CN109609670A - 一种基于数字pcr技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，是通过对待测水样进行富集浓缩、丙酮溶解、密度梯度分离、提取DNA、数字PCR定量，通过贾第鞭毛虫体内拷贝数与初始DNA浓度换算机理进行换算，得出检测的贾第鞭毛虫的最低个数。结果显示，该方法对贾第鞭毛虫定量可低至0.233个，回收率可达27.15％。该方法选择特异性扩增引物，采用优化的DNA提取条件，利用检测限更低、更灵敏的数字PCR技术进行定量。该方法在优化试剂使用和实验条件的同时，缩短实验时间，提高方法的灵敏度和稳定性。本发明方法特别适用于饮用水中少量贾第鞭毛虫的快速检测，可用于应急监测，具有广阔的推广前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，涉及分子生物学及基因检测技术领域。
背景技术
贾第鞭毛虫是一种常见的病原微生物，由于常规水处理工艺难以完全将其去除，对氯消毒又有很强的耐受性，加之其感染剂量很低，常以水介传播导致人群感染，从而引起了国际社会的广泛关注和高度重视。
我国《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2006)规定贾第鞭毛虫不得高于1个/10L。我国现行的《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750.12-2006)是参照美国环保局(USEPA)推荐的1623方法(815-R-05-002)滤囊/滤芯过滤-免疫磁分离方法-镜检法，不仅进行富集浓缩步骤操作繁琐、耗时长，回收率达到10％以后即认为方法合格，而且滤囊/滤芯及免疫磁珠均为一次性进口耗材，检测成本非常高。改进的膜过滤-密度分离梯度分离法-镜检法大幅度降低了检测成本，贾第鞭毛虫回收率虽然提高至56％，但仍存在镜检耗时耗力、自发荧光颗粒干扰等问题。
随着现代分子生物学技术的发展，定量PCR(简称qPCR)技术以快速、敏感、特异性强等特点备受青睐。研究表明qPCR技术应用于水中病原微生物的检测不仅提高检测灵敏度，缩短实验周期，还可实现批量检测，尤其适用于集团性突发水污染事件调查。目前，传统的qPCR技术在低拷贝靶分子、低模板浓度差异中灵敏度和精确度仍然相对较差，新兴的数字PCR技术则采用高密度纳升流控芯片技术，可实现低至单拷贝样品的检测，大幅度提高检测灵敏度，同时具有变异度低、可精确定量的优点。因此，开发一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法非常必要。
发明内容
本发明的目的就是为了解决传统镜检法耗时耗力及存在藻类、荧光颗粒干扰的缺点，克服传统qPCR检测技术在低拷贝靶分子检测、低模板检测的灵敏度和精密度的差异相对较大的不足，建立一种基于高密度纳升流控芯片的数字PCR技术，实现低含量、高通量检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，该发明选择特异性扩增引物，优化DNA提取条件，确定数字PCR的最低检测限。该发明是一种灵敏度高、批量性、规范化检测水中贾第鞭毛虫的技术，能够对单拷贝DNA进行准确定量。
本发明解决上述问题的技术方案如下：基于数字PCR技术检测饮用水中贾第鞭毛虫，包括以下步骤：
首先，利用盘式过滤器和醋酸纤维膜对水样进行富集，利用丙酮对膜进行溶解，浓缩至EP管中。其次，利用percoll-蔗糖溶液对水样浓缩液进行纯化分离，捕获其中的贾第鞭毛虫；第三，利用QIAamp DNA mini kit作为优选的DNA提取试剂盒提取贾第鞭毛虫的DNA；第四，利用优选的芯片和预混液以及特定的反应体系和反应程序对提取DNA进行数字PCR检测。
根据贾第鞭毛虫体内拷贝数与初始DNA浓度换算机理进行换算，得出环境样品的贾第鞭毛虫的个数和回收率：
NG＝C×S/16 (1)
注：NG——贾第鞭毛虫的个数；C——所测样品基因拷贝数；S——样品DNA体积与加入模板体积的比值。
回收率＝(加标水样基因量-阴性对照基因量)/实际标样基因量×100％ (2)
本发明的有益效果是：利用盘式过滤器及醋酸纤维膜对待测水样进行富集，利用丙酮进行膜溶解，密度梯度分离法浓缩富集贾第鞭毛虫，大大降低实验成本，有利于方法在行业内的推广；利用液氮/沸水冻融法提取DNA，保护DNA二级结构而不影响DNA扩增效率，提高回收率和检测准确度；利用数字PCR检测技术可检测低至单拷贝的DNA样品，具有很高的灵敏度。同时，数字PCR技术可进行多样品的同时检测，大大提高检测通量，因而可以实现样品的批量、快速检测，特别是突发事件的应急检测，快速评价水体的贾第鞭毛虫感染状况，是一套快速、准确度高、高通量的贾第鞭毛虫检测方法。
