CN105273203B - 可降解靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途 - Google Patents

可降解靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN105273203B
CN105273203B CN201410347099.2A CN201410347099A CN105273203B CN 105273203 B CN105273203 B CN 105273203B CN 201410347099 A CN201410347099 A CN 201410347099A CN 105273203 B CN105273203 B CN 105273203B
Authority
CN
China
Prior art keywords
degradable
targeting
triblock copolymer
solution
nanoparticle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410347099.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105273203A (zh
Inventor
冯亚凯
石长灿
任相魁
李茜
于丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN201410347099.2A priority Critical patent/CN105273203B/zh
Publication of CN105273203A publication Critical patent/CN105273203A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105273203B publication Critical patent/CN105273203B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)

Abstract

本发明公开了可降解靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途，一种可降解靶向性三嵌段共聚物，是由可降解环状单体共聚物、聚乙烯亚胺和CREDVW构成的共聚物；实验证明本发明的可降解靶向性三嵌段共聚物细胞毒性低、转染率高且具有内皮细胞靶向性功能。本发明方法简单，无污染，用本发明的共聚物制备的纳米粒具有良好的生物相容性，能够靶向性地携载目的基因进入血管内皮细胞。可降解靶向性三嵌段共聚物作为纳米粒的疏水核心。纳米粒表面链接大量的低分子量的PEI和适量的REDV多肽，提高了纳米粒的转染效率，降低了其细胞毒性，同时还赋予了纳米粒血管内皮细胞靶向选择功能。

