CN109563532A

CN109563532A - 具有窄荧光发射的氢化卟啉珠粒

Info

Publication number: CN109563532A
Application number: CN201780043650.6A
Authority: CN
Inventors: J·B·皮特纳; R·B·埃文斯-斯托姆斯; D·A·奥尔森
Original assignee: Nervana Science Co Ltd
Current assignee: Nervana Science Co Ltd
Priority date: 2016-06-10
Filing date: 2017-06-12
Publication date: 2019-04-02
Also published as: US11999885B2; EP3469094A1; JP2019524972A; EP3469094A4; WO2017214637A1; US20190264102A1; JP7034148B2

Abstract

提供具有聚合物基质和与其缔合的至少一种卟啉大环的荧光微粒和/或纳米颗粒。在一些实施方式中，与本发明公开的荧光微粒和/或纳米颗粒相关的卟啉大环选自：卟啉(包括17,18‑didehydrophorbines)，二氢卟酚(包括phorbines)，菌绿素(包括bacteriophorbines)和异菌绿素(包括含有稠合“E”环的异菌绿素)。在一些实施方式中，卟啉大环具有选自式I和II的结构。还提供了由多种不同的荧光微粒和/或纳米颗粒组成的群，制备方法和使用它们的方法，可分别检测的荧光微粒和/或纳米颗粒的组和制备和使用它们的方法，包含卟啉大环的，与颗粒缀合的二合体，及其使用方法来校准多激光流式细胞仪，对准和/或校准共聚焦荧光显微镜，和/或差异标记细胞和/或其他生物分子，和生物分子如抗体，其片段和衍生物(其与本发明公开的荧光微粒和/或纳米颗粒共价缀合的，和/或与本发明公开的包含卟啉大环的二合体共价缀合的)。

Description

具有窄荧光发射的氢化卟啉珠粒

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年6月10日提交的美国临时专利申请序列号62/348,532的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明公开的主题涉及包含一种或多种卟啉大环，任选地一种或多种二氢卟酚(chlorins)，菌绿素(bacteriochlorins)和/或异菌绿素(isobacteriochlorins)的组合物，以及使用其标记和/或以其检测生物分子和/或细胞的方法。具体地说，涉及包含本发明公开的卟啉大环，分子和载体如纳米颗粒和微粒(其已经用本发明公开的卟啉大环标记)的组合物，以及使用其标记和/或检测靶的方法。

背景技术

基于荧光的多色流式细胞仪(PFC)是现代免疫学和生命科学研究中的关键分析技术。PFC特别适用于真核细胞的分析和免疫表型分析，用于研究和诊断目的，它使免疫细胞亚群和功能的分析越来越复杂。最初由20世纪80年代艾滋病病毒研究的需求驱动，它从早期的三色T细胞亚群测量(CDC，1982)发展到HIV阳性患者(其中疾病进展，细胞谱系，和疫苗应答因子全部可用PFC检测(Chattopadhyay&Roederer，2010))的复杂多标记研究。除免疫疾病外，PFC的临床应用包括白血病和淋巴瘤免疫表型分型(现在使用8-10种颜色；参见例如，Craig&Foon,2008；Peters&Ansari,2011)和用于移植交叉匹配的HLA分型。

对更高复用能力的需求不断增加，再加上光学和激光的改进，推动了新的高参数流式细胞仪的推出，包括Becton Dickinson的50色FACSYMPHONY^TM品牌高速细胞分析仪和Bio-Rad的28色ZE5^TM品牌细胞分析仪。然而，这些和以前仪器上的PFC多路复用能力目前受到现有染料的宽光谱带宽的阻碍，导致宽的和重叠的发射谱，这严重限制了这些新器件充分利用的功能的能力。广泛和重叠的发射减少了可由给定激光器分析的光谱可分辨颜色的数量。用于PFC的当前染料需要使用次优带通滤波器，预分析实验和补偿(重叠校正)。这些实践导致荧光灵敏度降低并产生诸如“扩散”之类的伪影。例如，即使使用原型50色仪器，领先的PFC研究人员也只能实现30参数面板(Chattopadhyay等，2015)。因此，迫切需要用于高参数PFC板的新染料，用于诸如但不限于疫苗和药物开发，传染病研究和肿瘤学的领域。特别地，不仅存在对至少二十(20)个或更多个新荧光团的需求，同时且不断增加的对新的非常窄的发射，光谱上不同的荧光团的需要。

发明内容

该发明内容列出了本公开主题的若干实施方式，并且在许多情况下列出了这些实施方式的变型和替换。该发明内容仅仅是众多不同的示例实施方式。提及给定实施方式的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方式通常可以存在或不存在所提及的特征；同样地，这些特征可以应用于本公开主题的其他实施方式，无论是否在本概述中列出。为避免过度重复，本概述未列出或建议此类功能的所有可能组合。

在一些实施方式中，本发明公开的主题提供荧光微粒和/或纳米颗粒。在一些实施方式中，本发明公开的荧光微粒和/或纳米颗粒包含聚合物基质和与其缔合的至少一种卟啉大环。在一些实施方式中，所述至少一种卟啉大环选自：卟啉(包括17,18-didehydrophorbines)，二氢卟酚(包括phorbines)，菌绿素(包括bacteriophorbines)和异菌绿素(包括含有稠合“E”环的异菌绿素)。在一些实施方式中，所述至少一种卟啉大环中的一种或多种具有选自式I和II的结构：

其中M是金属或不存在；X选自Se，NH，CH₂，O和S；R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷和R⁸独立地选自：H，烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基烷基，环烷基烯基，环烷基炔基，杂环基，杂环烷基，杂环烯基，杂环炔基，芳基，芳烷基，芳基烯基，芳基炔基，杂芳基，杂芳基烷基，杂芳基烯基，杂芳基炔基，烷氧基，卤素，巯基，叠氮基，氰基，甲酰基，羧酸，羟基，硝基，酰基，芳氧基，烷硫基，氨基，烷基氨基，芳基烷基氨基，二取代氨基，酰氨基，酰氧基，酯，酰胺，次硫酰基(sulfoxyl)，磺酰基，磺酸盐(酯)基，磺酸，磺酰胺，脲，烷氧基酰氨基，氨基酰氧基，连接基团和表面连接基；K¹，K²，K³和K⁴是独立地选自N，O，S，Se，Te和CH的杂原子；S³，S⁴，S⁷，S⁸，S⁹，S¹⁰，S¹¹，S¹²，S¹³和S¹⁴，以及S¹和S⁵，或S²和S⁶独立地选自H，芳基，苯基，环烷基，烷基，烯基，炔基，卤素，烷氧基，烷硫基，全氟烷基，全氟芳基，吡啶基，氰基，硫代氰酰(thiocyanato)，硝基，氨基，烷基氨基，酰基，次硫酰基(sulfoxyl)，磺酰基(sulfonyl)，亚氨基(imido)，酰氨基(amido)和氨基甲酰基；或S⁷和S¹³一起形成＝O。在一些实施方式中，R¹，R²，R⁵，R⁷和R⁸各自为H；R³和R⁴各自为烷基；且R⁶是任选取代的芳基。在一些实施方式中，R¹，R²，R⁵，R⁷和R⁸各自为H；R³和R⁴各自为甲基；且R⁶是对甲苯基。在一些实施方式中，M存在并且选自Pd，Pt，Mg，Zn，Al，Ga，In，Sn，Cu，Ni和Au。在一些实施方式中，M是Zn或Mg。在一些实施方式中，K¹，K²，K³和K⁴独立地选自N，O，S和CH。在一些实施方式中，K¹，K²，K³和K⁴都是N。在一些实施方式中，S⁴，S⁷，S⁸，S⁹，S¹⁰，S¹¹，S¹²，S¹³和S¹⁴都是烷基。在一些实施方式中，荧光微粒和/或纳米颗粒存在于荧光微粒和/或纳米颗粒群中，并且其中所述群包含多种不同的荧光微粒和/或纳米颗粒；每种不同的荧光微粒和/或纳米颗粒与一种或多种不同的卟啉大环相缔合；每种不同的卟啉大环都有这样的发射波段(emission wavelength band)，其具有小于约25nm的半峰全宽(afull width at half maximum peak)，且与群中任何其他不同的卟啉大环的半峰全宽相隔至少5nm。在一些实施方式中，聚合物基质是聚苯乙烯，任选地其中聚合物基质包含聚苯乙烯珠粒。在一些实施方式中，至少一种卟啉大环通过与荧光微粒和/或纳米颗粒的外部非共价缔合存在，由荧光微粒和/或纳米颗粒包封，或前述两者。

本发明公开的主题还提供了包含多种本发明公开的不同荧光微粒和/或纳米颗粒的群。在一些实施方式中，每种荧光微粒和/或纳米颗粒包含聚合物基质和至少一种卟啉大环；且该群包含至少两种不同的包含不同的卟啉大环的荧光微粒和/或纳米颗粒。在一些实施方式中，每种不同的荧光微粒和/或纳米颗粒与一种或多种不同的卟啉大环缔合；每种不同的卟啉大环具有这样的发射波段，其具有小于约25nm的半峰全宽，且与群中任何其他不同的卟啉大环的半峰全宽相隔至少5nm。在一些实施方式中，所述群包含至少三种，四种，五种，六种，七种或八种不同的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒。在一些实施方式中，聚合物基质包含聚苯乙烯。在一些实施方式中，群中的每种不同的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒能够通过单一波长的光和/或约320nm至约450nm的光激发。在一些实施方式中，不同荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的至少亚组包括选自以下的卟啉大环：卟啉(包括17,18-didehydrophorbines)，二氢卟酚(包括phorbines)，菌绿素(包括bacteriophorbines)和异菌绿素(包括含有稠合“E”环的异菌绿素)。在一些实施方式中，所述至少一种卟啉大环中的一种或多种具有选自式I和II的结构：

其中M是金属或不存在；X选自Se，NH，CH₂，O和S；R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷和R⁸独立地选自：H，烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基烷基，环烷基烯基，环烷基炔基，杂环基，杂环烷基，杂环烯基，杂环炔基，芳基，芳烷基，芳基烯基，芳基炔基，杂芳基，杂芳基烷基，杂芳基烯基，杂芳基炔基，烷氧基，卤素，巯基，叠氮基，氰基，甲酰基，羧酸，羟基，硝基，酰基，芳氧基，烷硫基，氨基，烷基氨基，芳基烷基氨基，二取代氨基，酰氨基，酰氧基，酯，酰胺，次硫酰基(sulfoxyl)，磺酰基(sulfonyl)，磺酸盐(酯)基，磺酸，磺酰胺，脲，烷氧基酰氨基，氨基酰氧基，连接基团和表面连接基；K¹，K²，K³和K⁴是独立地选自N，O，S，Se，Te和CH的杂原子；S³，S⁴，S⁷，S⁸，S⁹，S¹⁰，S¹¹，S¹²，S¹³和S¹⁴，以及S¹和S⁵，或S²和S⁶独立地选自H，芳基，苯基，环烷基，烷基，烯基，炔基，卤素，烷氧基，烷硫基，全氟烷基，全氟芳基，吡啶基，氰基，硫代氰酰(thiocyanato)，硝基，氨基，烷基氨基，酰基，次硫酰基(sulfoxyl)，磺酰基(sulfonyl)，亚氨基(imido)，酰氨基(amido)和氨基甲酰基；或S⁷和S¹³一起形成＝O。在一些实施方式中，R¹，R²，R⁵，R⁷和R⁸各自为H；R³和R⁴各自为烷基；且R⁶是任选取代的芳基。在一些实施方式中，R¹，R²，R⁵，R⁷和R⁸各自为H；R³和R⁴各自为甲基；且R⁶是对甲苯基。在一些实施方式中，M存在并且选自Pd，Pt，Mg，Zn，Al，Ga，In，Sn，Cu，Ni和Au。在一些实施方式中，M是Zn或Mg。在一些实施方式中，K¹，K²，K³和K⁴独立地选自N，O，S和CH。在一些实施方式中，K¹，K²，K³和K⁴都是N。在一些实施方式中，S⁴，S⁷，S⁸，S⁹，S¹⁰，S¹¹，S¹²，S¹³和S¹⁴都是烷基。在一些实施方式中，至少一种卟啉大环中的一种或多种选自：氢化卟啉SE197，SE211，SE420，SE357，SE355，B56，B62，B66及其组合，且其中，氢化卟啉SE197，SE211，SE420，SE357，SE355，B56，B62和B66具有以下结构：

