地を含有する１個のウエルに加
えた。10%血清の存在下で増殖した細胞を、無血清培地
中でトランスフェクション後４時間にわたってインキュ
ベートした。24時間インキュベートした後の可溶性細胞
抽出物中のルシフェラーゼ活性を測定し、タンパク質mg
あたりの相対光単位(RLU)として表現した。
【００７３】表５は、種々の接着細胞系におけるルシフ
ェラーゼ活性を測定することによって、PEIと組み合わ
せた実施例２の化合物のトランスフェクション効率を示
す。
【表５】 これらの結果は、種々の細胞系における本発明の化合物
とPEIとによる効率の相乗的増強を明確に示している。
以下の実施例においては、下記の材料と方法が用いられ
た：化学薬品および発現ベクター ポリエチレンイミン(PEI)、MW25はAldrich (Buchs, Swi
tzerland)より入手した。10 mM モノマー水性ストック
溶液は、9 mgのPEI (25 kDaの100% wt/vol）を10 mlの
水と混合し、HClで中和し、そして滅菌濾過することに
よって調製した(Boussifら、Proc. Natl. Acad. Sci. 9
2, 7297-7301, 1995)。ストック溶液は室温で、または
４℃で数ヶ月保存した。実施例２で得た合成レトロ-イ
ンベルソジオレイルメリチン1 mgを500μlのアセトニト
リルに溶解し（濁ったままであった）、500μlの滅菌純
水で希釈した（ほぼ透明になった）。このストック試薬
上に窒素を重層し、数ヶ月４℃で間保存した。
【００７４】リポーター遺伝子としてホタル・ルシフェ
ラーゼ遺伝子および分泌型ヒト胎盤アルカリホスファタ
ーゼ(SEAP)遺伝子を用いた。該ルシフェラーゼをコード
するpGL3-CMVプラスミド(Promega)は、Legendreら、199
6によって最近記述されたように構築した。pCMV/SEAPプ
ラスミドはTropix (USA)より入手した。プラスミド調製
物（Terrific Broth中の大腸菌(E. coli) DH5)は、市販
のminiprep kit (BIO-Rad Laboratories, CA, USA)およ
びmaxiprep kit (Nucleobond AX, Macherry-Nagel AG,
Switzerland)を用いて作製した。プラスミド濃度は分光
測光によって測定し、そしてpUC18 DNA (Pharmacia Bio
tech, Zurich, Switzerland)を用いて基準化した1%アガ
ロースゲル電気泳動によって評価した。
【００７５】細胞の培養 ヒト胚性腎細胞HEK293 (ATCC CRL 1573)およびサブクロ
ーン293-EBNA (Invitrogen)を強化HL培地における無血
清増殖に適合させた(Schumppら, J. Cell Science 97,
639-647, 1990)。カルシウムを含まない基礎HL培地は、
Schlaeger, J. Immunol. Methods 194, 191-199, 1996
に最近記述されたように強化したDHI培地およびRPMI 16
40培地の混合物（重量比2:1）であり、グルタミン(5 m
M)、グルコース(3 g/L)、インスリン(5 mg/L, Sigma Ch
emie)、ヒトトランスフェリン(15 mg/L)(Roche Diagnos
tics, Rotkreuz, Switzerland)、Primatone RL (0.3% v
/v、ストック溶液10%由来, Sheffield Products/Quest
International, The Netherlands)、Pluronic F68 (0.0
1%, ストック溶液10%由来）、およびヘパリン(30 U/ml,
Sigma Chemie)を含むものである。上記粉末培地、すな
わちカルシウム不含DHI培地およびカルシウム不含RPMI
1640培地は、Life Technologies (Basel, Switzerland)
より購入した。供給液は最近記述されたように(Schlaeg
er, 1996)調製した。
【００７６】細胞は撹拌フラスコ中で105 rpmで、推奨
される実施容量の70〜80%を使用して通常の方法で培養
した(Bellco, Inotech AG, Dottikon, Switzerland)。B
iomodul 40B (Munich, Germany)を備えたCO2インキュベ