Description

可降解靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途
技术领域
本发明属于基因载体材料技术领域，具体涉及到具有低毒性、高转染率和靶向性的可降解靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途。
技术背景
人工血管一般是由高分子聚合物制备而成，与天然血管相比，人工血管最大的区别在于其内表面缺乏功能化的内皮细胞(ECs)层。同时，由高分子聚合物形成的人工血管内表面还存在亲水性差或无细胞识别位点，这些差异往往导致人工血管术后再狭窄，这是临床上导致患者死亡的主要原因。
内皮细胞层位于天然血管的最内层，它提供了一个无血栓形成内表面，同时还在防止血栓形成和血管堵塞发生方面发挥着重要作用。在人工血管表面实现快速内皮化，从而形成内皮层，这是提高人工血管长期通畅率，防止血栓形成的重要方法之一。迄今为止，科研工作者们开发了很多具有应用前景的方法，来实现人工血管植入物原位内皮化。为了制备具有ECs捕获和(或)ECs绑定能力的生物活性表面，人们通常利用Arg-Gly-Asp(RGD)和Arg-Glu-Asp-Val(REDV)多肽作为配体，将这些多肽连接到人工血管表面，从而实现人工血管内表面对ECs的粘附，进而实现快速内皮化。然而，研究发现，在众多的细胞识别配体中，只有REDV多肽序列能够特异性地被ECs表面的α4β1整合素受体识别。因此，连接有REDV多肽的人工血管表面，能够实现对ECs的特异性识别和吸附。将REDV多肽固定在人工血管的表面，可以促进人工血管特异性地选择吸附内皮细胞，促进其内皮化。
虽然，利用REDV多肽修饰人工血管已经取得了一些成果。但是，目前利用REDV多肽制备ECs-靶向基因载体，携带目的基因(ZNF580基因)进入内皮细胞，从而促进内皮细胞快速增殖，抑制平滑肌增殖，最终实现快速内皮化，这样的研究至今还未见报道。
目前，亟需一种细胞毒性低、转染率高且具有内皮细胞靶向性功能的可降解靶向性三嵌段共聚物。
发明内容
本发明的第一个目的是解决现有技术存在的使用PEI25kDa，因其分子量高而具有高细胞毒性的问题，提供一种细胞毒性低且具有高转染性能的起着基因载体作用的可降解靶向性三嵌段共聚物。
本发明的第二个目的是提供一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种可降解靶向性三嵌段共聚物制备纳米粒的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种可降解靶向性三嵌段共聚物，是由可降解环状单体共聚物、聚乙烯亚胺和CREDVW构成的分子量为3600-98000的共聚物；所述可降解环状单体共聚物由L-丙交酯、D-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、ε-己内酯、对二氧环己酮和三亚甲基环碳酸酯之两种聚合成分子量为1600-80000的可降解共聚物；所述聚乙烯亚胺分子量为200-5000。
一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法，包括如下步骤：
(1)按摩尔比为100：(10-500)的比例称取环状单体L-丙交酯、D-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、ε-己内酯、对二氧环己酮和三亚甲基环碳酸酯之两种，加入引发剂和含锡催化剂，在隔离空气的条件下，120-155℃反应0.5-2h，再在100-130℃反应12-72h，得到混合物；所述引发剂为CnH(2n+2)O2，其中10≥n≥8；所述引发剂的加入量为环状单体质量的0.16％-8％；所述含锡催化剂的加入量为环状单体质量的0.001％-5％；
(2)将步骤(1)获得的混合物经分离提纯得到分子量为1600-80000的可降解共聚物；
(3)按比例将0.125mmol所述可降解共聚物溶于3-8mL极性有机溶剂中得到溶液，滴加到5-10mL浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入含锡催化剂，所述含锡催化剂的加入量为可降解共聚物质量的0.001％-5％，25℃反应12-48h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液滴加到8-18mL浓度为0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，50-60℃反应12-72h；降至室温后，加入10-100mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色可降解两亲性三嵌段共聚物；所述聚乙烯亚胺分子量为200-5000；
(5)按比例取步骤(4)获得的可降解两亲性三嵌段共聚物0.5-2g，溶于5-10mL N,N-二甲基甲酰胺，加入39-390μL三乙胺，在-5～0℃条件下，滴入5mL质量分数为1％-10％的二烯丙基氨基甲酰氯N,N-二甲基甲酰胺溶液中，1-2h滴加完毕，室温下反应12-24小时，过滤，向滤液中加入5-10mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和2-5mL浓度为0.15M的CREDVW的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在紫外灯波长为365nm的条件下照射10-20min，用正己烷进行沉淀，过滤，得到可降解靶向性三嵌段共聚物。
含锡催化剂优选为辛酸亚锡、辛酸锡、二丁基氧化锡或二月桂酸二丁基锡。
步骤(2)优选为：将5-50g的步骤(1)获得的混合物溶于10-100mL三氯甲烷制成溶液，加入30-300mL正己烷，分离，除去未反应的环状单体，提纯得到分子量为1600-80000的可降解共聚物。
极性有机溶剂为无水三氯甲烷、无水二氯甲烷、无水二甲基亚砜或无水N，N-二甲基甲酰胺。
上述可降解靶向性三嵌段共聚物制备纳米粒的用途，其特征是包括如下步骤：按比例将10-100mg可降解靶向性三嵌段共聚物溶于1-10mL第二种有机溶剂中制成聚合物溶液，在滴速为0.01-0.10mL/min滴入搅拌速率为400-2000rpm的10-100mL超纯水中，再在400-2000rpm搅拌24-48h，蒸发第二种有机溶剂，得到含有粒径为50-150nm的纳米粒液体，所述第二种有机溶剂为四氢呋喃或体积比为(1-3):1的四氢呋喃与DMF的混合液。
