CN105315470B - 含有吗啉‑2，5‑二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了含有吗啉‑2，5‑二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途，含有吗啉‑2，5‑二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物是由吗啉‑2，5‑二酮衍生物的共聚物、聚乙烯亚胺和CREDVW构成的分子量为3600‑98000的共聚物；实验证明本发明的含有吗啉‑2，5‑二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物细胞毒性低、转染率高且具有内皮细胞靶向性功能。本发明方法简单，无污染，用本发明的含有吗啉‑2，5‑二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物制备的纳米粒具有良好的生物相容性，能有效携载基因进入细胞且具有血管内皮细胞靶向性。
Description
技术领域
本发明属于基因载体材料技术领域，具体涉及到含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途。
背景技术
人工血管一般是由高分子聚合物制备而成，与天然血管相比，人工血管最大的区别在于其内表面缺乏功能化的内皮细胞(ECs)层。同时，由高分子聚合物形成的人工血管内表面还存在亲水性差或无细胞识别位点，这些差异往往导致人工血管术后再狭窄，这是临床上导致患者死亡的主要原因。
内皮细胞层位于天然血管的最内层，它提供了一个无血栓形成内表面，同时还在防止血栓形成和血管堵塞发生方面发挥着重要作用。在人工血管表面实现快速内皮化，从而形成内皮层，这是提高人工血管长期通畅率，防止血栓形成的重要方法之一。迄今为止，科研工作者们开发了很多具有应用前景的方法，来实现人工血管植入物原位内皮化。为了制备具有ECs捕获和(或)ECs绑定能力的生物活性表面，人们通常利用Arg-Gly-Asp(RGD)和Arg-Glu-Asp-Val(REDV)多肽作为配体，将这些多肽连接到人工血管表面，从而实现人工血管内表面对ECs的粘附，进而实现快速内皮化。然而，研究发现，在众多的细胞识别配体中，只有REDV多肽序列能够特异性地被ECs表面的α4β1整合素受体识别。因此，连接有REDV多肽的人工血管表面，能够实现对ECs的特异性识别和吸附。将REDV多肽固定在人工血管的表面，可以促进人工血管特异性地选择吸附内皮细胞，促进其内皮化。
虽然，利用REDV多肽修饰人工血管已经取得了一些成果。但是，目前利用REDV多肽制备ECs-靶向基因载体，携带目的基因(ZNF580基因)进入内皮细胞，从而促进内皮细胞快速增殖，抑制平滑肌增殖，最终实现快速内皮化，这样的研究至今还未见报道。
聚吗啉-2，5-二酮衍生物是α-氨基酸和α-羟基酸交替共聚物，是一种无毒并且在体内外均可生物降解的聚合物。吗啉-2，5-二酮衍生物的均聚物是一类有价值的生物可降解医用材料。聚吗啉-2，5-二酮衍生物，例如聚3(S)-甲基-吗啉-2，5-二酮，降解产物L-丙氨酸能够通过生物代谢途径而被人体利用。丙交酯和乙交酯共聚物是经美国FDA批准的可用于人体医学替代品的高分子聚合物，它具有良好的生物相容性和可降解性。吗啉-2，5-二酮衍生物可以和其他共聚单体聚合生成共聚物，例如和L-丙交酯、D-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、ε-己内酯、对二氧环己酮、三亚甲基环碳酸酯共聚得到优良性能的吗啉-2，5-二酮衍生物的共聚物。通过控制共聚单体化学结构和它们的比例，可以很好地控制共聚物的物理化学性能，尤其是亲水性能、生物降解性能等。
目前，亟需一种细胞毒性低、转染率高且具有内皮细胞靶向性功能的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种细胞毒性低、转染率高且具有内皮细胞靶向性功能的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物。
本发明的第二个目的是提供一种含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的制备方法。
本发明的第三个目提提供一种含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物，是由吗啉-2，5-二酮衍生物的共聚物、聚乙烯亚胺和CREDVW构成的分子量为3600-98000的共聚物；
所述吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和环状单体的共聚物，所述环状单体为L-丙交酯、D-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、ε-己内酯、对二氧环己酮或三亚甲基环碳酸酯；
所述吗啉-2，5-二酮衍生物单体的结构为式(I)所示：
其中R1：-H或-CH3；
R2：-H，-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH(CH3)2，-CH2C(CH3)2或-CH(CH3)-CH2-CH3；
所述吗啉-2，5-二酮衍生物的共聚物的分子量为1600-80000；
所述聚乙烯亚胺分子量为200-5000。
上述一种含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的制备方法，包括如下步骤：
(1)按摩尔比为(10-25)：(90-75)的比例称取吗啉-2，5-二酮衍生物单体和环状单体，加入引发剂和含锡催化剂，在隔离空气的条件下，140-155℃反应0.5-2h，再在100-130℃反应12-72h，得到混合物；所述含锡催化剂的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和环状单体质量之和的0.001％-5％；所述引发剂的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和环状单体质量之和的0.16％-8％，所述引发剂为CnH(2n+2)O2，其中10≥n≥8；所述吗啉-2，5-二酮衍生物单体的结构为式(I)：
其中R1：-H或-CH3；
R2：-H，-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH(CH3)2，-CH2C(CH3)2或-CH(CH3)-CH2-CH3；
所述环状单体为L-丙交酯、D-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、ε-己内酯、对二氧环己酮和三亚甲基环碳酸酯；