ーター中でVariomag stirrer 4Bを用いた。
【００７７】トランスフェクション方法 HEK293-EBNA細胞は、細胞の凝集を防ぐためヘパリンの
存在下で通常の方法で増殖させた。トランスフェクショ
ン実験のため、細胞を密度が８〜12×105個/mlになるま
で培養し、1100 rpmで２分間遠心し(Labofuge 400, Her
aeus AG, Germany)、ヘパリンを含まないHL培地（室
温）で１回洗浄し、そしてヘパリンおよび抗生物質を含
まない培地に再懸濁した。細胞密度を5.5〜６×105個/m
lとなるように調節し、そしてトランスフェクションを
実施する前に培養物を撹拌フラスコ中で少なくとも４時
間インキュベートした。トランスフェクション複合体を
添加した後、細胞を１〜４日間、培地を交換することな
くインキュベートした。トランスフェクションの２日後
から、通常、培養物に１日１回栄養混合物を供給した。
【００７８】トランスフェクション複合体の調製 DNA複合体は、室温でHL培地を用いて培養物容量の1/10
の量となるように形成した。1 mlの細胞に対する最適遺
伝子デリバリー条件下で、0.2 μgのDNAを0.1mlの新鮮
な培地に添加し（15 mlのFalconチューブ）、おだやか
に混合した。２分後、実施例２で得た化合物0.15μgを
これに添加し、混合し、さらに２分後に0.5μgのPEIを
添加して混合した。室温で15-30分インキュベートした
後、この0.1mlのトランスフェクション複合体を1 mlの
調製された細胞に添加し、おだやかに振とうし、そして
37℃で培養した。
【００７９】標準的トランスフェクション実験は、25 m
lの撹拌フラスコに入れた15 mlの細胞を用いて実施し
た。3 μgのDNAを1.5 mlのHL培地に添加し、次に2.25μ
gの実施例２で得た化合物および7.5μgのPEIを添加し
た。混合しインキュベートした後、このDNA複合体を15
mlの細胞に添加し、CO2インキュベーター中で37℃で培
養した。
【００８０】産物の解析 ルシフェラーゼ活性は通常、トランスフェクションの20
〜24時間後に測定した。各時点で1 mlのサンプル２個を
採取し、５分間2000 rpmで４℃で遠心した。上清を静か
に流し去り、残りの液体を注意深く除去した。細胞ペレ
ットを機械的に再懸濁し、1 mlの氷冷溶解バッファー(B
oehringer Mannheim)を添加した。混合後、サンプルを
氷上に13分間置き、そして12000 rpmで10分間遠心し、
細胞破砕物を除去した。上清は測定に用いるまで-20℃
で冷凍した。このサンプルを融解し、溶解バッファーで
希釈し、そしてLumat LB950 (Berthold AG, Regensdor
f,Switzerland)を用いて文献に記述されているように(L
egendreら, 1996)分析した(試験管形式）。
【００８１】可溶性細胞抽出物のタンパク質含有量は、
BCAタンパク質アッセイ試薬(Pierce, Rockford, IL, US
A)を用いて分析した。
【００８２】SEAP発現は、細胞培養物上清を用いて、化
学発光SEAPリポーター遺伝子アッセイ(マイクロタイタ
ープレート形式、Top Count I NXT, Packard)を使い供
給者(Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland)のプ
ロトコールに従って測定した。
【００８３】実施例８．ルシフェラーゼ発現に対するタ
ンパク質加水分解物の効果 実施例２の化合物1 mgを0.5 mlのアセトニトリルに溶解
し、3〜5分間37℃で混合し、0.5 mlの滅菌純水で希釈し
(1 mg/ml)、4℃で保存した。分子量25 kDaのポリエチレ
ンイミン(PEI) 90 mgを滅菌純水に溶解し(0.9 mg/ml)、
HClで中和し、滅菌濾過し、4℃で保存した。Primatone
RL（純水に溶解した滅菌10%ストック溶液）を1.5 mlのH
L培地(Primatoneを含まない)に添加し、混合した。2〜3
分後、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド溶
液(1 mg/ml) 3 μlを1.5 mlのHL培地に添加し、混合し
た。室温で2分間インキュベートした後、2.25μlの実施
例2の化合物(1 mg/ml)をこれに添加し、混合し、次に8.