实验证明本发明的可降解靶向性三嵌段共聚物细胞毒性低、转染率高且具有内皮细胞靶向性功能。本发明方法简单，无污染，用本发明的可降解靶向性三嵌段共聚物制备的纳米粒具有良好的生物相容性，能够靶向性地携载目的基因进入血管内皮细胞。可降解靶向性三嵌段共聚物作为纳米粒的疏水核心。纳米粒表面链接大量的低分子量的PEI和适量的REDV多肽，提高了纳米粒的转染效率，降低了其细胞毒性，同时还赋予了纳米粒血管内皮细胞靶向选择功能。
附图说明
图1为一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备示意图。
图2为一种可降解靶向性三嵌段共聚物自组装形成纳米粒示意图。
图3为以一种可降解靶向性三嵌段共聚物为基材的纳米粒，吸附并压缩pEGFP-ZNF580，进而形成纳米粒/pEGFP-ZNF580复合物示意图。
图4为可降解共聚物及可降解两亲性三嵌段共聚物的红外光谱分析。(A)可降解共聚物P(LA-co-GA)，(B)可降解两亲性三嵌段共聚物(PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI)。
图5为可降解靶向性三嵌段共聚物接枝CREDVW前后荧光吸收。
(a)PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI共聚物，(b)REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI-g-REDV共聚物。
图6为不同氮磷比条件下的一种纳米粒/pEFGP-ZNF580复合物琼脂糖凝电泳阻滞实验。
图7为可降解靶向性三嵌段共聚物在PBS中的残余质量(％)变化情况(37℃，30rpm)。(A)PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI，(B)PEI-g-P(LA-co-PDO)-g-PEI。误差棒代表标准差(n＝3)。
图8为Transwell试验结果。(A)未经任何处理的HUVECs作为阴性对照组，(B)以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI-g-REDV为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染的HUVECs，(C)以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-PDO)-g-PEI-g-REDV共聚物为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染的HUVECs，(D)利用LipofectamineTM2000试剂转染HUVECs作为阳性对照。
图9以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI-g-REDV为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染HUVECs和HUASMCs24小时后，细胞免疫荧光效果图。(A)HUVECs和HUASMCs共培养体系24小时后细胞生长状态，(B)DAPI标记HUVECs和HUASMCs的细胞核，(C)FITC标记HUVECs，(D)α-SMA标记的HUASMCs。
具体实施方式
说明：文中所用缩写说明如下，
CREDVW：半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-色氨酸；
pDNA：质粒DNA；
P(LA-co-GA)：聚(丙交酯-共聚-乙交酯)；
PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI：聚乙烯亚胺-接枝-聚(丙交酯-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺；
REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI-g-REDV：REDV-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-聚(丙交酯-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-REDV；
PEI-g-P(LA-co-PDO)-g-PEI：聚乙烯亚胺-接枝-聚(丙交酯-共聚-对二氧环己酮)-接枝-聚乙烯亚胺；
HUVECs：人脐静脉内皮细胞；
REDV-g-PEI-g-P(LA-co-PDO)-g-PEI-g-REDV：REDV-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-聚(丙交酯-共聚-对二氧环己酮)-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-REDV；
HUASMCs：人脐动脉平滑肌细胞。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明进行任何限制。
实施例1
一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法，用下述方法制成：
(1)按摩尔比为100：200的比例称取环状单体L-丙交酯和乙交酯，加入引发剂1,8-辛二醇和辛酸亚锡，在隔离空气的条件下，135℃反应1h，再在120℃反应48h，得到混合物；辛酸亚锡的加入量为L-丙交酯和乙交酯质量之和的1％；1,8-辛二醇的加入量为L-丙交酯和乙交酯质量之和的7％。
(2)将10g的步骤(1)获得的混合物溶于20mL三氯甲烷制成溶液，加入60mL正己烷，分离，除去未反应的环状单体，提纯得到分子量为10000的可降解共聚物(P(LA-co-GA))。见图4(A)。
(3)将0.125mmol可降解共聚物溶于5mL无水三氯甲烷中得到溶液，滴加到7mL浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入辛酸亚锡，辛酸亚锡的加入量为可降解共聚物质量的1％，25℃反应32h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液滴加到12mL浓度为0.250mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，55℃反应48h；降至室温后，加入60mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色可降解两亲性三嵌段共聚物(PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI)，见图4(B)，图5(a)；所述聚乙烯亚胺分子量为2000；
