CN109602757B

CN109602757B - 罗汉果苷iie在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用

Info

Publication number: CN109602757B
Application number: CN201910027652.7A
Authority: CN
Inventors: 金俊飞; 肖娟; 黄凯; 刘丙刚; 林厚民; 李爱丽
Original assignee: Affiliated Hospital of Guilin Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Guilin Medical University
Priority date: 2019-01-11
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2039-01-11
Also published as: CN109602757A

Abstract

本发明公开了罗汉果苷IIE在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用，属于医药技术领域。本申请的发明人经过长期大量的试验发现，罗汉果苷IIE可抑制腺泡细胞本底的胰蛋白酶活性，抑制作用具有时间及浓度依赖性。此外，罗汉果苷IIE可以抑制急性胰腺炎诱导剂——雨蛙素对胰蛋白酶原的激活作用。同时，罗汉果苷IIE抑制胰蛋白酶原的激活与组织蛋白酶B有关，故罗汉果苷IIE可以用于制备胰蛋白酶抑制剂。

Description

罗汉果苷IIE在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及罗汉果苷IIE在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

罗汉果属于葫芦科多年生草质藤本植物，其果实可食用也可入药，主要分布在广西壮族自治区、广东省、江西省、湖南省和贵州省等地。成熟的罗汉果提取物味甜，甜度可达蔗糖的300倍，但其热量低且无其它明显副作用，因此是糖的良好替代品。罗汉果苷是罗汉果及其提取物的主要甜味来源，同时也是罗汉果皂苷的主要活性成分。除了甜味剂的商业价值外，罗汉果苷还有多种药理活性，包括：降血糖，食用后不引起机体血糖的升高；降血脂，糖尿病小鼠食用后血中的胆固醇及甘油三酯含量显著下降，高密度脂蛋白含量显著升高；消炎，降低炎症因子的释放；抗氧化，增加抗氧化物质的产生；抗癌，中和癌症诱导剂的作用等。

未成熟的罗汉果富含苦味的罗汉果苷IA1及罗汉果苷IIE，而在罗汉果成熟过程中，两者会转化为甜味的罗汉果苷IV及罗汉果苷V。其中，罗汉果苷V是商业甜味剂。近年来研究发现，罗汉果单体也具有较好的药理活性，例如：罗汉果苷V研究较多，具有降糖，消炎，抗癌活性；罗汉果苷IVE，可抑制肝脏星状细胞，可能对肝脏纤维化有缓解作用；罗汉果IIIE则具有体外抗纤维化，抑制细菌性肺损伤的功能。然而，目前对罗汉果苷单体的研究并不充分。

罗汉果是广西特种经济作物，主要以成熟的罗汉果作为商品。然而，在丰收采摘季节仍有相当数量的罗汉果由于天气等原因未达到成熟。未成熟的罗汉果如果能加以利用，则能将该作物的价值发挥到最大。未成熟的罗汉果中，罗汉果苷IIE含量丰富。开展罗汉果苷IIE的活性研究，将为未成熟罗汉果的利用提供依据。但目前为止，罗汉果苷IIE的功能尚不清楚。

胰蛋白酶的前体是胰蛋白酶原，胰蛋白酶原由胰腺腺泡细胞合成并分泌。正常生理情况下，胰蛋白酶原被分泌至肠道，在碱性环境下被肠道激酶激活转变成胰蛋白酶。胰蛋白酶不仅能消化蛋白质，还能激活糜蛋白酶原等其它消化酶。病理因素刺激下，组织蛋白酶B造成胰蛋白酶原在腺泡细胞内提前激活，胞内胰蛋白酶引起腺泡细胞的损伤，大量消化酶被释放。胰酶的提前激活是急性胰腺炎发生的重要引发因素。最新研究表明，在坏死性胰腺炎中，腺泡细胞释放的胰酶原被巨噬细胞吞噬并激活。胰蛋白酶导致巨噬细胞活性增加，包括使其释放多种炎症因子。由此可见，胰蛋白酶的活性对胰腺炎的发生发展至关重要，然而目前，对于胰蛋白酶抑制剂的研究并不充分。

