CN109602783B - 一种酶辅助提取杜仲叶活性成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种酶辅助提取杜仲叶活性成分的方法，解决现有生物酶法提取杜仲叶活性成分时存在的提取工艺繁琐、提取时间长、提取成本高等问题。该方法包括：步骤1)去杂粉粹，将杜仲叶去杂处理，粉碎后备用；步骤2)酶法提取，将步骤1)中粉碎后的杜仲叶与酶液混合置于反应器中，且使酶液没过杜仲叶，进行酶水解反应；所述酶液中包括主酶和辅酶；所述主酶为纤维素酶；所述辅酶为木聚糖酶、果胶酶和角质酶中的一种或多种；步骤3)分离，待步骤2)酶水解反应结束后，离心，将水解液进行固液分离，得到含有活性成分的水解上清液。

Description

一种酶辅助提取杜仲叶活性成分的方法
技术领域
本发明属于天然产物提取的技术领域，具体涉及一种酶辅助提取杜仲叶中活性成分的方法。
背景技术
杜仲(Eucommia ulmoides Olive)为杜仲科杜仲属的落叶乔木，作为中国传统的中药材，以皮煎煮入药，具有补肝肾、降血糖、增强免疫力、抗衰老等功效。通过对杜仲成分的大量研究测定表明，杜仲皮和杜仲叶成分基本一致，而杜仲叶含有的部分活性成分，如绿原酸、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、黄酮等，含量高于杜仲皮数倍。其中，绿原酸具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用；京尼平苷酸(GPA)具有消炎利胆等功能，在临床上降压作用明显，日本健康卫生部已将它作为一种保健品添加剂；桃叶珊瑚苷则具有清湿热、利小便、镇痛、降压、保肝护肝、抗肿瘤等作用，是某些成药的质量指标；上述均是非常重要的生物活性成分。
传统提取杜仲叶中活性成分的方法有水提法和溶剂提取法。水提法效率不高且提取的成分有限；溶剂提取法存在溶剂残留和污染严重等问题。上述问题很大程度上影响了杜仲叶资源的综合开发利用。
为了解决传统工艺在杜仲叶活性成分提取中存在的弊端，张学俊等采用氢氧化钠除去杜仲叶角质层后，通过添加纤维素酶以促进石油醚对杜仲胶的提取(《天然产物研究与开发》，2009，21：115-121)。中国专利CN102838757B一种酶解提取杜仲胶的方法中，提出利用纤维素酶、果胶酶和蛋白酶的复合物水解杜仲皮、杜仲叶等，然后使用超声波法可获得力学性能优良的杜仲胶。中国专利CN106954852A保健杜仲精粉中，以杜仲叶或杜仲皮为原料，依次用内切蛋白酶、果胶酶及纤维素酶水解杜仲原料，获得的酶解液经过分离、纯化、干燥得到杜仲精粉。然而上述过程均为依次使用各酶水解杜仲叶，提取工艺繁琐，提取时间长，不利于杜仲活性成分的工业化生产。
目前，研究人员在使用生物酶法从杜仲叶中提取活性成分的研究过程中，大多从酶的种类、酶水解的反应条件或者借用其他物理辅助措施着手，期望提高活性成分的提取效率和速率；但仍然是依次使用单一酶进行水解，而忽略了各酶液对杜仲叶纤维素细胞壁的协同降解作用；因此，在现有的相关文献中，可以看出从杜仲叶中提取活性成分的时间仍然比较长。
根据上述研究现状分析表明，现有生物酶法多用于杜仲胶的提取，在用于杜仲活性成分提取时，会存在提取工艺繁琐、提取时间长、提取成本高等问题。
发明内容
本发明的目的在于解决现有生物酶法用于杜仲叶活性成分提取时存在提取工艺繁琐、提取时间长、提取成本高的不足之处，而提供了一种酶辅助提取杜仲叶活性成分的方法。
为实现上述目的，本发明所提供的技术解决方案是：
一种酶辅助提取杜仲叶活性成分的方法，其特殊之处在于，
步骤1)去杂粉粹
将杜仲叶去杂处理，粉碎后备用，最好置于干燥阴凉处；
步骤2)酶法提取
将步骤1)中粉碎后的杜仲叶与酶液混合置于反应器中，且使酶液没过杜仲叶，进行酶水解反应；所述酶液中包括主酶和辅酶；所述主酶为纤维素酶；所述辅酶为木聚糖酶、果胶酶和角质酶中的一种或多种；