(5)取步骤(4)获得的可降解两亲性三嵌段共聚物1g，溶于6mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入80μL三乙胺，在-2℃条件下，滴入5mL质量分数为2％的二烯丙基氨基甲酰氯DMF中，1.5h滴加完毕，室温下反应18小时，过滤，向滤液中加入6mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和3mL浓度为0.15M的CREDVW的DMF溶液，在紫外灯波长为365nm的条件下照射15min，用正己烷进行沉淀，过滤，得到分子量为18800的可降解靶向性三嵌段共聚物。其示意结构，见图1,图5(b)。见图7(A)。
图7(A)为PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI在PBS中的残余质量(％)变化情况(37℃，30rpm)。此外，可降解靶向性三嵌段共聚物接枝CREDVW前后荧光吸收变化情况，见图5。
实施例2
一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法，用下述方法制成：
(1)按摩尔比为100：10的比例称取环状单体L-丙交酯和ε-己内酯，加入1,8-辛二醇和辛酸锡，在隔离空气的条件下，120℃反应2h后，再在100℃反应72h，得到混合物；所述辛酸锡的加入量为L-丙交酯和ε-己内酯质量之和的0.001％；1,8-辛二醇的加入量为L-丙交酯和ε-己内酯质量之和的8％。
(2)将5g的步骤(1)获得的混合物溶于10mL三氯甲烷制成溶液，加入30mL正己烷，分离，除去未反应的环状单体，提纯得到分子量为1600的可降解共聚物；
(3)将0.125mmol可降解共聚物溶于3mL无水二氯甲烷中得到溶液；将该溶液滴加到5mL的浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入辛酸锡，辛酸锡的加入量为可降解共聚物质量的0.001％，25℃反应12h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液滴加到8mL浓度为0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，50℃反应72h；降至室温后，加入10mL正己烷进行沉淀，得到白色可降解两亲性三嵌段共聚物；聚乙烯亚胺分子量为200；
(5)取步骤(4)获得的可降解两亲性三嵌段共聚物0.5g，溶于5mL DMF，加入39μL三乙胺，在-5℃条件下，逐滴滴入5mL质量分数为1％的二烯丙基氨基甲酰氯DMF溶液，1h滴加完毕，室温下继续反应24h，过滤，向滤液中加入5mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和2mL浓度为0.15M CREDVW的DMF溶液，在紫外灯波长为365nm的条件下照射20min。反应物用正己烷进行沉淀，过滤，得到可降解靶向性三嵌段共聚物。可降解靶向性三嵌段共聚物的分子量为3600。
实施例3
一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法，用下述方法制成：
(1)按摩尔比为100：10的比例称取环状单体L-丙交酯和ε-己内酯，加入1,9-壬二醇和二丁基氧化锡，在隔离空气的条件下，155℃反应0.5h后，在130℃反应12h，得到混合物；二丁基氧化锡的加入量为L-丙交酯和ε-己内酯之和的5％；1,9-壬二醇加入量为环状L-丙交酯和ε-己内酯之和的0.16％；
(2)将50g的步骤(1)获得的混合物溶于100mL三氯甲烷制成溶液，加入300mL正己烷，分离，除去未反应的环状单体，提纯得到分子量为80000的可降解共聚物；
(3)将0.125mmol所述可降解共聚物溶于3mL无水二甲基亚砜中得到溶液；将该溶液滴加到5mL浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入二丁基氧化锡，二丁基氧化锡的加入量为可降解共聚物质量的5％，25℃反应12h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液滴加到8mL浓度为0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，60℃反应12h；降至室温后，加入10mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色可降解两亲性三嵌段共聚物；所述聚乙烯亚胺分子量为5000；
(5)取步骤(4)获得的可降解两亲性三嵌段共聚物2g，溶于10mL DMF，加入390μL三乙胺，在0℃条件下，逐滴滴入5mL质量分数为10％的二烯丙基氨基甲酰氯DMF溶液，2h滴加完毕，室温下继续反应12h，过滤，向滤液中加入10mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和5mL浓度为0.15M CREDVW的DMF溶液，在紫外灯波长为365nm的条件下照射10min，反应物用正己烷进行沉淀，过滤，得到分子量为98000的可降解靶向性三嵌段共聚物。
实施例4
一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法，用下述方法制成：
(1)按摩尔比为100：500的比例称取环状单体L-丙交酯和对二氧环己酮，加入1，10-癸二醇和二月桂酸二丁基锡，在隔离空气的条件下，155℃反应0.5h后，再在130℃反应12h，得到混合物；二月桂酸二丁基锡的加入量为L-丙交酯和对二氧环己酮质量之和的5％；1,10-癸二醇加入量为L-丙交酯和对二氧环己酮质量之和的0.16％；
(2)将25g的步骤(1)获得的混合物溶于50mL三氯甲烷制成溶液，加入150mL正己烷，分离，除去未反应的环状单体，提纯得到分子量为80000的可降解共聚物；
