CN109628379A - 一种动物克隆胚胎培养液及培养方法 - Google Patents

一种动物克隆胚胎培养液及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种动物克隆胚胎培养液及培养方法：按照50～100μM将牛磺熊去氧胆酸添加到胚胎基础培养液中，得到胚胎培养液；将通过核移植获得的动物克隆胚胎移入所述胚胎培养液中进行培养。本发明利用牛磺熊去氧胆酸在核移植后的培养阶段显著的抑制动物克隆胚胎的内质网应激，同时，显著的提高动物克隆胚胎的体外发育率。本发明对提高动物克隆胚胎的体外培养效率，特别是对于获得基因修饰兔和克隆兔，具有重要的应用价值。

Description

一种动物克隆胚胎培养液及培养方法
技术领域
本发明涉及体外胚胎培养，具体涉及动物克隆胚胎培养液及培养方法。
背景技术
核移植是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中并得到重构胚胎的细胞工程技术。该技术在构建基因修饰动物、拯救濒临灭绝物种、干细胞治疗以及线粒体治疗等领域中具有重要的价值。目前体细胞核移植效率处于极低的水平。
核移植获得的重构胚胎不同于受精胚胎，在构建胚胎的过程中涉及到显微操作过程(去核、注核、融合和激活)，核移植操作的刺激能够导致诱导细胞发生内质网应激。体外培养条件的刺激也会导致诱导细胞发生内质网应激，持续的内质网应激不利于核移植获得的重构胚胎的发育，往往导致胚胎发育阻滞和早期胚胎死亡。
当细胞受到外界的某些刺激时，内质网会产生一系列调节机制，形成内质网应激，失调的内质网应激会导致凋亡通路的激活，并导致核移植胚胎基因表达异常，从而使得核移植胚胎表现出发育阻滞和早期胚胎死亡的现象。胚胎发育率以及胚胎囊胚期总细胞数、细胞凋亡水平是主要的用于评价胚胎发育质量的指标。
在进行体细胞核移植时，去核、融合、激活等操作以及胚胎培养都会造成动物克隆胚胎发生内质网应激和氧化应激，目前并没有专门针对动物克隆胚胎的体外培养液，特别是在基因编辑兔以及体细胞核移植兔的克隆胚胎培养中，亟待提出能够抑制克隆胚胎发生的内质网应激，以及提高动物克隆胚胎发育率的培养液及培养方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种动物克隆胚胎培养液及培养方法，可以提高动物克隆胚胎的体外培养效率。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种动物克隆胚胎培养液，该胚胎培养液包括胚胎基础培养液以及内质网应激抑制剂，所述内质网应激抑制剂为具有内质网应激抑制作用的胆汁酸或其衍生物，所述胚胎培养液中内质网应激抑制剂的浓度为50～100μM。
优选的，所述胚胎基础培养液包括用于模拟动物(例如，兔子)输卵管液的理化特征的无机盐组分、有机盐组分、氨基酸组分、葡萄糖及血清白蛋白(例如，牛血清白蛋白)。
优选的，所述胚胎基础培养液所含无机盐组分具体包括1.780～1.790mM的CaCl2·2H2O、1.510～1.520mM的MgSO4·7H2O、7.160～7.170mM的KCl、1.190～1.200mM的KH2PO4、25.000～25.010mM的NaHCO3以及107.590～107.690mM的NaCl。
优选的，所述胚胎基础培养液所含有机盐组分具体包括0.393～0.403mM的丙酮酸钠、4.053～4.063mM的乳酸钠以及0.340～0.350mM的柠檬酸钠。
优选的，所述胚胎基础培养液所含氨基酸组分具体包括0.080～0.090mM的丙氨酸、0.190～0.199mM的精氨酸、0.120～0.129mM的天冬酰胺、0.100～0.112mM的天冬氨酸、0.120～0.132mM的胱氨酸、0.090～0.100mM的谷氨酸、0.680～0.689mM的谷氨酰胺、3.000～3.035mM的甘氨酸、0.050～0.055mM的组氨酸、0.020～0.031mM的羟脯氨酸、0.280～0.291mM的异亮氨酸、0.440～0.451mM的亮氨酸、0.260～0.273mM的赖氨酸、0.110～0.121mM的蛋氨酸、0.130～0.139mM的苯丙氨酸、0.100～0.112mM的脯氨酸、0.150～0.156mM的丝氨酸、0.260～0.272mM的苏氨酸、0.050～0.059mM的色氨酸、0.130～0.139mM的酪氨酸以及0.260～0.270mM的缬氨酸。
优选的，所述胚胎基础培养液所含葡萄糖的浓度为2.770～2.780mM，胚胎基础培养液所含血清白蛋白的浓度为60～80g/L。