(2)将步骤(1)获得的混合物分离，提纯得到分子量为1600-80000的吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物；
(3)按比例将0.125mmol所述吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物溶于3-8mL极性有机溶剂中得到溶液；滴加到5-10mL的浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入含锡催化剂，所述含锡催化剂的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物质量的0.001％-5％，25℃反应12-48h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液滴加到8-18mL的浓度为0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，50-60℃反应12-72h；降至室温后，加入10-100mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物；所述聚乙烯亚胺分子量为200-5000；
(5)取含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物0.5-2g，溶于5-10mL N,N-二甲基甲酰胺，加入39-390μL三乙胺，在-5～0℃条件下，滴入5mL质量分数为1.0％-10％的二烯丙基氨基甲酰氯的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，1-2h滴加完毕，室温下反应12-24小时，过滤，向滤液中加入5-10mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和2-5mL浓度为0.15M CREDVW的N,N-二甲基甲酰胺溶液；在紫外灯的波长为365nm条件下照射10-20min；加入正己烷进行沉淀，得到含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物。
含锡催化剂优选为辛酸亚锡、辛酸锡、二丁基氧化锡或二月桂酸二丁基锡。
极性有机溶剂优选为三氯甲烷，二氯甲烷，二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺。
含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物制备纳米粒的用途，包括如下步骤：按比例将10-100mg含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物溶于1-10mL第二种极性有机溶剂中制成聚合物溶液，在滴速为0.01-0.10mL/min滴入搅拌速率为400-2000rpm的10-100mL超纯水中，再在400-2000rpm搅拌24-48h，蒸发第二种极性有机溶剂，得到含有粒径为55-81nm的纳米粒的液体；
第二种极性有机溶剂优选为四氢呋喃或体积比是(1-3):1的四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺的混合液。
本发明的优点：实验证明本发明的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物细胞毒性低、转染率高且具有内皮细胞靶向性功能。本发明方法简单，无污染，用本发明的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物制备的纳米粒具有良好的生物相容性，能有效携载基因进入细胞且具有血管内皮细胞靶向性。含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物以吗啉-2，5-二酮衍生物的共聚物作为疏水性纳米粒的核心，疏水链段之间的氢键作用提高了疏水核心的稳定性。纳米粒表面链接大量的低分子量的PEI和适量的CREDVW多肽，提高了纳米粒的转染效率，降低了其细胞毒性，同时还赋予了纳米粒血管内皮细胞靶向选择功能。
附图说明
图1为一种含有吗啉-2,5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的制备示意图。
图2为一种含有吗啉-2,5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物自组装形成纳米粒示意图。
图3为以一种含有吗啉-2,5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物为基材的纳米粒，吸附并压缩pEGFP-ZNF580，进而形成纳米粒/pEGFP-ZNF580复合物示意图。
图4为含吗啉-2，5-二酮衍生物的两亲性三嵌段共聚物的1H NMR图谱。
图5为一种含有吗啉-2,5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物纳米粒(A)和含有吗啉-2,5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物纳米粒/pEFGP-ZNF580复合物(B)TEM图。
图6为不同氮磷比条件下的一种含有吗啉-2,5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物纳米粒/pEFGP-ZNF580复合物琼脂糖凝电泳阻滞实验。
图7为纳米粒/pEFGP-ZNF580复合物中pEFGP-ZNF580在人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926，购自American Type Culture Collection)细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。(A)未做任何处理的细胞作为阴性对照，(B)以REDV-g-PEI-g-P(MMD-co-GA)-g-PEI-g-REDV共聚物为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染HUVECs后，细胞中绿色荧光蛋白的表达情况，(C)以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV共聚物为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染HUVECs后，细胞中绿色荧光蛋白的表达情况，(D)利用LipofectamineTM2000试剂转染HUVECs作为阳性对照。