(3)将0.125mmol可降解共聚物溶于8mLN，N-二甲基甲酰胺中得到溶液；将该溶液滴加到10mL浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入二月桂酸二丁基锡，二月桂酸二丁基锡的加入量为可降解共聚物质量的5％，25℃反应48h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液滴加到18mL的0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，60℃反应12h；降至室温后，加入100mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色可降解两亲性三嵌段共聚物；所述聚乙烯亚胺分子量为5000；
(5)取步骤(4)获得的可降解两亲性三嵌段共聚物2g，溶于10mL DMF，加入390μL三乙胺，在-2℃条件下，逐滴滴入5mL质量分数为10％的二烯丙基氨基甲酰氯DMF溶液，1h滴加完毕，室温下继续反应18h，过滤，向滤液中加入10mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和5mL浓度为0.15M CREDVW的DMF溶液，在紫外灯波长为365nm的条件下照射15min。用正己烷进行沉淀，过滤，得到可降解靶向性三嵌段共聚物PEI-g-P(LA-co-PDO)-g-PEI，分子量为98000。
图7(B)为PEI-g-P(LA-co-PDO)-g-PEI在PBS中的残余质量(％)变化情况(37℃，30rpm)。
实施例5
一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法，用下述方法制成：
(1)按摩尔比为100：100的比例称取环状单体L-丙交酯和三亚甲基环碳酸酯，加入1，10-癸二醇和辛酸亚锡，在隔离空气的条件下，150℃反应1h后，再在120℃反应24h，得到混合物；辛酸亚锡催化剂的加入量为L-丙交酯和三亚甲基环碳酸酯质量之和的1％；1,10-癸二醇的加入量为L-丙交酯和三亚甲基环碳酸酯质量之和的6.04％；
(2)将50g的步骤(1)获得的混合物溶于100mL三氯甲烷制成溶液，加入300mL正己烷，分离，除去未反应的环状单体，提纯得到分子量为20000的可降解共聚物；
(3)将0.125mmol可降解共聚物溶于5mL无水三氯甲烷中得到溶液；将该溶液滴加到8mL浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入辛酸亚锡，辛酸亚锡催化剂的加入量为可降解共聚物质量的2％，25℃反应36h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液滴加到13mL浓度为0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，60℃反应12h；降至室温后，加入100mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色可降解两亲性三嵌段共聚物；所述聚乙烯亚胺分子量为3000；
(5)取步骤(4)获得的可降解两亲性三嵌段共聚物2g，溶于10mL DMF，加入390μL三乙胺，在-3℃条件下，逐滴滴入5mL质量分数为10％的二烯丙基氨基甲酰氯DMF溶液，1h滴加完毕，室温下继续反应15h，过滤，向滤液中加入10mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和5mL浓度为0.15M CREDVW的DMF溶液，在紫外灯波长为365nm的条件下照射16min。反应物用正己烷进行沉淀，得到分子量为34000的可降解靶向性三嵌段共聚物。
实施例6
一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法，用下述方法制成：
(1)按摩尔比为100：50的比例称取环状单体D-丙交酯和ε-己内酯，加入1,10-癸二醇和辛酸锡，在隔离空气的条件下，140℃反应1.5h后，再在120℃反应30h，得到混合物；辛酸锡的加入量为D-丙交酯和ε-己内酯质量之和的1％；1,10-癸二醇加入量为D-丙交酯和ε-己内酯质量之和的6.8％；
(2)将5g的步骤(1)获得的混合物溶于10mL三氯甲烷制成溶液，加入30mL正己烷，分离，除去未反应的环状单体，提纯得到分子量为15000的可降解共聚物；
(3)将0.125mmol可降解共聚物溶于5mL无水二氯甲烷中得到溶液；将该溶液滴加到8mL的浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入辛酸锡，辛酸锡的加入量为可降解共聚物质量的2％，25℃反应36h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液滴加到13mL浓度为0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，60℃反应12h；降至室温后，加入100mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色可降解两亲性三嵌段共聚物；所述聚乙烯亚胺分子量为1800；
(5)取步骤(4)获得的可降解两亲性三嵌段共聚物1.5g，溶于8mL DMF，加入160μL三乙胺，在0℃条件下，逐滴滴入5mL质量分数为3％的二烯丙基氨基甲酰氯DMF溶液，1h滴加完毕，室温下继续反应18h，过滤，向滤液中加入8mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和5mL浓度为0.15CREDVW的DMF溶液，在紫外灯波长为365nm的条件下照射12min。反应物用正己烷进行沉淀，过滤，得到分子量为21400的可降解靶向性三嵌段共聚物。
实施例7
一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法，用下述方法制成：
(1)按摩尔比为100：50的比例称取环状单体D，L-丙交酯和乙交酯，加入1,10-癸二醇和二月桂酸二丁基锡，在隔离空气的条件下，150℃反应1h后，再在120℃反应24h，得到混合物；二月桂酸二丁基锡催化剂的加入量为D，L-丙交酯和乙交酯质量之和的1％；1,10-癸二醇加入量为D，L-丙交酯和乙交酯质量之和的4.6％；
(2)将5g的步骤(1)获得的混合物溶于10mL三氯甲烷制成溶液，加入30mL正己烷，分离，除去未反应的环状单体，提纯得到分子量为25000的可降解共聚物；
