KR20190028665A - 기능화된 나노입자(functionalized nanoparticles)를 사용하여 선택된(예정된) 분화된 세포에 대한 사람 체세포의 직접적인 재프로그래밍 - Google Patents

기능화된 나노입자(functionalized nanoparticles)를 사용하여 선택된(예정된) 분화된 세포에 대한 사람 체세포의 직접적인 재프로그래밍 Download PDF

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안드라닉 앤드류 에이프리키안
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스템제닉스 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 사람 체세포로부터 심장, 간, 혈액, 신경 및 다른 세포와 같은, 목적한 분화된 세포형을 생성하기 위해 초기 세포(예를 들면, 체세포)를 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 초기(예를 들면, 체세포) 세포는 목적한 사람 유도된 세포형을 생산하는 사람 세포이다. 일부 구현예에서, 조성물 및 방법은 생물학적으로 활성인 분자(RNA, 단백질, 펩타이드 및 다른 소 분자)로 기능화된 나노입자를 포함한다. 이러한 새로이 생성된(즉, "유도된) 분화된 세포는 기관 기능 및/또는 조직 재생(심장, 간 등)을 증진시키고 기능적 활성을 스크리닝하는데 유용하다.

Description

기능화된 나노입자(functionalized nanoparticles)를 사용하여 선택된(예정된) 분화된 세포에 대한 사람 체세포의 직접적인 재프로그래밍
관련 출원의 상호 참고
본 출원은 2016년 6월 3일자로 출원된 미국 가특허원 제62/345360호의 이익을 청구하며, 이의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 사람 체세포로부터 심장, 간, 혈액, 뉴우런 및 다른 세포와 같은 다양한 사람 세포형을 세포 재프로그래밍(cell reprogramming)하여 생성하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이러한 새로이 생성된 분화된 세포(specialized cell)는 기관 기능 및/또는 조직 재생(심장, 간 등)을 증진시키고 기능적 활성을 위한 약물을 스크리닝하는데 유용하다.
정부 실시권의 설명
본 발명은 국립 과학 재단(National Science Foundation)이 수여한 중소 기업 혁신 연구(Small Business Innovation Research: SBIR) 제I 단계 IIP-1214943 하의 정부지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정한 권리를 갖는다.
다양한 세포형으로 정상적으로 증식하고, 이주하여 분화(differentiating)하는 세포의 능력은 배형성 및 다양한 선천성 또는 후천성 질환에서 심혈관 및/또는 조혈 시스템의 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 성숙한 세포의 기능에 있어서 중요하다. 줄기 세포 및/또는 보다 차등적으로 분화된 세포형의 이러한 기능적인 능력은 다양한 병리학적 상태에서 변경되지만, 생물학적으로 활성인 성분의 세포내 도입시 또는, 대안적으로는 복구 또는 기능적 증진이 요구되는 분화된 세포형으로 다른 세포형의 전환분화(transdifferentiation)에 의해 정상화될 수 있다. 예를 들면, 손상을 입은 생존 및/또는 골수 줄기/선조 세포의 호중구로의 분화와 같은 비정상적인 세포 기능은 생명을 심각하게 위협하는 감염으로 고생할 수 있고 급성 골수성 백혈병 또는 다른 악성종양을 발달시킬 수 있는 주기적이거나 심각한 선천적 호중구감소증을 지닌 환자에서 관찰된다(Carlsson et al., Blood, 103, 3355 (2004); Carlsson et al., Haematologica, (2006)). 다른 예는 바쓰 증후군(Barth syndrome)이며, 여기서 환자는 조혈 세포의 비정상적인 생존뿐만 아니라 심근증으로 불리는 손상된 심장 기능도 가질 수 있다(Makaryan et　al., Eur. J. Haematol., (2012)).
바쓰 증후군(Barth syndrome)과 같은 다른 유전된 질환인, 미토콘드리아 TAZ 유전자내 기능 상실 돌연변이에 의해 추정적으로 유도된 다중 시스템 줄기 세포 장애(multi-system stem cell disorder)는 재발성으로 중증이고 때때로 생명을 위협하는 치명적인 감염 및/또는 심장 이식에 의해 해결할 수 있는 심부전을 초래할 수 있는 심근증을 유발할 수 있는 호중구감소증(감소된 수준의 혈액 호중구)과 관련될 수 있다.
과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF)를 사용한 호중구감소증 환자의 치료는 세포 표면에 위치하는 G-CSF 수용체 분자에 있어서 구조적 변화를 유도하며, 이는 궁극적으로 호중구의 생산을 거의 정상 수준으로 회복시켜 환자의 삶의 질을 증진시키는 세포내 사건(event)의 연쇄를 후속적으로 유발(triggering)한다(Welte and Dale, Ann. Hematol. 72, 158 (1996)). 그럼에도 불구하고, G-CSF로 치료된 환자는 백혈병으로 발달할 수 있으며(Aprikyan et al., Exp. Hematol. 31, 372 (2003); Rosenberg et al., Br. J. Haematol. 140, 210 (2008); Newburger et al., Genes. Pediatr. Blood Cancer, 55, 314 (2010), Aprikyan and Khuchua, Br. J. Haematol. 161, 330 (2013)), 이는 호중구감소증의 치료를 위한 골수 또는 조혈 줄기 세포 이식 또는 사람 유도된 다능성 줄기 세포의 분화시 심장 세포를 생체외(ex vivo) 생성한 후 새로이 생성된 심장 세포를 환자의 심장내로의 이식함으로써 심부전과 싸워 심근 기능을 회복하거나 증진시키는 대안적인 세포 치료요법 시도가 탐구되고 있는 이유이다.
대안적 세포 치료요법 시도는 환자의 체세포(예컨대, 섬유아세포)의 기능성 심근세포로의 직접적인 재프로그래밍을 포함하며, 이는 심장 근육의 구조적 통합성을 뒷받침할 수 있고 사람 심장의 기능을 정상화할 수 있다. 최근에, 이러한 직접적인 재프로그래밍 시도는 심장-특이적인 전사 인자, 소 분자 및 마이크로RNA를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 심장 특이적인 인자를 지닌 레트로- 또는 렌티-바이러스(바이러스 벡터)의 사용을 포함한다. 마이크로RNA의 존재 또는 부재하에서 심장 유전자의 상이한 세트의 이러한 바이러스 전달은 심장 특이적인 유전자의 유도된 발현에 의해 입증된 바와 같이 사람 섬유아세포를 유도된 심근세포-유사 세포(iCM)로 직접 재프로그래밍하는데 효과적이었다(참고: Doppler, et al., Int. J. Mol. Sci.　16, 17368-17393 (2015)). 그럼에도 불구하고, 이러한 바이러스 재프로그래밍은 바이러스 DNA의 세포 게놈내로의 무작위 통합과 관련되며, 이는 다양한 돌연변이를 유도하여, 숙주 세포내에서 정상의 유전자 발현 양식을 변경시키고 종양유전자 발현을 유발함으로써 암 또는 다른 유해한 결과를 가져오는 것으로 알려져 있다. 따라서, 바이러스 재프로그래밍은 세포 재프로그래밍 및 사람에서 후속적인 사용을 위한 타당한 시도가 아니다.
직접적인 재프로그래밍에 의해 트리거(trigger)된 세포내 사건은 명확하게 통합되지 않은 기능화된 나노입자를 사용하여 상이한 생물학적으로 활성인 분자(RNA, 마이크로RNA, 단백질, 펩타이드 및 다른 소 분자)의 칵테일(cocktail)을 세포내 전달할 때 보다 효과적으로 영향받고 조절될 수 있다. 세포막은 외인성 자극에 의해 영향받는 것으로부터 세포내 사건의 캐스캐이드(cascade)를 보존하는 활성 장벽으로서 제공되지만, 이들 생물활성 기능화된 나노입자는 세포 막을 침투하여 세포 기능을 변형시키고/시키거나, 필요한 경우 원치않는 세포를 제거하고/하거나 사람 체세포를 목적한 다른 세포형으로 직접 재프로그램화할 수 있다.