在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了包含多种不同荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的群。在一些实施方式中，每种不同的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒通过将至少一种卟啉大环在溶剂(任选地四氢呋喃(THF))中的溶液与包含聚合物基质的微粒的水溶液混合，然后除去溶剂来制备；并且具有这样的发射波段，其具有小于约25nm的半峰全宽，且与群中任何其他不同的荧光聚合物微粒的发射波段的半峰全宽相隔至少5nm。

在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了包含多种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的群，其通过以下的方法获得，包括制备一种或多种卟啉大环在溶剂(任选地四氢呋喃(THF))中的第一溶液，和进一步任选地其中第一溶液包含约0.25μg/ml至约20μg/ml的氢化卟啉；将第一溶液加入包含聚合物微粒和/或纳米颗粒，水和聚合物表面活性剂的第一混合物中，从而提供第二混合物，任选地，其中加入第一溶液以提供包含约33％溶剂的第二混合物和/或其中聚合物微粒和/或纳米颗粒包含聚苯乙烯和/或其中聚合物表面活性剂是聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)嵌段共聚物；将第二混合物混合一段时间，任选地其中一段时间为约15分钟；从第二混合物中除去溶剂以提供第一荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒，任选地其中所述除去包括离心第二混合物和/或漂洗微粒；重复前面的步骤以提供一种或多种另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒，其中所述一种或多种另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种包含与第一荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒或任何其他另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒不同的卟啉大环或卟啉大环混合物；将第一荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒与一种或多种另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的至少一种混合，从而提供包含多种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的群，其中每种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒包含聚合物基质和至少一种卟啉大环，其中当群被光激发时，任选地其中光在约320nm和约450nm之间，并且进一步任选地其中光具有单一波长，多种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种可被分别和/或同时检测。

在本文公开的群的一些实施方式中，多种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种具有不同的发射波长，特征为小于约25nm的半峰全宽，和/或与在任一其他荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的发射波段的半峰全宽相隔至少约5nm。在一些实施方式中，多种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种的发射波段在约590nm和约750nm之间。在一些实施方式中，群能够被405nm的光激发。在一些实施方式中，每种荧光微粒和/或纳米颗粒包含聚合物基质和一种卟啉大环。在一些实施方式中，本发明公开的群包含1至5种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒，其中1至5种荧光微粒和/或纳米颗粒中的每种包含卟啉大环，其选自氢化卟啉SE197，SE211，SE420，SE357，SE355，B56，B62和B66及其组合，并且进一步其中氢化卟啉SE197，SE211，SE420，SE357，SE355，B56，B62和B66。

在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了用于制备可分别检测的荧光微粒和/或纳米颗粒的组(任选地用于多重测定)的方法。在一些实施方式中，方法包括制备一种或多种卟啉大环在溶剂(任选地四氢呋喃(THF))中的第一溶液，和进一步任选地其中第一溶液包含约0.25μg/ml至约20μg/ml的一种或多种卟啉大环；将第一溶液加入包含聚合物微粒和/或纳米颗粒，水和聚合物表面活性剂的第一混合物中，从而提供第二混合物，任选地，其中加入第一溶液以提供包含约33％溶剂的第二混合物和/或其中聚合物微粒和/或纳米颗粒包含聚苯乙烯和/或其中聚合物表面活性剂是聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)嵌段共聚物；将第二混合物混合一段时间，任选地其中一段时间为约15分钟；从第二混合物中除去溶剂以提供第一荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒，任选地其中所述除去包括离心第二混合物和/或用水漂洗微粒和/或纳米颗粒一或多次；和重复前面的步骤以提供一种或多种另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒，其中所述一种或多种另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种包含与第一荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒或任何其他另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒不同的卟啉大环或卟啉大环混合物，其中在该组中荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的吸附波段重叠，且其中该组中荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种具有不同的发射波段，特征为小于约25nm的半峰全宽，和/或与在任一其他荧光聚合物微粒的发射波段的半峰全宽相隔至少约5nm。在一些实施方式中，本发明公开的方法还包括将一种或多种微粒和/或纳米颗粒缀合至由分子，蛋白质，抗体，抗体片段，核酸和细胞组成的组中的一种。

在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了通过本发明公开的方法之一制备的可分别检测的荧光微粒和/或纳米颗粒的组。

在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了本发明公开的可分别检测的荧光微粒和/或纳米颗粒的组在用于校准流式细胞仪的方法中的用途。

在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了与颗粒，任选地微粒和/或纳米颗粒缀合的包含卟啉大环的二合体(dyads)。在一些实施方式中，微粒和/或纳米颗粒是珠粒。在一些实施方式中，珠粒是聚苯乙烯珠粒。在一些实施方式中，珠粒还包含多种不同的包含卟啉大环的二合体，使得所述珠粒包含至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的荧光分子。在一些实施方式中，第一荧光分子包含二氢卟酚，且第二荧光分子包含菌绿素，并且其中在用紫光激发时，二合体发射红光和近红外光。在一些实施方式中，第二荧光分子包括荧光共振能量转移(FRET)供体，并且其中FRET供体的特征在于发射光谱与第一荧光分子的最大发射重叠。

在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了本公开的包含卟啉大环的二合体在多激光流式细胞仪的校准，共焦荧光显微镜的对准和/或校准，和/或细胞和/或其他生物分子的差异标记中的用途。在一些实施方式中，其他生物分子选自抗体和/或含有互补位(paratope)的片段或其衍生物。

在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了本发明公开的群用于差异标记多壁板的孔的用途。在一些实施方式中，该方法包括用不同的荧光微粒和/或纳米颗粒涂覆多壁板的多个孔中的每一个，使得基于源自本文特定荧光微粒和/或纳米颗粒的激发光谱，涂覆的孔可以彼此区分。

在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了本公开的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的群用于差异标记细胞的用途。在一些实施方式中，该方法包括将不同的荧光微粒和/或纳米颗粒引入细胞中，使得基于源自本文特定荧光微粒和/或纳米颗粒的激发光谱，单个细胞可以彼此区分。

本发明公开的主题还提供了与本公开的荧光微粒和/或纳米颗粒和/或本发明公开的包含卟啉大环的二合体共价缀合的抗体及其片段和/或衍生物。在一些实施方式中，卟啉大环选自卟啉大环SE197，SE211，SE420，SE357，SE355，B56，B62，B66和/或其任意组合，和/或包含卟啉大环的二合体包含至少一种选自卟啉大环SE197，SE211，SE420，SE357，SE355，B56，B62和B66，和/或其任意组合的卟啉大环。

本领域技术人员在阅读本公开内容后将明白这些和其他方面和实施方式，为本领域提供用于检测和/或标记生物分子和/或细胞的组合物和方法。

附图说明

图1描绘了叶绿素a和细菌叶绿素a(bacteriochlorophyll a)的结构，以及分别基于叶绿素a和细菌叶绿素a的合成的二氢卟酚和菌绿素的核心结构。

图2A和2B是二氢卟酚和菌绿素的典型吸光度和荧光发射光谱的图(图2B)。

图3A和3B描绘了五种合成二氢卟酚的结构(图3A)和荧光发射光谱(图3B)。在图3B中，光谱是增加发射波长的顺序，并且对应于二氢卟酚SE197，SE211，SE420，SE357和SE355(从左到右)。

图4是在用于在5.4μm直径的聚苯乙烯珠粒(固体)对比用THF处理但未添加二氢卟酚(虚线)的珠粒中，二氢卟酚SE420(也称为二氢卟酚C3)的半对数浓度滴定的一系列流式细胞术直方图。

图5是来自用五种不同的二氢卟酚C1至C5分别处理的珠粒的混合物的补偿数据的一系列选择成对点图。使用表2的值进行补偿。

图6A和6B描绘了按照波长B56，B66和B62增加的顺序，发射在700和800nm之间的三种菌绿素的结构(图6A)和相同的三种菌绿素的荧光发射光谱(图6B)。

图7A-7C是从五种不同浓度的染料溶液中滴定的菌绿素掺杂的5.43微米直径的聚苯乙烯珠粒的一系列流式细胞术直方图。图7A对应于菌绿素B62，图7B对应于菌绿素B66，而图7C对应于菌绿素B56。每个组包括5个峰，其从左到右分别对应于0、0.25、0.5、1.0和5.0μg/mL的浓度。

图8提供了一系列未补偿的(顶部三个图)和补偿的(底部三个图)点图，用于对三种菌绿素掺杂的5.43μm直径珠粒的混合物进行流式细胞术分析。

图9A-9D是在405nm激发下聚苯乙烯(PS)和磁性PS珠粒悬液的一系列荧光图。图9A是染色前磁性PS珠粒的荧光图。图9B是用二氢卟酚SE197(左峰)和SE355(右峰)染色后PS和磁性PS珠粒的混合物的荧光图。图9C是磁珠用磁架保留后珠粒混合物上清液的荧光图。图9D是洗涤和涡旋步骤后重悬浮磁珠的荧光图。

图10是一系列图，显示405nm激发下，在1.0、2.0、4.0、8.0、16.0和32.0μg/mL，SE420染料掺杂的0.46μm PS-COOH纳米珠粒的荧光发射(分别为最低峰到最高峰)。

图11是一系列图，显示在5.0、45.0和90.0μg/mL染料下，SE420染料掺杂的0.11μmPS纳米珠粒的悬浮液的荧光发射(分别为最低至最高峰)。激发在405nm。

图12是一系列图，显示了在20μg、40μg和80μg/mL染料下，二氢卟酚SE420染料掺杂的0.042μm聚苯乙烯颗粒的悬浮液的荧光发射(分别为最低至最高峰)。0.43％w/v终产物(1.07×10¹⁴颗粒/mL)。将样品稀释250倍。激发在405nm。

图13A和13B是山羊抗小鼠IgG捕获珠粒的流式细胞术直方图，未结合的(图13A和13B各自的最左侧峰)，和结合被动地涂覆有1x抗CD3的二氢卟酚SE420掺杂的纳米颗粒的0.2、0.6和2.0μL的FITC标记的抗CD3抗体(图13A)，1:1和1:10稀释(图13B)。

图14A和14B是山羊抗小鼠IgG捕获珠粒的流式细胞术直方图，未结合的(虚线)，和结合1:10、1:3.16和1:1稀释的二氢卟酚SE420掺杂的蛋白G/抗CD3包被的纳米颗粒(图14B；分别为左至右图)的0.125ng、1.25ng和125ng FITC标记的抗CD3(图14A；分别为左至右图)。

图15是一系列图，显示在0.25、0.5和1.0μg/mL下(分别为各组中最低至最高峰)共掺杂有二氢卟酚SE197(左三个峰)和SE420(右三个峰)的5.43μm颗粒的荧光发射。激发在405nm。

图16A和16B是具有不同掺杂水平的两种二氢卟酚的多种珠粒的混合物的FACS散点图。图16A显示了用于分析单个珠粒的门所示的前向和侧向散射。图16B显示9-plex珠粒阵列的荧光，其中BV605通道中具有SE197，BV650通道中具有SE420。

图17是掺杂有二氢卟酚(SE211)聚苯乙烯珠粒悬浮液的一系列荧光发射和荧光能量转移供体(ADS036FO)。如图所示，激发在355或405nm。“1.0μg”，“2.0μg”和“4.0μg”是指测试的二氢卟酚SE211的量。

图18是掺杂有二氢卟酚(SE211，4μg/mL)的聚苯乙烯珠粒的荧光发射的几个图和不同浓度的荧光能量转移供体。355ex393em(虚线)是指355nm的激发和393nm的发射，其对应于单独的供体的激发和发射。355ex635em(实线)是指供体的激发和二氢卟酚的发射，显示FRET供体/受体对的作用。405ex635em(虚线)是指二氢卟酚的激发和二氢卟酚的发射，显示单独的二氢卟酚的作用。