鉴于此，有必要提供一种新来源的胰蛋白酶抑制剂。

发明内容

本发明的目的之一，是提供一种罗汉果苷IIE的新应用。本申请的发明人经过长期大量的试验发现，罗汉果苷IIE可抑制腺泡细胞本底的胰蛋白酶活性，抑制作用具有时间及浓度依赖性。此外，罗汉果苷IIE可以抑制急性胰腺炎诱导剂——雨蛙素对胰蛋白酶原的激活作用。同时，罗汉果苷IIE抑制胰蛋白酶原的激活与组织蛋白酶B有关，故罗汉果苷IIE可以用于制备胰蛋白酶抑制剂。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：罗汉果苷IIE在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用。

本申请的发明人分别进行了如下实验，并分别得出了如下实验结论：

第一，本申请的发明人通过罗汉果苷IIE作用AR42J细胞的时效实验发现，罗汉果苷IIE抑制AR42J细胞胰蛋白酶及组织蛋白酶B活性具有时间依赖性。

第二，本申请的发明人通过将罗汉果苷IIE作用原代胰腺腺泡的时效实验发现，罗汉果苷IIE抑制原代胰腺腺泡细胞胰蛋白酶及组织蛋白酶B活性具有时间依赖性。

第三，本申请的发明人通过罗汉果苷IIE作用AR42J细胞的量效实验发现，罗汉果苷IIE抑制AR42J细胞胰蛋白酶及组织蛋白酶B活性具有浓度依赖性。

第四，本申请的发明人通过罗汉果苷IIE作用原代胰腺腺泡细胞的量效实验发现，罗汉果苷IIE抑制原代胰腺腺泡细胞胰蛋白酶及组织蛋白酶B活性具有浓度依赖性。

第五，本申请的发明人通过体外AR42J细胞干预实验发现，AR42J细胞中罗汉果苷IIE可以抑制急性胰腺炎诱导剂——雨蛙素对胰蛋白酶原及组织蛋白酶B的激活作用。

第六，本申请的发明人通过体外原代胰腺腺泡细胞干预实验发现，AR42J细胞中罗汉果苷IIE可以抑制急性胰腺炎诱导剂——雨蛙素对胰蛋白酶原及组织蛋白酶B的激活作用。

第七，本申请的发明人通过体内干预实验发现，罗汉果苷IIE可抑制急性胰腺炎小鼠胰腺组织中胰蛋白酶及组织蛋白酶B的活性。

由此可以判定，罗汉果苷IIE可抑制腺泡细胞本底的胰蛋白酶活性，抑制作用具有时间及浓度依赖性。此外，罗汉果苷IIE可以抑制急性胰腺炎诱导剂——雨蛙素对胰蛋白酶原的激活作用。同时，罗汉果苷IIE抑制胰蛋白酶原的激活与组织蛋白酶B有关，故罗汉果苷IIE可以用于制备抑制胰腺腺泡细胞胰蛋白酶活性的药物。罗汉果苷IIE的作用效果图具体如图1所示。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述罗汉果苷IIE的结构式为：

上述罗汉果苷IIE购于成都曼思特生物科技有限公司。

本发明的目的之二，是提供一种胰蛋白酶抑制剂。本发明的胰蛋白酶抑制剂中，含有罗汉果苷IIE活性成分。罗汉果IIE为天然植物成分，具有良好的生物利用度，能有效抑制胰蛋白酶。同时，罗汉果果实可食用，而罗汉果苷IIE在未成熟罗汉果中含量丰富，故罗汉果苷IIE的毒副作用偏小，在医药领域具有广阔的应用前景。此外，罗汉果是广西特种作物，来源广，便于罗汉果苷IIE的提取。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种胰蛋白酶抑制剂，所述胰蛋白酶抑制剂是以有效量的罗汉果苷IIE为活性成分，加上药学上可接受的载体和/或辅料制备而成的药物制剂。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述胰蛋白酶抑制剂中罗汉果苷IIE的给药剂量为每日根据病人体重每千克5mg-10mg。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述剂量，可以达到抑制抑制胰腺腺泡细胞胰蛋白酶活性的药效。