(3)将0.125mmol可降解共聚物溶于5mL无水二甲基亚砜中得到溶液；将该溶液滴加到8mL浓度为0.250mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入二月桂酸二丁基锡，二月桂酸二丁基锡催化剂的加入量为可降解共聚物质量的2％，25℃反应36h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液滴加到13mL浓度为0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，60℃反应12h；降至室温后，加入100mL正己烷进行沉淀，得到白色可降解两亲性三嵌段共聚物；聚乙烯亚胺分子量为2500；
(5)取步骤(4)获得的可降解两亲性三嵌段共聚物2g，溶于8mL DMF，加入160μL三乙胺，在0℃条件下，逐滴滴入5mL质量分数为3％的二烯丙基氨基甲酰氯DMF溶液，1h滴加完毕，室温下继续反应18h，过滤，向滤液中加入8mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和5mL浓度为0.15M CREDVW的DMF溶液。在紫外灯波长为365nm的条件下照射12min，反应物用正己烷进行沉淀，得到可降解靶向性三嵌段共聚物。可降解靶向性三嵌段共聚物的分子量为31400。
实施例8
可降解靶向性三嵌段共聚物制备纳米粒的用途，包括如下步骤：
将实施例1制备的可降解靶向性三嵌段共聚物制备纳米粒50mg溶于5mL第二种有机溶剂中制成聚合物溶液，在滴速为0.05mL/min滴入搅拌速率为1000rpm的50mL超纯水中，再在1000rpm搅拌36h，蒸发第二种有机溶剂，得到含有粒径为88±10nm的纳米粒的液体，第二种有机溶剂为体积比为2:1的四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺的混合液。见图2，见图5。
实施例9
以一种可降解靶向性三嵌段共聚物为基材的纳米粒，吸附并压缩pEGFP-ZNF580，进而形成纳米粒/pEGFP-ZNF580，见图3。
在Eppendorf管内，用PBS(pH＝7.4)溶液将pEGFP-ZNF580质粒稀释至1μg/50μL。将稀释后的质粒溶液加入到实施例8获得的纳米粒的液体中，用移液器轻轻吹打混合液，将其充分混匀。室温条件下，将混合液置于超净台中静置30分钟。制备得到纳米粒/pEGFP-ZNF580(NPs/pEGFP-ZNF580)复合物溶液。
pEGFP-ZNF580(具体方法见S.Guo,Y.Huang,T.Wei,W.Zhang,W.Wang,D.Lin,X.Zhang,A.Kumar,Q.Du,J.Xing,L.Deng,Z.Liang,P.C.Wang,A.Dong and X.J.Liang,Biomaterials,2011,32,879)其中，ZNF580是由中国人民武装警察后勤学院，生理与病理实验室张文成课题组首先克隆并于Genbank注册的C2H2型转录因子新基因，注册号为AF184939。
以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-PDO)-g-PEI-g-REDV为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染的HUVECs其Transwell试验结果，见图8。将EA.hy926细胞接种到24孔板(1×104cells/well)中，孵育至80-90％融合。转染前，细胞培养基换为无血清培养基，对细胞进行饥饿处理12小时。之后，将不同N/P不同浓度的NPs/pEGFP-ZNF580复合物分别加入到24孔板中。4-5小时之后，将无血清培养基换为新鲜的生长培养基(10％FBS DMEM)。之后，5％CO2，37℃条件下孵育细胞，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，并拍照记录。(EA.hy926，购自American Type Culture Collection)。
图6，不同氮磷比条件下的一种纳米粒/pEFGP-ZNF580复合物琼脂糖凝电泳阻滞实验。
以REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI-g-REDV1为基材的NPs/pEGFP-ZNF580复合物转染HUVECs和HUASMCs24小时后，细胞免疫荧光效果图，见图9，其中，(A)HUVECs和HUASMCs共培养体系24小时后细胞生长状态，(B)DAPI标记HUVECs和HUASMCs的细胞核，(C)FITC标记HUVECs，(D)α-SMA标记的HUASMCs。
实施例10
可降解靶向性三嵌段共聚物制备纳米粒的用途，包括如下步骤：
将实施例2制备的10mg可降解靶向性三嵌段共聚物溶于1mL第二种有机溶剂中制成聚合物溶液，在滴速为0.01mL/min滴入搅拌速率为2000rpm的10mL超纯水中，再在2000rpm搅拌24h，蒸发第二种有机溶剂，得到含有粒径为60±10nm的纳米粒的液体，所述第二种有机溶剂为体积比为1:1的四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺的混合液。
实施例11
可降解靶向性三嵌段共聚物制备纳米粒的用途，包括如下步骤：
将实施例3制备的100mg可降解靶向性三嵌段共聚物溶于10mL第二种有机溶剂中制成聚合物溶液，在滴速为0.10mL/min滴入搅拌速率为400rpm的100mL超纯水中，再在400rpm搅拌48h，蒸发第二种有机溶剂，得到含有粒径为140±10nm的纳米粒的液体，所述第二种有机溶剂为体积比为3:1的四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺的混合液。
本实施例的第二种有机溶剂选用四氢呋喃，其它同本实施例，也可以得到与本实施例相似的纳米粒的液体。
用实施例4、5、6、7制备的可降解靶向性三嵌段共聚物分别采用本实施例的方法制备出与实施例相似的纳米粒的液体。
在溶剂挥发法自组装制备纳米粒过程中，可降解共聚物作为疏水链段，形成可降解的纳米粒核心。降解产物起到缓冲载体周围环境pH变化的功能。利用不同的环状单体进行共聚能够调节纳米粒核心的降解速度。通过在疏水核心表面连接大量的亲水性低分子量的PEI链段，既增加了纳米粒的亲水性，又为纳米粒表面提供了大量正电荷，保持其具有较高的转染力。通过在PEI末端链接REDV肽，赋予NPs靶向选择ECs的功能。