步骤3)分离
待步骤2)酶水解反应结束后，离心，将水解液进行固液分离(也可现有的其他方式进行固液分离)，得到含有活性成分的水解上清液，活性成分为绿原酸、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷和黄酮。
进一步地，步骤2)中，所述纤维素酶用量为10～20FPU/g底物；木聚糖酶用量为500～1000nkat/g底物；果胶酶用量为1～2mg蛋白/g底物；角质酶用量为1～2mg蛋白/g底物，其中，底物指的是杜仲叶。
进一步地，步骤2)中，将粉碎后的杜仲叶与酶液混合后，再加入柠檬酸钠缓冲溶液(稳定反应体系的pH环境)，使底物浓度为10％w/v(w为底物质量，v为溶液体积)，底物即指杜仲叶。
进一步地，步骤2)中，所述酶水解反应中水解体系pH优选5.0，所述酶水解反应的温度为50℃。该环境下，有利于主酶和辅酶快速进行酶水解；整个水解反应仅需0.5h即可完成。
进一步地，步骤1)中采用粉碎机对去杂该处理后的杜仲叶进行粉碎。
本发明的机理是：
在杜仲叶细胞组织中，角质层、木聚糖、木质素以及果胶和纤维素紧密相连，限制了纤维素酶对杜仲叶细胞壁的破坏，不利于杜仲叶中活性成分的溶出。但是在纤维素酶水解木质纤维原料过程中添加木聚糖酶、果胶酶或角质酶中的一种或多种时可将覆盖在纤维素表面的木聚糖、果胶或角质层等降解，提高纤维素酶对纤维素的可及性，协同提高细胞壁中纤维素的降解效率，从而加速纤维素细胞壁的破坏，极大地提高细胞内活性成分的溶出效率和速率。
本发明的优点是：
本发明中所使用的酶液为主酶纤维素酶与辅酶木聚糖酶、果胶酶和角质酶三者中的一种或多种的复合酶液，协同提高了杜仲叶活性成分的溶出效率与溶出速率。本发明的提取工艺非常简单，仅需将粉碎后的杜仲叶和上述复合酶液进行混合，并置于适宜的水解环境下即可实现快速提取活性成分的目的，大大缩短了提取时间，水解半个小时左右即可；操作极其方便、整个提取成本较低，适用于工业化提取，且整个操作过程中，对操作人员的技能要求不是特别高，前期培训成本较低。同时，可收集分离后的残渣，进一步用于提取杜仲胶，充分利用杜仲叶资源。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的内容作进一步的详细描述：
实施例一
先称取5g粉碎后的杜仲叶置于三角瓶中，加入纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶和角质酶的复合酶液(纤维素酶用量为20FPU/g底物、木聚糖酶用量为1000nkat/g底物、果胶酶用量为1mg蛋白/g底物、角质酶用量为1mg蛋白/g底物)；再加入柠檬酸钠缓冲溶液使底物浓度为10％w/v(w为底物质量，v为溶液体积)，使水解体系pH值等于5.0；在50℃的温度下，水解0.5h后，取出水解液，离心得到水解上清液。
采用液相色谱法对所得上清液中各活性成分进行含量测定，测得京尼平苷酸得率为5.5mg/g底物；绿原酸为16.8mg/g底物；黄酮为73.5mg/g底物；桃叶珊瑚苷为24.5mg/g底物。
实施例二
先称取5g粉碎后的杜仲叶置于三角瓶中，加入纤维素酶、果胶酶和角质酶的复合酶液(纤维素酶用量为10FPU/g底物、果胶酶用量为1mg蛋白/g底物、角质酶用量为1mg蛋白/g底物)；再加入柠檬酸钠缓冲溶液使底物浓度为10％w/v(w为底物质量，v为溶液体积)，使水解体系pH值等于5.0；在50℃的温度下，水解0.5h后，取出水解液，离心得到水解上清液。
采用液相色谱法对所得上清液中各活性成分进行含量测定，测得京尼平苷酸得率为3.8mg/g底物；绿原酸为17.1mg/g底物；黄酮为74.3mg/g底物；桃叶珊瑚苷为23.3mg/g底物。
实施例三