图19是示例性的β-连接的二氢卟酚-二萘嵌苯二合体(C-PMI¹³)的结构。

图20是掺杂有在指示的激发波长(即，405nm，561nm，532nm，355nm，488nm和640nm，分别为最高峰到最低峰)激发的示例性二氢卟酚-二萘嵌苯二合体的珠粒悬浮液的一系列荧光发射。

具体实施方式

现在将在下文中更全面地描述本发明公开的主题，其中描述了本公开主题的一些但不是全部实施方式。实际上，当前公开的主题可以以许多不同的形式实施，并且不应该被解释为限于这里阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式是为了使本公开满足适用的法律要求。

I.定义

这里使用的术语仅用于描述特定实施方式，并不意图限制本发明公开的主题。

尽管认为以下术语是本领域普通技术人员很好理解的，但是阐述了以下定义以便于解释本发明公开的主题。

除非下文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。对本文采用的技术的引用旨在表示本领域通常理解的技术，包括对那些技术的变化或对本领域技术人员显而易见的等效技术的替代。尽管认为以下术语是本领域普通技术人员很好理解的，但是阐述了以下定义以便于解释本发明公开的主题。

在描述本公开的主题时，应该理解，公开了许多技术和步骤。这些中的每一个都具有单独的益处，并且每个也可以与一个或多个或在一些情况下所有其他公开的技术结合使用。

因此，为了清楚起见，本说明书将避免以不必要的方式重复各个步骤的每个可能组合。然而，应该理解说明书和权利要求书，应理解这些组合完全在本发明和权利要求的范围内。

根据长期存在的专利法惯例，术语“一(a)”，“一(an)”和“该(the)”在本申请中使用时指的是“一个/种或多个/种”，包括权利要求。例如，短语“荧光微粒和/或纳米颗粒”是指一个/种或多个/种荧光微粒和/或纳米颗粒，包括多种相同的荧光微粒和/或纳米颗粒。类似地，短语“至少一个/种”，当在本文中用于指代实体时，是指例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更多个/种实体，包括但不限于1到100之间且大于100的整数值。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示成分的量，反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当涉及诸如质量，重量，时间，体积，浓度或百分比的可测量值时，术语“约”，意指包括在一些实施方式中±20％的变化，在一些实施方式中±10％，在一些实施方式中±5％，在一些实施方式中±1％，在一些实施方式中±0.5％，并且在一些实施方式中±0.1％的指定量，因为这样的变化是适合于执行所公开的方法。因此，除非有相反的指示，否则本说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据寻求通过本发明公开的主题获得的所需性质而变化。

如本文所用，术语“和/或”当在实体列表的上下文中使用时，是指单独或组合存在的实体。因此，例如，短语“A，B，C和/或D”分别包括A，B，C和D，但也包括A，B，C和D的任何和所有组合和子组合。

短语“缔合(associated with)”是指两个实体之间，例如聚合物基质和卟啉大环之间的任何相互作用。在一些实施方式中，聚合物基质和卟啉大环通过非共价键彼此缔合，所述非共价键例如但不限于疏水，静电和范德华相互作用中的一种或多种。在一些实施方式中，聚合物基质和卟啉大环由于包含卟啉大环的聚合物基质(例如，纳米颗粒，微粒，珠粒等)而彼此相缔合，使得卟啉大环存在于聚合物基质中。在这样的实施方式中，聚合物基质也被称为“掺杂(doped by)”或“掺杂有(doped with)”卟啉大环，并且卟啉大环可以被认为是“嵌入”在聚合物基质内。在一些实施方式中，聚合物基质和卟啉大环通过共价键(将卟啉大环连接至聚合物基质的表面)彼此缔合。

与“包含”，“含有”或“特征在于”同义的术语“包括”是包含性的或开放式的，并且不排除另外的，未列举的元件和/或方法步骤。“包括”是一个术语，意味着存在所指定的元素和/或步骤，但是可以添加其他元素和/或步骤，并且仍然落入相关主题的范围内。

如本文所用，短语“由......组成”排除未具体叙述的任何要素，步骤或成分。值得注意的是，当短语“由......组成”出现在权利要求主体的一个条款中，而不是紧跟在前序之后时，它仅限制该条款中规定的要素；其他要素不作为整体排除在权利要求之外。

如本文所用，短语“基本上由......组成”将相关公开内容或权利要求的范围限制于指定的材料和/或步骤，以及不会实质上影响所公开的基本和新颖特征的那些和/或声称主题。例如，荧光微粒和/或纳米颗粒可以“基本上由聚合物基质和与其缔合的至少一种卟啉大环组成”，这意味着所述聚合物基质是荧光微粒和/或纳米颗粒存在于其中的唯一聚合物基质。

关于术语“包括”，“由......组成”和“基本上由......组成”，其中本文使用这三个术语之一，本发明公开和要求保护的主题可包括使用其他两个术语中的任一个。例如，在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及荧光微粒和/或纳米颗粒。本领域普通技术人员在阅读本公开内容后将理解，本发明公开的主题因此涵盖基本上由本发明公开主题的聚合物基质与其缔合的至少一种卟啉大环组成的荧光微粒和/或纳米颗粒，以及由本发明公开主题的聚合物基质和与其缔合的至少一种卟啉大环组成的荧光微粒和/或纳米颗粒。

本文所用的“卤素”是指任何合适的卤素，包括-F，-Cl，-Br，-I和-At。

如本文所用的“巯基”是指-SH基团。

如本文所用的“叠氮基”是指-N₃基团。

如本文所用的“氰基”是指-CN基团。

如本文所用的“羟基”是指-OH基团。

如本文所用的“硝基”是指-NO₂基团。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“烷基”是指含有1或2至10，20或50个碳原子的直链或支链烃(例如，C₁至C₄烷基；C₄至C₁₀烷基；C₁₁至C₅₀烷基)。烷基的代表性实例包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，仲丁基，异丁基，叔丁基，正戊基，异戊基，新戊基，正己基，3-甲基己基，2,2-二甲基戊基，2,3-二甲基戊基，正庚基，正辛基，正壬基，正癸基等。如本文所用，“低级烷基”是烷基的子集，优选在一些实施方式中，并且是指含有1至4个碳原子的直链或支链烃基。低级烷基的代表性实例包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基等。除非另有说明，术语“烷基”或“低级烷基”旨在包括取代和未取代的烷基或低级烷基，并且这些基团可以被选自以下的基团取代：卤素，烷基，卤代烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳基烷基，杂环，杂环烷基，羟基，烷氧基，烯氧基，炔氧基，卤代烷氧基，环烷氧基，环烷基烷氧基，芳氧基，芳基烷氧基，杂环氧基，杂环烷氧基，巯基，烷基-S(O)m，卤代烷基-S(O)m，烯基-S(O)m，炔基-S(O)m，环烷基-S(O)m，环烷基烷基-S(O)m，芳基-S(O)m，芳烷基-S(O)m，杂环-S(O)m，杂环烷基-S(O)m，氨基，羧基，烷基氨基，烯基氨基，炔基氨基，卤代烷基氨基，环烷基氨基，环烷基烷基氨基，芳基氨基，芳基烷基氨基，杂环氨基，杂环烷基氨基，二取代氨基，酰氨基，酰氧基，酯，酰胺，磺酰胺，脲，烷氧基酰氨基，氨基酰氧基，硝基或氰基，其中m＝0、1、2或3。

如本文所用的“亚烷基(alkylene)”是指双官能的直链，支链或环状烷基，其可以是取代的或未取代的，并且其中“烷基”如上所定义。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“烯基”是指含有1或2至10、20或50个碳原子的直链或支链烃(例如，C₁至C₄烯基；C₄至C₁₀烯基；C₁₁至C₅₀烯基)(或低级烯基1-4个碳原子)，其在正链中包含1-4个双键。烯基的代表性实例包括但不限于乙烯基，2-丙烯基，3-丁烯基，2-丁烯基，4-戊烯基，3-戊烯基，2-己烯基，3-己烯基，2,4-庚二烯基等。除非另有说明，术语“烯基”或“低级烯基”旨在包括取代和未取代的烯基或低级烯基，并且这些基团可以被如上文关于烷基和低级烷基所述的基团取代。

如本文所用的“亚烯基(alkenylene)”是指双官能的直链，支链或环状烷基，其可以是取代的或未取代的，并且其中“烯基”如上所定义。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“炔基”是指含有1或20至10、20或50个碳原子的直链或支链烃(例如，C₁至C₄炔基；C₄至C₁₀炔基；C₁₁至C₅₀炔基)(或低级炔基1-4个碳原子)，其在正链中包含1个三键。炔基的代表性实例包括但不限于2-丙炔基，3-丁炔基，2-丁炔基，4-戊炔基，3-戊炔基等。除非另有说明，术语“炔基”或“低级炔基”旨在包括取代和未取代的炔基或低级炔基，并且这些基团可以用与上述烷基和低级烷基相关的相同基团取代。

如本文所用的“亚炔基(alkynylene)”是指双官能的直链，支链或环状炔基，其可以是取代的或未取代的，并且其中“炔基”如上所定义。

如本文所用的“亚烷基链(alkylidene chain)”是指双官能的直链，支链和/或环状有机基团，其可以是取代的或未取代的，其可以是饱和的或不饱和的，并且其可以任选地含有一个，两个或三个选自以下的杂原子：N，O和S。实例包括但不限于亚烷基，亚烯基，亚炔基，亚芳基，亚烷芳基(alkarylene)和亚芳烷基(aralkylene)。参见例如美国专利No.6,946,533。亚烷基链可含有任何合适数量的碳原子(例如，C₁至C₄；C₄至C₁₀；C₁₀至C₂₀；C₂₀至C₅₀)。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“烷氧基”是指通过氧基-O-与母体分子部分连接的本文所定义的烷基或低级烷基。烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基，乙氧基，丙氧基，2-丙氧基，丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，己氧基等。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“酰基”是指-C(O)R基团，其中R是任何合适的取代基，例如芳基，烷基，烯基，炔基，环烷基或本文所述的其它合适的取代基。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“卤代烷基”是指通过本文所定义的烷基与母体分子部分连接的至少一个本文所定义的卤素。卤代烷基的代表性实例包括但不限于氯甲基，2-氟乙基，三氟甲基，五氟乙基，2-氯-3-氟戊基等。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“烷硫基”是指通过本文所定义的硫代部分与母体分子部分连接的本文所定义的烷基。烷硫基的代表性实例包括但不限于甲硫基，乙硫基，叔丁硫基，己硫基等。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“芳基”是指具有一个或多个芳环的单环碳环系统或双环碳环稠环系统。芳基的代表性实例包括甘菊环基(azulenyl)，茚满基，茚基，萘基，苯基，四氢萘基等。除非另有说明，术语“芳基”旨在包括取代和未取代的芳基，并且这些基团可以用与上述烷基和低级烷基相关的相同基团取代。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“芳烷基”是指通过本文所定义的烷基与母体分子部分连接的本文所定义的芳基。芳烷基的代表性实例包括但不限于苄基，2-苯基乙基，3-苯基丙基，2-萘-2-基乙基等。

如本文所用的“氨基”是指基团-NH₂。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“烷基氨基”是指基团-NHR，其中R是烷基。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“芳烷基氨基”是指基团-NHR，其中R是芳基烷基。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“二取代氨基”是指基团-NR_aR_b，其中R_a和R_b独立地选自烷基，卤代烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，杂环基，杂环烷基。。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“酰氨基”是指基团-NR_aR_b，其中R_a是如本文所定义的酰基，R_b选自氢，烷基，卤代烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，杂环基，杂环烷基。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“酰氧基”是指基团-OR，其中R是如本文所定义的酰基。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“酯”是指-C(O)OR基团，其中R是任何合适的取代基，例如烷基，环烷基，烯基，炔基或芳基。