당해 분야에서의 발전에도 불구하고, 염색체 구조에 대한 손상을 피하면서 생물학적으로 활성인 분자를 세포의 내부로 전달하여 세포의 재프로그래핑을 효율적으로 유도하기 위한 효율적인 시도가 여전히 요구되고 있다. 본 발명은 다양한 세포형으로의 비-통합성의 직접 재프로그래밍, 완전한 사람 세포 게놈의 보존의 필요성을 충족시키며 추가로 관련된 이점에 대한 새로운 수단을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 세포 기능을 조절하고 사람 체세포를 선택된(예정된) 계통의 기능성 세포로 직접 재프로그래밍하기 위해 단백질, 펩타이드 및/또는 RNA 분자를 생접합성 나노입자로 연결하는 기능화(functionalization) 방법에 관한 것이다. 이러한 기능성 세포는 연구 및 개발, 약물 스크리닝 및 사람에서 세포 및/또는 기관 기능을 증진시키기 위한 치료학적 적용에 후속적으로 사용될 수 있다. 예시적인 선택된(예정된) 세포형은 유도된 심장 세포, 간세포, 신경 세포 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 기능화된 생물적합성 나노입자 자체에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 및 다른 양태는 다음의 상세한 설명에 대해 참고가 이루어지는 경우 당해 분야의 통상의 기술자에게 보다 더 용이하게 명백해질 것이다.
생물학적으로 활성인 분자를 세포내적으로 전달하기 위하여, 본 발명은 생물학적으로 활성인 분자에 공유결합으로 연결된 세포 막-침투 나노입자를 포함하는 조성물을 기반으로 한 공통의 플랫폼(universal platform)을 제공한다. 이러한 목적을 위해, 단백질, 펩타이드, 및/또는 RNA(예를 들면, 마이크로RNA, 전사 인자를 암호화하는 RNA, siRNA, shRNA 등) 분자의 나노입자에 대한 공유결합성 연결을 보증하는 기능화 방법이 본원에 제공된다. 본 발명의 변형된 세포-침투성 나노입자는 일반적으로 세포 기능의 조절 및/또는 정상화를 위한 생물학적으로 활성인 분자의 세포내 전달, 및 사람 체세포의 선택된(예정된) 계통으로의 직접적인 재프로그래밍을 위한 공통의 메카니즘을 제공하며, 이는 연구 및 개발, 약물 스크리닝 및 사람에서 세포 및/또는 기관/조직 기능을 증진시키기 위한 치료학적 적용에 후속적으로 사용될 수 있다. 예시적인 선택된(예정된) 세포형은 심장 세포, 간세포, 신경 세포 등을 포함한다.
본원에 개시된 방법은 예를 들면, 초상자성 산화철 또는 금 나노입자, 또는 과학 문헌에 이미 기술된 것들과 유사한 중합체성 나노입자를 포함하는, 생체적합성나노입자를 이용한다(Lewin et al., Nat. Biotech. 18, 410-414, (2000); Shen et al., Magn. Reson. Med. 29, 599-604 (1993); Weissleder, et al. Am. J. Roentgeneol., 152, 167-173 (1989); 각각의 참고문헌은 이의 전문이 참고로 본원에 포함된다). 이러한 나노입자는 예를 들면, 골수 세포, 림프절, 비장 및 간의 자기 공명 영상을 위한 임상 셋팅에 사용될 수 있다(참고: 예컨대, Shen et al., Magn. Reson. Med. 29, 599 (1993); Harisinghani et al., Am. J. Roentgenol. 172, 1347 (1999); 본원에 포함된 각각의 참고문헌은 이의 전문이 참고로 본원에 포함된다). 예를 들면, 크기가 50 nm 미만이고 가교-결합된 세포막-투과성 TAT-유도된 펩타이드를 함유하는 자기 산화철 나노입자는 세포당 30 pg 이하의 초상자성 철 나노입자의 양으로 조혈 및 중성 선조 세포내로 효율적으로 내부화된다(Lewin et al., Nat. Biotechnol. 18, 410 (2000)). 또한, 나노입자 혼입은 사람 골수-기원한 CD34+ 원시 선조 세포의 증식 및 분화 특성 또는 세포 생존능에 영향을 미치지 않는다(Maite Lewin et al., Nat.　Biotechnol. 18, 410 (2000)). 따라서, 개시된 나노입자는 표지된 세포의 생체내(in vivo) 트래킹(tracking)에 사용될 수 있다.
표지된 세포는 이들의 분화능을 보유하며 또한 자기 공명 영상을 사용하여 조직 샘플 속에서 검출될 수 있다. 본원에서, 본 발명자들은 신규한 나노입자-기반 조성물을 제시하며, 이는 기능성화되어 RNA의 다양한 세트(예를 들면, 예컨대, 마이크로RNA, 전사 인자를 암호화하는 RNA, siRNA, shRNA 등), 단백질, 펩타이드 및 생물학적으로 활성인 분자의 세포내 전달을 위한 탁월한 비히클(vehicle)로서 제공되어 세포내 사건을 표적화하고 사람 체세포의 목적한 다양한 세포형으로의 직접적인 재프로그래밍을 위한 세포 기능 및 특성을 조절할 수 있는 다른 소 분자로 기능화된다.
나노입자-펩타이드/단백질/RNA 접합체(conjugate)의 일반적인 설명:
나노입자는 다양한 길이의 링커가 부착되고 최종적으로, 이들의 X/Y 기능성 그룹을 통해 단백질, RNA(예를 들면, 마이크로RNA, 전사 인자를 암호화하는 RNA, siRNA, shRNA 등) 분자 및/또는 펩타이드(또는 다른 소 분자)에 공유결합으로 부착되는, X/Y 기능성 그룹을 지닌 생체적합성 중합체 코팅(예컨대, 덱스트란 다당류)를 지닌 철 또는 다른 물질을 기반으로 할 수 있다. 링커 구조는 잘-알려져 있으며 개시된 기능성화된 나노입자 설계에 일반적으로 적용될 수 있다. 링커는 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 부착된 생활성 화합물에 구조적 가요성(conformational flexibility)을 제공함으로써, 이들이 이의 적절한 3차원 구조를 유지하고 회전하여 이의 세포내 파트너(partner)와 보다 효율적으로 상호작용하여 결합할 수 있도록 할 수 있다.
가교결합에 사용될 수 있는 기능성 그룹의 예시적인, 비-제한 예는 다음을 포함한다:
-NH2(예를 들면, 라이신, a―NH2);
-SH;
-COOH;
-NH-C(NH)(NH2);
탄수화물;
-하이드록실(OH); 및
링커 상에서 아지도 그룹의 광화학을 통한 부착.
가교결합 시약의 예시적인, 비-제한 예는 다음을 포함한다:
가교결합된 아미노 및 티올 그룹에 대한 설포석신이미딜 유도체인, 설포-SMCC를 포함하는 SMCC[석신이미딜 4-(N-말레이미도-메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트];
설포-LC-SMCC를 포함하는 LC-SMCC(장쇄 SMCC);
아민과 반응하고 티올 그룹을 제공하는, 설포-SPDP를 포함하는 SPDP[N-석신이미딜-3-(피프리딜디티오)-프로피오네이트];
설포-LC-SPDP를 포함하는 LC-SPDP(장쇄 SPDP);
-COOH 그룹을 -NH2 그룹과 연결시키는데 사용된 시약인, EDC[1-에틸 하이드로클로라이드-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드];
설포-SM(PEG)n 유도체를 포함하는 SM(PEG)n(여기서 n=1,2,3,4...24개의 글리콜 단위이다);
설포-SPDP(PEG)n 유도체를 포함하는 SPDP(PEG)n(여기서 n=1,2,3,4...12개의 글리콜 단위이다);
카복실 및 아민 그룹 둘 다를 함유하는 PEG 분자; 및
카복실 및 설프하이드릴 그룹 둘 다를 함유하는 PEG 분자.
