CN109628470B - 基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的分子标记及其应用 - Google Patents

基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种控制半矮秆多分蘖性状的基因fol‑a，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。本发明还同时公开了上述半矮秆多分蘖基因fol‑a编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所述。本发明还同时公开了基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol‑a的分子标记SNPE3。利用分子标记SNPE3，可以鉴定大麦中是否含有fol‑a半矮秆多分蘖基因。利用该标记进行fol‑a基因的半矮秆多分蘖育种辅助选择可以保证100％的准确率，加快大麦半矮秆多分蘖育种进度。

Description

基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的分子标记 及其应用
技术领域
本发明涉及鉴别大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的基因标记方法及相应引物，所述方法属于农业生物技术领域，可以用于大麦半矮秆多分蘖种质的快速筛选和含fol-a突变基因的分子标记辅助育种。
背景技术
人口增长、气候变化和自然环境破坏等诸多因素导致了全球粮食短缺，如何提高作物的产量成为育种家普遍关注的问题。上个世纪60年代，半矮秆基因的应用显著提高了作物产量，被称之为“绿色革命”(Peng et al.,1999；Monna et al.,2002)，“绿色革命基因”涉及赤霉素代谢途径。半矮秆作物增加了作物的抗倒性，但同时也增加了肥料的投入量，导致了生产成本的提高和环境污染等问题。因此，迫切需要寻找一种新的遗传变异来提高作物的产量。
分蘖和株高是影响作物产量和株型的两个非常重要的农艺性状(Sakamoto andMatsuoka,2004；Wang and Li,2008；Alqudah et al.,2016)，虽然他们受到光照，温、湿度、营养和种植方式等环境因素的影响，但是在很大程度上还是由遗传因素决定。因此，研究控制分蘖和株高的基因对于提高作物产量具有重要的意义。
在大麦中，目前报道了5个半矮秆多分蘖基因，分别是int-c,mnd,gra-a,int-m和fol-a(Druka et al.,2011；Hussien et al.,2014)。然而，只有int-c和mnd被克隆，int-c是水稻和玉米TB1基因的同源基因，mnd编码细胞色素P450蛋白酶(Ramsay et al.,2011；Mascher et al.,2014)，其他3个基因gra-a,int-m和fol-a分别定位在大麦染色体3HL，5HL和2HL上。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克隆了一个大麦半矮秆多分蘖基因fol-a，提供了一种与半矮秆多分蘖性状关联的分子标记；本发明所获得的分子标记SNPE3，可以鉴定大麦中是否含有fol-a半矮秆多分蘖基因。
为了解决上述技术问题，本发明一种控制半矮秆多分蘖性状的基因fol-a，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。
本发明还同时提供了上述半矮秆多分蘖基因fol-a编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所述。
本发明还同时提供了基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的分子标记SNPE3，以大麦作为物种，所述分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，
正向引物为：
BW370allele-1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTTATGCTGGAACAAACCCAGG
Bowman allele-2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTTATGCTGGAACAAACCCAGA
反向引物(共同反向引物)ACGACACATTAACTAGGCCTTCC。
注：带下划线的为接头引物。
本发明还同时提供了利用上述分子标记SNPE3鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测大麦品种基因组DNA(采用CTAB法(Stein et al.,2001)；
(2)利用分子标记SNPE3对大麦基因组DNA进行PCR扩增；
(3)根据PCR产物荧光信号的差异，使用QuantStudio Real-Time PCR软件分析，进而鉴别出每个待测大麦的基因型(即，鉴定出属于纯合野生型，纯合突变型和杂合型，这3类基因型中的哪种)。
作为本发明的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的方法的改进，步骤2)的KASParPCR反应体系为：
1μL基因组DNA(浓度为100ng/μL)，0.1μL引物，1.4μL灭菌水和2.5μL KASPBuffer，反应总量为5μL；PCR反应在ABI ViiA7荧光定量PCR仪上进行，反应程序为：95℃15min；94℃变性20s，61℃(-0.6℃/循环)退火60s，10个循环；再94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环；