3 μlの PEI (0.9 mg/ml)を添加し、混合した。混合
し、室温で15〜30分間インキュベートした後、この混合
物を15 mlのHEK293-EBNA細胞に添加した。このＤＮＡ複
合体の添加に先立って、HL培地 (0.3% Primatone RLを
含有)中で無血清懸濁培養により増殖した細胞を新鮮なH
L培地(0.3% Primatone RLを含有)に移し、細胞密度を5.
5〜6×106個/mlに調整した。
【００８４】22時間インキュベートした後の可溶性細胞
抽出物中のルシフェラーゼ活性を測定し、培養物mlあた
りの相対光単位として表現した。
【００８５】表６は、実施例２の化合物およびPEIを用
いたDNA複合体を含有する培地(HL)（以後、「DNA複合体
培地」と称する）中のタンパク質加水分解物の量が増え
るにつれて発現レベルが上昇することを示している。
【表６】 上記の結果は、タンパク質加水分解物の存在下における
ルシフェラーゼ活性の増大を示し、最適条件はDNA複合
体培地(HL)中に0.1% Primatone RLが存在する場合であ
った。
【００８６】実施例９．種々の培地におけるルシフェラ
ーゼ発現に対するタンパク質加水分解物の効果 実施例２の化合物1 mgを0.5 mlのアセトニトリルに溶解
し、3〜5分間37℃で混合し、0.5 mlの滅菌純水で希釈し
(1 mg/ml)、4℃で保存した。分子量25 kDaのポリエチレ
ンイミン(PEI) 90 mgを滅菌純水に溶解し(0.9 mg/ml)、
HClで中和し、滅菌濾過し、4℃で保存した。Primatone
RL（純水に溶解した滅菌10%ストック溶液）を異なる1.5
mlの培地(Primatoneを含まない)に添加し、混合した。
2-3分後、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミ
ド溶液(1 mg/ml) 3 μlを上記1.5mlの培地に添加し、混
合した。室温で2分間インキュベートした後、2.25μlの
実施例2の化合物(1 mg/ml)をこれに添加し、混合し、次
に8.3 μlの PEI (0.9 mg/ml)を添加した。混合し、室
温で15〜30分間インキュベートした後、この混合物を15
mlのHEK293-EBNA細胞に添加した。このDNA複合体の添
加に先立って、HL培地 (0.3% Primatone RLを含有)中で
無血清懸濁培養により増殖した細胞を新鮮なHL培地(0.3
% Primatone RLを含有)に移し、細胞密度を5.5〜6×106
個/mlに調整した。20〜22時間インキュベートした後の
可溶性細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性を測定し、培
養物mlあたりの相対光単位として表現した。
【００８７】表７は、実施例２の化合物およびPEIを用
いた異なるDNA複合体培地中におけるタンパク質加水分
解物の存在下および不存在下でのルシフェラーゼ活性を
示す。
【表７】 上記結果は、異なる複合体培地における発現レベルの高
度に重要な変動を明確に示した。HLおよびDHI培地は最
も高い活性および比較的低いタンパク質加水分解物刺激
を示したが、他方DMEM/HAM F12培地中に形成したDNA複
合体はPrimatoneRLの存在下で100倍以上の発現増大を達
成した。
【００８８】実施例10．発現に対するタンパク質加水分
解物濃度の効果 実施例２の化合物1 mgを0.5 mlのアセトニトリルに溶解
し、3〜5分間37℃で混合し、0.5 mlの滅菌純水で希釈し
(1 mg/ml)、4℃で保存した。分子量25 kDaのポリエチレ
ンイミン(PEI) 90 mgを滅菌純水に溶解し(0.9 mg/ml)、
HClで中和し、滅菌濾過し、4℃で保存した。Primatone
RL（純水に溶解した滅菌10%ストック溶液）を1.5 mlのD
MEM/HAM F12培地(Primatoneを含まない)に添加し、混合
した。2〜3分後、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプ
ラスミド溶液(1 mg/ml) 3 μlをさらに添加し、混合し
た。室温で2分間インキュベートした後、2.25μlの実施
例2の化合物(1 mg/ml)をこれに添加し、混合し、次に8.