优选的，所述内质网应激抑制剂选自牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)。
一种动物克隆胚胎培养方法，包括以下步骤：
1)将内质网应激抑制剂添加到上述胚胎基础培养液中，得到胚胎培养液，所述内质网应激抑制剂为具有内质网应激抑制作用的胆汁酸或其衍生物，所述胚胎培养液中内质网应激抑制剂的浓度为50～100μM；
2)将通过核移植获得的动物(例如，兔子)克隆胚胎移入所述胚胎培养液中进行培养。
优选的，所述步骤2)中，核移植采用电融合方式，受体细胞选自动物(例如，兔子)的去核卵母细胞，供体细胞选自动物(例如，兔子)的卵丘细胞。
优选的，所述步骤2)具体包括以下步骤：将所述胚胎培养液制作微滴并覆盖石蜡油，然后置于38.5℃、CO2体积分数为5％及完全相对湿度的培养箱中进行平衡以用于胚胎培养，将经过注核、融合、激活后获得的动物克隆胚胎移入经过平衡后的胚胎培养液的微滴中，并继续置于所述培养箱中进行培养。
本发明具有以下有益的技术效果：
本发明通过选择一定的内质网应激抑制剂作为培养液添加成分，可通过核移植后的培养阶段显著的抑制动物克隆胚胎的内质网应激，同时，发现能够显著的提高动物克隆胚胎的体外发育率。本发明对提高动物克隆胚胎的体外培养效率，特别是对于获得基因修饰兔和克隆兔，具有重要的应用价值。
进一步的，本发明将化合物牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)添加到培养液中，该化合物能够有效抑制胚胎细胞发生的内质网应激，且获得最佳的动物克隆胚胎发育率和质量。
进一步的，所述胚胎基础培养液从模拟动物输卵管液的理化特征角度出发进行组分优化，从而确定无机盐组分、有机盐组分、氨基酸组分等的组成，模拟体内发育微环境，更好的促进动物克隆胚胎的体外发育。同时，使本发明更加适应工业化体外胚胎培养需求。
附图说明
图1为CHOP和GRP78在对照组和TUDCA组克隆兔胚胎(囊胚时期)中的mRNA表达水平：上标字母不同表示差异显著。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而不是对本发明保护范围的限制。
1.试剂的来源和制备
注射用绒促性素(HCG)购自宁波市三生药业有限公司；灭菌注射用水购自芮城县维尔富兽药有限公司；戊巴比妥钠购自Merck公司。DPBS、PBS均购自Hyclone公司。PBS-PVA、细胞松弛素B、透明质酸酶、胰酶、TUDCA、6-二甲氨基嘌呤、M199培养液、DMEM均为sigma产品。电融合液为Btx产品。固定液、TritonX-100、Hoechst33342均为碧云天产品。FBS为Gibco产品。
胚胎培养液(记为A液)的配方，由以下(1)、(2)、(3)及(4)中的组分构成，采用超纯水配制，作为基础培养液：
(1)CaCl2·2H2O 1.780mM、MgSO4·7H2O 1.510mM、KCl 7.160mM、KH2PO4 1.190mM、NaHCO3 25.000mM，以及NaCl 107.590mM；
(2)丙酮酸钠(C3H3NaO3)0.393mM、乳酸钠(C3H5NaO3)4.053mM，以及柠檬酸钠(C6H5Na3O7·2H2O)0.340mM；
(3)丙氨酸0.080mM、精氨酸0.190mM、天冬酰胺0.120mM、天冬氨酸0.100mM、胱氨酸0.120mM、谷氨酸0.090mM、谷氨酰胺0.680mM、甘氨酸3.000mM、组氨酸0.050mM、羟脯氨酸0.020mM、异亮氨酸0.280mM、亮氨酸0.440mM、赖氨酸0.260mM、蛋氨酸0.110mM、苯丙氨酸0.130mM、脯氨酸0.100mM、丝氨酸0.150mM、苏氨酸0.260mM、色氨酸0.050mM、酪氨酸0.130mM，以及缬氨酸0.260mM；
(4)葡萄糖2.770mM，以及牛血清白蛋白60g/L。
2.收集卵母细胞
在供体兔(新西兰雌兔，西安交通大学实验动物中心)注射HCG 12小时后，3％戊巴比妥钠静脉注射过量麻醉兔子，固定在解剖台上，切开腹腔，剥离卵巢，将卵巢置于生理盐水中。选取卵巢表面直径大于1mm的可见卵泡，用12号针头(10mL注射器)抽吸。在体视显微镜下挑选卵丘细胞包裹完整、胞质均匀、形态完好的卵丘卵母细胞复合体。然后将卵丘卵母细胞复合体于2g/L的透明质酸酶中消化5min。反复轻轻吹打去除外周包裹的卵丘细胞。
3.去核