图8为纳米粒/pDNA复合物转染48小时后人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)细胞内ZNF580蛋白表达western blot分析。(A)未经任何处理的细胞作为对照组，(B)以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染细胞，(C)以LipofectamineTM2000试剂作为对照组，转染细胞。(n＝3,*p<0.05vs.A组)。
图9为不同浓度的纳米粒和纳米粒/pEFGP-ZNF580(N/P＝10)复合物处理48小时后，人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)细胞的相对细胞活力(n＝6，*p<0.05vs.PEI组)。(A)以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV共聚物为基材的NPs的细胞毒性，(B)以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV共聚物为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物的细胞毒性，(C)PEI作为阴性对照组。
图10为在不同时间点人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)细胞的迁移过程。(1)未经NPs/pEGFP-ZNF580处理的细胞作为阴性对照组，(2)以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI-g-REDV为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染的HUVECs，(3)以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV共聚物为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染的细胞。(n＝3,*p<0.05vs.对照组)。
图11以REDV-g-PEI-g-P(MMD-co-GA)-g-PEI-g-REDV为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染HUVECs和HUASMCs24小时后，细胞免疫荧光效果图。(A)HUVECs和HUASMCs共培养体系24小时后细胞生长状态，(B)DAPI标记HUVECs和HUASMCs的细胞核，(C)FITC标记HUVECs，(D)α-SMA标记的HUASMCs。
具体实施方式
文中所用缩写说明如下，
CREDVW：半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-色氨酸；
pDNA：质粒DNA；
REDV-g-PEI-g-P(MMD-co-GA)-g-PEI-g-REDV：REDV-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-聚(3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-REDV；
REDV-g-PEI-g-P(LA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV：REDV-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-聚(丙交酯-共聚-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-REDV；
REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV：REDV-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-聚(丙交酯-共聚-乙交酯-共聚-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-REDV。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明进行任何限制。
为了克服因使用高分子量PEI而带来的细胞毒性，本发明采用低毒性和低分子量的PEI，将分子量限制在200至5000，优选为600-2000。
实施例1
一种含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照摩尔比为20：80的比例称取吗啉-2，5-二酮衍生物单体和L-丙交酯，加入引发剂和辛酸亚锡催化剂，在隔离空气的条件下，在150℃反应1h，再在120℃反应48h，得到混合物；辛酸亚锡的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和L-丙交酯质量之和的2％；引发剂为1,8-辛二醇，1,8-辛二醇的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和L-丙交酯质量之和的7％。
吗啉-2，5-二酮衍生物单体的结构为式(I-a)：
(2)将25g的步骤(1)获得的混合物溶于50mL二甲基亚砜制成溶液，加入150mL无水乙醚，分离，除去未反应的单体，提纯得到分子量为15000白色的吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物；
(3)将0.125mmol吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物溶于5mL三氯甲烷中得到溶液；滴加到7mL的浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入辛酸亚锡，所述辛酸亚锡的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物质量的1％，25℃反应24h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液滴加到12mL的浓度为0.250mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，55℃反应40h；降至室温后，加入50mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物；所述聚乙烯亚胺分子量为1800；图4所示为含吗啉-2，5-二酮衍生物的两亲性三嵌段共聚物的1H NMR图谱。