所述0.1μL引物中，2种正向引物浓度各为10pmol/L，反向引物(共同反向引物)浓度为30pmol/L。
本发明使用的突变体材料BW370，它是由辐射诱变突变体Proctor与大麦品种Bowman多次回交获得的(Druka et al.,2011，www.nordgen.org)；本发明利用突变体材料BW370，进行分子标记定位和RNA-Seq试验，克隆了控制BW370半矮秆多分蘖性状的基因fol-a，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。该半矮秆多分蘖基因fol-a编码的蛋白质具有SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列。
相对应的，野生型大麦HORVU2Hr1G098820基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述，其编码的蛋白质，具有如SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列。
本发明的研究发现fol-a基因是由于其野生型大麦基因HORVU2Hr1G098820内含子3的第一个碱基由G变为A，使该基因的剪切方式发生改变，从而导致编码的蛋白发生改变，产生半矮秆多分蘖表型，该基因编码一种胰蛋白酶，不同于以前报道的大麦半矮秆多分蘖基因。利用该突变位点本发明设计了一个KASP标记能够快速准确的检测大麦材料中是否含有fol-a突变基因。
即，本发明经序列分析发现，野生型大麦HORVU2Hr1G098820基因与半矮秆多分蘖突变体BW370的fol-a基因在核苷酸序列上存在一个单碱基突变，HORVU2Hr1G098820基因的第3个内含子第一个碱基由G变为A，该突变导致了基因剪切方式发生改变，从而导致编码蛋白提前终止，产生了半矮秆多分蘖的表型。
半矮秆多分蘖突变体BW370和其野生型Bowman相比其外在表现为：叶片变细窄(叶宽约为野生型Bowman的1/2)，叶色变深，株高变矮(约为野生型Bowman的2/3)，分蘖增多(约为野生型Bowman1.52-1.84倍)。
本发明利用生物技术克隆了一个大麦半矮秆多分蘖基因fol-a，它不同于以前报道的已克隆的大麦半矮秆多分蘖基因，利用其单碱基突变位点发明人设计了一个KASP标记SNPE3，该标记具有以下优点：
1)、本发明所获得的基因标记是根据基因内部碱基突变设计的，因此不存在遗传交换，也不需要表型的进一步验证。
2)、本发明设计的KASP标记直接利用采集的荧光信号进行基因分型，无需电泳、染胶、读带等过程，可以简单快速，高通量的鉴别大麦种质资源中是否含有fol-a基因。
3)、利用本发明方法进行分子标记辅助选择育种，显著提高大麦品种的选择效率。
4)、利用该标记进行fol-a基因的半矮秆多分蘖育种辅助选择可以保证100％的准确率，加快大麦半矮秆多分蘖育种进度。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为fol-a基因结构及其与野生型的差异位点；
图2突变体BW370和Bowman中基因fol-a的氨基酸序列对比；
具体是突变体BW370半矮秆多分蘖基因fol-a和Bowman中相对应基因HORVU2Hr1G098820的氨基酸序列比对。
图3为利用本发明设计的KASP标记SNPE3鉴定突变体BW370和Bowman的fol-a基因型。
左上角
Figure BDA0001967089880000031
为Bowman(在彩色图中显示为蓝色)，右下角的●为突变体BW370(在彩色图中显示为红色)，■为阴性对照，均为2个重复。
图4为利用本发明设计的KASP标记SNPE3鉴定大麦种质资源；
左上角
Figure BDA0001967089880000041
为野生型(在彩色图中显示为蓝色)，右下角的●为突变体BW370(在彩色图中显示为红色)，中间的
Figure BDA0001967089880000042
为杂合型(在彩色图中显示为绿色)，■为阴性对照。
说明：软件自动形成的图中，红色圆圈代表纯合基因型ALLEL1/ALLEL1，蓝色圆圈代表纯合基因型ALLEL2/ALLEL2，绿色圆圈代表杂合ALLEL1/ALLEL2，×表示基因型不确定。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、设计分子标记SNPE3
1)、供试材料：突变体BW370和Bowman；
从该突变体BW370克隆到控制半矮秆多分蘖性状的基因fol-a，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。该半矮秆多分蘖基因fol-a编码的蛋白质具有SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列。
辐射诱变突变体Proctor(诱变后的突变体具有半矮秆多分蘖性状)与大麦品种Bowman多次回交获得突变体BW370，其具有Bowman的遗传背景，但表现半矮秆多分蘖性状。
野生型Bowman HORVU2Hr1G098820基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述，其编码的蛋白质，具有如SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列。
2)、半矮秆多分蘖基因fol-a分子标记的获得：根据序列比对结果，发现基因fol-a在突变体BW370和其野生型Bowman间存在一个碱基突变，使用Premier5软件结合这个单碱基突变位点设计KASP标记，命名为SNPE3。
正向引物为：