3 μlの PEI (0.9 mg/ml)を添加し、混合した。混合
し、室温で15〜30分間インキュベートした後、この混合
物を15 mlのHEK293-EBNA細胞に添加した。このＤＮＡ複
合体の添加に先立って、HL培地 (0.3% Primatone RLを
含有)中で無血清懸濁培養により増殖した細胞を新鮮なH
L培地(0.3% Primatone RLを含有)に移し、細胞密度を5.
5〜6×106個/mlに調整した。20-22時間インキュベート
した後の可溶性細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性を測
定し、培養物mlあたりの相対光単位として表現した。
【００８９】表８は、実施例２の化合物およびPEIを用
いたDMEM/HAM F12 DNA複合体培地中のタンパク質加水
分解物の量が増大するにつれて発現レベルが上昇するこ
とを示している。
【表８】 上記結果は、発現レベルの有意な上昇を示し、最適条件
はDMEM/HAM F12培地中に0.2%のタンパク質加水分解物が
存在する場合であった。
【００９０】実施例11．ルシフェラーゼ発現に対する種
々の化合物の効果 実施例２の化合物1 mgを0.5 mlのアセトニトリルに溶解
し、3〜5分間37℃で混合し、0.5 mlの滅菌純水で希釈し
(1 mg/ml)、4℃で保存した。分子量25 kDaのポリエチレ
ンイミン(PEI) 90 mgを滅菌純水に溶解し(0.9 mg/ml)、
HClで中和し、滅菌濾過し、4℃で保存した。
【００９１】種々の増殖促進化合物を1.5 mlのDMEM/HAM
F12培地(いずれの化合物も含まない)に添加し、混合し
た。2〜3分後、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラ
スミド溶液(1 mg/ml) 3 μlを1.5 mlのHL培地に添加
し、混合した。室温で2分間インキュベートした後、2.2
5μlの実施例2の化合物(1 mg/ml)をこれに添加し、混合
し、次に8.3 μlの PEI (0.9 mg/ml)を添加し、混合し
た。混合し、室温で15-30分間インキュベートした後、
この混合物を15 mlのHEK293-EBNA細胞に添加した。この
DNA複合体の添加に先立って、HL培地 (0.3% Primatone
RLを含有)中で無血清懸濁培養により増殖した細胞を新
鮮なHL培地(0.3% Primatone RLを含有)に移し、細胞密
度を5.5〜6×106個/mlに調整した。20〜22時間インキュ
ベートした後の可溶性細胞抽出物中のルシフェラーゼ活
性を測定し、培養物mlあたりの相対光単位として表現し
た。
【００９２】表９は、実施例２の化合物およびPEIを用
いたDMEM/HAM F12培地中のDNA複合体の形成に及ぼす種
々の化合物の影響を示す。
【表９】 上記の結果は、３つの異なるPrimatoneバッチ（Primato
ne RLを用いた場合の増大を100%とした）が最良の結果
をもたらすこと、ならびにHySoyおよびラクトアルブミ
ンがそれらに続くことを示した。Primatoneは細胞培養
産物であり、多くの異なる細胞系に対して細胞密度およ
び細胞生存率を増大させ、また組換えタンパク質の収率
を増大させるための血清代替物・培地補充物として長年
にわたって使用されてきたアミノ酸および小さいペプチ
ドの公知の供給源である。HySoy(Sheffield Products,
Quest International, 純水に溶解した10%ストック溶
液）は、ダイズ由来のタンパク質加水分解物である。ラ
クトアルブミン(LTI, Switzerland)は純水に溶解した10
%ストック溶液として使用した。酵母抽出物(Difco,Swit
zerland)は純水に溶解した10%ストック溶液として使用
した。グルタミンは純水に溶解した200 mMストック溶液
として使用し、-20℃で保存した。必須アミノ酸(LTI, S
witzerland)は、100倍ストック溶液として使用した。非
必須アミノ酸(LTI, Switzerland)は、50倍ストック溶液
として使用した。脂質混合物を調製するため、無血清昆
虫細胞培地を調製するための記述(Schlaegerら、1995）