选取胞质均匀、排出第一极体的卵母细胞置于含7.5μg/mL细胞松弛素B的M199培养液中，采用盲吸法迅速去核，去核时用内径10微米的去核针刺破透明带并插入到卵周隙内，将极体连同其下卵膜包围的部分胞质吸去。用10μg/mL Hoechst33342处理5min，打开紫外光短暂照射，筛选出去核完全的卵母细胞，转入M199培养液中，在培养箱中静置，等待注核。
4.注核
卵丘细胞用作供体细胞，一般卵丘细胞用添加10％FBS的DMEM在37℃、CO2体积分数为5％，及完全相对湿度的培养箱中培养。需要注核时，胰酶消化成单个细胞后离心，再用M199培养液悬浮。选取表面平滑、形态完整的圆形细胞，单个注入去核卵母细胞的卵周隙内，备用。
5.融合
将两个显微电极的绝缘塑料管分别固定在显微操作仪的左右两个操作臂上，将铜线一端与电融合仪相连接，开启显微操作仪，通过控制显微操作仪移动显微电极至显微镜视野中央；调整显微电极的高度、角度；将显微电极置于75％酒精微滴中浸泡10分钟，移开酒精后，待显微电极自然晾干，开启电融合仪。将注核后的卵母细胞在电融合液中清洗3次，每次3分钟。将清洗后的注核卵母细胞置于电融合液中，然后将注核卵母细胞1型排列。采用显微电极固定供体细胞与受体卵母细胞，使得供体细胞与受体卵母细胞轻轻接触，然后电刺激下融合(30V、10μs的2个方波脉冲)。融合完毕后得到的兔体细胞核移植重构胚在M199培养液中清洗3次，每次2min，将兔体细胞核移植重构胚移入M199培养液中。半小时后挑选融合成功的兔体细胞核移植重构胚，融合失败的兔体细胞核移植重构胚弃掉。将融合成功的兔体细胞核移植重构胚激活。
6.激活
采用电刺激和6-二甲氨基嘌呤联合处理的方式激活。先电刺激，电刺激参数同融合的参数，电刺激完毕后，洗涤3次，每次1分钟。再移入含2mmol/L的6-二甲氨基嘌呤的M199培养液中处理3小时。激活处理结束后，将兔体细胞核移植重构胚进行体外克隆胚胎培养。
7.胚胎培养
在自制的胚胎培养液(A液)中添加终浓度为100μM的TUDCA，得到兔克隆胚胎培养液(记为B液)。
将胚胎培养液(A液及B液)分别制作微滴，然后用胚胎级的矿物油覆盖，置于培养箱中(平衡2小时)，用于胚胎培养。将激活后的重构胚在DPBS+10％FBS中清洗6次，以去除6-二甲氨基嘌呤残留，然后将胚胎移入制作的培养微滴中。
将经过激活的重构胚分为2组进行培养试验，培养环境为38.5℃、体积分数为5％的CO2、完全相对湿度的培养箱。对照组(胚胎培养液为A液)218枚，TUDCA组(胚胎培养液为B液)234枚。每组又分为4个小组，对照组4个培养微滴中培养胚胎数目分别为54枚、54枚、55枚、55枚，TUDCA组4个培养微滴中培养胚胎数目分别为57枚、57枚、60枚、60枚。
体外培养一天后，统计卵裂率；第4天统计囊胚发育率，用卡方检验进行统计学分析。
8.实时定量
收集克隆囊胚用于做定量分析，每组各使用10个胚胎。总RNA的提取和cDNA的合成用Cells-to-SignalTM Kit(Ambion Co,USA)试剂盒，按照说明书的操作方法进行。定量反应所用试剂是SYBR Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa)，按照StepOne PlusTMReal-Time PCR System(Applied Biosystems)进行，反应条件如下：95℃30s；40循环(95℃5s)；60℃30s；72℃30s。采用2-△△Ct方法分析数据，采用SPSS软件对基因(例如，CHOP、GRP78等)表达水平进行统计学分析，采用Graphpad软件绘图。
9.凋亡检测
用Dead End Fluorometric TUNEL System(全式金)检测各组囊胚的细胞凋亡率。将胚胎在固定液中孵育2小时，PBS-PVA清洗3次，在0.2％TritonX-100中透化30分钟，PBS-PVA清洗3次，之后所有操作都需避光，在FITC的dUTP和terminal deoxynucleotidyltransferase中孵育60分钟后，加入终止液，PBS-PVA清洗3次，将胚胎转入DAPI(碧云天)中，于室温避光孵育3～5min，然后PBS-PVA清洗3次，压片后在荧光显微镜下观察胚胎细胞凋亡情况。用SPSS软件对凋亡率进行分析，采用Graphpad软件绘图。
10.结果分析
TUDCA组的胚胎在囊胚时期的内质网应激相关基因CHOP和GRP78的表达水平显著低于对照组，表明添加TUDCA能够有效降低克隆胚胎内质网应激(图1)。参见表1，添加TUDCA能够显著降低克隆胚胎囊胚时期的凋亡率(4.1±1.3vs 11.6±2.1)；添加TUDCA能够显著提高克隆胚胎的卵裂率(88.9％vs 78.0％)和囊胚率(29.9％vs 11.5％)。结果表明添加TUDCA能够抑制克隆胚胎内质网应激，降低克隆胚胎的细胞凋亡率，并且提高克隆胚胎发育率，从而提高克隆胚胎体外培养效率。