进一步，所述胰蛋白酶抑制剂的剂型为溶液剂。

进一步，所述胰蛋白酶抑制剂的给药方式为皮下注射、肌内注射、静脉注射中的一种或多种。

采用上述进一步的有益效果是：注射给药可以让药物直接进入血液循环到达患处，不会因为消化道造成药效的降解。

本发明的有益效果是：

1.本申请的发明人经过长期大量的试验发现，罗汉果苷IIE可抑制腺泡细胞本底的胰蛋白酶活性，抑制作用具有时间及浓度依赖性。此外，罗汉果苷IIE可以抑制急性胰腺炎诱导剂——雨蛙素对胰蛋白酶原的激活作用。同时，罗汉果苷IIE抑制胰蛋白酶原的激活与组织蛋白酶B有关，故罗汉果苷IIE可以用于制备抑制胰腺腺泡细胞胰蛋白酶活性的药物。

2.本发明发现了罗汉果苷IIE的新应用，为提升罗汉果的开发利用提供了参考价值，市场前景广阔。

3.本发明提供的胰蛋白酶抑制剂中，含有罗汉果苷IIE活性成分，能有效抑制胰蛋白酶，罗汉果IIE为天然植物成分，具有良好的生物利用度，能有效抑制胰蛋白酶。同时，罗汉果果实可食用，而罗汉果苷IIE在未成熟罗汉果中含量丰富，故罗汉果苷IIE的毒副作用偏小，在医药领域具有广阔的应用前景。此外，罗汉果是广西特种作物，来源广，便于罗汉果苷IIE的提取。

附图说明

图1为本发明的罗汉果苷IIE的作用效果图。

图2为本发明的实施例1罗汉果苷IIE抑制胰腺腺泡细胞AR42J胰蛋白酶活性的时间效应图。与0h结果对比，**表示P<0.01差异极显著,***表示P<0.001差异极极显著。

图3为本发明的实施例1罗汉果苷IIE抑制胰腺腺泡细胞AR42J组织蛋白酶B活性的时间效应图。与0h结果对比，*表示P<0.05差异显著，**表示P<0.01差异极显著。

图4为本发明的实施例2罗汉果苷IIE抑制原代胰腺腺泡细胞胰蛋白酶活性的时间效应图。与0h结果对比，*表示P<0.05差异显著。

图5为本发明的实施例2罗汉果苷IIE抑制原代胰腺腺泡细胞组织蛋白酶B活性的时间效应图。与0μM结果对比，*表示P<0.05差异显著,**表示P<0.01差异极显著。

图6为本发明的实施例3罗汉果苷IIE抑制胰腺腺泡细胞AR42J胰蛋白酶活性的浓度效应图。与0μM结果对比，*表示P<0.05差异显著，**表示P<0.01差异极显著，***表示P<0.001差异极极显著。

图7为本发明的实施例3罗汉果苷IIE抑制胰腺腺泡细胞AR42J组织蛋白酶B活性的浓度效应图。与0μM结果对比，*表示P<0.05差异显著。

图8为本发明的实施例4罗汉果苷IIE抑制原代胰腺腺泡细胞胰蛋白酶活性的浓度效应图。与0μM结果对比，**表示P<0.01差异极显著。

图9为本发明的实施例4罗汉果苷IIE抑制原代胰腺腺泡细胞组织蛋白酶B活性的浓度效应图。与0μM结果对比，*表示P<0.05差异显著。

图10为本发明的实施例5罗汉果苷IIE抑制胰腺腺泡细胞AR42J雨蛙素对胰蛋白酶原的激活效果图。与对照组比，***表示P<0.001差异极极显著。与模型组比，##表示P<0.01差异极显著，###表示P<0.001差异极极显著。对照组细胞加入0.1％甲醇，模型组为200nM雨蛙素，干预组1细胞加入200nM雨蛙素和5μM罗汉果苷IIE，干预组2细胞加入200nM雨蛙素和10μM罗汉果苷IIE，干预组3细胞200nM雨蛙素和20μM罗汉果苷IIE。