に従って、種々の脂質をエタノールに溶解し、そしてPl
uronic F68と激しく混合することによって希釈した。
【００９３】実施例12．複合体の安定性に対するタンパ
ク質加水分解物の効果 実施例２の化合物1 mgを0.5 mlのアセトニトリルに溶解
し、3〜5分間37℃で混合し、0.5 mlの滅菌純水で希釈し
(1 mg/ml)、4℃で保存した。分子量25 kDaのポリエチレ
ンイミン(PEI) 90 mgを滅菌純水に溶解し(0.9 mg/ml)、
HClで中和し、滅菌濾過し、4℃で保存した。Primatone
RL（純水に溶解した滅菌10%ストック溶液）を1.5 mlのI
S 293培地(Primatoneを含まない)に添加し、混合した。
2〜3分後、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミ
ド溶液(1 mg/ml) 3 μlをさらに添加し、混合した。室
温で2分間インキュベートした後、2.25μlの実施例2の
化合物(1 mg/ml)をこれに添加し、混合し、次に8.3 μl
の PEI (0.9 mg/ml)を添加し、混合した。混合し、室温
で15〜30分インキュベートした後、この混合物を15 ml
のHEK293-EBNA細胞に添加した。このDNA複合体の添加に
先立って、HL培地(0.3% Primatone RLを含有)中で無血
清懸濁培養により増殖した細胞を新鮮なHL培地(0.3% Pr
imatone RLを含有)に移し、細胞密度を5.5〜6×106個/m
lに調整した。20〜22時間インキュベートした後の可溶
性細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性を測定し、培養物
mlあたりの相対光単位として表現した。
【００９４】表10は、実施例２の化合物およびPEIを用
いたIS 293培地におけるタンパク質加水分解物の存在下
および不存在下でのDNA複合体の安定性を示す。
【００９５】
【表10】 上記の結果は、0.2% Primatone RLの存在下で、かつイ
ンキュベーション時間が30分の場合に、IS 293培地にお
いて最大の発現レベルが達成されたことを明確に示して
いる。
【００９６】実施例13．タンパク質加水分解物を用いた
発現レベルに対する抗生物質の効果 実施例２の化合物1 mgを0.5 mlのアセトニトリルに溶解
し、3〜5分間37℃で混合し、0.5 mlの滅菌純水で希釈し
(1 mg/ml)、4℃で保存した。分子量25 kDaのポリエチレ
ンイミン(PEI) 90 mgを滅菌純水に溶解し(0.9 mg/ml)、
HClで中和し、滅菌濾過し、4℃で保存した。ルシフェラ
ーゼ遺伝子をコードするプラスミド溶液(1 mg/ml) 3 μ
lを1.5 mlのHL培地に(0.3% Primatone RLを含有)添加
し、混合した。室温で2分間インキュベートした後、2.2
5μlの実施例2の化合物(1 mg/ml)をこれに添加し、混合
し、次に8.3 μlの PEI (0.9 mg/ml)を添加し、混合し
た。混合し、室温で15〜30分間インキュベートした後、
この混合物を異なる抗生物質を含有する15 mlのHEK293-
EBNA細胞に添加した。このDNA複合体の添加に先立っ
て、HL培地 (0.3% Primatone RLおよび異なる抗生物質
を含有)中で無血清懸濁培養により増殖した細胞を新鮮
なHL培地(0.3% Primatone RLおよび異なる抗生物質を含
有)に移し、細胞密度を5.5〜6×106個/mlに調整した。2
0〜22時間インキュベートした後の可溶性細胞抽出物中
のルシフェラーゼ活性を測定し、培養物mlあたりの相対
光単位として表現した。
【００９７】表11は、Primatone RL(0.3%)を含有するHL
培地における異なる抗生物質の存在下での発現レベルを
示す。
【００９８】
【表11】 上記の結果は、異なる抗生物質の存在下における発現レ
ベルの軽度の低下を示した。ペニシリン／ストレプトマ
イシン(110倍濃縮）およびゲンタマイシンはLTIから入
手し、ジェネティシンおよびドキシサイクリンはSigma
より入手した。