(5)取含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物2g，溶于8mL N,N-二甲基甲酰胺，加入160μL三乙胺，在-2℃条件下，逐滴滴入5mL质量分数为4％的二烯丙基氨基甲酰氯N,N-二甲基甲酰胺溶液中，1h滴加完毕，室温下继续反应18h，用砂芯漏斗过滤，滤液转移至干燥的表面皿中，加入8mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和3mL浓度为0.15M的CREDVW的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在紫外灯的波长为365nm条件下照射溶液15min；加入正己烷进行沉淀，得到含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物。见图1。含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的分子量为23400。
实施例2
一种含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的制备方法，包括如下步骤：
(1)按摩尔比为10：90的比例称取吗啉-2，5-二酮衍生物单体和D-丙交酯，加入引发剂和辛酸锡，在隔离空气的条件下，在140℃反应2h后，再在100℃反应72h，得到混合物；辛酸锡的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和D-丙交酯质量之和的0.001％；引发剂为1,9-壬二醇，1,9-壬二醇的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和D-丙交酯质量之和的8％；
吗啉-2，5-二酮衍生物单体的结构为式(I)：
其中R1：-H；R2：-CH(CH3)-CH2-CH3；
(2)将5g的步骤(1)获得的混合物溶于10mL三氯甲烷制成溶液，加入50mL无水乙醚，分离，除去未反应的单体，提纯得到白色分子量为1600的吗啉-2，5-二酮衍生物的共聚物；
(3)将0.125mmol吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物溶于3mL二氯甲烷中得到溶液；滴加到5mL的浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入辛酸锡，辛酸锡的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物质量的0.001％，25℃反应48h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液加入到8mL的浓度为0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，50℃反应72h；降至室温后，加入10mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物；聚乙烯亚胺分子量为200；
(5)取步骤(4)获得的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物0.5g，溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺，加入39μL三乙胺，在-5℃条件下，逐滴滴入5mL质量分数为1.0％的二烯丙基氨基甲酰氯N,N-二甲基甲酰胺溶液，1h滴加完毕，室温下继续反应12h，过滤，向滤液中加入5mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和2mL浓度为0.15M的CREDVW的N,N-二甲基甲酰胺溶液；在紫外灯的波长为365nm条件下照射溶液10min。反应物用正己烷进行沉淀，得到含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物。含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的分子量为3600。
实施例3
一种含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的制备方法，包括如下步骤：
(1)按摩尔比为25：75的比例称取吗啉-2，5-二酮衍生物单体和D,L-丙交酯，加入引发剂和二丁基氧化锡，在隔离空气的条件下，在155℃反应0.5h后，再在130℃反应12h，得到混合物；二丁基氧化锡的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和D,L-丙交酯质量之和的5％；引发剂为1,10-癸二醇，1,10-癸二醇质量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和D,L-丙交酯质量之和的0.16％；
吗啉-2，5-二酮衍生物单体的结构为式(I)：
其中R1：-CH3；R2：-CH2C(CH3)2；
(2)将25g的步骤(1)获得的混合物溶于50mL二氯甲烷制成溶液，加入150mL正己烷，分离，除去未反应的单体，提纯得到白色分子量为80000的吗啉-2，5-二酮衍生物的共聚物；
(3)将0.125mmol吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物溶于8mL二甲基亚砜中得到溶液；滴加到10mL的浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入二丁基氧化锡，二丁基氧化锡的加入量为两嵌段共聚物质量的5％，25℃反应12h；
(4)在隔绝空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液加入到18mL的含0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，60℃反应12h；降至室温后，加入100mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物，聚乙烯亚胺分子量为5000；
(5)取步骤(4)获得的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物2g，溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺，加入390μL三乙胺，在0℃条件下，逐滴滴入5mL质量分数为10％的二烯丙基氨基甲酰氯的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，2h滴加完毕，室温下继续反应24h。过滤，向滤液中加入10mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和5mL浓度为0.15M的CREDVW的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在紫外灯的波长为365nm条件下照射溶液20min。反应物用正己烷进行沉淀，得到含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物；含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的分子量为98000。