캡핑(capping) 및 차단 시약의 예시적인, 비-제한적 예는:
NH에 대해 특이적인, 시트라콘산 무수물;
SH에 대해 특이적인 에틸 말레이미드; 및
말레이미드에 대해 특이적인 머캅토에탄올.
이러한 목적에 유용한 나노입자는 산화철 또는 금과 같은 금속 코어를 함유할 수 있거나, 금속 코어는 함유하지 않지만 시간에 걸쳐 방출되어 장기 지속 효과를 생성하는, 트랩된(trapped) 내부 생물활성 분자를 함유하는 중합체성 나노입자일 수 있다.
상기한 관점에서, 본 발명자들은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된, 제U.S. 2014/0342004호에 기술된 바와 같이, 생체적합성 나노입자를 표면에서 기능성 아민으로 처리하여 단백질, 핵산 및 짧은 펩타이드를 화학적으로 결합시켰다. 요약하면, 초상자성 또는 대안적 나노입자는 크기가 50 nm 미만 또는 이상일 수 있고 ml당 나노입자가 1015 내지 1020개 이거나 나노입자당 아민 그룹이 10개 이상이다.
SMCC(예를 들면, ThermoFisher로부터의 것)는 예를 들면, ACROS(밀봉된 바이알(vial) 및 무수성)로부터 수득된 디메틸포름아미드(DMF) 속에 1 mg/ml 농도에서 용해시킬 수 있다. 샘플은 밀봉하여 거의 즉시 사용된다.
십(10) 마이크로리터의 용액을 200 마이크로리터 용적의 나노입자에 가한다. 이는 큰 과량의 SMCC를 존재하는 이용가능한 아민 그룹에 제공하며, 반응을 대략 1 내지 2시간 동안 진행하도록 한다. 과량의 SM 및 DMF는 컷오프(cutoff)가 3,000 달톤인 원심분리 여과기 컬럼(공급원: Amicon)을 사용하여 제거할 수 있다. 용적의 5회 교환이 일반적으로 적절한 완충액 교환을 보증하기 위해 요구된다. 과량의 SMCC가 이 단계에서 제거되도록 하는 것이 중요하다.
임의의 RNA 또는 펩타이드계 분자, 예를 들면, 상업적으로 이용가능한 녹색 형광성 단백질(GFP) 또는 정제된 재조합 GFP, 또는 임의의 다른 목적한 단백질을 활성화된 나노입자에 가할 수 있다. 적절한 MW 컷오프(GFP를 사용한 예에서 이는 컷-오프가 50,000 달톤 이상이다)를 지닌 원심분리 여과기 단위에 의해 제거된다. 샘플은 -80℃의 동결건조기에서 또는 4℃에서 저장된다. 아미콘 원심분리 여과기 컬럼을 사용하는 것 대신에, Bio Rad P 크기 배제 컬럼과 같은, 고체 크기 여과 성분을 함유하는 작은 스핀 컬럼을 또한 사용할 수 있다. SMCC를 또한 설포 유도체(Sulfo-SMCC)로서 구입하여, 이를 보다 수용성이 되도록 할 수 있음에 주목하여야 한다. DMSO(디메틸 설폭사이드)는 또한 표지 시약(labeling reagent)에 대해 용매 담체로서 DMF를 대체할 수 있으며; 다시, 이는 무수성이어야 한다.
모든 다른 가교결합 시약도 유사한 방식으로 적용할 수 있다. SPDP를 또한 SMCC와 동일한 방식으로 단백질/적용가능한 펩타이드에 적용한다. 이는 DMF 속에서 용이하게 용해될 수 있다. 디티올은 DTT와 1시간 이상 동안 반응시켜 절단한다. 부산물 및 반응하지 않은 물질을 제거한 후, 이를 컷오프가 3,000 MW인 Amicon 원심분리 여과기 컬럼을 사용하여 정제한다.
나노입자를 펩타이드, RNA(예를 들면, 마이크로RNA, 전사 인자를 암호화하는 RNA, siRNA, shRNA 등), 또는 단백질 분자로 표지하는 또 다른 수단은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된, 본 발명자가 제US 2014/0342004호에 기술한 바와 같은, 2개의 상이한 이기능성 커플링 시약(bifunctional coupling reagent)을 사용하는 것일 수 있다.
나노입자 상의 펩타이드, RNA(예를 들면, 마이크로RNA, 전사 인자를 암호화하는 RNA, siRNA, shRNA 등) 및 단백질의 부착. 일 구현예에서, 다양한 비율의 SMCC 표지된 단백질 및 펩타이드를 비드(bead)에 가하고 반응시킨다. 예시적인 단백질 및 펩타이드는 하기에 보다 상세히 기술한다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 사람 체세포를 다른 세포형(예컨대, iCM과 같음)으로 직접 재프로그램화하는 것을 목표로 세포내 활성의 조절을 위한 기능화된 나노입자에 부착된 생체활성 분자를 전달하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 상업적으로 이용가능하거나 표준 또는 변형된 실험 과정을 사용하여 수득된 사람 세포, 섬유아세포 또는 다른 세포형을 우선 멸균 조건 하에서 세포가 부착되는 기판(공급장치 셀(feeder cell), 젤라틴, 마트리겔, 피브로넥틴, 라미닌 등)의 존재 또는 부재하에서 고체 표면 위에 먼저 플레이팅(plating)한다. 플레이팅된 세포를 세포 분열/증식 또는 허용되는 세포 생존능의 유지를 허용하는 특정 인자 조합으로 일정시간 동안 배양한다. 예에는 세포형의 경우 적절하게는 혈청 및/또는 다양한 성장 인자/사이토킨이 있으며, 이는 나중에 제거되거나 다시 채워져서 배양을 지속한다. 플레이팅된 세포를 자기장의 존재 또는 부재하에서 본원 및 어느 곳(참고: 예컨대, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 제US 2014/0342004호)에 간단히 기술된 다양한 방법을 사용하여 부착된 공유결합으로 연결된 세포-특이적인 재프로그래밍 인자(예를 들면, 심장-, 간세포-, 및 신경-특이적인 재프로그래밍 인자와 같은, 목적한 세포형에 특이적인 재프로그래밍 인자)를 지닌 기능화된 생체적합성 세포-투과성 나노입자의 존재하에 배양한다. 초상자성 나노입자의 경우에 자석의 사용은 세포와 나노입자 사이의 표면적과 접촉시 중요한 증가를 부여함으로써 세포 막을 통해 펩타이드, 단백질 또는 RNA 분자로 기능화된 나노입자의 추가로 증진된 침투를 강화한다. 필요한 경우, 세포 집단은 기능화된 나노입자로 반복적으로 처리함으로써 생체활성 분자를 세포내적으로 전달한다.