BW370 allele-1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTTATGCTGGAACAAACCCAGG(5’-3’)
Bowman allele-2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTTATGCTGGAACAAACCCAGA(5’-3’)
反向引物(共同反向引物)ACGACACATTAACTAGGCCTTCC(5’-3’)
注：带下划线的为接头引物。
实施例2、用分子标记鉴定突变体BW370和Bowman的序列差异：
1)、DNA提取：取大麦叶片100mg，使用CTAB法提取DNA，具体步骤如下：
①剪叶片于液氮中研磨后装入1.5ml离心管中，每管加CTAB 600μL于65℃温水浴50-60min(每隔10min取出轻摇)；
②加氯仿/异戊醇(24：1)600微升充分混匀15min，动作缓慢，两两称重，平衡后离心9600转，10min，4℃离心；
③吸取上清液至另一1.5ml新离心管，加2倍体积的无水乙醇轻微混匀(置-20℃冰箱30-60min沉淀)；
③用枪头挑出沉淀，置1.5ml离心管中，用70％乙醇洗2遍风干；
④加100μL超纯水，4℃冰箱溶解(母液)母液：工作液＝1:20。
2)、KASPar PCR反应及结果分析：
引物如实施例1所述。
KASP PCR反应体系为：1μL基因组DNA(浓度为100ng/μL)，0.1μL引物(2种正向引物浓度各为10pmol/L，反向引物(共同引物)浓度为30pmol/L)，1.4μL灭菌水和2.5μL KASPBuffer，反应总量为5μL。PCR反应在ABI ViiA7荧光定量PCR仪上进行，反应程序为：95℃15min；94℃变性20s，61℃(-0.6℃/循环)退火60s，10个循环；再94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环。
注：KASP Buffer为购自LGC公司的KASP Master mix试剂盒；-0.6℃/循环代表每个循环减0.6℃。
直接在ABI ViiA7荧光定量PCR仪上进行PCR反应，所述PCR仪连接QuantStudioReal-Time PCR软件，从而直接获得分析结果，所得结果如图3，即，软件自动将检测样品按照不同的基因型分成纯合野生型，纯合突变型和杂合型。
QuantStudio Real-Time PCR软件分析当出现同突变体BW370同样颜色的圆点时，表示圆点对应的材料基因型同BW370，是纯合突变型；当出现同野生型Bowman同样颜色的圆点时，表示圆点对应材料的基因型同Bowman，是纯合野生型；当出现绿色圆点时，表示圆点对应材料的基因型是杂合型的。
备注说明：2个正向引物前分别设置各自的荧光接头(为不同颜色)，分别对应ALLELE1和ALLELE2，如果检测的材料是纯合基因型，扩增的时候只会选其中对应的一个引物扩增(例如，BW370突变型只能与“BW370allele-1”发生反应)，根据荧光的差异，分辨出所测材料是allel1/allel1还是allel2/allele2，如果检测的材料是杂合型的，扩增时2个引物都会被用到，产生的荧光不同于纯合基因型的材料，从而实现区分杂合的基因型。
软件自动形成的图中，红色圆圈代表纯合基因型ALLEL1/ALLEL1，蓝色圆圈代表纯合基因型ALLEL2/ALLEL2，绿色圆圈代表杂合ALLEL1/ALLEL2，×表示基因型不确定。
实施例3、按照实施例2所述方法利用分子标记SNPE3检测32份大麦种质资源(包括突变体BW370和Bowman，2个重复)，该大麦种质资源包含野生大麦，地方品种和来自世界各地的大麦育成品种以及BW370与Vlamingh杂交所得的F1(见表1)；
结果如图4所示。
检测结果显示这些材料中BW370/Vlamingh的F1杂交种为杂合型，突变体BW370为突变型的基因型；其他材料均为野生型的基因型，观测它们的表型也不同于突变体BW370的半矮秆多分蘖表型，说明它们不含有Hvthd突变基因，也证明该分子标记能够用于大麦种质资源的检测。
表1、使用分子标记SNPE3检测的32份大麦种质资源信息
Figure BDA0001967089880000061
Figure BDA0001967089880000071
验证实验：将表1所述的大麦进行DNA检测，所得结果为：仅在突变体BW370中检测出如SEQ ID NO:1所述的基因序列，BW370/Vlamingh的F1杂交种检测出如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所述的基因序列，而其他材料只检测出如SEQ ID NO:2所述的基因序列；即所得结果完全同上述实施例3所得结果。
实施例4、将表2所述的大麦按照实施例3所述方法进行检测，检测结果显示这些材料(除BW370外)均为野生型的基因型，观测它们的表型也不同于突变体BW370的半矮秆多分蘖表型，说明它们不含有fol-a突变基因，也证明该分子标记能够用于大麦种质资源的检测。
表2、使用分子标记SNPE3检测的82份大麦种质资源信息
Figure BDA0001967089880000072
Figure BDA0001967089880000081
Figure BDA0001967089880000091
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的分子标记及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4945
<212> DNA
<213> 大麦(Hordeum vulgare L.)
<400> 1
gccgggctgc tcgtcgtccc tctttggtgg ttgagttgcc aatctggtat gccaggttgt 60