实施例4
一种含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的制备方法，包括如下步骤：
(1)按摩尔比为18：82的比例称取吗啉-2，5-二酮衍生物单体和乙交酯，加入引发剂和二月桂酸二丁基锡，在隔离空气的条件下，在150℃反应1h，再在120℃反应48h，得到混合物；二月桂酸二丁基锡的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和乙交酯质量之和的2.5％；引发剂为1,10-癸二醇，1,10-癸二醇质量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和乙交酯质量之和的6％；
吗啉-2，5-二酮衍生物单体的结构为式(I)：
其中R1：-CH3；R2：-CH2C(CH3)2；
(2)将10g的步骤(1)获得的混合物溶于20mL三氯甲烷制成溶液，加入60mL正己烷，分离，除去未反应的单体，提纯得到白色分子量为20000的吗啉-2，5-二酮衍生物的共聚物；
(3)将0.125mmol吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物溶于5mLN，N-二甲基甲酰胺中得到溶液；滴加到8mL的浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入二月桂酸二丁基锡，二月桂酸二丁基锡的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物质量的2.5％，25℃反应25h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液加入到12mL的浓度为0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，60℃反应24h；降至室温后，加入80mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物；聚乙烯亚胺分子量为2500；
(5)取步骤(4)获得的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物1g，溶于8mL N,N-二甲基甲酰胺，加入80μL三乙胺，在0℃条件下，逐滴滴入5mL质量分数为2％的二烯丙基氨基甲酰氯的N,N-二甲基甲酰胺溶液，2h滴加完毕，室温下继续反应18h，过滤，向滤液中加入6mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和4mL浓度为0.15M的CREDVW的N,N-二甲基甲酰胺溶液；在紫外灯的波长为365nm条件下照射溶液15min，反应物用正己烷进行沉淀，得到含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物。
含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的分子量为31400。
实施例5
一种含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的制备方法，包括如下步骤：
(1)按摩尔比为23：77的比例称取吗啉-2，5-二酮衍生物单体和对二氧环己酮，加入引发剂和辛酸亚锡，在隔离空气的条件下，在150℃反应1h，再在120℃反应48h，得到混合物；辛酸亚锡的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和对二氧环己酮质量之和的2.5％；引发剂为1,10-癸二醇，1,10-癸二醇为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和对二氧环己酮质量之和7％；
吗啉-2，5-二酮衍生物单体的结构为式(I)：
其中R1：-CH3；R2：-CH(CH3)-CH2-CH3；
(2)将50g的步骤(1)获得的混合物溶于100mL三氯甲烷制成溶液，加入300mL正己烷，分离，除去未反应的单体，提纯得到白色分子量为15000的吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物；
(3)将0.125mmol吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物溶于5mL三氯甲烷中得到溶液；滴加到8mL的浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入辛酸亚锡，辛酸亚锡的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物质量的2.5％，25℃反应25h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液加入到12mL的浓度为0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，60℃反应24h；降至室温后，加入80mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物；聚乙烯亚胺分子量为1500；
(5)取步骤(4)获得的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物1g，溶于8mL N,N-二甲基甲酰胺，加入80μL三乙胺；在-3℃条件下，逐滴滴入5mL质量分数为2％的二烯丙基氨基甲酰氯的N,N-二甲基甲酰胺溶液，1.2h滴加完毕，室温下继续反应18h，过滤，向滤液中加入6mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和3mL浓度为0.15M的CREDVW的N,N-二甲基甲酰胺溶液；在紫外灯的波长为365nm条件下照射溶液15min，加入正己烷进行沉淀，得到含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物；含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的分子量为22800。
实施例6
一种含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的制备方法，包括如下步骤：