세포는 배양 배지 속에 부착시키거나 현탁시켜 유지되며, 비-포함된 나노입자는 원심분리 또는 세포 분리로 제거함으로써 집단으로 존재하는 세포를 남긴다. 이후에, 세포를 적합한 기간 동안 신선한 배지 속에 재현탁시키고 재배양한다. 세포는 기능화된 나노입자에 연결된 특이적인 생체활성 분자에 의해 유발된 후속적인 직접적인 재프로그래핑이 관찰될 때까지, 분리, 재현탁, 및 재배양의 다수의 주기를 통해 취할 수 있다. 본 발명은 하나의 세포형의 다른 것으로의 직접적인 재프로그래핑뿐만 아니라, 원래의 세포형을 보존하면서 세포 운명(cell fate)을 제어하거나 조절하는 새로운 수단으로서도 적용가능하다. 사람 섬유아세포, 혈액 세포, 상피 세포, 중간엽 세포 등과 같은 광범위한 세포형을 사용할 수 있다.
세포 재프로그래밍은 직접이든 간접이든 간에, 다양한 단백질, 펩타이드, 소 분자, RNA(예를 들면, 마이크로RNA, 전사 인자를 암호화하는 RNA, siRNA, shRNA) 등을 포함할 수 있는 생체활성 분자를 사용한 다양한 세포형 또는 조직의 처리를 기본으로 한다. 이러한 생체활성 분자는 세포막을 통해 효율적으로, 또는 전적으로 침투하지 않고, 특수한 전달 비히클 및/또는 구체화된 실험 조건없이 세포 핵에 도달할 수 없다. 더욱이, 이러한 생체활성 분자는 반감기가 짧고 다양한 프로테아제 및 뉴클레아제에 대한 노출 시 분해를 겪을 수 있다. 이러한 단점은 경우에 따라, 생체활성 분자의 감소된 효능을 야기하고 주목할만한 세포 재프로그래밍 효과를 달성하기 위해 훨씬 더 많거나 반복된 투여량의 치료를 필요로 한다. 따라서, 본 발명에서는 기능화된 나노입자를 사용하여 전술한 단점을 극복한다. 보다 구체적으로, 이들 생체활성 분자는 나노입자와 연결되는 경우 및 원래의 "네이키드(naked)" 상태와 비교하여, 새로운 물리적, 화학적, 생물학적인 기능적 특성을 획득하며, 이는 세포-침투 및 세포 핵-표적화 능력, 보다 큰 크기 및 변경된 전체적인 3차원 구조 뿐만 아니라 목적한 표적 유전자의 발현을 조절하는 후천적인 능력도 획득한다.
지금까지, 다수의 유전자 생성물 및 생체활성 분자가 재프로그래핑 효과를 나타내는 것으로 보고되었고, 목록이 지속적으로 증가하고 있다. 예를 들면, 생체활성 분자 및/또는 유전자 생성물의 상이한 세트가 사람 섬유아세포의 심근세포로의 직접적인 재프로그래핑을 유도하는 것으로 보고되었다. 하나의 이러한 세트는 전사 인자의 그룹을 나타낸다. 또 다른 세트는 마이크로RNA 분자 miR1 및 miR133과 함께 이들 인자들 중 일부 및 추가의 유전자를 포함한다. 여전히 다른 세트는 보고된 바와 같은 생체활성 분자의 상이한 조합을 포함한다(Fu JD, et al., Direct Reprogramming of Human Fibroblasts toward a Cardiomyocyte-like State. Stem Cell Reports, 1, 235-247 (2013); Nam YJ, et al., Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 5588-5593 (2013); Wada R, et al., Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 12667-12672, (2013); 및 Cao N, et al., Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352, 1216-1220 (2016); 각각은 이의 전문이 본원에 참고로 포함됨). 이들 생체활성 분자를 지닌 바이러스로 형질도입된 사람 섬유아세포는 원래의 섬유아세포에서 부재하는 심장-특이적인 마커의 존재에 의해 입증되는 바와 같이 심근세포-유사 세포(iCM)로 직접 재프로그램화된다. 여전히, 수득되는 재프로그램화된 세포는 바이러스 및 유전자 생성물-암호화 DNA의 세포 게놈내로의 삽입에 기인한 왜곡된 유전자 발현 양식(skewed gene expression pattern)을 갖는다. 또한, 이러한 직접적인 재프로그래밍의 효능은 매우 낮으며, 이는 부분적으로 이들 생체활성 분자의 짧은 반감기에 기인한다. 이러한 문제는 본 개시내용이 다루고 있으며, 본 개시내용은 비-통합 펩타이드, 단백질 및 RNA 분자로 기능화된 나노입자 또는 PEG 또는 다른 화합물 또는 분자와 같은 추가의 분해-보호 화합물을 사용함으로써 세포 게놈을 완전하게 보존하는 것을 제공한다. 일부 구현예에서, RNA 분자는 예컨대, 마이크로RNA, 전사 인자를 암호화하는 RNA, siRNA, shRNA 등일 수 있다.
섬유아세포 대 심근세포 재프로그래밍을 지시하는 것 외에, 직접적인 재프로그래밍은 생체활성 분자의 상이한 세트를 사용하여 간세포 및 신경 세포의 생성이 가능한 것으로 보고되었다. 예를 들면, FOXA3, HNF1A, 및 HNF4A 유전자는, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 사람 섬유아세포내에서 발현시키는 경우, 급성 간 부전의 동물 모델에서 간 유전자의 발현 및 간 기능의 회복에 의해 입증되는 바와 같이 세포의 직접적인 재프로그래밍 및 기능적 간세포의 생성을 초래한다. 바이러스-매개된 직접적인 심장 재프로그래밍과 유사하게, 이러한 시도는 바이러스 DNA의 사람 세포 게놈으로의 무작위 통합 및 암의 발달로 인하여 치명적인 결과를 초래할 수 있다. 본 발명은 비-통합 분자로서 상술한 및/또는 다른 재프로그래밍 인자를 사용함으로써 세포 게놈을 완전하게 완벽하게 보존함으로써 기능화시킨 나노입자의 생성 및 사용시 이러한 문제를 극복한다.
성공적인 섬유아세포 대 신경 세포 직접적인 재프로그래밍이 단일 인자 Sox-2를 사용한 태아 섬유아세포의 치료시 보고되었다(Ring et al., Cell Stem Cell, 11, 100-109, (2012); 이의 전문은 참고로 본원에 포함된다). 수득되는 새로운 리프로그램된 세포는 신경 세포 표현형 및 올리고수지세포 및 별아교세포와 같은 다른 신경 세포형으로 추가로 분화하는 능력을 지닌 유전자 발현 양식을 나타낸다. Sox2 및 Pax6 유전자의 보다 최근의 발현은 사람 성체 섬유아세포의 신경 세포로의 재프로그래밍에 효과적인 것으로 보고되었다(Connor et al., Direct Conversion of Adult Human fibroblasts into Induced Neural Precursor Cells by Non-Viral Transfection. Protocol Exchange (2015), doi:10.1038/protex.2015.034; 이의 전문은 참고로 본원에 포함됨). 섬유아세포와 같은 사람 체세포를 신경 세포로 직접 리프로그램한 다양한 인자 또는 이들의 조합이 존재한다(참고: 예컨대, Son et al. Cell Stem Cell., 9, 205-218 (2011); Pfisterer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 108, 10343-10348 (2011); Ambasudhan et al., Cell Stem Cell., 9, 113-118, (2011); 각각의 참고문헌은 이의 전문이 참고로 본원에 포함됨).