图11为本发明的实施例5罗汉果苷IIE抑制胰腺腺泡细胞AR42J雨蛙素对组织蛋白酶B激活效果图。与对照组比，*表示P<0.05差异显著。与模型组比，#表示P<0.05差异显著。对照组细胞加入0.1％甲醇，模型组为200nM雨蛙素，干预组1细胞加入200nM雨蛙素和5μM罗汉果苷IIE，干预组2细胞加入200nM雨蛙素和10μM罗汉果苷IIE，干预组3细胞加入200nM雨蛙素和20μM罗汉果苷IIE。

图12为本发明的实施例6罗汉果苷IIE抑制原代胰腺腺泡细胞雨蛙素对胰蛋白酶原的激活效果图。与对照组比，***表示P<0.001差异极极显著。与模型组比，#表示P<0.05差异显著，##表示P<0.01差异极显著，###表示P<0.001差异极极显著。对照组细胞加入0.1％甲醇，模型组为200nM雨蛙素，干预组1细胞加入200nM雨蛙素和5μM罗汉果苷IIE，干预组2细胞加入200nM雨蛙素和10μM罗汉果苷IIE，干预组3细胞加入200nM雨蛙素和20μM罗汉果苷IIE。

图13为本发明的实施例6罗汉果苷IIE抑制原代胰腺腺泡细胞雨蛙素对组织蛋白酶B激活效果图。与对照组比，***表示P<0.001差异极极显著。与模型组比，#表示P<0.05差异显著，##表示P<0.01差异极显著。

图14为本发明的实施例7罗汉果苷IIE体内抑制雨蛙素对胰蛋白酶原的激活效果图。***表示P<0.001差异极极显著。对照组小鼠腹腔注射与苷IIE等体积的溶剂(溶剂中，V_{二甲基亚砜}：V_吐温80：V_生理盐水＝2：25：73)，模型组为50μg/kg雨蛙素，干预组1、2小鼠加入50μg/kg雨蛙素和5mg/kg、10mg/mg罗汉果苷IIE。

图15为本发明的实施例7罗汉果苷IIE抑制原代胰腺腺泡细胞雨蛙素对组织蛋白酶B激活效果图。***表示P<0.001差异极极显著。对照组小鼠腹腔注射与苷IIE等体积的溶剂(溶剂中，V_{二甲基亚砜}：V_吐温80：V_生理盐水＝2：25：73)，模型组为50μg/kg雨蛙素，干预组1、干预组2小鼠加入50μg/kg雨蛙素和5mg/kg、10mg/mg罗汉果苷IIE。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1：罗汉果苷IIE作用AR42J细胞的时效实验

在美国ATCC细胞库购买大鼠胰腺外分泌细胞AR42J细胞。AR42J培养条件为：F12K培养基(ATCC)和20％胎牛血清(Gibco)，37℃，5％二氧化碳。细胞特性：大鼠来源，贴壁生长，类上皮细胞，无支原体，无菌。

在成都曼思特生物科技有限公司购买罗汉果苷IIE，为粉末状，分子量801，分子式C₄₂H₇₂O₁₄，纯度≥98％(HPLC)，可溶于甲醇和二甲基亚砜。所述罗汉果苷IIE的结构式为：

在大鼠胰腺外分泌细胞AR42J细胞中，加入20μM罗汉果苷IIE(实施例1-6中均为甲醇溶解)。分别作用0h、1h、3h和6h后，分别检测AR42J细胞内胰蛋白酶及组织蛋白酶B的活性。