如本文所用的“甲酰基”是指-C(O)H基团。

如本文所用的“羧酸”是指-C(O)OH基团。

如本文所用的“次硫酰基(sulfoxyl)”是指式-S(O)R的化合物，其中R是任何合适的取代基，例如烷基，环烷基，烯基，炔基或芳基。

如本文所用的“磺酰基(sulfonyl)”是指式-S(O)(O)R的化合物，其中R是任何合适的取代基，例如烷基，环烷基，烯基，炔基或芳基。

如本文所用的“磺酸盐(酯)”是指式-S(O)(O)OR的化合物，其中R是任何合适的取代基，例如烷基，环烷基，烯基，炔基或芳基。

如本文所用的“磺酸”是指式-S(O)(O)OH的化合物。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“酰胺”是指-C(O)NR_aR_b基团，其中R_a和R_b是任何合适的取代基，例如H，烷基，环烷基，烯基，炔基或芳基。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“磺酰胺”是指-S(O)₂NR_aR_b基团，其中R_a和R_b是任何合适的取代基，例如H，烷基，环烷基，烯基，炔基或芳基。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“脲”是指-N(R_c)C(O)NR_aR_b基团，其中R_a，R_b和R_c是任何合适的取代基，例如H，烷基，环烷基，烯基，炔基或芳基。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“烷氧基酰氨基”是指-N(R_a)C(O)OR_b基团，其中R_a，R_b是任何合适的取代基，例如H，烷基，环烷基，烯基，炔基或芳基。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“氨基酰氧基”是指-OC(O)NR_aR_b基团，其中R_a和R_b是任何合适的取代基，例如H，烷基，环烷基，烯基，炔基或芳基。

本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的“环烷基”是指含有3、4或5至6、7或8个碳的饱和或部分不饱和的环状烃基(如下面所讨论的，这些碳可以在杂环基团中被取代)。环烷基的代表性实例包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基。这些环可任选地被如本文所述的另外的取代基取代，例如卤素或低级烷基。除非另有说明，术语“环烷基”是通用的并且旨在包括如下所讨论的杂环基团。

II.组合物

II.A.概述

在一些实施方式中，本发明公开的主题提供了荧光微粒和/或纳米颗粒，其包含聚合物基质和与其缔合的至少一种卟啉大环(在本文中可选地称为“氢化卟啉”)。如本文所用，“聚合物基质”可以是形成微粒和/或纳米颗粒的任何分子或分子的复合物，从而提供用于缔合一种或多种卟啉大环的支架。示例性的聚合物基质包括聚苯乙烯。

术语“微粒”是指具有至少一个区域的结构，其尺寸(例如，长度，宽度，直径等)小于约1,000μm但大于约1000nm。在一些实施方式中，尺寸可以小于约500μm，在一些实施方式中小于约250μm，在一些实施方式中小于约200μm，在一些实施方式中小于约150μm，在一些实施方式中小于约125μm，在一些实施方式中小于约100μm，在一些实施方式中小于约80μm，在一些实施方式中小于约70μm，在一些实施方式中小于约60μm，在一些实施方式中小于约50μm，在一些实施方式中小于约40μm，在一些实施方式中小于约30μm，在一些实施方式中小于约20μm，在一些实施方式中方式中小于约10μm，并且在一些实施方式中小于约5μm。在一些实施方式中，尺寸在约1μm和约250μm之间(例如，5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250μm)。

类似地，术语“纳米颗粒”是指具有至少一个区域的结构，其尺寸(例如，长度，宽度，直径等)小于约1,000nm。在一些实施方式中，尺寸较小(例如，小于约500nm，小于约250nm，小于约200nm，小于约150nm，小于约125nm，小于约100nm，小于约80nm，小于约70nm，小于约60nm，小于约50nm，小于约40nm，小于约30nm或甚至小于约20nm。在一些实施方式中，尺寸在约5nm和约250nm之间(例如，约1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250nm)。

在一些实施方式中，微粒或纳米颗粒近似为球形。当微粒或纳米颗粒近似为球形时，特征尺寸可对应于球体的直径。除球形外，微粒或纳米颗粒可以是圆盘形，板形(例如，六边形板状)，椭圆形，多面体形，棒形，立方形或不规则形状。

微粒或纳米颗粒可包括核心区域(即，颗粒外部尺寸之间的空间)和外表面(即，限定颗粒外部尺寸的表面)。在一些实施方式中，微粒或纳米颗粒可具有围绕或部分围绕微粒或纳米颗粒芯的一个或多个涂层。因此，例如，球形微粒或纳米颗粒可具有一个或多个同心涂层，每个连续层分散在更靠近颗粒中心的较小层的外表面上。

术语“聚合物”和“聚合物的”是指具有重复单元的化学结构(即，给定化学亚结构的多个拷贝)。聚合物可由可聚合单体形成。可聚合单体是包含一个或多个部分的分子，所述部分可以与其他可聚合单体分子上的部分反应以形成键(例如，共价键或配位键)。在一些实施方式中，每个可聚合单体分子可以与两个或更多个其他分子/部分键合。在一些情况下，可聚合单体将仅与另一个分子键合，形成聚合物材料的末端。

聚合物可以是有机的，或无机的，或其组合。如本文所用，术语“无机”是指含有除碳，氢，氮，氧，硫，磷或卤化物之一之外的至少一些原子的化合物或组合物。因此，例如，无机化合物或组合物可含有一个或多个硅原子和/或一个或多个金属原子。在一些实施方式中，聚合物是聚苯乙烯，微粒和/或纳米颗粒由聚苯乙烯构成。在一些实施方式中，微粒和/或纳米颗粒是聚苯乙烯珠粒。

如本文所公开的，聚合物基质与至少一种卟啉大环缔合，以产生本发明公开主题的荧光微粒和/或纳米颗粒。在一些实施方式中，至少一种卟啉大环通过与荧光微粒和/或纳米颗粒的外部非共价缔合存在，由荧光微粒和/或纳米颗粒包封，或前述两者。在一些实施方式中，至少一种卟啉大环是荧光分子。在一些实施方式中，至少一种卟啉大环选自：卟啉(包括17,18-didehydrophorbines)，二氢卟酚(包括phorbines)，菌绿素(包括bacteriophorbines)和异菌绿素(包括含有稠合“E”环的异菌绿素)。如本文所用，术语“卟啉(porphyrin)”是指通常由四个吡咯环和四个氮原子和两个可替代的氢(各种金属原子可以容易地取代)组成的环状结构。典型的卟啉是氯化血红素(hemin)。可用于本发明公开主题的组合物和方法中的示例性卟啉大环公开于美国专利No.6,559,374；7,173,691；8,173,691；8,207,329；8,546,088和9,417,245；Taniguchi等，2008；和Lindsey，2015，其中每一个都通过引用整体并入。

在一个实施方式中，所述至少一种卟啉大环具有发射波段，所述发射波段具有小于约25nm的半峰全宽，且与群中任何其他不同的卟啉大环的半峰全宽相隔至少5nm。制备具有有利的激发和发射光谱的卟啉大环的方法用于本发明公开的主题的微粒和/或纳米颗粒中，例如描述于美国专利6,559,374；7,173,691；和9,417,245，其全部内容通过引用并入本文。

关于本文公开的示例性卟啉大环，也可以对其进行修改，以便“波长调谐”示例性的卟啉大环，以给出具有不同和/或改进的发射光谱的额外的卟啉大环。在一些实施方式中，通过在β-吡咯位置放置不同的助色团(auxochromes)来修改(即，“调谐”)本发明公开主题的卟啉大环的发射波长。在一些实施方式中，还在还原的吡咯中加入二甲基以增强卟啉大环的稳定性。参见例如Lindsey，2015。

II.B.菌绿素作为卟啉大环

在本公开的主题的一些实施方式中，本发明公开的主题的卟啉大环是菌绿素。如本文所用，“菌绿素”基本上与卟啉相同，但与卟啉的不同之处在于具有两个部分饱和的非相邻(即反式)吡咯环。示例性的，非限制性的菌绿素包括但不限于美国专利No.8,173,691中公开的菌绿素。如其中所述，示例性菌绿素具有上文所述的式I结构，其中：

M不存在或是金属，可选地为选自Pd、Pt、Mg、Zn、Al、Ga、In、Sn、Cu、Ni和Au的金属；

X选自Se，NH，CH₂，O和S；

R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷和R⁸独立地选自：H，烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基烷基，环烷基烯基，环烷基炔基，杂环基，杂环烷基，杂环烯基，杂环炔基，芳基，芳烷基，芳基烯基，芳基炔基，杂芳基，杂芳基烷基，杂芳基烯基，杂芳基炔基，烷氧基，卤素，巯基，叠氮基，氰基，甲酰基，羧酸，羟基，硝基，酰基，芳氧基，烷硫基，氨基，烷基氨基，芳基烷基氨基，二取代氨基，酰氨基，酰氧基，酯，酰胺，次硫酰基(sulfoxyl)，磺酰基(sulfonyl)，磺酸盐(酯)基，磺酸，磺酰胺，脲，烷氧基酰氨基，氨基酰氧基，连接基团和表面连接基。

在一些实施方式中，R¹，R²，R⁵，R⁷和R⁸各自为H；R³和R⁴各自为烷基；R⁶是任选取代的芳基。在一些实施方式中，R¹，R²，R⁵，R⁷和R⁸各自为H；R³和R⁴各自为甲基；R⁶是对甲苯基。

在一些实施方式中，式I的菌绿素是通过在酸存在下，使式III的化合物(或缩合一对化合物)在有机溶剂中自缩合而制备的，其中式III为：

其中R是缩醛或醛基；X和R¹至R⁷如上所述，R⁸为H(或烷氧基，或由缩醛或醛基共同贡献)；R¹¹和R¹²分别为H；或R¹¹和R¹²一起形成共价键。任选地，然后可以根据已知技术将化合物进一步衍生化以在R⁸位置通过上面给出的其它取代基交换氢。

II.C.二氢卟酚作为卟啉大环

在本公开主题的一些实施方式中，本发明公开的主题的卟啉大环是二氢卟酚。如本文所用，“二氢卟酚”与卟啉基本相同，但与卟啉的不同之处在于具有一个部分饱和的吡咯环。叶绿素(植物光合作用的绿色色素)的基本发色团是二氢卟酚。本发明公开主题的示例性非限制性二氢卟酚包括美国专利No.6,559,374中公开的反式取代的二氢卟酚。如其中所述，示例性的反式取代的二氢卟酚具有上文所述的式II的结构，其中：

K¹，K²，K³和K⁴是独立地选自N，O，S，Se，Te和CH的杂原子；和

S³，S⁴，S⁷，S⁸，S⁹，S¹⁰，S¹¹，S¹²，S¹³和S¹⁴，以及S¹和S⁵，或S²和S⁶独立地选自H，芳基，苯基，环烷基，烷基，烯基，炔基，卤素，烷氧基，烷硫基，全氟烷基，全氟芳基，吡啶基，氰基，硫氰酸根，硝基，氨基，烷基氨基，酰基，次硫酰基(sulfoxyl)，磺酰基(sulfonyl)，亚氨基，酰氨基和氨基甲酰基；或S⁷和S¹³一起形成＝O。

在一些实施方式中，M是Zn或Mg。在一些实施方式中，K¹，K²，K³和K⁴独立地选自N，O，S和CH。在一些实施方式中，K¹，K²，K³和K⁴都是N。在一些实施方式中，S⁴，S⁷，S⁸，S⁹，S¹⁰，S¹¹，S¹²，S¹³和S¹⁴都是烷基。

式II的反式取代的二氢卟酚可以如美国专利No.6,599,374中所述制备。在一些实施方式中，式II的反式取代的二氢卟酚通过在酸存在下将式IV的化合物与式V的化合物(参见下文)在有机溶剂中缩合以形成缩合产物来制备。

II.D.异菌绿素作为卟啉大环

在本发明公开的主题的一些实施方式中，本发明公开的主题的卟啉大环是异菌绿素。“异菌绿素”基本上与卟啉相同，但与卟啉的不同之处在于具有两个部分饱和的相邻(即顺式)吡咯环。本发明公开主题的示例性异菌绿素包括但不限于美国专利No.8,546,088中公开的那些。

II.E.卟啉大环和荧光共振能量转移(FRET)