전환분화(transdifferentiation)에 있어서의 다른 보고와 유사하게, 상기 나타낸 직접적인 재프로그래밍 시도는 또한 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 또는 플라스미드 DNA를 사용하여 세포로 전달된 유전자 생성물의 발현을 기반으로 한다. 다시, DNA의 사용은 뉴클레오타이드의 숙주 세포의 게놈 DNA 내로의 예측불가능한 무작위 삽입을 트리거함으로써 잠재적으로 치명적인 결과를 가져오거나 표현형을 왜곡하는 경향이 있다. 그러나, 세포 재프로그래밍을 위한 세포-침투능을 지닌 TAT-유사 펩타이드에 융합된 단백질과 같은 재프로그래밍 인자를 사용하여 세포 재프로그래밍을 시행하기 위한 시도는 목적한 유전자의 바이러스 전달과 비교하여 매우 비효율적이었으며(Kim et al., Cell　Stem Cell., 4, 472-476 (2009); Zhou et al., Cell Stem Cell., 4, 381-384 (2009); 각각의 참고문헌은 이의 전문이 참고로 본원에 포함됨), 이는 이러한 시도가 폐기되어 따르지 않았던 주요 이유이다.
지금까지, 상이한 인자 또는 이의 다양한 조합이 직접적인 재프로그래밍에 효과적인 것으로 보고되어 왔으며, 유사한 특성을 지닌 잠재적인 인자의 목록이 지속적으로 커지고 있다. 하기 표 1은 본 발명에 따른 직접적인 재프로그래밍에서 사용하기에 적합한 다양한 생체활성 인자 또는 이들의 조합의 몇가지 예시적이고 비-제한적인 예를 포함한다:
[표 1]
예시적인 재프로그래밍 인자 및 조합, 각각의 참고문헌은 이의 전문이 참고로 본원에 포함된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
본 발명은 하나의 세포형을 다른 세포형으로 재프로그래밍할 수 있는 상기 언급한 또는 다른 생체활성 분자 반등(exposure) 중 어느 것으로 기능화시킨 나노입자(금속-코어(예를 들면, 초상자성 철-기반 또는 금 기반 나노입자) 또는 비-코어(예를 들면, 중합체성 나노입자)에 상관없이)를 사용함으로써 삽입 돌연변이유발 및 왜곡된 유전형/표현형 문제를 극복한다. 인용된 세포형, 인자, 및/또는 인자의 조합은 제한하는 것으로 의도되지 않으며 이러한 추가의 인자 및/또는 조합은 새로이 발견될 것이고 이러한 조합은 본 출원에 기술된 바와 동일한 방식으로 작업할 수 있다.
본 발명의 하나의 용도는 세포 재프로그래밍에 있어서의 효과에 대한 생체활성 분자(화합물 또는 화합물들)의 스크리닝/시험이다. 이는 본원에 개시된 방법을 사용하여 나노입자에 부착된 화합물을 목적한 세포 집단(섬유아세포, 혈액 세포, 중간엽 세포 등에 상관없이)과 조합시키는 단계, 적합한 기간 동안 배양하는 단계 및 이후에 화합물(들)로부터 생성되는 어떠한 조절 효과도 측정하는 단계를 포함한다. 이는 심장 세포, 간세포(간 세포), 또는 신경 세포와 같은, 분화된 목적한 세포형의 세포 재프로그래밍 및 생성, 독성, 대사성 변화, 또는 수축 활성 및/또는 다른 기능에 있어서의 효과에 대한 세포의 시험을 포함한다.
본 발명의 다른 용도는 사람 또는 동물 체의 치료로 의도된 의약(medicament)으로서 또는 전달 장치 속에 분화된 세포를 형성시키는 것이다. 이는 임상의가 기능화된 나노입자를 손상된 기관(예컨대, 심장, 뇌, 또는 간) 조직 속에 또는 주변에 혈관구조로부터 또는 근육 또는 기관 조직내로 직접 투여함으로써, 분화된 세포가 이식되어, 손상을 제한하고, 조직의 근육화의 재생/재성장 및 분화된 기능의 회복에 관여하도록 할 수 있다. 대안적으로, 본원에 기술된 바와 같은, 유도된 심장 세포(iCM) 또는 다른 세포형은 기술된 기능화된 나노입자와 함께 생체외(ex vivo)에서 생산되어 이후 대상체의 질환이 있거나 손상된 조직 주변의 부위내로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 다른 적용은 스크리닝 스캐폴드(screening scaffold)로서 iCM을 생성하고/하거나 사용하여 심장 질환과 관련하여 치료학적 또는 약리학적 효과에 대해 하나 이상의 후보 조성물을 시험하는 것이다. 예를 들면, iCM(또는 간세포 및 신경 세포와 같은 목적한 세포형)을 시험관내에서 생성하여 배양하고 후보물 약제학적 제제와 접촉시키고 이후 세포를 효과에 대해 관찰할 수 있다. 일부 구현예에서, iCM 또는 다른 세포형은 심장 장애 또는 다른 질환을 지닌 대상체로부터 기원한 체세포로부터 생성될 수 있다. 따라서, 심장 상태와 관련하여 약제학적 활성에 대한 스크리닝을 약제학적 제제에 대한 대상체의 반응성을 평가할 필요가 있는 대상체의 특수한 유전적 배경에 대해 이룰 수 있다.
본원에서 달리 구체적으로 정의하지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 용어는 이들이 본 발명의 분야에서 기술자에게 제공하는 바와 동일한 의미를 가진다. 의사는 특히 Sambrook J., et　al., (eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2001); 및 Ausubel F.M., et　al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (2010)를 조회하며, 이들 각각은 참고로 본원에 포함된다.
청구범위에서 용어 "또는"의 사용은, 본 개시내용이 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하지만, 대안들 만을 지칭하는 것으로 표현하여 나타내거나 대안들이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다.
장기간 유지되는 특허법에 따르면, 청구범위 또는 명세서에서 단어 "포함하는"과 관련하여 사용된 경우 단수 단어("a" 및 "an")는 달리 나타내지 않는 한, 하나 이상을 나타낸다.
내용이 달리 명확하게 요구하지 않는 한, 상세한 설명 및 청구범위 전체에서, 단어 "포함하다", "포함하는" 등은 독점적인 또는 배타적인 의미와 대치되는 것으로서 포괄적인 의미로 해석되어야 하는데; 즉 "포함하나, 제한하지 않는"의 의미를 나타낸다. 단수 또는 복수를 사용하는 단어는 또한 복수 및 단수 각각을 포함한다. 또한, 용어 "본원", "상기", 및 "하기", 및 유사한 의미의 단어는, 본 출원에 사용된 경우, 전체적인 것으로서 및 본원의 어떠한 특수한 부위가 아닌 본 출원을 지칭할 것이다.
개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있거나, 이와 함께 사용될 수 있거나, 이의 제조시 사용될 수 있거나, 이의 생성물인 물질, 조성물, 및 성분이 개시되어 있다. 이들 물질의 조합, 부분집합, 상호작용, 그룹 등이 개시된 경우, 다양한 개개 및 총괄적인 조합 각각은 이들 화합물의 각각 및 모든 단일 조합 및 순열에 대한 구체적인 참고가 분명하게 개시되지 않을 수 있다고 해도, 구체적으로 고려된다. 이러한 개념은 기술된 방법에서 단계들을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 본 개시내용의 모든 국면에 적용된다. 따라서, 어떠한 앞서의 구현예의 구체적인 구성성분은 다른 구현예에서의 구성성분과 조합되거나 이로 치환될 수 있다. 예를 들면, 수행될 수 있는 다양한 추가의 단계가 존재하는 경우, 이들 추가의 단계들 각각은 어떠한 구체적인 방법 단계 또는 개시된 방법의 방법 단계들의 조합으로 수행될 수 있으며, 각각의 이러한 조합 또는 조합들의 부분집합은 구체적으로 고려되고 개시되는 것으로 고려되어야 함이 이해된다. 또한, 본원에 기술된 구현예는 본원의 다른 곳에 기술되거나 당해 분야에 공지된 어떠한 적합한 물질도 사용하여 시행할 수 있음이 이해된다.
