CN109580510A - 一种活性污泥ttc脱氢酶活性测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种活性污泥TTC脱氢酶活性测定方法，包括两个部分：标准曲线制作和样品测定；其中，标准曲线制作：标准曲线制作包括酶反应、萃取测试和线性回归三个步骤；其中，样品测定：样品测定包括酶反应、萃取测试和定量分析三个步骤。采用Na2S为还原剂，提高了还原产物TF的稳定性。用滴管去除上清液，再加丙酮，之后用蒸馏水定容的方式，避免了因污泥悬浮造成的TF损失，并且使丙酮的比例保持在83.3％，保证了结果的精确性。本发明通过漩涡振荡混匀的方式，提高对污泥中TF的萃取率；通过用滤膜过滤萃取液的方式，避免了污泥悬浮对最后测定结果的影响。

Description

一种活性污泥TTC脱氢酶活性测定方法
技术领域
本发明属于微生物活性测定技术领域，特别涉及废水生物处理工艺中活性污泥脱氢酶活性的测定方法。
背景技术
脱氢酶属于氧化还原酶类，它参与从有机物到分子氧化的电子得失的整个过程。脱氢酶活性经常作为评价污泥活性的指标，很大程度上反映了活性污泥中微生物对有机物的代谢能力。TTC-脱氢酶活性测定法，其原理是利用脱氢酶将氯化三苯基四氮唑(TTC)还原成三苯基甲臜(TF)后在485nm处有特征吸收，从而测定脱氢酶活性。
早期，国内外常在90℃高温条件下萃取生成的TF，但是萃取剂在高温下极易蒸发，破塞而溢，导致测定结果不稳定。而后众多研究者提出了常温萃取测定法的分析程序，萃取温度通常37℃，效果良好。在标准曲线制作中，早期使用还原剂连二亚硫酸钠，但生成的TF稳定性极差，其颜色在40分钟后几乎全部消失，连二亚硫酸钠逐渐被硫化钠取代。酶反应终止剂主要有浓H2SO4、甲醛、乙醇和丙酮等试剂，浓H2SO4会与污泥培养液和残留细胞反应，出现“茶色现象”，甲醛的酶反应终止效果优于乙醇和丙酮，一般情况下，甲醛的用量为反应液体积的1/10。在甲醇、乙醇及丙醇等萃取剂中，丙酮的萃取效果最好，有利于萃取颜色的稳定，而且80％的丙酮比纯丙酮萃取效果更好。活性污泥呈颗粒状，对TF具有很强的吸附能力，加入萃取液并在摇床中振荡提取，仍然有部分TF无法溶解。酶反应结束，离心分离后去除上清液的过程中，活性污泥易悬浮，造成TF的损失，从而导致结果不准确，无法完全去除上清液。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种方便、可靠、精确的污泥脱氢酶活性测定方法，以克服标准曲线制作过程中硫化钠易氧化及样品测试过程中活性污泥吸附性强和易悬浮的特点，从而提高活性污泥脱氢酶活性测定的可操作性及精确性。
本发明为解决背景技术中的技术问题，采用的技术方案是一种活性污泥TTC脱氢酶活性测定方法，包括两个部分：标准曲线制作和样品测定；
1)标准曲线制作：标准曲线制作包括酶反应、萃取测试和线性回归三个步骤；
(1)酶反应：将TTC储备液稀释成一系列不同浓度TTC使用液，在10mL离心管中依次加入 TTC使用液1mL，2mL Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mL去离子水和1mL新配的10％的Na2S，漩涡振荡混匀后，37℃下暗处振荡反应30min，180r/min，加入0.5mL的甲醛终止酶反应，漩涡振荡混匀；
(2)萃取测试：反应混合液在5000r·min-1下离心5min，用滴管弃去上清液，使液面在1mL 刻度线以下，加入5mL丙酮，再滴加去离子水使液面至6mL刻度线，37℃下暗处振荡萃取10min， 180r/min，在485nm处读取萃取液吸光度A；
(3)线性回归：以TTC浓度为横坐标，TF萃取液的A值为纵坐标作图，即得到TTC-A标准曲线，对标准曲线进行线性回归，即得标准方程：
y＝kx-b
式中，x为反应体系的TTC浓度(mg·L-1)，y是TF萃取液的A值；
2)样品测定：样品测定包括酶反应、萃取测试和定量分析三个步骤；
(1)酶反应：在10mL离心管中依次加入1mL活性污泥样品、2mL Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、 1mL去离子水和1mL0.4％TTC溶液；
对照组依次加入1mL活性污泥样品、2mL Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mL去离子水、0.5mL 甲醛溶液后和1mL0.4％TTC溶液；
漩涡振荡混匀，37℃下暗处振荡反应30min，180r/min，除对照组以外，加入0.5mL的甲醛终止酶反应，漩涡振荡混匀；
(2)萃取测试：反应混合液在5000r·min-1下离心5min，用滴管弃去上清液，使液面在1mL 刻度线以下，加入5mL丙酮，再滴加去离子水使液面至6mL刻度线，37℃下暗处振荡萃取10min， 180r/min，漩涡振荡一分钟，0.22μm有机滤膜过滤，在485nm处读取萃取液吸光度A；
(3)定量分析：通过标准曲线计算TF的生成量
式中，UI为TTC-比脱氢酶活性(mg TTC·g-1·min-1)，V为萃取剂体积(mL)，k为TTC-A 标准曲线的斜率，W为污泥样品的干重(mg MLSS)，t为酶促反应时间(min)。
有益效果
1、本发明采用Na2S为还原剂，提高了还原产物TF的稳定性。
2、本发明通过用滴管去除上清液，再加丙酮，之后用蒸馏水定容的方式，避免了因污泥悬浮造成的TF损失，并且使丙酮的比例保持在83.3％，保证了结果的精确性。
3、本发明通过漩涡振荡混匀的方式，提高对污泥中TF的萃取率；通过用滤膜过滤萃取液的方式，避免了污泥悬浮对最后测定结果的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例来对本发明做详细的说明。本发明的实施例是为了更好地使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。