【００９９】実施例14．異なるトランスフェクション試
薬を用いたDNA複合体形成 多数の異なる培養培地を、タンパク質加水分解物の存在
下および不存在下で、高度に活性なトランスフェクショ
ン複合体の形成について試験した。その結果は、異なる
培地において発現レベルの高い変動が観察され、タンパ
ク質加水分解物の添加はいくつかの場合において2〜100
倍という大幅な発現活性の増大をもたすことを明確に示
した。DNA複合体形成に及ぼすタンパク質加水分解物の
陽性効果は、他のトランスフェクション試薬を試験した
場合にも観察された。タンパク質加水分解物の存在下で
DNA複合体形成を実施した場合のトランスフェクション
効率の増大はいまだに解明されていない。
【０１００】実施例２の化合物1 mgを0.5 mlのアセトニ
トリルに溶解し、3〜5分間37℃で混合し、0.5 mlの滅菌
純水で希釈し(1 mg/ml)、4℃で保存した。分子量25 kDa
のポリエチレンイミン(PEI) 90 mgを滅菌純水に溶解し
(0.9 mg/ml)、HClで中和し、滅菌濾過し、4℃で保存し
た。
【０１０１】ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラス
ミド溶液(1 mg/ml) 1 μlを0.5 mlの異なる培地に添加
し、混合した。室温で2分間インキュベートした後、0.7
5μlの実施例2の化合物(1 mg/ml)をこれに添加し、混合
し、次に異なる量の種々のトランスフェクション試薬を
添加し、混合した。混合し、室温で15〜30分インキュベ
ートした後、この混合物をBellcoインキュベーションチ
ューブに入れた1.5 mlのHEK293-EBNA細胞に添加した。
このDNA複合体の添加に先立って、HL培地 (0.3% Primat
one RLを含有)中で無血清懸濁培養により増殖した細胞
を新鮮なHL培地(0.3% Primatone RLを含有)に移し、細
胞密度を5.5〜6×106個/mlに調整した。インキュベーシ
ョンの間、ローラードラム内でチューブを回転させた。
20〜22時間インキュベートした後の可溶性細胞抽出物中
のルシフェラーゼ活性を測定し、培養物mlあたりの相対
光単位として表現した。
【０１０２】
【表12】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１３年７月２７日（２００１．７．２
７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 式中、R1およびR2は直鎖および分枝鎖の飽和および不飽
和脂肪族カルボン酸のヒドロカルビル部分、ならびにリ
ン脂質部分からなる群より選択され；R3は逆向きのアミ
ド主鎖を有する塩基性の膜傷害性ペプチドであり；Yは
炭素数2-10のアルキレンであり；そしてXは-C(O)-NH-、
-S-S-およびそれらの塩からなる群より選択される；に
よって表わされるコンジュゲート。
【化２】
【化３】 式中、R1およびR2は直鎖および分枝鎖の飽和および不飽
和脂肪族カルボン酸のヒドロカルビル部分、ならびにリ
ン脂質部分からなる群より選択され；R3は逆向きのアミ
ド主鎖を有する塩基性の膜傷害性ペプチドであり；Yは
炭素数2-10のアルキレンであり；そしてXは-C(O)-NH-、
-S-S-およびそれらの塩からなる群より選択される；に
よって表わされるコンジュゲート、ならびにヘルパー脂
質、短鎖リン脂質およびカチオン性脂質からなる群より
選択されるトランスフェクションコンピテント分子を含
む該試薬組成物。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/34 Ａ６１Ｋ 47/42 ４Ｈ０４５ 47/42 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 エリック アルジリオス キタス スイス国 シィーエイチ−4144 アーレス ハイム イン ダー シュアッペ ５ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA08 CA02 DA02 DA03 EA04 GA13 HA17 4C076 AA11 AA17 AA19 AA22 