본원에 인용된 공보 및 이들이 인용하는 주제는 이의 전문이 참고로 본원에 구체적으로 포함된다.
추가의 예시의 방식으로 및 제한하지 않고, 다음의 실시예는 본 발명의 다른 국면을 개시한다.
실시예 1
비-통합성 나노입자는 심장-특이적인 전사 인자의 세트(예를 들면, 본원에 이의 전문이 참고로 포함된 최근에 기술된 (Nam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 5588-5593, (2010) Gata4, MEF2C, TBX5, MESP1, 및 MYOCD를 포함하는 세트 1)로 기능화된다. 요약하면, 사람 체세포를 기능화된 나노입자로 1회 또는 반복적으로(2회 이상) 처리하며, 이는 심장-특이적인 인자의 처리된 세포의 세포질 및 핵으로의 전달을 초래한다. 세포는 연장된 기간 동안 적절한 배양 배지 속에 유지시키고 사람 체세포의 기능성 심장 세포로의 이러한 직접적인 재프로그래밍의 결과를 다양한 분자 생물학, 생화학 및 세포 생물학 기술을 사용하여 모니터링한다. 구체적으로, 심장 특이적인 트로포닌 T 또는 트로포미오신의 발현을 RNA 분리에 이은 실시간 또는 역 전사된 PCR, 적절한 항체를 사용한 세포의 면역염색(immunostaining), 또는 배양된 세포의 유세포 분석기 분석(flow cytometry analysis)에 의해 측정할 수 있다.
실시예 2
사람 체세포의 직접적인 재프로그래밍을 위한 심장 특이적인 인자의 상이한 세트는 심장-특이적인 전사 인자 및 마이크로RNA로 기능화된 나노입자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 세트 2는 4개의 단백질 Gata4, Hand2, TBX5, MYOCD 및 2개의 마이크로RNA miR-1 및 miR-133을 포함한다. 바이러스 벡터를 사용하여 세포내로 도입된 생체활성 분자의 이러한 조합은 기능적으로 활성인 수축 심근세포-유사 세포의 생성과 함께 사람 섬유아세포의 직접적인 재프로그래밍에 효율적이다(Wada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 12667-12672, (2013)). 여기서, 사람 섬유아세포는 재조합체 단백질 및 마이크로RNA의 세트 2로 기능화시킨 나노입자로 처리하고 배양하여 사람 iCM의 생성을 유도한다. 이들 및/또는 다른 세트의 심장-특이적인 인자의 대안적인 조합은 사람 체세포의 심장 세포로의 재프로그래밍을 함께 유발한다.
이러한 비-통합 기능화된 나노입자의 제제는 세포 게놈내로 통합되어 정상의 유전자 발현 양식을 파괴할 수 있는 어떠한 DNA 분자도 포함하지 않는다. 본 발명은 이의 취지 또는 필수적인 특징으로부터 벗어나지 않고 다른 구체적인 형태로 구현될 수 있다.
인용된 세포형, 인자, 및/또는 인자들의 조합은 예시적이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 새로이 발견된 것들을 포함하는 추가의 인자 및/또는 조합은 본 발명에 포함되며 본원에 기술된 바와 동일한 방식으로 기능할 것이다.
실시예 3
비-통합 나노입자를 예를 들면 최근에 기술된 FOXA3, HNF1A, 및 HNF4A(Huang et al., Cell Stem Cell., 14, 370-384, (2014), 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨)를 포함하는 간세포-재프로그래밍 전사 인자의 세트로 기능화한다. 요약하면, 사람 체세포를 기능화된 나노입자로 1회 또는 반복적으로(2회 이상) 처리하고, 이는 처리된 세포의 세포질 및 핵에 간-특이적인 인자를 전달한다. 세포를 적절한 배양 배지 속에 연장된 기간 동안 유지시키고 사람 체세포의 기능적 간 세포로의 이러한 직접적인 재프로그래밍의 결과를 다양한 분자 생물학, 생화학 및 세포 생물학 기술을 사용하여 모니터링한다. 구체적으로, 알부민(ALB), a-1-항트립신(AAT) 및 사이토크롬 P450(CYP) 효소의 발현을 RNA 분리에 이어 실시간 또는 역 전사된 PCR, 적절한 항체를 사용한 세포의 면역염색, 또는 배양된 세포의 유세포 분석기 분석으로 측정할 수 있다. 또한, 새로이 생성된 간세포의 기능성을 또한 액체 크로마토그래피-탄뎀 질량 분광법(liquid chromatography-tandem mass spectrometry)을 사용하여 유도된 CYP 효소의 물질대사 활성을 평가함으로써 확인할 수 있다. 이러한 유형의 간 세포는, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 재프로그램화된다고 해도, 급성 간 부전의 동물 모델에서 간 기능의 회복을 나타낸다(Huang et al., Cell Stem Cell., 14, 370-384 (2014)).
인용된 세포-형, 인자, 및/또는 인자들의 조합은 예시적이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 새로이 발견된 것들을 포함하는, 추가의 인자 및/또는 조합이 본 발명에 포함되며 본원에 기술된 바와 동일한 방식으로 기능할 것이다.
실시예 4
비-통합 나노입자를 최근에 기술된 신경-재프로그래밍 전사 인자 PAX6 및/또는 SOX2(Connor, Protocol Exchange doi:10.1038/protex.2015.034 (2015), 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨)의 세트로 기능화한다. 요약하면, 사람 체세포를 기능화된 나노입자로 1회 또는 반복적으로(2회 이상) 처리하여, 처리된 세포의 세포질 및 핵으로 재프로그래밍 인자를 전달한다. 세포를 적절한 배양 배지 속에서 연장된 시간 동안 유지시키고 사람 체세포의 신경 선조 세포로의 이러한 직접적인 재프로그래밍의 결과를 다양한 분자생물학, 생화학 및 세포 생물학 기술을 사용하여 모니터링한다. 구체적으로, 새로이 생성된 신경 세포 속에서 타이로신 하이드록실라제(TH), vGlut1,　GAD65/67 및　DARPP32와 함께 뉴우런-특이적인 TUJ1,　MAP2, 또는　NSE 표현형 마커의 발현을 RNA 분리에 이어 실시간 또는 역 전사된 PCR 및/또는 적절한 항체를 사용한 세포의 면역염색, 또는 사람 섬유아세포로부터 직접 재프로그램된 배양된 신경 세포의 유세포 분석기 분석에 의해 측정할 수 있다.
인용된 세포-형, 인자, 및/또는 인자들의 조합은 예시적이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 새로이 발견된 것들을 포함하는, 추가의 인자 및/또는 조합은 본 발명에 포함되며 본원에 기술된 바와 동일한 방식으로 작용할 것이다.
실시예 5
사람들이 약제학적 약물에 상이하게 반응함은 잘-확립되어 있다. 이러한 차이는 이들 세포가 개인들 중에서 세포의 유전형 또는 변이체 발달 이력을 기반으로 하여 약제학적 약물에 상이하게 반응하기 때문에 세포 수준에서 명시될 수 있다(Turner RM, et al., Parsing interindividual drug variability: an emerging role for systems pharmacology. Rev Syst Biol Med. 2015 7(4), 221-41, 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨). 배선 변이체(germline variant)는 유전된 변이이며 흔히 약물 침착 및 궁극적으로 약물 효능 및/또는 독성을 포함하는, 약물의 약물독력학적 거동과 관련되는 반면, 체세포 돌연변이는 흔히 약물에 대한 약동학적 반응을 예측하는데 유용하다. 약물민족성(Pharmacoethnicity), 또는 약물 반응 또는 독성에 있어서의 인종적 다양성은 약물 반응의 개인간 변화를 고려하여 크기 인식된 인자이다. 약물민족성은 흔히 배선 약제유전체 인자(pharmacogenomic factor) 및 다양한 집단을 걸친 단일 뉴클레오타이드 다형성의 분포에 의해 결정된다(Patel JN, Cancer pharmacogenomics: implications on ethnic diversity and drug response. Pharmacogenet Genomics. 2015 25(5), 223-30, 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨).