(1)按摩尔比为22：78的比例称取吗啉-2，5-二酮衍生物单体和三亚甲基环碳酸酯，加入引发剂和辛酸锡在隔离空气的条件下，在150℃反应1h后，再在120℃反应48h，得到混合物；辛酸锡的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和对三亚甲基环碳酸酯质量之和的2.5％；引发剂为1,10-癸二醇；1,10-癸二醇的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和对三亚甲基环碳酸酯质量之和的5％；
吗啉-2，5-二酮衍生物单体的结构为式(I)：
其中R1：-H；R2：-CH(CH3)-CH2-CH3；
(2)将5g的混合物溶于10mL二甲基亚砜制成溶液，加入30mL正己烷，分离，除去未反应的单体，提纯得到白色分子量为25000的吗啉-2，5-二酮衍生物的共聚物；
(3)将0.125mmol吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物溶于5mL三氯甲烷中得到溶液；滴加到8mL的浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入辛酸锡，辛酸锡的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物质量的2.5％，25℃反应12h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液加入到12mL的浓度为0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，55℃反应59h；降至室温后，加入80mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物；聚乙烯亚胺分子量为800；
(5)取步骤(4)获得的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物1g，溶于8mL N,N-二甲基甲酰胺，加入80μL三乙胺，在0℃条件下，逐滴滴入5mL质量分数为2％的二烯丙基氨基甲酰氯的N,N-二甲基甲酰胺溶液，1h滴加完毕，室温下继续反应18h。用砂芯漏斗过滤，滤液转移至干燥的表面皿中，向滤液中加入6mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和3mL浓度为0.15M的CREDVW的N,N-二甲基甲酰胺溶液；在紫外灯的波长为365nm条件下照射溶液15min，加入正己烷进行沉淀，得到含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物；含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的分子量为31400。
实验证明，用-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3或-CH(CH3)2替代本实施例中的步骤(1)的的-CH(CH3)-CH2-CH3，其它同本实施例，可以制备出与本实施例相似的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物。
实验证明，用ε-己内酯替代本实施例中步骤(1)的三亚甲基环碳酸酯，其它同本实施例，可以制备出与本实施例相似的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物。
实施例7
实施例1制备的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物制备纳米粒的用途，包括如下步骤：
将实施例1制备的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物50mg溶于5mL第二种极性有机溶剂中制成聚合物溶液，在滴速为0.05mL/min滴入搅拌速率为1000rpm的50mL超纯水中，再在1000rpm搅拌36h，蒸发第二种极性有机溶剂，得到含有粒径67±10nm的纳米粒的液体，第二种极性有机溶剂为体积比为2:1的四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺的混合液。见图2。
实施例8
以实施例7的纳米粒，吸附并压缩pEGFP-ZNF580，进而形成纳米粒/pDNA复合物，见图3，图5；
在Eppendorf(EP)管内，用PBS(pH＝7.4)溶液将提取得到的pEGFP-ZNF580质粒稀释至1μg/50μL。将稀释后的质粒溶液加入到实施例7的纳米粒溶液中(每个管内含有1μg质粒)，用移液器轻轻吹打混合液，将其充分混匀。室温条件下，将混合液置于超净台中静置30分钟。制备得到一系列N/P的NPs/pEGFP-ZNF580复合物溶液。为不同氮磷比条件下的一种含有吗啉-2,5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物纳米粒/pEFGP-ZNF580复合物琼脂糖凝电泳阻滞实验见图6。
用实施例7的纳米粒制备的纳米粒/pEFGP-ZNF580复合物，在不同时间点人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)细胞的迁移过程和迁移面积(具体方法见M.Zubair,A.Ekholm,H.Nybom,S.Renvert,C.Widen and K.Rumpunen,J.Ethnopharmacol.,2012,141,825)，见图7。
纳米粒/pDNA复合物转染48小时后人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)细胞内ZNF580蛋白表达western blot分析。(A)未经任何处理的细胞作为对照组，(B)以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染细胞，(C)以LipofectamineTM2000试剂作为对照组，转染细胞。(n＝3,*p<0.05vs.A组)见图8。
不同浓度的纳米粒和纳米粒/pEFGP-ZNF580的细胞毒性见图9，不同浓度的纳米粒和纳米粒/pEFGP-ZNF580(N/P＝10)复合物处理48小时后，人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)细胞的相对细胞活力(n＝6，*p<0.05vs.PEI组)。(A)以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV共聚物为基材的NPs的细胞毒性，(B)以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV共聚物为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物的细胞毒性，(C)PEI作为阴性对照组。