先称取5g粉碎后的杜仲叶置于三角瓶中，加入纤维素酶、木聚糖酶和角质酶的复合酶液(纤维素酶用量为20FPU/g底物、木聚糖酶用量为500nkat/g底物、角质酶用量为2mg蛋白/g底物)；再加入缓冲溶液使底物浓度为10％w/v(w为底物质量，v为溶液体积)，使水解体系pH值等于5.0；在50℃的温度下，水解0.5h后，取出水解液，离心得到水解上清液。
采用液相色谱法对所得上清液中各活性成分进行含量测定，测得京尼平苷酸得率为3.7mg/g底物；绿原酸为17.2mg/g底物；黄酮为73.0mg/g底物；桃叶珊瑚苷为25.1mg/g底物。
实施例四
先称取5g粉碎后的杜仲叶置于三角瓶中，加入纤维素酶、木聚糖酶和角质酶的复合酶液(纤维素酶用量为10FPU/g底物、木聚糖酶用量为500nkat/g底物、角质酶用量为2mg蛋白/g底物)；再加入缓冲溶液使底物浓度为10％w/v(w为底物质量，v为溶液体积)离心得到水解上清液。
采用液相色谱法对所得上清液中各活性成分进行含量测定，测得京尼平苷酸得率为3.9mg/g底物；绿原酸为16.9mg/g底物；黄酮为75.9mg/g底物；桃叶珊瑚苷为25.7mg/g底物。
实施例五
先称取5g粉碎后的杜仲叶置于三角瓶中，加入纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的复合酶液(纤维素酶用量为10FPU/g底物、木聚糖酶用量为1000nkat/g底物、果胶酶用量为2mg蛋白/g底物)；再加入缓冲溶液使底物浓度为10w/v％(w为底物质量，v为溶液体积)，使水解体系pH值等于5.0；在50℃的温度下，水解0.5h后，取出水解液，离心得到水解上清液。
采用液相色谱法对所得上清液中各活性成分进行含量测定，测得京尼平苷酸得率为4.2mg/g底物；绿原酸为18.9mg/g底物；黄酮为72mg/g底物；桃叶珊瑚苷为26.5mg/g底物。
实施例六
先称取5g粉碎后的杜仲叶置于三角瓶中，加入纤维素酶和角质酶的复合酶液(纤维素酶用量为15FPU/g底物、角质酶用量为1.5mg蛋白/g底物)；再加入缓冲溶液使底物浓度为10％w/v(w为底物质量，v为溶液体积)，使水解体系pH值等于5.0；在50℃的温度下，水解0.5h后，取出水解液，离心得到水解上清液。
采用液相色谱法对所得上清液中各活性成分进行含量测定，测得京尼平苷酸得率为3.4mg/g底物；绿原酸为14.7mg/g底物；黄酮为70.2mg/g底物；桃叶珊瑚苷为23.1mg/g底物。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种酶辅助提取杜仲叶活性成分的方法，其特征在于：
步骤1)去杂粉粹
将杜仲叶去杂处理，粉碎后备用；
步骤2)酶法提取
将步骤1)中粉碎后的杜仲叶与酶液混合置于反应器中，且使酶液没过杜仲叶，进行酶水解反应；所述酶水解反应的时间为0.5h；
所述酶液中包括主酶和辅酶；所述主酶为纤维素酶；所述辅酶为木聚糖酶、果胶酶和角质酶中的一种或多种；所述纤维素酶用量为10～20FPU/g底物；木聚糖酶用量为500～1000nkat/g底物；果胶酶用量为1～2mg蛋白/g底物；角质酶用量为1～2mg蛋白/g底物；
步骤3)分离
待步骤2)酶水解反应结束后，离心，将水解液进行固液分离，得到含有活性成分的水解上清液。
2.根据权利要求1所述的酶辅助提取杜仲叶活性成分的方法，其特征在于：
步骤2)中，将粉碎后的杜仲叶与酶液混合后，再加入柠檬酸钠缓冲溶液，使底物浓度为10％w/v。
3.根据权利要求1～2任一所述的酶辅助提取杜仲叶活性成分的方法，其特征在于：步骤2)中，所述酶水解反应中水解体系pH为5.0。
4.根据权利要求3所述的酶辅助提取杜仲叶活性成分的方法，其特征在于：步骤2)中，所述酶水解反应的温度为50℃。
5.根据权利要求1所述的酶辅助提取杜仲叶活性成分的方法，其特征在于，步骤1)中：采用粉碎机对去杂处理后的杜仲叶进行粉碎。
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