tgctccctgc cagtgccatg ggagttccgt gatgcctgca cagtaacagc ttcaggcgtt 120
ctcttcttat ttccttccgc cttccttgtt ggcctcgctt ccggggccaa atgccacgga 180
aagcttagca gctcggcctc caagaatctt cgccacggga gcagggagct ccattgccgc 240
tctgcaaccg gcatcaatcc aagctcgcgt gccttcagct gcaggctctc ttctgcggcc 300
agataaaagt tgcattgctc cagcaaaacc gatttcaggc ctgctattgg atgtaacaca 360
aggggagagt gcttgccgtt tgttcccccc gatttcttgt cggcgggttg tttcttcttt 420
tgattatgcc ttttctcttt cagcaaagtg cacgatgcct ttgccaaact tcacccgcgg 480
tgccgcctgc ttaatttgcg cgtaggccct acccttttcg cgtcgatatt tttgttatca 540
tcacaagtac tccgtgtggt agttgtcatg tggatttatg ccaattccct gtgtttaaag 600
gcagaatttg tgccatgcct ttcgccgaac aaacggatgg agacttcctc caccctctgg 660
cttttgcaga ttccactctc ctgtgatatt ctctgcttgg ttctacggcg gatgcgcaac 720
aagaatatac atatacaatg ggtcatattc gtcgtacaga ggattcctct tatgatatta 780
tctgcttttg tttgcgtggt tgcaatcctg caagaaccta ttccccgaga atatcaggct 840
actccaccag cacttgttta tttattttct tgtgtataat agcttggatg ctagctagcc 900
tcacactcat acattgctta atttcaccat acatttccca gtctgatgta ggtctattag 960
ggtgcaaaca catttggtag attgctgagt gctaactttc cagtgtctcc tctcctgaca 1020
tttttgcctt ggggcaagat tatgttctca gacttgtttg ctctaatttt tagggccata 1080
gcttctcctg tccactacgc ctgtcaactg ttcggcacga tgaagccttc agatgacagg 1140
atgcagctct caggtttgac gcggtcggaa gagtcgtctc ttgatgtgga ggggcattgc 1200
tctcaccatg aggcatttcc ttgttctccg tcgatgcaac cggttgcttc tgggtgcgtg 1260
cacacagaaa acagcgcggc atacttctta tggccgactt caaacctgca gcattgtgcg 1320
gcggagggac gggcaaacta ctttgggaac ctccagaaag gattactgcc ggtactccct 1380
ggaaagctgc ccaagggtca gcaagcaaat agcttgcttg atttgatgac cataagagct 1440
ttccacagca agatattgcg gcgtttcagc cttgggacgg cagtgggctt ccgcataaca 1500
aaaggggttc tcacagaaac ccctgccatt cttgtcttcg ttgctcgaaa ggttcacaag 1560
aaatggctta atccgaacca atgccttcct gcaattcttg cggtatgaga acctcatttt 1620
atctcttgtc ttatattatt ggacaggctt gttttcagac ttggagtcgt ttttgtcttt 1680
gactaatatc tttcacttgg ctggatgttt acagggtcca ggaggtgttt ggtgtgatgt 1740
tgatgtcgta gaattttcat actatggtgc gccggctcaa acacctaaag aacagacgtt 1800
tagtgagctt gttaataagc tgtgtggcag tgacgaatat attggttcag gctctcaggt 1860
ttatacatct atgctcttat ctgtattggt ttgcattacc tagatatcat cttcttgaag 1920
cagtgaatgc tgccatgtgt acaaattgga ttgggcacaa acatgcacta ctagttattt 1980
tctctgtctt gccagtgggc tgttcaaatt ttgtgaagat tctttggaca aagtgaataa 2040
aattgcagtg cccataaggt tatgacaatg gctgataggt actatgtcag ttcacactgt 2100
tatgcataac aatgagctac tagaagtcct gccagtgcta actttgttct tgtttagttt 2160
aaataaatct ttgttcgttt ttcttgcggt cgtctctaga gtgccaactg gatgtaactt 2220