附图说明
附图1基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法的技术路线示意图。
附图2基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的β-Giardin基因扩增产物凝胶电泳图。其中，条带1～4和6～9为β-Giardin基因；条带0和5为阴性对照，条带M为Marker。
具体实施方式
为使该发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，所依据的原理为：待测水样利用盘式过滤器将水体中的贾第鞭毛虫富集至醋酸纤维膜上，利用丙酮对膜进行溶解，收集贾第鞭毛虫孢囊。利用DNA提取试剂盒对收集的孢囊提取DNA，而数字PCR技术是一种绝对定量技术，利用数字PCR仪在反应后逐一对阳性微反应体积进行计算得出样品初始的DNA模板量。根据数字PCR反应单元总数、有荧光信号的单元数及样品的稀释倍数，可以得到样品的不同基因的最初拷贝数，根据贾第鞭毛虫孢囊β-Giardin基因(目的片段为75bp)进行分析，从而获得贾第鞭毛虫的个数。
本发明的基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法的具体步骤包括：
水样富集及浓缩：
将标准菌株混合样品标样补充PBS至1ml后进行稀释，稀释10倍后，用异硫氰酸荧光素(FITC)和4',6二脒基-2-苯吲哚(DAPI)染色细胞壁和细胞核，用显微镜镜检，混匀，取500μl进行镜检，镜检10次，按照镜检结果分别确定(2±1)个孢囊。将含有一定个数孢囊的稀释液加到含有100L蒸馏水中，进行过滤，过滤完后使用PBST溶液，乙醇及MiliQ超纯水分次洗涤塑料桶。将滤膜置于50ml离心管中，用丙酮溶解掉滤膜，离心后去上清，最后用PBS清洗离心管，收集浓缩物。
密度梯度分离：
向上述浓缩物中添加6ml PBS+0.1％Tween80，用振荡器进行轻柔振荡，将混合液均匀分至4个15ml离心管中；另取4ml PBS+0.1％Tween80清洗上一离心管；向各分管中添加比重2ml比重为1.10-1.15的percoll-蔗糖溶液，用长吸管从底部缓慢注入percoll-蔗糖溶液；20℃、1050G条件下离心10分钟，离心管混合液分成3层，吸取上层和中间层移至新的离心管中；对离心后的残渣添加3ml PBS+0.1％Tween80溶液，再重复上述步骤，上层和中间层移至新的离心管中。加PBS至40ml，2000G，20min，沉淀，弃上清，待用。
DNA提取：
吸取360μLATL裂解液至上述5ml离心管中，将离心管放置于泡沫浮漂上后，放到盛有液氮的保温杯中冷冻2min，取出后将其装有持续沸腾热水的烧杯中2min；重复液氮冷冻和沸水融化步骤四次；向离心管中加入40μL蛋白酶K，用涡旋混匀，震荡20s，放恒温水浴56℃水浴3h，中间需直至完全裂解；向离心管中加入400μL AL缓冲液，振荡15s，70℃水浴10min；将离心管中的上清液转移至新的5ml管中；向离心管中加入400μL乙醇，振荡15s，短时离心；将上述混合液加入到QIAamp Mini Spin Coloum中，将离心柱放入2ml收集管中，于6000G离心1min，丢弃收集管中的液体；加入500μL AW1缓冲液到离心柱中，6000G离心1min，丢弃收集管中的液体；加入500μL AW2缓冲液到离心柱中，20000G离心3min，丢弃收集管中的液体；将离心柱放入新的2ml收集管中，20000G离心1min，丢弃收集管中的液体；向离心柱中加入100μL AE缓冲液，6000G离心1min；重复上述步骤，留过柱液以备使用。
数字PCR定量：
数字PCR反应包括体系配制、样品加载及芯片密封、扩增、读取及初始分析和二次分析5个步骤。反应体系为14.5μl，其中含有3D digital PCR Master Mix 7.25μl，上游、下游引物(10μmol/L)各1.3μl，探针(10μmol/L)0.363μl，DNA模板4.287μl。每次试验均做3个平行样，每次试验同时设置无模板阴性对照。其中，贾第鞭毛虫的β-Giardin基因的特异性上游引物序列：GDF引物：5’-CATCCGCGAGGAGGTCAA-3’，下游引物序列：GDR引物：5’-GCAGCCATGGTGTCGATCT-3’，探针：β-Giardin基因TaqMan探针序列：5’-[VIC]-AAGTCCGCCGACAACATGTACCTAACGA-[BHG-1]。