Claims (4)

1.一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)按摩尔比为100：(10-500)的比例称取环状单体L-丙交酯、D-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、ε-己内酯、对二氧环己酮和三亚甲基环碳酸酯之两种，加入引发剂和含锡催化剂，在隔离空气的条件下，120-155℃反应0.5-2h，再在100-130℃反应12-72h，得到混合物；所述引发剂为CnH(2n+2)O2，其中10≥n≥8；所述引发剂的加入量为环状单体质量的0.16％-8％；所述含锡催化剂的加入量为环状单体质量的0.001％-5％；
(2)将步骤(1)获得的混合物经分离提纯得到分子量为1600-80000的可降解共聚物；
(3)按比例将0.125mmol所述可降解共聚物溶于3-8mL极性有机溶剂中得到溶液，滴加到5-10mL浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入含锡催化剂，所述含锡催化剂的加入量为可降解共聚物质量的0.001％-5％，25℃反应12-48h；
(4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液滴加到8-18mL浓度为0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，50-60℃反应12-72h；降至室温后，加入10-100mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色可降解两亲性三嵌段共聚物；所述聚乙烯亚胺分子量为200-5000；
(5)按比例取步骤(4)获得的可降解两亲性三嵌段共聚物0.5-2g，溶于5-10mL N,N-二甲基甲酰胺，加入39-390μL三乙胺，在-5～0℃条件下，滴入5mL质量分数为1％-10％的二烯丙基氨基甲酰氯N,N-二甲基甲酰胺溶液中，1-2h滴加完毕，室温下反应12-24小时，过滤，向滤液中加入5-10mg 2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和2-5mL浓度为0.15M的CREDVW的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在紫外灯波长为365nm的条件下照射10-20min，用正己烷进行沉淀，过滤，得到可降解靶向性三嵌段共聚物。
2.根据权利要求1中所述的一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法，其特征是所述含锡催化剂为辛酸亚锡、辛酸锡、二丁基氧化锡或二月桂酸二丁基锡。
3.根据权利要求1中所述的一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法，其特征是所述步骤(2)为：将5-50g的步骤(1)获得的混合物溶于10-100mL三氯甲烷制成溶液，加入30-300mL正己烷，分离，除去未反应的环状单体，提纯得到分子量为1600-80000的可降解共聚物。
4.根据权利要求1所述的一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法，其特征是极性有机溶剂为无水三氯甲烷、无水二氯甲烷、无水二甲基亚砜或无水N，N-二甲基甲酰胺。
CN201410347099.2A 2014-07-21 2014-07-21 可降解靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途 Active CN105273203B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410347099.2A CN105273203B (zh) 2014-07-21 2014-07-21 可降解靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410347099.2A CN105273203B (zh) 2014-07-21 2014-07-21 可降解靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105273203A CN105273203A (zh) 2016-01-27
CN105273203B true CN105273203B (zh) 2017-12-01