aagttaatcc cattgtgaac tgatcagcaa tcagaagtaa ctttcttaac ggcagtctct 2280
agagtgtcat gtcatttaat gactaagtac ttgaatggtc taagttatca tatgcagctg 2340
aacaattggg tccctgcaca aatctagaca ccacttatct ttaaaactca tgtaccattt 2400
tgaatgacag tttttttttc tttccaaaac agaactaaat tatatactct agaagttaga 2460
gcagcatata gtgcattgaa tgattcaaga gggcatgctc tcatttcctg cttgagagtt 2520
ctctatacct gtttcactgt ctcaggttgc aagccaggat acatttggaa ctttgggtgc 2580
aattgtgaaa cgacgcacca acaacaagca agttggtttc ctcacgaacc gacatgttgc 2640
agttgatttg gactatccta accagaagat gtttcacccg ttgccgccga atcttgggcc 2700
tggtgtttat cttggagctg tcgagagggc aacatctttc atcacagatg atgtttggta 2760
tggaatttat gctggaacaa acccagatag agcagctaca aattatgcgg ttgatatagg 2820
ggattcatgt attattcgca gaattgaact ttaaagtata tgttatagag gaaggcctag 2880
ttaatgtgtc gtctatttaa acacaatgtc ttaaatgcat aaaatgaata aattgatgca 2940
ttccacaaac acaaacataa gtttgtgatg caggacttgt ctttctgatt gtaccagttt 3000
ttgtcagtca ggtcaacaac aacttgtgct ttagactaca taggaacaaa acaatatctg 3060
tttatggaac aaaaaactta gtttatgttt tatatatgta aatttataat ttatgtttta 3120
tatatgtaga tttataaact tataagtttc tccttctgtt tagtgttgtt atatatgatg 3180
catatgtgct gttctaatcc ccaaacatat atgctgcccc tctgtggacc tgcagagaca 3240
tttgtacgag ctgacggcgc attcatccca tttgctgatg actttgacat ttccacagtc 3300
acaactgtag ttagggaagt tggtgagatt ggggatgtta agattataga tctgcagtgt 3360
cctatcaaga gcctcatcgg gaggcaagtt tgcaaagtcg gcagaagttc cggtcacaca 3420
actgggactg tgatggcata tgcccttgag tacaatgatg agaaaggaat atgcttcttc 3480
actgacctcc tcgttgttgg tgagaatcgc caaacatttg atttggaggg tgacagcgga 3540
agccttatta tcctgaccag ccaggatggg gagaagccac gtcctattgg gataatatgg 3600
ggtggcacag caaaccgtgg gaggataaag ctcacaagtg gctatggtcc tgaaaactgg 3660
actacagggg ttgatcttgg ccgccttctt gatcgcctag aacttgatct tatcataaac 3720
gacgaatcgc tcaaaggtga gcactgcaac agtttccttc atattccagt gttgtcctgg 3780
aaatacattt gccatgcaaa cttttattat gttattggca tttttcatat ctcattgttg 3840
aatcccgttt gctccaatgt tacaaggctg acgtaattca tctataataa agatgctgtg 3900
caggagcaaa ggaatgcttt tgtggctgca attaactctg ctattgggga gtcctctgcg 3960
gtgactgtta ctgccccaga agccacccca gcagagaagg ttgaagagat ctttgagcct 4020
cttgggatcc aaattcagca gctgcctcgt cacgacccga caagcgccgc agacgaaggg 4080
gagggcgcag ccaacacacc gtccgacatg gaagagcgtc agttcatctc gaacttcgtt 4140
ggcatgtctc cggtgcgccg tgaccatgat gctcggagga ccattgccaa cctgaacaac 4200
ccgtcagagg aagagcttgc catgtcgctg cacctaggcg accgggagcc caagcggcta 4260
cgtttggacc cggaatcaaa cctagacctc gagaagcagc ctcacccgga ccaggaaccg 4320
agcctagatc tggagaagca gcctcgttcg gacccggaaa tgatgagcct agacctggag 4380