在一些实施方式中，本发明公开的主题的微粒和/或纳米颗粒包含荧光共振能量转移(FRET)供体，其中卟啉大环起到FRET受体作用。这是为了添加不同的荧光激发波长以激发卟啉大环(它们通常本身显示很少或没有激发效率)。作为实施例而非限制，使用本文所述的方法将含有卟啉大环和第二疏水染料的有机溶液一起加入到珠粒或颗粒中，以用单独的卟啉大环掺杂珠粒和颗粒。通常，选择具有与所选卟啉大环的最大激发显着重叠的所需激发特性和发射的FRET供体。在一些实施方式中，FRET供体的特征在于发射光谱与第一荧光分子的最大发射显着重叠。如本文所用，短语“显着重叠”是指归一化供体发射和标准化受体吸收之间的重叠区域。参见Lakowicz，1999。

II.F.二合体(dyads)

在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了卟啉大环的二合体。如本文所用，术语“二合体”是指与一种或多种其他卟啉大环和/或其他染料共价连接的卟啉大环。因此，如本文所用，术语“二合体”涵盖共价连接的卟啉大环，即与1、2、3、4、5或更多种不同的卟啉大环和/或其它染料共价连接。连接基(linker)可以变化，但通常炔基，苯基-炔基，芳基-炔基等，连接基用于连接卟啉大环和其他结合部分(partner)。在一些情况下，这可以增强诸如荧光量子产率之类的性质，或者可以提供诸如溶剂依赖性荧光之类的性质(参见Yu等人，2014)。二氢卟酚-菌绿素二合体例如可以结合二氢卟酚激发与菌绿素NIR荧光发射(参见Muthiah等，2008)。虽然不希望受任何操作理论的束缚，但使用这种方法可以产生紫色可激发的珠粒/颗粒，不仅具有用二氢卟酚的典型红色发射，而且还具有使用二氢卟酚-菌绿素二合体的NIR发射。还参见美国专利No.6,420,648，其全部内容通过引用并入本文。

本文还公开了具有多个激发波长的卟啉大环二合体掺杂珠粒和/或颗粒。目前，具有这种性质的珠粒用于多激光流式细胞仪的校准，并且使用多种荧光团的混合物制备，例如在SPHERO^TM Rainbow Calibration Particles(Spherotech Inc.，Lake Forest，Illinois，United States of America)中。这些也用于共焦荧光显微镜的对准和校准。由于荧光团掺杂效率的变化，以及多种荧光团的能量转移和对光学性质的其他干扰或竞争，使用多种荧光团提出了重大挑战。与使用多种荧光团相比，二合体提供了更简单的单一荧光成分以及一致且均匀的掺杂过程。例如，在Hu等人，2016中描述了“全色”荧光二合体，其将氢化卟啉与广泛吸收的苝(perylene)染料结合。除苝以外可与二合体中的氢化卟啉一起使用的其他配偶体基团包括但不限于BODIPY，卟啉，芘，terrylene，香豆素等。还参见美国专利No.6,420,648，其通过引用整体并入本文。

因此，在一些实施方式中，本发明公开的主题提供了与颗粒，任选地微粒，纳米颗粒和/或珠粒，任选地聚苯乙烯珠粒缀合的含卟啉大环的二合体。在一些实施方式中，所述珠粒还包含多种不同的含卟啉大环的二合体，使得所述珠粒包含至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的荧光分子。在一些实施方式中，第一荧光分子包含二氢卟酚，且第二荧光分子包含菌绿素，并且其中在用紫光激发时，二合体发射红光和近红外光。在一些实施方式中，本发明公开的主题的含卟啉大环的二合体用于多激光流式细胞仪的校准，共焦荧光显微镜的对准和/或校准，或细胞和/或其他生物分子(例如，抗体或其片段或衍生物)的差异标记。在一些实施方式中，本发明公开的主题的含卟啉大环的二合体与抗体和/或含有互补位(paratope)的片段或其衍生物缀合。

II.G.不同荧光微粒和/或纳米颗粒的群

本发明公开的主题还提供了包含多种不同荧光微粒和/或纳米颗粒的群。如本文所用，术语“不同”是指荧光微粒和/或纳米颗粒，其可基于任何可测量的标准彼此区分。例如，如果荧光微粒和/或纳米颗粒具有与其缔合的不同的卟啉大环(具有可区分的发射光谱)，则可以认为它们是不同的。在一些实施方式中，本发明公开主题的不同荧光微粒和/或纳米颗粒与一种或多种不同的卟啉大环相缔合，其中每种不同的卟啉大环具有这样的发射波段，其具有小于约25nm的半峰全宽，且与群中任何其他不同的卟啉大环的半峰全宽相隔至少5nm。

在一些实施方式中，每种荧光微粒和/或纳米颗粒包含聚合物基质和至少一种卟啉大环，并且在一些实施方式中，群包含至少两种不同的，包含不同卟啉大环的荧光微粒和/或纳米颗粒。

在一些实施方式中，每种不同的荧光微粒和/或纳米颗粒与一种或多种不同的卟啉大环相缔合；每种不同的卟啉大环具有这样的发射波段，其具有小于约25nm的半峰全宽，且与群中任何其他不同的卟啉大环的半峰全宽相隔至少5nm。在一些实施方式中，该群包含至少三种，四种，五种，六种，七种或八种不同的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒。

在一些实施方式中，聚合物基质包含聚苯乙烯，其任选为珠粒形式。在一些实施方式中，至少一种卟啉大环通过与荧光微粒、纳米颗粒和/或珠粒的外部非共价缔合存在，由荧光微粒、纳米颗粒和/或珠粒包封，共价连接至荧光微粒，纳米颗粒和/或珠粒或其任何组合的表面。

在目前公开的群的一些实施方式中，群中存在的每种不同的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒能够通过单一波长的光和/或约320nm至约450nm的光激发。

在目前公开的群的一些实施方式中，至少不同的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的亚组包括选自以下的卟啉大环：卟啉(包括17,18-didehydrophorbines)，二氢卟酚(包括phorbines)，菌绿素(包括bacteriophorbines)和异菌绿素(包括含有稠合“E”环的异菌绿素)。在一些实施方式中，所述至少一种卟啉大环中的一种或多种具有选自上文所述的式I和II的结构。在一些实施方式中，所述至少一种卟啉大环中的一种或多种选自：氢化卟啉SE197，SE211，SE420，SE357，SE355，B56，B62，B66及其组合。

在目前公开的群的一些实施方式中，多种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种具有不同的发射波段，特征为半峰全宽小于约25nm，和/或与任一其他荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的发射波段的半峰全宽相隔至少约5nm。

在一些实施方式中，多种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中每种的发射波段在约590nm和约750nm之间。在一些实施方式中，群能够通过405nm的光激发。在一些实施方式中，每种荧光微粒和/或纳米颗粒包含聚合物基质和一种卟啉大环。在一些实施方式中，本发明公开的群包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒，任选地其中一种或多种荧光微粒和/或纳米颗粒包含选自以下的卟啉大环：氢化卟啉SE197、SE211、SE420、SE357、SE355、B56、B62和B66及其组合。

在一些实施方式中，本发明公开群的不同荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒通过将至少一种卟啉大环在溶剂(任选地四氢呋喃(THF))中的溶液与包含聚合物基质的微粒的水相混合，并随后去除溶剂来制备；并且具有这样的发射波段，其具有小于约25nm的半峰全宽，并且与群中任何其他不同的荧光聚合物微粒的发射波段半峰全宽相隔至少5nm。应注意，可以使用除THF之外的其他溶剂，例如但不限于对二氧六环，四氢吡喃和2-甲基-四氢呋喃。所选择的溶剂应该溶解氢化卟啉，可以与水混溶，并且理想地应该非常温和地溶胀微粒和/或纳米颗粒(例如，聚苯乙烯颗粒或珠子)，从而允许至少一种卟啉大环与微粒和/或纳米颗粒(例如，聚苯乙烯颗粒或珠粒)缔合。

在一些实施方式中，群通过以下步骤制备：在溶剂(任选地四氢呋喃(THF))中制备一种或多种卟啉大环的第一溶液，并且进一步任选地，其中第一溶液包含约0.25μg/ml至约20μg/ml氢化卟啉；将第一溶液加入包含聚合物微粒和/或纳米颗粒，水和聚合物表面活性剂的第一混合物，从而提供第二混合物，任选地其中加入第一溶液以提供包含约33％溶剂的第二混合物，和/或，其中聚合物微粒和/或纳米颗粒包含聚苯乙烯，和/或其中聚合物表面活性剂是聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)嵌段共聚物；将第二混合物混合一段时间，任选地其中一段时间为约15分钟；从第二混合物中除去溶剂，以提供第一荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒，任选地其中所述除去包括离心第二混合物和/或漂洗微粒；重复前面的步骤以提供一种或多种另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒，其中一种或多种另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种包含不同于第一荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒或任何其他荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的卟啉大环或卟啉大环混合物；将第一荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒与一种或多种另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的至少一种混合，从而提供包含多种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的群，其中每种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒包含聚合物基质和至少一种卟啉大环，其中当群被光激发时，任选地其中光在约320nm和约450nm之间，并且进一步任选地其中光具有单一波长，多种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种可以被分别和/或同时检测。

在一些实施方式中，本发明公开的方法还包括将一种或多种微粒和/或纳米颗粒缀合至由分子，蛋白质，抗体，抗体片段，核酸和细胞组成的组中的一种。

如本文所用，术语“抗体(antibody或antibodies)”是指包含一种或多种基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽的蛋白质。免疫球蛋白基因通常包括appa(κ)，lambda(λ)，alpha(α)，gamma(γ)，delta(δ)，epsilon(ε)和mu(μ)恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。在哺乳动物中，重链被分类为γ，μ，α，δ或ε，它们进而分别定义免疫球蛋白类别，IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。其他物种具有其他轻链和重链基因(例如，某些禽类产生的所谓的IgY，其是母鸡在其蛋黄中留下的免疫球蛋白类型)，其类似地包括在本发明公开的主题中。

已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(平均分子量约25千道尔顿(kDa))和一条“重”链(平均分子量约50-70kDa)。两条相同的多肽链对通过存在于重链区内的二硫键以二聚体形式保持在一起。每条链的N-末端限定了约100至110个或更多个氨基酸的，主要负责抗原识别可变区。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指这些轻链和重链。

抗体通常作为完整的免疫球蛋白或许多充分表征的片段(其可以通过用各种肽酶消化产生)存在。例如，用木瓜蛋白酶消化抗体分子在二硫键近N末端切割抗体。这产生三个片段：两个相同的“Fab”片段，其具有轻链和重链的N-末端，以及“Fc”片段，其包括通过二硫键保持在一起的重链的C-末端。另一方面，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键的抗体近C末端，产生称为“F(ab)'₂”片段的片段，该片段是由二硫键连接的Fab片段的二聚体。可以在温和条件下还原F(ab)'₂片段以破坏铰链区中的二硫键，从而将F(ab')₂二聚体转化为两个“Fab”单体。Fab'单体基本上是具有部分铰链区的Fab片段(参见例如Paul，1993，其他抗体片段的更详细描述)。关于这些各种片段，Fab，F(ab’)₂和Fab'片段包括至少一个完整的抗原结合结构域(称为“互补位”)，因此能够结合抗原。

尽管根据完整抗体的消化定义了各种抗体片段，但是技术人员将理解，可以化学地或通过利用重组DNA方法从头合成各种这些片段(包括但不限于Fab'片段)。因此，如本文所用的术语“抗体”还包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段。在一些实施方式中，术语“抗体”包括具有至少一个抗原结合结构域的片段。

本发明公开的主题的抗体，片段和衍生物也可包括嵌合抗体。如抗体在本文的上下文中所使用，术语“嵌合”及其语法变体是指具有恒定区和可变区的抗体衍生物，所述恒定区基本上或完全源自来自一个物种的抗体恒定区，和所述可变区基本上或完全源自来自另一物种的可变区的序列。特定种类的嵌合抗体是“人源化”抗体，其中通过用例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)取代人抗体的CDR来产生此抗体(参见例如PCT国际专利申请公开号WO 1992/22653)。因此，在一些实施方式中，人源化抗体具有除CDR以外基本上或完全源自相应的人抗体区的恒定区和可变区，以及除人以外基本上或完全源自哺乳动物的CDR。