Family

ID=55143086

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410347099.2A Active CN105273203B (zh) 2014-07-21 2014-07-21 可降解靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105273203B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108379595B (zh) * 2018-02-14 2020-05-15 天津大学 多功能靶向性基因载体及制备方法及用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1182208A2 (en) * 2000-07-28 2002-02-27 Roche Diagnostics GmbH Composition for DNA transfection
CN103709411A (zh) * 2013-12-13 2014-04-09 天津大学 含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物及制备方法及用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1182208A2 (en) * 2000-07-28 2002-02-27 Roche Diagnostics GmbH Composition for DNA transfection
CN103709411A (zh) * 2013-12-13 2014-04-09 天津大学 含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物及制备方法及用途

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Peptide-Grafted Lactide-Based Poly(ethylene glycol) Porous Scaffolds for Specific Cell Adhesion;Chul Ho Park，等;《Macromolecular Research》;20100519;第18卷(第5期);第526-532页，尤其是正文第526页摘要，第527页左栏第1段，第532页左栏第1段 *
Photochemical internalization for pDNA transfection: Evaluation of poly(d,l-lactide-co-glycolide) and poly(ethylenimine) nanoparticles;M. Gargouri，等;《International Journal of Pharmaceutics》;20101029;第403卷(第1-2期);第276-284页，尤其是第277页左栏第3段、最后一段，右栏第1-2段，第283页左栏第3段 *
Poly(-lactic acid)/polyethylenimine nanoparticles as plasmid DNA carriers;Park, Y.M.，等;《Arch. Pharm. Res.》;20080131;第31卷(第1期);第96-102页 *
Regulation of the endothelialization by human vascular endothelial cells by ZNF580 gene complexed with biodegradable microparticles;Changcan Shi，等;《Biomaterials》;20140522;第35卷;第7133-7145页 *
具有内皮细胞选择性的细胞膜仿生支架材料的研究;魏雨，等;《高分子学报》;20101231(第12期);第1474-1478页 *
具生物活性的快速光交联生物可降解水凝胶的设计合成;邓超，等;《高分子学报》;20130531(第5期);第695-704页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105273203A (zh) 2016-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Deng et al. A biodegradable triblock copolymer poly (ethylene glycol)-b-poly (l-lactide)-b-poly (l-lysine): Synthesis, self-assembly, and RGD peptide modification
Yu et al. Phenylalanine-based poly (ester urea): synthesis, characterization, and in vitro degradation
CN106574026B (zh) 通过乳液聚合制备的多元接枝共聚物超级弹性体
Shi et al. Regulation of the endothelialization by human vascular endothelial cells by ZNF580 gene complexed with biodegradable microparticles
US9587070B2 (en) Polymeric structures containing strained cycloalkyne functionality for post-fabrication azidealkyne cycloaddition functionalization
Deng et al. RGD peptide grafted biodegradable amphiphilic triblock copolymer poly (glutamic acid)‐b‐poly (l‐lactide)‐b‐poly (glutamic acid): Synthesis and self‐assembly
CN101792510A (zh) 对聚偏氟乙烯进行可控亲水改性的方法
CN102093554A (zh) 聚（l-谷氨酸）均聚物、无规共聚物、接枝共聚物及其制备方法
Lin et al. Micelle formation and drug release behavior of polypeptide graft copolymer and its mixture with polypeptide block copolymer
CN109735572A (zh) 一种靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体及制备方法和应用
CN105273203B (zh) 可降解靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途
Hu et al. Novel aliphatic poly (ester‐carbonate) with pendant allyl ester groups and its folic acid functionalization
Peng et al. Amphiphilic triblock copolymers of methoxy-poly (ethylene glycol)-b-poly (L-lactide)-b-poly (L-lysine) for enhancement of osteoblast attachment and growth
CN105792814B (zh) 用于药物递送的载有芳香族n-杂环的聚碳酸酯
CN105315470B (zh) 含有吗啉‑2，5‑二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途
CN103709411B (zh) 含有吗啉-2，5-二酮衍生物共聚物的两亲性三嵌段共聚物及制备方法及用途
Li et al. Preparation of thermo-responsive drug-loaded nanofibrous films created by electrospinning
CN106750343B (zh) Y型两亲嵌段共聚物及其制备方法和以该共聚物为载体靶向胞内释药的载药胶束
Ju et al. Poly (ε-caprolactone) with pendant natural peptides: an old polymeric biomaterial with new properties
CN103724616A (zh) 一种两亲性三嵌段共聚物及制备方法及用途
Xiang et al. A Convenient Method for the Synthesis of the Amphiphilic Triblock Copolymer Poly (L‐lactic acid)‐block‐Poly (L‐lysine)‐block‐Poly (ethylene glycol) Monomethyl Ether
TWI498123B (zh) 共聚物及複合物
CN106750332A (zh) 星形聚合物接枝多肽和聚乙烯亚胺的基因载体及制备方法
CN102898636B (zh) 含可控侧链羧基数目的聚酯类材料及其制备方法
Mo et al. Synthesis and characterization of amphiphilic block polymers with amino groups and their conjugates with folic acid and fluorescent probes

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: 300350 District, Jinnan District, Tianjin Haihe Education Park, 135 beautiful road, Beiyang campus of Tianjin University

Patentee after: Tianjin University

Address before: 300072 Tianjin City, Nankai District Wei Jin Road No. 92

Patentee before: Tianjin University

CP02 Change in the address of a patent holder