aagcagcctc gctcggaccc ggaaccgggc ctggacctgg agaagcgcct tccagctgac 4440
ccggagccga gcatagactt ggagaagtga actcgctgat tcgaatgacg tctttggaat 4500
gagcttgcaa acgataaaat cgagtagatg gaagaacccc tgtggttcag caaactggac 4560
ctgcgatgtt agcttaagtt aactactact gctggccttg tggggaagca tatcatttca 4620
tatcatgtac tagtatggca cttgattcag ctccttgtag gatattgttg ggtggtatag 4680
ccctgcagtt ttgctgtgct cataagattt gatatacaga atgctgaatc tgaatctctt 4740
ctcttggaga acaatatgcc ggcactgatg gatgagactc tgggatgatt gatgtctctt 4800
tccaaatcac tgatggagta attgtttgat cttacgatgt atttcttcca ttccataatt 4860
tttgtcgtgt ttttagttca aggggagtac ttctcaaatc tagcccttgt tcaggatctt 4920
tttttaaaac ccaaattcag aatct 4945
<210> 2
<211> 4945
<212> DNA
<213> 大麦(Hordeum vulgare L.)
<400> 2
gccgggctgc tcgtcgtccc tctttggtgg ttgagttgcc aatctggtat gccaggttgt 60
tgctccctgc cagtgccatg ggagttccgt gatgcctgca cagtaacagc ttcaggcgtt 120
ctcttcttat ttccttccgc cttccttgtt ggcctcgctt ccggggccaa atgccacgga 180
aagcttagca gctcggcctc caagaatctt cgccacggga gcagggagct ccattgccgc 240
tctgcaaccg gcatcaatcc aagctcgcgt gccttcagct gcaggctctc ttctgcggcc 300
agataaaagt tgcattgctc cagcaaaacc gatttcaggc ctgctattgg atgtaacaca 360
aggggagagt gcttgccgtt tgttcccccc gatttcttgt cggcgggttg tttcttcttt 420
tgattatgcc ttttctcttt cagcaaagtg cacgatgcct ttgccaaact tcacccgcgg 480
tgccgcctgc ttaatttgcg cgtaggccct acccttttcg cgtcgatatt tttgttatca 540
tcacaagtac tccgtgtggt agttgtcatg tggatttatg ccaattccct gtgtttaaag 600
gcagaatttg tgccatgcct ttcgccgaac aaacggatgg agacttcctc caccctctgg 660
cttttgcaga ttccactctc ctgtgatatt ctctgcttgg ttctacggcg gatgcgcaac 720
aagaatatac atatacaatg ggtcatattc gtcgtacaga ggattcctct tatgatatta 780
tctgcttttg tttgcgtggt tgcaatcctg caagaaccta ttccccgaga atatcaggct 840
actccaccag cacttgttta tttattttct tgtgtataat agcttggatg ctagctagcc 900
tcacactcat acattgctta atttcaccat acatttccca gtctgatgta ggtctattag 960
ggtgcaaaca catttggtag attgctgagt gctaactttc cagtgtctcc tctcctgaca 1020
tttttgcctt ggggcaagat tatgttctca gacttgtttg ctctaatttt tagggccata 1080
gcttctcctg tccactacgc ctgtcaactg ttcggcacga tgaagccttc agatgacagg 1140
atgcagctct caggtttgac gcggtcggaa gagtcgtctc ttgatgtgga ggggcattgc 1200
tctcaccatg aggcatttcc ttgttctccg tcgatgcaac cggttgcttc tgggtgcgtg 1260
cacacagaaa acagcgcggc atacttctta tggccgactt caaacctgca gcattgtgcg 1320
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ttccacagca agatattgcg gcgtttcagc cttgggacgg cagtgggctt ccgcataaca 1500
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<213> 大麦(Hordeum vulgare L.)