表1.添加有TUDCA的胚胎培养液对克隆胚胎体外发育的影响
注：上标字母不同的同一列数据之间差异显著(P<0.05)。
总之，本发明对兔以及其他动物辅助生殖成功率的提高具有重要的借鉴作用，可促进动物(特别是基因修饰兔和克隆兔)繁殖育种生产效率，为开展基因修饰和克隆动物的研究提供了有效的理论和实践支持。

Claims (10)

1.一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：该胚胎培养液包括胚胎基础培养液以及内质网应激抑制剂，所述内质网应激抑制剂为具有内质网应激抑制作用的胆汁酸或胆汁酸衍生物，胚胎培养液中内质网应激抑制剂的浓度为50～100μM。
2.根据权利要求1所述一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：所述胚胎基础培养液包括用于模拟动物输卵管液的理化特征的组分。
3.根据权利要求1或2所述一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：所述胚胎培养液包括以下用于构成所述胚胎基础培养液的组分：无机盐组分、有机盐组分、氨基酸组分、葡萄糖及血清白蛋白。
4.根据权利要求3所述一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：所述无机盐组分具体包括1.780～1.790mM的CaCl2·2H2O、1.510～1.520mM的MgSO4·7H2O、7.160～7.170mM的KCl、1.190～1.200mM的KH2PO4、25.000～25.010mM的NaHCO3以及107.590～107.690mM的NaCl。
5.根据权利要求3所述一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：所述有机盐组分具体包括0.393～0.403mM的丙酮酸钠、4.053～4.063mM的乳酸钠以及0.340～0.350mM的柠檬酸钠。
6.根据权利要求3所述一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：所述氨基酸组分具体包括0.080～0.090mM的丙氨酸、0.190～0.199mM的精氨酸、0.120～0.129mM的天冬酰胺、0.100～0.112mM的天冬氨酸、0.120～0.132mM的胱氨酸、0.090～0.100mM的谷氨酸、0.680～0.689mM的谷氨酰胺、3.000～3.035mM的甘氨酸、0.050～0.055mM的组氨酸、0.020～0.031mM的羟脯氨酸、0.280～0.291mM的异亮氨酸、0.440～0.451mM的亮氨酸、0.260～0.273mM的赖氨酸、0.110～0.121mM的蛋氨酸、0.130～0.139mM的苯丙氨酸、0.100～0.112mM的脯氨酸、0.150～0.156mM的丝氨酸、0.260～0.272mM的苏氨酸、0.050～0.059mM的色氨酸、0.130～0.139mM的酪氨酸以及0.260～0.270mM的缬氨酸。
7.根据权利要求3所述一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：所述葡萄糖的浓度为2.770～2.780mM，血清白蛋白的浓度为60～80g/L。
8.根据权利要求1所述一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：所述内质网应激抑制剂选自牛磺熊去氧胆酸。
9.一种动物克隆胚胎培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将内质网应激抑制剂添加到胚胎基础培养液中，得到胚胎培养液，所述内质网应激抑制剂为具有内质网应激抑制作用的胆汁酸或胆汁酸衍生物，胚胎培养液中内质网应激抑制剂的浓度为50～100μM；
2)将通过核移植获得的动物克隆胚胎移入所述胚胎培养液中进行培养。
10.根据权利要求9所述一种动物克隆胚胎培养方法，其特征在于：所述步骤2)中，核移植采用电融合方式，受体细胞选自动物的去核卵母细胞，供体细胞选自动物的卵丘细胞。
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