反应程序：在96℃下预变性10min；60℃时退火/延伸2min，98℃变性30s，39个循环；60℃退火2min，10℃保持∞。配置好的体系通过Chip Loader仪器自动加载到芯片上各微孔中，体系加载完成后用Immersion Fluid覆盖芯片表面并将芯片密封。覆盖后的芯片置于平板PCR仪上进行扩增。根据公式(1)和(2)，计算贾第鞭毛虫的个数和回收率。
方法特异性的测定
特异性，引物的特异性是PCR扩增结果准确的保证。本发明中贾第鞭毛虫选用β-Giardin基因进行特异性扩增，对PCR进行电泳分析，扩增条带的大小与目标条带大小一致，见图2。因此，数字PCR利用该引物及探针定量具有很高的特异性。
方法精密度的测定
利用上述方法条件，每次试验均重新加标样品，选择相同的实验操作步骤和检测条件。精密度检测结果如表1所示。经计算，本发明检测限可至0.869copies/μL，即每个样品共计检出3.568个拷贝，回收率为27.15％。
表1.方法精密度测定
以上所述的具体实施例，对本发明的技术方案和有益效果进行进一步的详细说明，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限值本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改等同替换、改进等，均为包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其特征在于利用数字PCR技术对待测水样中富集浓缩后的贾第鞭毛虫提取的DNA进行检测，检测低至单拷贝样品，提高检测灵敏度，而且可对样品进行批量检测，缩短实验时间，降低实验成本。
2.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其特征在于采用Φ142mm的盘式过滤器和最大孔径为47μm的Φ142mm醋酸纤维膜对待测水样进行富集浓缩，利用丙酮对膜进行溶解，密度梯度分离法获得贾第鞭毛虫，此方法降低成本，有利于技术的广泛推广。
3.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其特征在于选择特定性引物GDF和GDR。
4.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其特征在于提取DNA采用液氮/沸水冻融法：将ATL裂解液与收集的贾第鞭毛虫悬浊液以2.5:1比例混合均匀，液氮中冷冻2min，沸水中破壁2min，5个循环，该DNA提取方式既可破坏孢囊结构又不影响DNA后续扩增效率。
5.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其特征在于采用试剂和耗材为：QIAamp DNA mini kit作为DNA提取试剂盒，Digital PCRMaster Mix v2作为DNA扩增混合液，Digital PCR V2 20K Chip 12-PA为PCR反应的芯片。
6.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其所述的数字PCR检测贾第鞭毛虫DNA采用反应体系为14.5μl，其中含有3D digital PCRMaster Mix 7.25μl，上游、下游引物(10μmol/L)各1.3μl，探针(10μmol/L)0.363μl，DNA模板4.287μl，该试验每个样品均做3个平行样，每次试验同时设置无模板阴性对照。
7.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其所述的数字PCR检测贾第鞭毛虫DNA采用特有的反应程序：在96℃下预变性10min；60℃时退火/延伸2min，98℃变性30s，39个循环；60℃退火2min，10℃保持∞。
8.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其特征在于对于单拷贝样品的检测，具有很高的准确性和精度。
9.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其特征在于可对样品的DNA进行高通量检测。
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