<400> 3
Met Phe Ser Asp Leu Phe Ala Leu Ile Phe Arg Ala Ile Ala Ser Pro
1 5 10 15
Val His Tyr Ala Cys Gln Leu Phe Gly Thr Met Lys Pro Ser Asp Asp
20 25 30
Arg Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Arg Ser Glu Glu Ser Ser Leu Asp
35 40 45
Val Glu Gly His Cys Ser His His Glu Ala Phe Pro Cys Ser Pro Ser
50 55 60
Met Gln Pro Val Ala Ser Gly Cys Val His Thr Glu Asn Ser Ala Ala
65 70 75 80
Tyr Phe Leu Trp Pro Thr Ser Asn Leu Gln His Cys Ala Ala Glu Gly
85 90 95
Arg Ala Asn Tyr Phe Gly Asn Leu Gln Lys Gly Leu Leu Pro Val Leu
100 105 110
Pro Gly Lys Leu Pro Lys Gly Gln Gln Ala Asn Ser Leu Leu Asp Leu
115 120 125
Met Thr Ile Arg Ala Phe His Ser Lys Ile Leu Arg Arg Phe Ser Leu
130 135 140
Gly Thr Ala Val Gly Phe Arg Ile Thr Lys Gly Val Leu Thr Glu Thr
145 150 155 160
Pro Ala Ile Leu Val Phe Val Ala Arg Lys Val His Lys Lys Trp Leu
165 170 175
Asn Pro Asn Gln Cys Leu Pro Ala Ile Leu Ala Gly Pro Gly Gly Val
180 185 190
Trp Cys Asp Val Asp Val Val Glu Phe Ser Tyr Tyr Gly Ala Pro Ala
195 200 205
Gln Thr Pro Lys Glu Gln Thr Phe Ser Glu Leu Val Asn Lys Leu Cys
210 215 220
Gly Ser Asp Glu Tyr Ile Gly Ser Gly Ser Gln Val Ala Ser Gln Asp
225 230 235 240
Thr Phe Gly Thr Leu Gly Ala Ile Val Lys Arg Arg Thr Asn Asn Lys
245 250 255
Gln Val Gly Phe Leu Thr Asn Arg His Val Ala Val Asp Leu Asp Tyr
260 265 270
Pro Asn Gln Lys Met Phe His Pro Leu Pro Pro Asn Leu Gly Pro Gly
275 280 285
Val Tyr Leu Gly Ala Val Glu Arg Ala Thr Ser Phe Ile Thr Asp Asp
290 295 300
Val Trp Tyr Gly Ile Tyr Ala Gly Thr Asn Pro Asp Arg Ala Ala Thr
305 310 315 320
Asn Tyr Ala Val Asp Ile Gly Asp Ser Cys Ile Ile Arg Arg Ile Glu
325 330 335
Leu
<210> 4
<211> 674
<212> PRT
<213> 大麦(Hordeum vulgare L.)