本发明公开的主题的抗体，片段和衍生物也可以是单链抗体和单链抗体片段。单链抗体片段含有具有本文所述完整抗体的至少一个可变区和/或CDR的氨基酸序列，但缺少那些抗体的一些或所有恒定结构域。这些恒定结构域对于抗原结合不是必需的，但是构成完整抗体结构的主要部分。

单链抗体片段可以克服与使用含有部分或全部恒定结构域的抗体相关的一些问题。例如，单链抗体片段倾向于没有在生物分子和重链恒定区之间的不希望的相互作用，或其他不需要的生物活性。另外，单链抗体片段比完整抗体小得多，因此可以具有比完整抗体更大的毛细管渗透性，允许单链抗体片段更有效地定位和结合靶抗原结合位点。而且，抗体片段可以在原核细胞中以相对大的规模产生，从而促进其产生。此外，相对小尺寸的单链抗体片段使得它们在受体中比完整抗体更不可能引起免疫应答。本发明公开的主题的单链抗体片段包括但不限于单链片段可变(scFv)抗体及其衍生物，例如但不限于串联di-scFv，串联tri-scFv，双抗体，包括双特异性双抗体，三抗体，四抗体，微抗体(miniantibodies)，微体(minibodies)，四价双特异性分子，双特异性F(ab')₂片段等。

因此，在一些实施方式中，本发明公开的主题涉及与本文所述的荧光微粒，纳米颗粒和/或二合体共价偶联和/或缔合的抗体或其片段或衍生物。在一些实施方式中，本发明公开主题的抗体或其片段或衍生物与选自以下的卟啉大环缀合和/或缔合：卟啉大环SE197,SE211,SE420,SE357,SE355,B56,B62,B66和/或其任何组合；和/或与包含一种或多种包含卟啉大环的二合体缀合和/或缔合，所述二合体包含选自以下的至少一种卟啉大环：卟啉大环SE197，SE211，SE420，SE357，SE355，B56，B62和B66，和/或其任意组合。

II.H.其它组合物

在一些实施方式中，本发明公开的主题还提供了可分别检测的荧光微粒，纳米颗粒和/或二合体的组，在一些实施方式中其通过本发明公开的方法制备。在一些实施方式中，一组可分别检测的荧光微粒，纳米颗粒和/或二合体包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多种可分别检测的荧光微粒，纳米颗粒和/或二合体。

用于合成本发明公开的主题的荧光微粒，纳米颗粒和/或二合体的其它起始材料和方法可以参见美国专利号7,332,599、7,408,058、7,423,160、7,470,785、7,501,508、7,518,905、7,534,807、7,553,977、7,582,751、7,595,407、7,633,007、7,678,900、7,723,513、7,745,618、7,884,280、7,947,828、7,947,829、7,951,939、7,964,720、7,994,312、8,013,149、8,062,756、8,080,653、8,097,609、8,129,520、8,173,691、8,173,692、8,187,824、8,188,298、8,207,329、8,212,023、8,212,055、8,278,439、8,304,561、8,445,695、8,524,892、8,530,459、8,546,088、8,664,260、8,980,565、9,303,165、9,365,722和9,417,245，这些全部援引加入本文。

III.使用方法

本发明公开的组合物(例如，荧光微粒，纳米颗粒，珠粒，二合体等)可用于可以使用荧光分子，特别是包含多种荧光分子的颗粒的任何目的。本发明公开主题的荧光微粒，纳米颗粒，珠粒，二合体及其群的示例性用途包括用作流式细胞术和其他诊断应用的校准标准(包括但不限于补偿控制，仪器设置控制等；参见例如Perfetto等，2006)；用在用于流式细胞术的多重珠粒阵列(包括但不限于免疫测定，核酸检测，PCR产物等)；用于细胞表面标志物的流式细胞术分析的标签；用于成像和显微镜的标签；用在细胞和生物分子(例如但不限于抗体和其片段和衍生物)的粒子阵列和条形码。

因此，在一些实施方式中，可以使用本发明公开主题的荧光聚合物微粒，纳米颗粒和/或二合体的群来差异地标记多壁板的孔。在一些实施方式中，多壁板的一个或多个孔被涂覆，每个孔具有不同的荧光微粒，纳米颗粒或二合体，或其组合，使得涂覆的孔可以基于源自其中存在的特定荧光微粒，纳米颗粒和/或二合体的激发光谱而被彼此分开。

类似地，在一些实施方式中，本发明公开主题的荧光聚合物微粒，纳米颗粒和/或二合体的群可以用于差异标记细胞和/或生物分子。在一些实施方式中，这通过向一个或多个细胞中引入不同的荧光微粒，纳米颗粒和/或二合体，或其组合，或将其与生物分子(包括但不限于抗体或其片段或衍生物)缔合和/或缀合来实现，使得个体的细胞和/或生物分子可以基于源自存在其中和/或与其缀合或缔合的特定荧光微粒，纳米颗粒和/或二合体的激发光谱而被彼此分开。

作为示例而非限制，窄发射卟啉大环为条形码实验提供了明显的优势。首先，窄发射允许通道之间较少的补偿(校正)，因此提高了珠粒/纳米颗粒识别的准确性。其次，窄发射允许来自一个激光器(例如紫激光器)的更多发射通道，消除交叉激发问题并允许使用多达6-10个不同的发射通道。第三，在一些实施方式中，合成卟啉大环是相当疏水的，允许均匀加载珠粒/纳米颗粒，并且当用于大多数生物测定的典型水性条件时，确保染料从珠粒/纳米颗粒的损失最小。Rees等人，2014提供了使用量子点(QD)进行条形码编码的示例，其描述了使用三种不同的QD来生成17,000个单独的单元代码。

IV.试剂盒

本发明公开的主题还提供了试剂盒，其在一些实施方式中包含一种或多种荧光微粒，纳米颗粒和/或二合体。在一些实施方式中，本发明公开的试剂盒包含多种荧光微粒和/或纳米颗粒和/或二合体，其中每种荧光微粒，纳米颗粒或二合体包含至少一种卟啉大环。在一些实施方式中，试剂盒提供在单独的容器中包含至少一种卟啉大环的作为纯化物质的多种荧光微粒和/或纳米颗粒和/或二合体，使得每个容器仅包含一种荧光微粒，纳米颗粒或二合体。如本文所用，“物质(species)”是用一种或多种卟啉大环标记的单个微粒，纳米颗粒或二合体，或用相同的一种或多种卟啉大环标记的多个相同的微粒，纳米颗粒或二合体，使得不同物质可彼此分别检测。因此，在一些实施方式中，试剂盒提供了可以单独使用或以各种组合使用以进行所述方法和/或参与本文所述用途的试剂。在一些实施方式中，所述试剂盒包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多可分别检测的荧光微粒，纳米颗粒和/或二合体。

实施例

以下实施例提供说明性实施方式。鉴于本公开和本领域的一般技术水平，本领域技术人员将理解，以下实施例仅旨在是示例性的，并且可以采用许多变化，修改和变更而不脱离本发明公开的主题的范围。

实施例1

具有二氢卟酚的聚苯乙烯珠粒的染色

材料：牌非离子型洗涤剂购自Sigma-Aldrich Co.，LLC(St.Louis,Missouri,United States of America)。各种二氢卟酚，包括SE197，SE211，SE420，SE355和SE357(参见图3)，获自John Lindsey of the North Carolina StateUniversity(Raleigh,North Carolina,United States of America)。不含抑制剂(无BHT)的四氢呋喃(THF)购自Sigma-Aldrich Co.，LLC(St.Louis,Missouri,United States ofAmerica；catalogue No.401757)。聚苯乙烯(PS)珠粒(平均直径5.43μm)购自BangsLaboratories,Inc.(Fishers,Indiana,United States of America；CatalogueNo.PS06N)。符合美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)的水购自Worldwide MedicalCorporation(Lake Forest,California,United States of America；CatalogNo.ES612)。在Varian Cary Eclipse荧光分光光度计(Varian,Inc.,now part of AgilentTechnologies,Palo Alto,California,United States of America)中检测和定量荧光。

方法：将以下物质加入1.7mL微量离心管中：140.0μL NCCLS水，70.0μL2.0％(v/v)牌非离子型去污剂和15.0μL PS珠粒(使用前重新悬浮)。逐滴加入二氢卟酚/THF溶液(115μL；在THF中的二氢卟酚浓度0.25μg/mL至20.0μg/mL)，同时涡旋微量离心管的内容物至最终浓度为约33％THF。将该管在室温下在旋转混合器上以70-80RPM“水平”温育15分钟。将反应管以850×g离心3分钟以沉淀掺杂的PS珠粒。使用Rainin P200移液器和枪头小心地移除上清液。将300μL NCCLS水加入到沉淀中，并使用“脉冲”方法以5/8速度乘以5个脉冲涡旋该管。将离心和随后的步骤重复两次以进行总共三次PS珠粒的洗涤。除去第三次上清液后，加入30.0μL NCCLS水，再次涡旋该管，并将样品在NCCLS水(即4.0μL样品加300μL NCCLS水)中1:75稀释，用于通过荧光光谱法表征。二氢卟酚掺杂的PS珠粒的光谱与在甲苯中测量的二氢卟酚荧光基本相同(参见图3B)。

实施例2

具有掺杂二氢卟酚的PS珠粒的流式细胞仪用于评估标记物的相对亮度

聚苯乙烯珠粒(5.43μm)从Bangs Laboratories获得，并如实施例1中所述用二氢卟酚制备。制备样品用于5mL聚苯乙烯圆底管中的流式细胞术(目录号352058，Corning,Inc.,Corning,New York,United States of America)。对于阴性对照，如实施例1中那样用THF处理未标记的聚苯乙烯珠粒用于上样，除了不加入染料。以相同方式洗涤材料并重悬于水中，用作流式细胞术中的空白。为了分析，将珠粒(空白或染色)在含有0.05％牌非离子去污剂的水中以1：400稀释到流式细胞术管中。

在19位参数LSR-II SORP流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，California，United States of America)的北卡罗来纳大学Core Flow Cytometry Facility(ChapelHill,North Carolina,United States of America)上分析样品，此流式细胞仪配备七(7)个激光器(355、405、488、532、561、594和633nm)或配备五(5)个激光器的LSRFORTESSA^TM品牌流式细胞仪(BD Biosciences)(355、405、488、561和640nm)，使用FACSDiva 8.0采集软件(BD Biosciences)。二氢卟酚SE420数据收集在100mW 405nm激光的通道A中，其中630nm长波通(LP)过滤器和660/20nm带通(BP)过滤器放置的位置可获得图4所示的数据。LP和BP过滤器获自BD Biosciences或Chroma Technology Corporation(Bellows Falls，Vermont，United States of America)。对于图5中所示的五种二氢卟酚图的数据，使用表1中描述的过滤器和通道。使用FlowJo软件(版本10.0.8，FlowJo,LLC,Ashland,Oregon,UnitedStates of America)进行实验后分析。

表1五种二氢卟酚染料的光谱特性及配套的流式细胞仪通道和过滤器选择，用于他们的流式细胞仪分析

基于前向和侧向光散射器鉴定空白珠粒。应用门控以排除具有比单个珠粒更低和更高散射的事件，并且使用该门控分析所有进一步的数据。对于所有实验，收集3000个门控事件。图4显示了用半对数浓度步骤制备的单一二氢卟酚(SE420)溶液处理的多组珠粒的组合的流式细胞术直方图的实施例，其中最高掺杂浓度等于1μg/mL。尖峰表明二氢卟酚施加到珠粒上的均匀度超过两个对数浓度范围。

图5显示了混合珠粒群之间同时成对相互作用的点图的选择。这些点图是在应用表2中的补偿矩阵值之后产生的。这些补偿值是通过测量每个珠粒进入其他四个通道的溢出来确定的。在该数据集中，通道和二氢卟酚被命名为C1-C5，如表1中所示。数据和补偿表值显示五种紫外可激发的窄发射二氢卟酚(峰值发射间隔小于120nm)可以通过流式细胞术使用最小的校正(补偿)和使用具有市售过滤器组的常规流式细胞仪进行精确分析。