(1)标准曲线制作
a.酶反应：配制100mg/LTTC储备液。以TTC储备液制备浓度分别为10、40、80、100、120、150和200mg/LTTC标准溶液。取21支10mL离心管，分成7组，每组3支平行。对于每组离心管，首先加入1mL某一浓度TTC标准溶液，然后依次加入2mL Tris-HCl缓冲液 (pH8.0)、1mL去离子水和1mL新配的10％的Na2S溶液。漩涡振荡混匀后，37℃下暗处振荡反应30min，180r/min，加入0.5mL的甲醛终止酶反应，漩涡振荡混匀。对照组以1mL去离子水替代TTC标准溶液，不设置平行，其他过程一致。
b.萃取测试：反应混合液在5000r·min-1下离心5min，用滴管弃去上清液，注意避免暗红色TF颗粒被移出，使液面在1mL刻度线以下，加入5mL丙酮，再滴加去离子水使液面至6mL刻度线，37℃下暗处振荡萃取10min，180r/min，在485nm处读取萃取液吸光度A，以对照组调零。
c.线性回归：以TTC浓度为横坐标，每组TF萃取液的A值的平均值为纵坐标作图，即得到TTC-A标准曲线，实验数据如表1所示。
表1标准曲线吸光度
对标准曲线进行线性回归，即得标准方程:
y＝0.0434x-0.0038
R2＝0.9993
式中，x为反应体系的TTC浓度(mg·L-1)，y是TF萃取液的A值。
(2)样品测定
a.酶反应：实验组设置3个平行，取3支10mL离心管，每支离心管中依次加入1mL活性污泥样品、2mLTris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mL去离子水和1mL0.4％TTC溶液。对照组不设置平行，取一支10mL离心管，依次加入1mL活性污泥样品、2mLTris-HCl缓冲液(pH8.0)、 1mL去离子水、0.5mL甲醛溶液后和1mL0.4％TTC溶液。漩涡振荡混匀，37℃下暗处振荡反应30min，180r/min，除对照组以外，加入0.5mL的甲醛终止酶反应，漩涡振荡混匀。
b.萃取测试：反应混合液在5000r·min-1下离心5min，用滴管弃去上清液，注意避免暗红色TF颗粒被移出，使液面在1mL刻度线以下，加入5mL丙酮，再滴加去离子水使液面至6mL刻度线，37℃下暗处振荡萃取10min，180r/min，漩涡振荡一分钟，0.22μm有机滤膜过滤，在485nm处读取萃取液吸光度A，以对照组调零。
实验中使用的活性污泥MLSS为3.176g/L。
3个平行样萃取液吸光度分别为0.885、0.857和0.863，平均值为0.868。
c.定量分析：通过标准曲线计算TF的生成量
其中，V＝6mL，k为TTC-A标准曲线的斜率，W＝3.176mg，t＝30min。
UI＝1.259mg TTC·g-1·min-1。
应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种活性污泥TTC脱氢酶活性测定方法，其特征在于，包括两个部分：标准曲线制作和样品测定；
1)标准曲线制作：标准曲线制作包括酶反应、萃取测试和线性回归三个步骤；
(1)酶反应：将TTC储备液稀释成一系列不同浓度TTC使用液，在10mL离心管中依次加入TTC使用液1mL，2mL Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mL去离子水和1mL新配的10％的Na2S，漩涡振荡混匀后，37℃下暗处振荡反应30min，180r/min，加入0.5mL的甲醛终止酶反应，漩涡振荡混匀；
(2)萃取测试：反应混合液在5000r·min-1下离心5min，用滴管弃去上清液，使液面在1mL刻度线以下，加入5mL丙酮，再滴加去离子水使液面至6mL刻度线，37℃下暗处振荡萃取10min，180r/min，在485nm处读取萃取液吸光度A；
(3)线性回归：以TTC浓度为横坐标，TF萃取液的A值为纵坐标作图，即得到TTC-A标准曲线，对标准曲线进行线性回归，即得标准方程：
y＝kx-b
式中，x为反应体系的TTC浓度(mg·L-1)，y是TF萃取液的A值；
2)样品测定：样品测定包括酶反应、萃取测试和定量分析三个步骤；
(1)酶反应：在10mL离心管中依次加入1mL活性污泥样品、2mL Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mL去离子水和1mL0.4％TTC溶液；
对照组依次加入1mL活性污泥样品、2mL Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mL去离子水、0.5mL甲醛溶液后和1mL0.4％TTC溶液；
漩涡振荡混匀，37℃下暗处振荡反应30min，180r/min，除对照组以外，加入0.5mL的甲醛终止酶反应，漩涡振荡混匀；
(2)萃取测试：反应混合液在5000r·min-1下离心5min，用滴管弃去上清液，使液面在1mL刻度线以下，加入5mL丙酮，再滴加去离子水使液面至6mL刻度线，37℃下暗处振荡萃取10min，180r/min，漩涡振荡一分钟，0.22μm有机滤膜过滤，在485nm处读取萃取液吸光度A；
(3)定量分析：通过标准曲线计算TF的生成量
式中，UI为TTC-比脱氢酶活性(mg TTC·g-1·min-1)，V为萃取剂体积(mL)，k为TTC-A标准曲线的斜率，W为污泥样品的干重(mg MLSS)，t为酶促反应时间(min)。
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