<400> 4
Met Phe Ser Asp Leu Phe Ala Leu Ile Phe Arg Ala Ile Ala Ser Pro
1 5 10 15
Val His Tyr Ala Cys Gln Leu Phe Gly Thr Met Lys Pro Ser Asp Asp
20 25 30
Arg Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Arg Ser Glu Glu Ser Ser Leu Asp
35 40 45
Val Glu Gly His Cys Ser His His Glu Ala Phe Pro Cys Ser Pro Ser
50 55 60
Met Gln Pro Val Ala Ser Gly Cys Val His Thr Glu Asn Ser Ala Ala
65 70 75 80
Tyr Phe Leu Trp Pro Thr Ser Asn Leu Gln His Cys Ala Ala Glu Gly
85 90 95
Arg Ala Asn Tyr Phe Gly Asn Leu Gln Lys Gly Leu Leu Pro Val Leu
100 105 110
Pro Gly Lys Leu Pro Lys Gly Gln Gln Ala Asn Ser Leu Leu Asp Leu
115 120 125
Met Thr Ile Arg Ala Phe His Ser Lys Ile Leu Arg Arg Phe Ser Leu
130 135 140
Gly Thr Ala Val Gly Phe Arg Ile Thr Lys Gly Val Leu Thr Glu Thr
145 150 155 160
Pro Ala Ile Leu Val Phe Val Ala Arg Lys Val His Lys Lys Trp Leu
165 170 175
Asn Pro Asn Gln Cys Leu Pro Ala Ile Leu Ala Gly Pro Gly Gly Val
180 185 190
Trp Cys Asp Val Asp Val Val Glu Phe Ser Tyr Tyr Gly Ala Pro Ala
195 200 205
Gln Thr Pro Lys Glu Gln Thr Phe Ser Glu Leu Val Asn Lys Leu Cys
210 215 220
Gly Ser Asp Glu Tyr Ile Gly Ser Gly Ser Gln Val Ala Ser Gln Asp
225 230 235 240
Thr Phe Gly Thr Leu Gly Ala Ile Val Lys Arg Arg Thr Asn Asn Lys
245 250 255
Gln Val Gly Phe Leu Thr Asn Arg His Val Ala Val Asp Leu Asp Tyr
260 265 270
Pro Asn Gln Lys Met Phe His Pro Leu Pro Pro Asn Leu Gly Pro Gly
275 280 285
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580 585 590
Met Ser Leu His Leu Gly Asp Arg Glu Pro Lys Arg Leu Arg Leu Asp
595 600 605
Pro Glu Ser Asn Leu Asp Leu Glu Lys Gln Pro His Pro Asp Gln Glu
610 615 620
Pro Ser Leu Asp Leu Glu Lys Gln Pro Arg Ser Asp Pro Glu Met Met
625 630 635 640
Ser Leu Asp Leu Glu Lys Gln Pro Arg Ser Asp Pro Glu Pro Gly Leu
645 650 655
Asp Leu Glu Lys Arg Leu Pro Ala Asp Pro Glu Pro Ser Ile Asp Leu
660 665 670
Glu Lys

Claims (5)

1.控制半矮秆多分蘖性状的基因fol-a，其特征是：所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所述。
2.如权利要求1所述的半矮秆多分蘖基因fol-a编码的蛋白质，其特征是：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所述。
3.基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的分子标记SNPE3，以大麦作为物种，其特征是：所述分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，
正向引物为：
BW370 allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTTATGCTGGAACAAACCCAGG
Bowman allele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTTATGCTGGAACAAACCCAGA
反向引物ACGACACATTAACTAGGCCTTCC。
4.利用如权利要求3所述的分子标记SNPE3鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)提取待测大麦品种基因组DNA；
(2)利用分子标记SNPE3对大麦基因组DNA进行KASPar PCR反应；
(3)根据PCR产物荧光信号的差异，使用QuantStudio Real-Time PCR软件分析，进而鉴别出每个待测大麦的基因型。
5.根据权利要求4所述的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的方法，其特征是步骤2)的KASPar PCR反应体系为：
1μL基因组DNA，0.1μL引物，1.4μL灭菌水和2.5μL KASP Buffer，反应总量为5μL；PCR反应在ABI ViiA7荧光定量PCR仪上进行，反应程序为：95℃ 15min；94℃变性20s，起始退火温度为61℃且每个循环退火温度减0.6℃的条件下退火60s，10个循环；再94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环；
所述0.1μL引物中，2种正向引物浓度各为10pmol/L，反向引物浓度为30pmol/L。
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