따라서, 환자의 체세포의 직접적인 재프로그래밍시 생성된 환자-특이적인 심장 세포를 이용하는 약제학적 스크린은 약제학적 약물에 대한 개인의 독특한 반응으로 인한 편향성(bias)을 반영할 것이다. 이는 초기 약물 스크린이 하나의 공급원 또는 개인으로부터의 세포로 수행될 수 있지만 약물의 적용능을 일반적인 집단으로 확장시킬 수 있으며; 상이한 개인으로부터 세포의 보다 광범위한 선택이 요구됨이존재할 수 있다. 개인 공급원의 수가 커질수록, 일반적인 집단에서 약물이 균일한 반응을 가질 가능성이 커진다. 이러한 보다 넓은 스크리닝 노력없이도, 약물은 집단의 퍼센트에 대해서만, 예를 들면, 50, 40, 또는 20%에 대해서만 효과적일 수 있으며, 이러한 퍼센트는 약물의 수익성을 감소시킨다. 약물 스크리닝에 사용된 심장 세포의 생성을 위한 개인 공급원의 수가 커질수록, 제공된 약물로 효과적으로 치료된 사람들의 퍼센트가 커진다.
유사하게, 임상 시험에 있어서의 참여자를 후보 참여자의 체세포의 직접적인 재프로그래밍시 생산된 심장 세포를 사용한 세포 검정으로 임상 시험하기 위해 예비-정성화시킬 수 있다. 세포가 임상 시험에서 평가되는 약물에 잘 반응하는 경우, 개인은 임상 시험에 포함될 수 있다. 세포가 잘 반응하지 않는 경우, 개인은 시험에서 배제될 수 있다. 임상 시험의 참여자의 보다 우수한 결과의 사전 확인이 보장될 수 있다.
따라서, 당해 분야에서의 진전에도 불구하고, 본 개시내용은 심혈관 및 다른 장애의 종합적인 약제학적 스크리닝을 시행하기 위한 조성물 및 기술을 제공함으로써 결과가 전체로서 전체 표적 집단을 보다 정밀하게 반영하고 개인의 반응 편향 및 임상 시험에서의 참여를 사전제한하는 것을 피한다.
따라서, 앞서의 구현예는 본원에 기술된 본 발명을 제한하기보다는 예시하는 것으로 고려되어야 한다. 본 발명의 영역을 따라서 앞서의 설명에 의해서보다는 첨부된 청구범위에 의해 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 등가의 범위내 모든 변화는 본원에 포함되는 것으로 의도된다.
또한, 본 개시내용의 영역에 따라 일부 방법 및 조성물의 설명의 예시적이고 비-배타적인 실시예는 다음의 번호매긴 절에 제공된다. 다음의 절은 설명의 배타적인 세트인 것으로 의도되지 않으며, 최소 또는 최대 영역, 또는 본 개시내용의 필요한 구성성분 또는 단계를 정의하는 것으로 의도되지 않는다. 오히려, 이들은 본 개시내용의 영역 내에서 선택된 방법 및 조성물의 예시적인 실시예로서 제공되며, 본원에 구체적으로 나열되지 않은, 보다 광의의 또는 보다 협소한 영역의 다른 설명은 여전히 본 개시내용의 영역내에 있다.
A1. 중심 나노입자(central nanoparticle)에 접합된 적어도 하나의 분화된 세포형-유도제(specialized cell type-inducing agent)를 포함하는, 체세포의 목적한 분화된 세포형으로의 분화를 유도하기 위한 조성물.
A2. 적어도 하나의 분화된 세포형-유도제가 나노입자에서 제1의 기능화된 그룹(functionalized group)을 통해 중심 나노입자에 접합되는, 절　A1의 조성물.
A3. 분화된 세포형이 심근세포-유사 세포(iCM), 간세포, 신경, 베타 세포, 혈액 선조 세포, 근세포, 골아세포, 또는 다른 세포형인, 절 A1 및 A2 중 하나의 조성물.
A4. 적어도 하나의 분화된 세포형-유도제가 표 1에 나열된 제제중 적어도 하나, 또는 이의 기능성 도메인(functional domain)을 포함하는, 절 A1 내지 A3 중 하나의 조성물.
A5. 적어도 하나의 분화된 세포형-유도제가 표 1에 나열된 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 분자를 포함하는, 절 A1 내지 A4 중 하나의 조성물.
A6. 적어도 하나의 분화된 세포형-유도제가 표 1에 나열된 하나 이상의 단백질 또는 RNA 분자, 또는 이의 기능성 도메인을 포함하는, 절 A1 내지 A5 중 하나의 조성물.
A7. 분화된 세포형이 심근세포-유사 세포(iCM)이고 하나 이상의 분화된 세포형-유도제가 Gata4, MEF2C, TBX5, MESP1, Hand2, MYOCD, miR-1, 및 miR-133으로부터 선택되는, 절 A1 내지 A6 중 하나의 조성물.
A8. 나노입자 위의 제2의 기능화된 그룹을 통해 나노입자에 접합된 침투 펩타이드(CPP)를 추가로 포함하는, 절 A1 내지 A7 중 하나의 조성물.
A9. 나노입자가, 직경이 약 100　nm 이하인 크기를 갖는, 절 A1 내지 A8 중 하나의 조성물.
A10. 나노입자가, 직경이 약 75, 50, 40, 또는 30 nm 이하인 크기를 갖는, 절 A1 내지 A9 중 하나의 조성물.
A11. 중심 나노입자가 철 또는 금 분자를 포함하는, 절 A1 내지 A10 중 하나의 조성물.
A12. 중심 나노입자가 중합체성 분자를 포함하는, 절 A1 내지 A11 중 하나의 조성물.
A13. 나노입자가 중합체 코팅을 포함하는, 절 A1 내지 A12 중 하나의 조성물.
A14. 나노입자가 중합체 코팅을 포함하고 제1 및/또는 제2의 기능성 그룹이 중합체 코팅에 부착되는, 절 A8 내지 A13 중 하나의 조성물.
A15. 제1의 기능성 그룹을 연결하는 제1의 링커 분자(linker molecule) 및 표 1에 나열된 적어도 하나의 분화된 세포형 유도제를 추가로 포함하는, 절 A2 내지 A14 중 하나의 조성물.
A16. 제2의 기능성 그룹 및 CPP를 연결하는 제2의 링커 분자(linker molecule)를 추가로 포함하는, 절 A8 내지 A15 중 하나의 조성물.
A17. 제1의 링커 분자가 제1의 길이를 가지고, 제2의 링커 분자는 제2의 길이를 가지며, 제2의 길이는 제1의 길이보다 더 긴, 절 A18의 조성물.
A18. CPP가 적어도 5개의 염기성 아미노산을 포함하는, 절 A8 내지 A17 중 하나의 조성물.
A19. CPP가 약 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 그 이상의 염기성 아미노산을 포함하는, 절 A8 내지 A18 중 하나의 조성물.
A20. CPP가 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 그 이상의 연속된 염기성 아미노산을 포함하는, 절 A8 내지 A19 중 하나의 조성물.
B1. 절 A1 내지 A20 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 세포.
B2. 세포가 체세포로부터 기원되는, 절 B1의 세포.
B3. 세포가 섬유아세포로부터 기원되는, 절 B1 또는 B2의 세포.