表2用于同时检测五种二氢卟酚染色的聚苯乙烯珠粒的补偿矩阵通道

实施例3

具有菌绿素的聚苯乙烯珠粒的染色

聚苯乙烯(PS)珠粒(5.43μm；目录号PS06N/6667，Bangs Laboratories)用三种菌绿素染色，其方法与实施例1中制备二氢卟酚染色的珠粒所用的方法相似。根据Taniguchi等人，2008或Yang等人，2011制备菌绿素。图6中给出了三种绿色素在甲苯中的结构和荧光发射光谱。

实施例4

用流式细胞术分析菌绿素掺杂的珠粒

流式细胞术分析与实施例2中描述的方法类似。然而，仅使用LSRFORTESSA^TM品牌流式细胞仪，激发源是UV激光(355nm)，并且用于分析的过滤器如表3中所规定。图7A-7C显示了使用表3中指定的过滤器分析的来自0、0.25、0.5、1.0和5.0μg/mL的掺杂溶液(对于每种菌绿素)的三种绿色素中的每一种的滴定。图7的尖带表明了氢化卟啉在珠粒内掺杂的均匀性。

表3菌绿素的光谱特性及配套流式细胞仪通道和过滤器选择，用于他们的流式细胞仪分析

基于前向和侧向光散射器鉴定空白珠。应用门控以排除具有比单个珠子更低和更高散射的事件，并且使用该门控分析所有进一步的数据。对于所有实验，收集3000个门控事件。在测量单个的菌绿素掺杂的珠粒之后，产生补偿矩阵(表4)。在图8中应用补偿之前和之后，显示了所有三种绿色素相互之间的点图。该数据表明，三种窄发射菌绿素(峰值发射仅相隔60nm)可以很容易地分离，并使用常规仪器，光学器件和过滤器组通过流式细胞仪表征。

表4补偿矩阵用于三种菌绿素掺杂的PS珠粒的分析

通道	B62染料	B56染料	B66染料
				C	100	0.6613	0.1385
A	9.7537	100	8.9234
				B	66.3141	22.871	100

实施例5

具有二氢卟酚的磁珠粒的染色

制备两种类型的珠粒：(1)聚苯乙烯(PS)珠粒；平均尺寸5.43μm目录号PS06N/6667，Bangs Laboratories)；(2)聚苯乙烯(PS)磁性颗粒；平均尺寸为5.21μm(目录号PM-50-10，Lot AF01；Spherotech,Inc.,Lake Forest,Illinois,United States ofAmerica)。染料掺杂的PS珠粒和PS磁性颗粒均通过实施例1中描述的一般方法制备，其中THF中的二氢卟酚最大浓度为1.0μg/mL。PS珠粒用二氢卟酚SE197染色，磁性PS珠粒用二氢卟酚SE357染色。PS磁性颗粒的原液为2.5％w/v。为了在掺杂期间使颗粒/珠粒浓度相等，在适当的管中分别使用15.0μL PS珠粒(10.2％w/v原液)和60.0μL PS磁性颗粒(2.5％原液)。

将以下物质加入到1.7mL微量离心管中：60.0μL含有0.05％品牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂(Sigma-Aldrich，Inc)的PBS，20.0μL 1.0μg/mL SE197掺杂的PS珠粒，和20.0μL 5.0μg/mL SE357掺杂的PS磁性颗粒。在水中以1:15稀释，测定未染色的磁珠(图9A)和二氢卟酚染色的PS混合物的荧光和磁性(图9B)。将具有混合物的管置于磁架(DYNAMAG^TM2,Life Technologies Corp.,现在是Thermo Fischer Scientific Corp.的一部分，Waltham,Massachusetts,United States of America)上3分钟。使用1000μL移液管和枪头除去上清液，并在水中以1:15稀释度读取荧光(图9C)。将含有0.05％品牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的PBS(300μL)加入到磁架上留在管中的磁性颗粒中，并使用“脉冲”方法以5/8速度乘以5个脉冲涡旋该沉淀。将其置于磁架上3分钟。重复涡旋，磁架，上清液去除和缓冲液添加步骤。此后，将沉淀用80μL水重悬，并使用“脉冲”方法以5/8速度用5个脉冲涡旋。将混合物在水中以1:15稀释并读取荧光(图9D)。如图9B-9D所示，使用磁架获得两个珠粒群的清洁分离。这证明了氢化卟啉可以有效地用于需要荧光磁珠粒的生物测定。

实施例6

亚微米直径二氢卟酚掺杂PS颗粒的制备

使用二氢卟酚SE420和0.46μm PS-COOH珠粒(羧基聚苯乙烯颗粒；0.46μm；5％(w/v)；目录号CP-05-10/AH02；Spherotech)，通过实施例1的一般方法制备0.46μm珠粒，与实施例1的方法区别如下。将反应管以9,000x g离心15分钟，水洗涤体积为600μL而不是300μL。图10显示了从20、40和80μg/mL二氢卟酚SE420溶液掺杂的一系列0.46μm PS珠粒在405nm激发下的荧光发射。将珠粒从5％悬浮液稀释75倍至水中。

较大直径的聚苯乙烯珠粒(例如，0.46μm和5.4μm珠粒)可以容易地处理并使用离心洗涤，以将珠粒与未结合的试剂，溶剂和缓冲液分离。然而，对于较小颗粒的掺杂和表面处理，离心效果较差，并且需要其他分离方法如切向流过滤(TFF)以将改性颗粒与其它组分分离。

为了制备0.11μm和0.046μm直径的掺杂颗粒，使用牌TFF系统和过滤器(Spectrum Laboratories,Rancho Dominguez,California,United States ofAmerica)。对于0.11μm颗粒，使用750千道尔顿(kDa)中空纤维过滤器(目录号C02E750-10N，Spectrum Laboratories)，对于0.046μm颗粒，使用300kDa中空纤维过滤器(目录号C02E300-05N,Spectrum Laboratories)。根据制造商的说明，使用含有0.1％(v/v)品牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的NCCLS水平衡纤维，使用5.0mL注射器，连续三(3)次循环，总共15mL。

二氢卟酚掺杂0.11μm颗粒如下。在5mL聚丙烯管中，462μL NCCLS水，231μL 2.0％(v/v)牌非离子型洗涤剂，50μL 0.11μm PS-COOH 10％珠粒(目录号PC02N/12634，Bangs Laboratories，使用前重新悬浮)，379μL SE420二氢卟酚染料的THF(90.0μg/mL)溶液。逐滴加入二氢卟酚SE420的THF溶液，同时涡旋聚丙烯管的内容物，使最终浓度接近33％THF。将其在室温下温育15分钟，并在旋转混合器上以70-80RPM避光混合。

将反应混合物稀释到含有0.1％(v/v)品牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的44.88mL水中，以将THF稀释至0.74％(小于1％，以使溶剂对中空纤维过滤器的影响最小化)。将750kDa中空纤维过滤器用含有0.1％(v/v)牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的NCCLS水调节，使用5mL注射器，三(3)次分开循环，总共15mL。使用5mL注射器从掺杂的颗粒中除去未反应的染料和其他反应物，以控制通过止回阀的流动。这一直持续到它降至100μL(渗余物)。用含有0.1％(v/v)牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的5.0mL水洗涤渗余物四次，直至总共20.0mL已经循环通过100μL渗余物。将另外500μL含有0.1％(v/v)牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的水加入到滤液注射器中，并使用通过最远端渗余物注射器的负压反冲洗收获洗涤的100μL渗余物。重复该操作以产生约3.0mL的最终掺杂颗粒(0.166％颗粒(w/v)，2.54×10¹²个颗粒/mL)。将该样品在NCCLS水中以1:75稀释用于荧光分析(参见图11)。

二氢卟酚掺杂0.042μm颗粒通过在1.7mL聚丙烯管中组合以下物质来完成：280μLNCCLS水，140μL 2.0％(v/v)牌非离子型去污剂，30μL 0.042μmPS10％颗粒(目录号CXCPS02N/10602，Bangs Laboratories，在使用前重新悬浮)，加上230μL SE420二氢卟酚染料的THF溶液(80、40和20μg/mL)中。逐滴加入二氢卟酚SE420的THF溶液，同时涡旋聚丙烯管的内容物，使最终浓度接近33％THF。将其在室温下温育15分钟，并在旋转混合器上以70-80RPM避光混合。

将反应混合物稀释到含有0.1％(v/v)品牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的34mL水中，以将THF稀释至0.74％(小于1％，以尽量减少溶剂对中空纤维过滤器的影响)。将300kDa中空纤维过滤器用含有0.1％(v/v)牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的NCCLS水调节，使用5mL注射器，3个独立循环，总共15mL。使用5mL注射器从掺杂的颗粒中除去未反应的染料和其他反应物，以控制通过止回阀的流动。这一直持续到它减少到100μL(渗余物)。用含有0.1％(v/v) 品牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的5.0mL水洗涤渗余物四次，直至总共20.0mL已经循环通过100μL渗余物。将另外250μL含有0.1％(v/v)品牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的水加入到滤液注射器中，并使用通过最远端渗余物注射器的负压反冲洗收获洗涤的100μL渗余物。重复该过程以产生约1.0mL的最终掺杂颗粒。将该样品在NCCLS水中1:75稀释用于荧光分析(参见图12)。

实施例7

二氢卟酚掺杂0.11μm直径PS颗粒，其被动包被小鼠抗人CD8和小鼠抗人CD3 IgG抗体

将实施例6中所述制备的掺有二氢卟酚的0.11μm直径的PS珠粒用于标记人抗CD8抗体。按照制造商的说明，使用含有0.0008％(v/v)牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的PBS平衡750kDa中空纤维过滤器，使用5mL注射器，使用三(3)个独立循环，总共15mL。使用新制备的90.0μg/mL SE420染料掺杂的0.11μm PS-COOH珠粒，开始将缓冲液交换到含有0.0008％(v/v)牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的PBS中。

使用新的干净5.0mL注射器并通过止回阀端口注射，用含有0.0008％(v/v)牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的PBS交换缓冲液四(4)次循环，直至总共20.0mL循环通过100μL渗余物。使用滤液注射器添加500μL含有0.0008％(v/v)牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的PBS，并使用通过最远端渗余物注射器的负压反冲洗收获洗涤的100μL渗余物。将该洗涤步骤重复两次，得到约5mL掺杂颗粒(0.13％(w/v)，1.53×10¹²个颗粒/mL)。

将5mL掺杂的颗粒等分到四个单独的1.7mL微量离心管(每管1.25mL)。以下述的量，向管中加入克隆UCHT-4小鼠抗人抗CD8IgG(目录号C366,9.4mg/mL；LeincoTechnologies，Inc.，St.Louis，Missouri，United States of America)的溶液：0.0、28.6、143和715μg UCHT-4；代表0.0x，0.2x，1.0x和5.0x理论单层量的IgG。将管在室温下以70-80RPM摇动，避光4小时，然后在4℃下放置16-18小时。通过添加125μL的10％牛血清白蛋白(BSA)溶液(BSA的最终浓度1.0％)来阻断每个管的反应物，并在室温下以70-80RPM再次摇动，避光1小时。使用如上所述的中空纤维方法纯化管的内容物，然而用以下溶液平衡纤维，并用洗涤样品：含有1.0％BSA和0.05％叠氮化钠的PBS。每个样品的最终体积约为1.0mL。

为了制备小鼠抗人CD3包被的纳米颗粒，使用与CD8相同的方法，但以相同的包被浓度和量(0.0、28.6、143和715μg)替换小鼠抗人CD3IgG(克隆UCHT-1，Leinco)。

图13B显示与相同抗体克隆的商业FITC标记的IgG相比(图13A；Bangs QuantumSimply Cellular Microspheres，产品号814)相比，1.0x单层抗CD3IgG包被的SE420 0.11μm直径纳米颗粒的三种不同稀释液(0、1:10和1:1)与抗小鼠IgG捕获珠粒(BangsLaboratories，Inc)的结合。如实施例2中所述设置流式细胞仪，用于SE420掺杂珠粒的流式细胞术。