AA24 AA29 AA36 AA53 AA95 BB01 BB12 BB22 BB24 BB25 BB27 BB29 BB31 DD63N EE25Q EE41N EE41Q FF34 FF63 FF66 FF68 4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 AA17 MA05 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA27 MA34 MA52 MA55 MA56 MA58 MA59 MA60 MA63 MA65 MA66 NA05 NA13 4C085 AA03 BB11 EE01 EE05 GG01 GG08 GG10 4C086 AA01 AA02 EA16 MA03 MA05 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA27 MA34 MA52 MA56 MA58 MA59 MA60 MA63 MA65 MA66 NA05 NA13 4H045 AA10 AA20 AA30 BA01 BA10 BA55 DA83 EA20 EA61 EA65 FA34 FA44 FA51

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の式I： 【化１】 式中、R1およびR2は直鎖および分枝鎖の飽和および不飽
    和脂肪族カルボン酸のヒドロカルビル部分、ならびにリ
    ン脂質部分からなる群より選択され；R3は逆向きのアミ
    ド主鎖を有する塩基性の膜傷害性ペプチドであり；Yは
    炭素数2-10のアルキレンであり；そしてXは-C(O)-NH-、
    -S-S-およびそれらの塩からなる群より選択される；に
    よって表わされるコンジュゲート。
  2. 【請求項２】 R1およびR2が炭素数12-20のカルボン酸
    のアシル部分である、請求項１に記載のコンジュゲー
    ト。
  3. 【請求項３】 R1およびR2がラウロイル、パルミトイ
    ル、ステアロイルおよびオレオイルからなる群より選択
    される、請求項１に記載のコンジュゲート。
  4. 【請求項４】 Xが-S-S-である、請求項１に記載のコン
    ジュゲート。
  5. 【請求項５】 Yがエチレン、プロピレンおよびデカメ
    チレンからなる群より選択される、請求項１に記載のコ
    ンジュゲート。
  6. 【請求項６】 R3が少なくとも50%のD-アミノ酸を含むG
    ln-Gln-Arg-Lys-Arg-Lys-Ile-Trp-Ser-Ile-Leu-Ala-Pro
    -Leu-Gly-Thr-Thr-Leu-Val-Lys-Leu-Val-Ala-Gly-Ile-N
    H-CH[CONH2]-(CH2)-である、請求項１に記載のコンジュ
    ゲート。
  7. 【請求項７】 R3がD-Gln-D-Gln-D-Arg-D-Lys-D-Arg-D-
    Lys-D-Ile-D-Trp-D-Ser-D-Ile-D-Leu-D-Ala-D-Pro-D-Le
    u-D-Gly-D-Thr-D-Thr-D-Leu-D-Val-D-Lys-D-Leu-D-Val-
    D-Ala-D-Gly-D-Ile-NH-CH[CONH2]-CH-(CH2)-である、請
    求項１に記載のコンジュゲート。
  8. 【請求項８】 下記の式IVによって表わされる化合物： 【化２】
  9. 【請求項９】 少なくとも50%のD-アミノ酸を含む、ペ
    プチドGln-Gln-Arg-Lys-Arg-Lys-Ile-Trp-Ser-Ile-Leu-
    Ala-Pro-Leu-Gly-Thr-Thr-Leu-Val-Lys-Leu-Val-Ala-Gl
    y-Ile-Cys-NH2ならびにその誘導体、塩および溶媒和
    物。
  10. 【請求項１０】 ペプチドD-Gln-D-Gln-D-Arg-D-Lys-D-
    Arg-D-Lys-D-Ile-D-Trp-D-Ser-D-Ile-D-Leu-D-Ala-D-Pr
    o-D-Leu-D-Gly-D-Thr-D-Thr-D-Leu-D-Val-D-Lys-D-Leu-