B4. 세포가 목적한 유도되고 분화된 세포형인 절 B1 내지 B3 중 어느 하나의 세포.
B5. 목적한 목적한 유도되고 분화된 세포형이 심근세포-유사 세포(iCM), 간세포, 신경, 베타 세포, 혈액 선조 세포, 근세포, 골아세포, 또는 다른 세포형인, 절 B4의 세포.
B6. 세포가 사람 세포인, 절 B1 내지 B5 중 어느 하나의 세포.
C1. 체세포를 절 A1 내지 A20 중 어느 하나의 조성물과 접촉시킴을 포함하여, 표 1에 나열된 분화된 목적한 세포형으로 체세포의 분화를 유도하는 방법.
C2. 목적한 유도되고 분화된 세포형이 심근세포-유사 세포(iCM), 간세포, 신경, 베타 세포, 혈액 선조 세포, 근세포, 골아세포, 또는 다른 세포형인, 절 C1의 세포.
C3. 체세포가 섬유아세포인, 절 C1 또는 C2의 방법.
C4. 체세포가 이러한 체세포의 분화를 허용하기에 충분한 배양 조건 하에 시험관내(in vitro)에서 접촉되는, 절 C1 내지 C3 중 어느 하나의 방법.
C5. 체세포가 사람 세포인, 절 C1 내지 C4 중 어느 하나의 방법.
D1. 유도되고 분화된 세포를 후보 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계; 및
활성의 표시(indication)에 대해 유도되고 분화된 세포를 관찰하는 단계를 포함하여, 목적한 유도되고 분화된 세포형 속에서의 활성에 대해 후보 약제학적 조성물을 시험관내 스크리닝(screening)하는 방법.
D2. 유도되고 분화된 세포가 표 1에 나열된 세포형 중 하나로부터 선택되는, 절 D1의 방법.
D3. 유도되고 분화된 세포가 심근세포-유사 세포(iCM), 간세포, 신경, 베타 세포, 혈액 선조 세포, 근세포, 골아세포, 또는 다른 세포형인, 절 D1 또는 D2의 방법.
D4. 체세포로부터 분화된 세포의 생성을 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 절 D1 내지 D3 중 하나의 방법.
D5. 분화된 세포가 절 C1 내지 C5 중 하나에서 인용된 방법에 따라 유도된, 절 D1 내지 D4 중 하나의 방법.
D6. 체세포가 정상인 대상체 또는 특정의 병리학적 상태를 지닌 대상체로부터 수득되고, 활성의 표시(indication)가 대상체에서 병리학적 상태의 치료를 위한 약제학적 조성물의 활성의 표시인, 절 D4 또는 D5의 방법.
독점적인 특성 또는 특권이 청구되어 있는 본 발명의 구현예는 다음과 같이 정의된다:

Claims (38)

  1. 중심 나노입자(central nanoparticle)에 접합된 적어도 하나의 분화된 세포형-유도제(specialized cell type-inducing agent)를 포함하는, 체세포의 목적한 분화된 세포형으로의 분화를 유도하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 분화된 세포형-유도제가 나노입자에서 제1의 기능화된 그룹(functionalized group)을 통해 중심 나노입자에 접합되는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 분화된 세포형이 심근세포-유사 세포(iCM), 간세포, 신경, 베타 세포, 혈액 선조 세포, 근세포, 골아세포, 또는 다른 세포형인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 분화된 세포형-유도제가 표 1에 나열된 제제중 적어도 하나, 또는 이의 기능성 도메인(functional domain)을 포함하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 분화된 세포형-유도제가 표 1에 나열된 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 분자, 또는 이의 기능성 도메인을 포함하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 분화된 세포형-유도제가 표 1에 나열된 제제, 또는 이의 기능성 도메인을 포함하는 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 분화된 세포형-유도제가 표 1에 나열된 하나 이상의 단백질 또는 RNA 분자, 또는 이의 기능성 도메인을 포함하는 조성물.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 분화된 세포형이 심근세포-유사 세포(iCM)이고 하나 이상의 분화된 세포형-유도제가 Gata4, MEF2C, TBX5, MESP1, Hand2, MYOCD, miR-1, 및 miR-133으로부터 선택되는 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자 위의 제2의 기능화된 그룹을 통해 나노입자에 접합된 침투 펩타이드(CPP)를 추가로 포함하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가, 직경이 약 100　nm 이하인 크기를 갖는 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 나노입자가, 직경이 약 75, 50, 40, 또는 30 nm 이하인 크기를 갖는 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 중심 나노입자가 철 또는 금 분자를 포함하는 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 중심 나노입자가 중합체성 분자를 포함하는 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 중합체 코팅을 포함하는 조성물.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 중합체 코팅을 포함하고 제1 및/또는 제2의 기능성 그룹이 중합체 코팅에 부착되는 조성물.
  16. 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 기능성 그룹을 연결하는 제1의 링커 분자(linker molecule) 및 표 1에 나열된 적어도 하나의 분화된 세포형 유도제를 추가로 포함하는 조성물.
  17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제2의 기능성 그룹 및 CPP를 연결하는 제2의 링커 분자(linker molecule)를 추가로 포함하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 제1의 링커 분자가 제1의 길이를 가지고, 제2의 링커 분자는 제2의 길이를 가지며, 여기서 제2의 길이는 제1의 길이보다 더 긴 조성물.
  19. 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, CPP가 적어도 5개의 염기성 아미노산을 포함하는 조성물.
  20. 제19에 있어서, CPP가 약 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 그 이상의 염기성 아미노산을 포함하는 조성물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, CPP가 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 그 이상의 연속된 염기성 아미노산을 포함하는 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 세포.
  23. 제22항에 있어서, 세포가 체세포로부터 기원되는 세포.
  24. 제23항에 있어서, 세포가 섬유아세포로부터 기원되는 세포.
  25. 제22항에 있어서, 세포가 목적한 유도되고 분화된 세포형인 세포.
  26. 제25항에 있어서, 목적한 유도되고 분화된 세포형이 심근세포-유사 세포(iCM), 간세포, 신경, 베타 세포, 혈액 선조 세포, 근세포, 골아세포, 또는 다른 세포형인 세포.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 사람 세포인 세포.
  28. 체세포를 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 접촉시킴을 포함하여, 표 1에 나열된 목적한 분화된 세포형으로의 체세포의 분화를 유도하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 목적한 유도되고 분화된 세포형이 심근세포-유사 세포(iCM), 간세포, 신경, 베타 세포, 혈액 선조 세포, 근세포, 골아세포, 또는 다른 세포형인 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 체세포가 섬유아세포인 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 체세포가 이러한 체세포의 분화를 허용하기에 충분한 배양 조건 하에 시험관내에서 접촉되는 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 체세포가 사람 세포인 방법.
  33. 유도되고 분화된 세포를 후보 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    활성의 표시(indication)에 대해 유도되고 분화된 세포를 관찰하는 단계를 포함하여, 목적한 유도되고 분화된 세포형 속에서 활성에 대해 후보 약제학적 조성물을 시험관내 스크리닝(screening)하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 유도되고 분화된 세포가 표 1에 나열된 세포형 중 하나로부터 선택되는 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 유도되고 분화된 세포가 심근세포-유사 세포(iCM), 간세포, 신경, 베타 세포, 혈액 선조 세포, 근세포, 골아세포, 또는 다른 세포형인 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 체세포로부터 분화된 세포의 생성을 유도하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 분화된 세포가 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 유도되는 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 체세포가 정상인 대상체 또는 특정의 병리학적 상태를 지닌 대상체로부터 수득되고, 활성의 표시(indication)가 대상체에서 병리학적 상태의 치료를 위한 약제학적 조성물의 활성의 표시인 방법.
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