在不同时间点人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)细胞的迁移过程。(1)未经NPs/pEGFP-ZNF580处理的细胞作为阴性对照组，(2)以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI-g-REDV为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染的HUVECs，(3)以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV共聚物为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染的细胞。(n＝3,*p<0.05vs.对照组)。见图10。
以REDV-g-PEI-g-P(MMD-co-GA)-g-PEI-g-REDV为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染HUVECs和HUASMCs24小时后，细胞免疫荧光效果图。(A)HUVECs和HUASMCs共培养体系24小时后细胞生长状态，(B)DAPI标记HUVECs和HUASMCs的细胞核，(C)FITC标记HUVECs，(D)α-SMA标记的HUASMCs，见图11。
pEGFP-ZNF580(具体方法见S.Guo,Y.Huang,T.Wei,W.Zhang,W.Wang,D.Lin,X.Zhang,A.Kumar,Q.Du,J.Xing,L.Deng,Z.Liang,P.C.Wang,A.Dong and X.J.Liang,Biomaterials,2011,32,879)其中，ZNF580是由中国人民武装警察后勤学院，生理与病理实验室张文成课题组首先克隆并于Genbank注册的C2H2型转录因子新基因，注册号为AF184939。
实施例8
实施例2制备的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物制备纳米粒的用途，包括如下步骤：
将实施例2制备的10mg含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物溶于1mL第二种极性有机溶剂中制成聚合物溶液，在滴速为0.01mL/min滴入搅拌速率为2000rpm的10mL超纯水中，再在2000rpm搅拌24h，蒸发第二种极性有机溶剂，得到含有粒径为65±10nm的纳米粒的液体，所述第二种极性有机溶剂为体积比为1:1的四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺的混合液。
将细胞接种到24孔板(1×104cells/well)中，孵育至80-90％融合。转染前，细胞培养基换为无血清培养基，对细胞进行饥饿处理12小时。之后，将不同N/P不同浓度的NPs/pEGFP-ZNF580复合物分别加入到24孔板中。4-5小时之后，将无血清培养基换为新鲜的生长培养基(10％FBS DMEM)。之后，5％CO2，37℃条件下孵育细胞，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，并拍照记录。该纳米粒对人脐静脉内皮细胞株的转染效果见图7。
实施例9
实施例3制备的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物制备纳米粒的用途，包括如下步骤：
将实施例3制备的100mg含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物溶于10mL第二种极性有机溶剂中制成聚合物溶液，在滴速为0.10mL/min滴入搅拌速率为400rpm的100mL超纯水中，再在400rpm搅拌48h，蒸发第二种极性有机溶剂，得到含有粒径为71±10nm的纳米粒的液体，所述第二种极性有机溶剂为体积比为3:1的四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺的混合液。
该纳米粒负载基因前后的粒径及形貌，见图5，为一种含有吗啉-2,5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物纳米粒(A)和含有吗啉-2,5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物纳米粒/pEFGP-ZNF580复合物(B)TEM图。(具体方法见S.Guo,Y.Huang,T.Wei,W.Zhang,W.Wang,D.Lin,X.Zhang,A.Kumar,Q.Du,J.Xing,L.Deng,Z.Liang,P.C.Wang,A.Dong and X.J.Liang,Biomaterials,2011,32,879)其中，ZNF580是由中国人民武装警察后勤学院，生理与病理实验室张文成课题组首先克隆并于Genbank注册的C2H2型转录因子新基因，注册号为AF184939。
该纳米粒/DNA复合物，转染EA.hy926细胞48小时后ZNF580蛋白表达Western blot分析(具体方法见D.L.Ren,H.K.Wang,J.Q.Liu,M.H.Zhang and W.C.Zhang,Mol.CellBiochem.,2012,359,183)结果，见图8。
图10所示为以该纳米粒/DNA复合物，转染EA.hy926细胞48小时后，在不同时间点人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)细胞的迁移过程。
实施例10
实施例4制备的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物制备纳米粒的用途，包括如下步骤：
将实施例3制备的100mg含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物溶于10mL四氢呋喃中制成聚合物溶液，在滴速为0.10mL/min滴入搅拌速率为400rpm的100mL超纯水中，再在400rpm搅拌48h，蒸发四氢呋喃，得到含有粒径为71±10nm的纳米粒的液体。
以REDV-g-PEI-g-P(MMD-co-GA)-g-PEI-g-REDV为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染HUVECs和HUASMCs24小时后，细胞免疫荧光效果图，见图11。
在溶剂挥发法自组装制备纳米粒过程中，含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物作为疏水链段，形成可降解的纳米粒核心，其优势在于分子链之间容易形成氢键，从而增加纳米粒的稳定性，同时，其降解产物含有能够被人体吸收利用的L-氨基酸，还可以起到缓冲载体周围的pH变化的功能。环状单体的引入，能够调节纳米粒的降解速度。所以，这种三嵌段共聚物的疏水核心克服了传统使用聚酯高分子做为纳米粒核心的缺点。