    D-Val-D-Ala-D-Gly-D-Ile-D-Cys-NH2ならびにその誘導
    体、塩および溶媒和物。
  11. 【請求項１１】 試薬組成物であって、下記の式I： 【化３】 式中、R1およびR2は直鎖および分枝鎖の飽和および不飽
    和脂肪族カルボン酸のヒドロカルビル部分、ならびにリ
    ン脂質部分からなる群より選択され；R3は逆向きのアミ
    ド主鎖を有する塩基性の膜傷害性ペプチドであり；Yは
    炭素数2-10のアルキレンであり；そしてXは-C(O)-NH-、
    -S-S-およびそれらの塩からなる群より選択される；に
    よって表わされるコンジュゲート、ならびにヘルパー脂
    質、短鎖リン脂質およびカチオン性脂質からなる群より
    選択されるトランスフェクションコンピテント分子を含
    む該試薬組成物。
  12. 【請求項１２】 ポリヌクレオチドおよびタンパク質か
    らなる群より選択されるアニオン性巨大分子をさらに含
    む、請求項1１に記載の組成物。
  13. 【請求項１３】 ポリカチオン性ポリマーをさらに含
    む、請求項1１に記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 前記ポリカチオン性ポリマーがポリエ
    チレンイミンである、請求項１３に記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 タンパク質加水分解物をさらに含む、
    請求項１１に記載の組成物。
  16. 【請求項１６】 請求項８に記載の化合物およびポリエ
    チレンイミンを含む試薬組成物。
  17. 【請求項１７】 タンパク質加水分解物をさらに含む、
    請求項１６に記載の組成物。
  18. 【請求項１８】 生物学的に活性な分子を真核細胞に導
    入する方法であって、以下のステップ： (a) DNA複合体形成のための培地を用意し；そして(b)
    該培地中で、請求項１に記載のコンジュゲートの存在下
    で、かつさらにヘルパー脂質、短鎖リン脂質およびカチ
    オン性脂質からなる群より選択されるトランスフェクシ
    ョンコンピテント分子の存在下で該細胞を該生物学的に
    活性な分子と接触させる；を含んでなる該方法。
  19. 【請求項１９】 前記接触ステップがさらにタンパク質
    加水分解物の存在下で実施される、請求項１８に記載の
    方法。
  20. 【請求項２０】 前記タンパク質加水分解物がトリプシ
    ンによる肉消化物である、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記生物学的に活性な分子がポリヌク
    レオチドおよびタンパク質からなる群より選択されるア
    ニオン性巨大分子である、請求項１８に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 生物学的に活性な分子を真核細胞に導
    入する方法であって、以下のステップ： (a) DNA複合体形成のための培地を用意し；そして(b)
    該培地中で、請求項８に記載の化合物の存在下で、かつ
    さらにヘルパー脂質、短鎖リン脂質およびカチオン性脂
    質からなる群より選択されるトランスフェクションコン
    ピテント分子の存在下で該細胞を該生物学的に活性な分
    子と接触させる；を含んでなる該方法。
  23. 【請求項２３】 前記接触ステップがさらにタンパク質
    加水分解物の存在下で実施される、請求項２２に記載の
    方法。
  24. 【請求項２４】 前記タンパク質加水分解物がトリプシ
    ンによる肉消化物である、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記生物学的に活性な分子がポリヌク
    レオチドおよびタンパク質からなる群より選択されるア
    ニオン性巨大分子である、請求項２２に記載の方法。
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