其中，胰蛋白酶活性测定(下述化合物均来自Sigma)方法：

取细胞裂解液(总蛋白20μg)与100μl 4mM胰酶底物丁氧羰基-谷氨酰-丙氨酰-精氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素盐酸盐混合,反应缓冲液为10mM Tris,20mM CaCl₂,pH值为7.4。37℃反应30min后，用酶标仪检测底物浓度,激发光380nm，发射光450nm。

组织蛋白酶B活性测定(下述化合物均来自Sigma)方法：

6μM Nα-苯氧羰基-精氨酰-精氨酰-4-甲基香豆素与细胞裂解液混合，反应溶液为：L-半胱氨酸盐酸盐溶液(8mM，溶剂为352mM磷酸钾,48mM磷酸钠,4.0mM乙二胺四乙酸，pH值为6.0)：0.1％(v/v)Brij为1.5:1。37℃反应60min后，用酶标仪检测底物浓度，激发光348nm,发射光440nm。

由图2可知，罗汉果苷IIE分别作用1h、3h和6h后，胰蛋白酶活性依次下降2.06％、8.07％和16.15％。

由图3可知，罗汉果苷IIE分别作用1h、3h和6h后，组织蛋白酶B活性依次下降9.18％、13.36％和21.66％。

由此可知，罗汉果苷IIE抑制AR42J细胞胰蛋白酶及组织蛋白酶B活性具有时间依赖性。

实施例2：罗汉果苷IIE作用原代胰腺腺泡细胞的时效实验

在小鼠原代胰腺腺泡中，加入20μM罗汉果苷IIE。分别作用0h、1h、3h和6h后，分别检测细胞内胰蛋白酶及组织蛋白酶B的活性。

由图4可知，罗汉果苷IIE分别作用1h、3h和6h后，胰蛋白酶活性依次下降1.21％、7.4％和15.21％。

由图5可知，罗汉果苷IIE分别作用1h、3h和6h后，组织蛋白酶B活性依次下降10.13％、13.74％和18.26％。

由此可知，罗汉果苷IIE抑制原代胰腺腺泡细胞胰蛋白酶及组织蛋白酶B活性具有时间依赖性。

实施例3：罗汉果苷IIE作用AR42J细胞的浓度效应实验

在大鼠胰腺外分泌细胞AR42J细胞中，分别加入0μM、5μM、10μM和20μM罗汉果苷IIE。分别作用6h后，检测细胞内胰蛋白酶及组织蛋白酶B的活性。

由图6可知，5μM、10μM和20μM罗汉果苷IIE作用后，胰蛋白酶活性依次下降8.57％、18.8％和20.89％。

由图7可知，5μM、10μM和20μM罗汉果苷IIE作用后，组织蛋白酶B活性依次下降12.19％、21.3％和26.42％。

由此可知，罗汉果苷IIE抑制AR42J细胞胰蛋白酶及组织蛋白酶B活性具有浓度依赖性。

实施例4：罗汉果苷IIE作用原代胰腺腺泡细胞的浓度效应实验在小鼠原代胰腺腺泡细胞中，分别加入0μM、5μM、10μM和20μM罗汉果苷IIE。分别作用6h后，检测细胞内胰蛋白酶及组织蛋白酶B的活性。

由图8可知，5μM、10μM和20μM罗汉果苷IIE作用后，胰蛋白酶活性依次下降3.47％、7.65％和18.06％。

由图9可知，5μM、10μM和20μM罗汉果苷IIE作用后，组织蛋白酶B活性依次下降4.56％、7.3％和17.1％。

由此可知，罗汉果苷IIE抑制原代胰腺腺泡细胞胰蛋白酶及组织蛋白酶B活性具有浓度依赖性。

实施例5：罗汉果苷IIE体外AR42J细胞干预实验

将大鼠胰腺外分泌细胞AR42J细胞分为三组：对照组、模型组和干预组。对照组加入0.1％甲醇，模型组加入200nM雨蛙素，干预组分为三种，即干预组1：加入200nM雨蛙素和5μM罗汉果苷IIE；干预组2：加入200nM雨蛙素和10μM罗汉果苷IIE；干预组3：加入200nM雨蛙素和20μM罗汉果苷IIE。分别作用6h后,检测细胞内胰蛋白酶及组织蛋白酶B的活性。