通过在疏水核心表面连接大量的亲水性低分子量的PEI链段，既增加了纳米粒的亲水性，又为纳米粒表面提供了大量正电荷，保持其具有较高的转染力。通过在PEI末端链接CREDVW多肽，赋予NPs靶向选择ECs的功能。
Claims (5)
1.一种含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物，其特征是由吗啉-2，5-二酮衍生物的共聚物、聚乙烯亚胺和CREDVW构成的分子量为3600-98000的共聚物；
所述吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和环状单体的共聚物，所述环状单体为L-丙交酯、D-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、ε-己内酯、对二氧环己酮或三亚甲基环碳酸酯；
所述吗啉-2，5-二酮衍生物单体的结构为式(I)所示：
其中R1：-H或-CH3；
R2：-H，-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH(CH3)2或-CH(CH3)-CH2-CH3；
所述吗啉-2，5-二酮衍生物的共聚物的分子量为1600-80000；
所述聚乙烯亚胺分子量为200-5000；
所述一种含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物用下述步骤制成：
(1)按摩尔比为(10-25)：(90-75)的比例称取吗啉-2，5-二酮衍生物单体和环状单体，加入引发剂和含锡催化剂，在隔离空气的条件下，140-155℃反应0.5-2h，再在100-130℃反应12-72h，得到混合物；所述含锡催化剂的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和环状单体质量之和的0.001％-5％；所述引发剂的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物单体和环状单体质量之和的0.16％-8％，所述引发剂为CnH(2n+2)O2，其中10≥n≥8；所述吗啉-2，5-二酮衍生物单体的结构为式(I)：
其中R1：-H或-CH3；
R2：-H，-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH(CH3)2或-CH(CH3)-CH2-CH3；
所述环状单体为L-丙交酯、D-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、ε-己内酯、对二氧环己酮或三亚甲基环碳酸酯；
(2)将步骤(1)获得的混合物分离，提纯得到分子量为1600-80000的吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物；
(3)按比例将0.125mmol所述吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物溶于3-8mL极性有机溶剂中得到溶液；滴加到5-10mL的浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入含锡催化剂，所述含锡催化剂的加入量为吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物质量的0.001％-5％，25℃反应12-48h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液滴加到8-18mL的浓度为0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，50-60℃反应12-72h；降至室温后，加入10-100mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物；所述聚乙烯亚胺分子量为200-5000；
(5)取含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物0.5-2g，溶于5-10mLN,N-二甲基甲酰胺，加入39-390μL三乙胺，在-5～0℃条件下，滴入5mL质量分数为1.0％-10％的二烯丙基氨基甲酰氯的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，1-2h滴加完毕，室温下反应12-24小时，过滤，向滤液中加入5-10mg 2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和2-5mL浓度为0.15M CREDVW的N,N-二甲基甲酰胺溶液；在紫外灯的波长为365nm条件下照射10-20min；加入正己烷进行沉淀，得到含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物。
2.根据权利要求1所述的一种含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物，其特征是所述含锡催化剂为辛酸亚锡、辛酸锡、二丁基氧化锡或二月桂酸二丁基锡。
3.根据权利要求1所述的一种含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物，其特征是所述极性有机溶剂为三氯甲烷，二氯甲烷，二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺。
4.权利要求1的含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物制备纳米粒的用途，其特征是包括如下步骤：按比例将10-100mg含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物溶于1-10mL第二种极性有机溶剂中制成聚合物溶液，在滴速为0.01-0.10mL/min滴入搅拌速率为400-2000rpm的10-100mL超纯水中，再在400-2000rpm搅拌24-48h，蒸发第二种极性有机溶剂，得到含有粒径为55-81nm的纳米粒的液体。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征是所述第二种极性有机溶剂为四氢呋喃或体积比是(1-3):1的四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺的混合液。
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