由图10可知，模型组中，胰蛋白酶活性上升27％。干预组中，干预组1、干预组2、干预组3作用后，胰蛋白酶活性依次下降19.13％、32.68％和37.13％。

由图11可知，模型组中，组织蛋白酶B上升31.58％。干预组中，干预组1、干预组2、干预组3作用后，组织蛋白酶B活性依次下降21.75％、31.26％和34.76％。

由此可知，AR42J细胞中罗汉果苷IIE可以抑制急性胰腺炎诱导剂雨蛙素对胰蛋白酶原及组织蛋白酶B的激活作用。

实施例6：罗汉果苷IIE体外原代胰腺腺泡细胞干预实验

将小鼠原代胰腺腺泡细胞分为三组：对照组、模型组和干预组。对照组细胞加入0.1％甲醇，模型组细胞加入200nM雨蛙素，干预组分为三种，即干预组1：加入200nM雨蛙素和5μM罗汉果苷IIE；干预组2：加入200nM雨蛙素和10μM罗汉果苷IIE；干预组3：加入200nM雨蛙素和20μM罗汉果苷IIE。分别作用6h后,检测细胞内胰蛋白酶及组织蛋白酶B的活性。

由图12可知，模型组中，胰蛋白酶活性上升25.69％。干预组1、干预组2、干预组3中，胰蛋白酶活性依次下降15.04％、21.72％和23.12％。

由图13可知，模型组中，组织蛋白酶B上升26.59％。干预组中，干预组1、干预组2、干预组3作用后，组织蛋白酶B活性依次下降20.87％、24.34％和26.56％。

实施例7：罗汉果苷体内干预实验

构建小鼠急性胰腺炎模型:20g-25g雌性C57BL/6小鼠禁食过夜，分为四组：对照组、模型组及干预组1，干预组2，每组6只小鼠。罗汉果苷IIE用溶剂(V_{二甲基亚砜}：V_吐温80：V_生理盐水＝2：25：73)配制成50mg/ml溶液,再用生理盐水稀释成0.5mg/ml,1mg/ml经腹腔注射入小鼠体内。

对照组小鼠腹腔注射生理盐水7次，每次间隔1小时，最后一次注射结束后，腹腔再次注射与罗汉果苷IIE(10mg/kg剂量，下同)等体积的溶剂(V_{二甲基亚砜}：V_吐温80：V_生理盐水＝2：25：73)；模型组小鼠腹腔注射50μg/kg雨蛙素7次，每次间隔1小时，最后一次注射结束后，腹腔再次注射与罗汉果苷IIE等体积的溶剂(V_{二甲基亚砜}：V_吐温80：V_生理盐水＝2：25：73)；干预组1最后一次雨蛙素注射结束后，腹腔再次注射5mg/kg罗汉果苷IIE。干预组2最后一次雨蛙素注射结束后，腹腔再次注射10mg/kg罗汉果苷IIE。注射结束后6h处死小鼠，取小鼠胰腺，裂解，检测胰蛋白酶及组织蛋白酶B的活性。

由图14可知，模型组中，胰蛋白酶活性升高31.77％，干扰组1中，胰蛋白酶活性下降14.86％，干扰组2中胰蛋白酶活性下降35.82％。

由图15可知，模型组中，组织蛋白酶B活性升高181.36％，干扰组1中，组织蛋白酶B活性下降52.49％，干扰组2中组织蛋白酶B活性下降64.18％。

由此可知，罗汉果苷IIE急性胰腺炎小鼠胰腺组织中胰蛋白酶及组织蛋白酶的活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.罗汉果苷IIE在制备胰蛋白酶介导的急性胰腺炎药物中的应用，所述罗汉果苷IIE的结构式为：