实施例8

二氢卟酚掺杂0.11μm直径Ps粒子，被动包被蛋白G和抗CD3 IgG抗体

在该实施例中使用来自实施例6的SE420二氢卟酚掺杂的颗粒(45μg/mL)。然而，不是首先用IgG进行被动包被，而是添加二氢卟酚掺杂的颗粒(含有0.0008％(v/v)品牌聚山梨醇酯型非离子表面活性剂的PBS中，约1.0mL，0.25％v/v)到含有500μg蛋白G溶液的管中(0.05mL，10mg/mL的PBS溶液，含有0.05％叠氮化物；rec-ProteinG，Life Technologies目录号003005)。在室温下将管以70-80RPM摇动，避光4小时，然后在4℃下保持16-18小时。通过添加125μL的10％BSA溶液(最终1.0％BSA)来封闭包被的颗粒，并在室温下以70-80RPM再次摇动，避光1小时。使用中空纤维方法洗涤内容物，得到约1.0mL。

首先，将50μL等份的蛋白G包被的二氢卟酚掺杂的0.11μm直径的聚苯乙烯颗粒(被动包被)与蛋白G孵育，然后与0.024μg抗CD3IgG抗体一起孵育。分析这些(克隆UCHT-1，Leinco)，在室温下孵育30分钟，然后用含有0.5％BSA的1mL PBS洗涤2次。图14显示了它们通过流式细胞术分析，类似于前述实施例中描述的方法。通过使用固定的蛋白G，使抗体通过Fc部分定向，获得有效的颗粒包被。

实施例9

用多于一种氢化卟啉掺杂的颗粒来制造阵列

使用实施例1的一般方法，分别以0、0.25、0.5和1.0μg/mL浓度制备二氢卟酚SE197和SE420，并且彼此组合用于掺杂5.43μm PS珠粒。图15显示了使用405nm激发掺杂有0.25、0.5和1.0μg/mL浓度的每种染料的颗粒的悬浮液的荧光。这些显示出每种二氢卟酚的两个明显的尖锐和窄的荧光发射峰。

图16显示了具有9种SE197和SE420组合的珠粒混合物的流式细胞术(SE197/SE420：0/0,0/0.025,0/0.25,0.025/0,0.25/0,0.025/0.025,0.025/0.25,0.25/0.025,0.25/0.25μg/mL)。不同群的分离是明确定义的，并且需要最小补偿，并且表明这些或类似制备的珠粒可用于可寻址阵列中条形码编码的不同细胞群。

实施例10

用荧光能量转移供体和氢化卟啉能量转移受体增强氢化卟啉掺杂珠粒的制备

使用实施例1的一般方法，将二氢卟酚SE211和UV吸收性芴低聚物ADS036FO(American Dye Source，Inc，Quebec，Canada)掺入5.43μm PS珠粒中。使用浓度为0、40、80或160μg/mL的ADS036FO的THF溶液，以1.0、2.0和4.0μg/mL的浓度制备SE211。图17显示了在355nm或405nm激发的珠粒悬浮液的荧光发射。图18显示了具有不同量的寡聚体的4.0μg/mLSE211的荧光强度。当存在80和160μg/mL的低聚物时，二氢卟酚的发射相对于单独的SE211，在355nm激发下增加3至4倍。这表明发生了从低聚物到二氢卟酚的能量转移。

实施例11

掺杂有氢化卟啉二合体的颗粒

通过实施例1中描述的方法，使用20μg/mL二合体的THF溶液，将苝-二氢卟酚二合体，C-PMI13(参见Hu等人，2016)掺入5.43μm PS颗粒中。图19显示了二合体的结构。在不同激发波长下激发的二合体掺杂珠粒的悬浮液的荧光发射显示在图20中。355、405、488、532、561和640nm的激发波长对应于用于多激光流式细胞仪的普通激光器和/或激光二极管，例如BD LSRFORTESSA^TM(BD Biosciences,San Jose,CA)。二合体掺杂的珠子在678-679nm处显示荧光发射，所有激发波长证明它们可用作多激光仪器的校准珠粒。

实施例讨论

氢化卟啉是一类与卟啉相关的化合物，但在核心四吡咯环系统内具有一个或多个还原键(参见例如Scheer等，1978)。天然存在的，有生物活性的氢化卟啉包括叶绿素和细菌叶绿素。二氢卟酚和菌绿素在结构上与叶绿素和细菌叶绿素有关，与叶绿素和细菌叶绿素分别存在一个和两个还原键的差异。与通常特征为两个荧光发射峰的卟啉相比，氢化卟啉在红色至近红外(NIR)光谱区域通常具有单个尖锐的发射带，并且在大多数情况下，具有比卟啉更高的荧光发射强度。

本文公开了将氢化卟啉衍生染料掺入珠粒中的方法，所述珠粒提供可用于流式细胞术和其他诊断测定的光稳定珠粒。该方法提供了染料负载珠粒，其没有明显的内部染料聚集，以提供与染料浓度在大于2log浓度范围内线性的信号。当在有机溶剂中表征时，染料负载珠粒保持与氢化卟啉所显示的相同的大斯托克斯位移(Stokes shifts)和急剧窄的荧光发射光谱。据信这种染料之前没有掺入聚合物珠粒中，这可能是由于它们的可获得性有限。利用本文公开的稳健合成方法，可以制备具有相邻发射峰的多种染料。本文还证明，使用普通紫色(405nm)激光器激发，用现代流式细胞仪在150nm窗口内的五个通道中同时检测来自五种二氢卟酚负载的聚苯乙烯珠粒的发射信号。

这些氢化卟啉珠粒具有以下潜在用途，用作仪器设置的校准标准，和用于确定流式细胞术中使用的重叠荧光团的“补偿”或数学校正值。它们在应用中也具有价值，其中大的有效斯托克斯位移最小化来自散射或珠粒自发荧光(其通常更接近激发波长)的背景。此外，在珠粒内使用多种水平的染料负载和/或两种或更多种氢化卟啉有助于使用本发明公开的组合物作为流式细胞仪中多重测定检测的平台。

出乎意料的是，确定了氢化卟啉的四氢呋喃(THF)溶液为染料扩散到聚苯乙烯(PS)珠粒中提供了快速有效的载体。珠粒悬浮液中水向THF的逐渐增加捕获珠粒中的氢化卟啉。在洗涤除去痕量THF后，通过相差显微镜检查珠粒，发现其具有与未修饰的PS珠粒相当的等效直径和最小聚集。在水性缓冲液中氢化卟啉染色的PS珠粒的悬浮液显示悬浮液的荧光性质(例如，尖锐的发射带)，其在溶解在THF中的相同氢化卟啉的光谱上几乎可叠加。使用其他方法将氢化卟啉衍生物掺入PS珠粒的尝试给出了可变或较差的结果。例如，使用氯仿和异丙醇通过逐渐溶剂蒸发法将氢化卟啉扩散到珠粒中(参见Zhang等人，2009)，这导致显着的珠粒降解。本文所述的方法也更快且更有效，步骤少于制备用于多重测定用途的多染料珠粒所述的方法(参见Chandler等人的美国专利No.6,632,536)。

在流式细胞术实验中，珠粒显示出尖锐发射带的保留和来自分别染色的珠粒混合物的信号，使用适当的发射过滤器和常见的紫色(405nm)激光激发，在590nm至750nm的发射波长范围内，可以容易地区分五种二氢卟酚。

本公开主题的代表性优点包括但不限于以下内容。迄今为止，常规染料已用于大多数校准标准品和多重珠粒阵列(例如，罗丹明，方酸，羰花青等)。这类染料通常具有宽的发射谱(swhm为40-50nm或更大)。根据本发明公开的主题，本发明公开的卟啉大环具有尖锐的窄发射峰：对于二氢卟酚通常为15-20nm，对于菌绿素通常为20-25nm。一起使用，这些染料中的两种或更多种产生比使用常规染料更高水平的来自单一激发源的多路传输(multiplexing)。例如，从590nm到740nm，可以检测到五种二氢卟酚，它们之间具有最小的光谱重叠。在比五种二氢卟酚更高水平的光谱重叠下，只有三种常规染料在该范围内是可分开的。卟啉大环相对于常规染料的另一个优点是大的有效斯托克斯位移(激发和发射波长之间的差异)。常规染料很少具有大于20-30nm的斯托克斯位移。另一方面，二氢卟酚可以在405nm激发，具有590nm和750nm之间的发射，产生185nm至350nm或更高的有效斯托克斯位移。这减少了来自其他珠粒或颗粒非染料组分(例如聚苯乙烯)的背景，其提供更清洁和更可靠的负荧光控制信号和更准确的阳性信号。

参考文献

本公开中列出的所有参考文献，包括但不限于所有专利，专利申请和出版物，科学期刊文章和数据库条目，通过引用整体并入本文，其补充，解释，提供背景，和/或教导本文采用的方法，技术和/或组合物。对参考文献的讨论仅仅是为了总结其作者所作的论述。不承认任何参考(或任何参考文献的一部分)是相关的现有技术。申请人保留质疑任何引用参考文献的准确性和针对性的权利。

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应当理解，在不脱离本文公开的主题的范围的情况下，可以改变当前公开的主题的各种细节。此外，前面的描述和实施例仅用于说明的目的，而不是为了限制的目的。

Claims

1.荧光微粒和/或纳米颗粒，包含聚合物基质和与其缔合的至少一种卟啉大环。

2.权利要求1的荧光微粒和/或纳米颗粒，其中所述至少一种卟啉大环选自：卟啉(包括17,18-didehydrophorbines)，二氢卟酚(包括phorbines)，菌绿素(包括bacteriophorbines)和异菌绿素(包括含有稠合“E”环的异菌绿素)。

3.权利要求1和2任一的荧光微粒和/或纳米颗粒，其中所述至少一种卟啉大环中的一种或多种具有选自式I和II的结构：

其中：

M是金属或不存在；

X选自Se，NH，CH₂，O和S；和

R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷和R⁸独立地选自：H，烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基烷基，环烷基烯基，环烷基炔基，杂环基，杂环烷基，杂环烯基，杂环炔基，芳基，芳烷基，芳基烯基，芳基炔基，杂芳基，杂芳基烷基，杂芳基烯基，杂芳基炔基，烷氧基，卤素，巯基，叠氮基，氰基，甲酰基，羧酸，羟基，硝基，酰基，芳氧基，烷硫基，氨基，烷基氨基，芳基烷基氨基，二取代氨基，酰氨基，酰氧基，酯，酰胺，次硫酰基(sulfoxyl)，磺酰基，磺酸盐(酯)基，磺酸，磺酰胺，脲，烷氧基酰氨基，氨基酰氧基，连接基团和表面连接基；

K¹，K²，K³和K⁴是独立地选自N，O，S，Se，Te和CH的杂原子；且

S³，S⁴，S⁷，S⁸，S⁹，S¹⁰，S¹¹，S¹²，S¹³和S¹⁴，以及S¹和S⁵，或S²和S⁶独立地选自H，芳基，苯基，环烷基，烷基，烯基，炔基，卤素，烷氧基，烷硫基，全氟烷基，全氟芳基，吡啶基，氰基，硫代氰酰，硝基，氨基，烷基氨基，酰基，次硫酰基(sulfoxyl)，磺酰基，亚氨基，酰氨基和氨基甲酰基；或S⁷和S¹³一起形成＝O。

4.权利要求3的荧光微粒和/或纳米颗粒，其中R¹，R²，R⁵，R⁷和R⁸各自为H；R³和R⁴各自为烷基；且R⁶是任选取代的芳基。

5.权利要求3的荧光微粒和/或纳米颗粒，其中R¹，R²，R⁵，R⁷和R⁸各自为H；R³和R⁴各自为甲基；且R⁶是对甲苯基。

6.权利要求3的荧光微粒和/或纳米颗粒，其中M存在并且选自Pd，Pt，Mg，Zn，Al，Ga，In，Sn，Cu，Ni和Au。

7.权利要求3的荧光微粒和/或纳米颗粒，其中M是Zn或Mg。

8.权利要求3的荧光微粒和/或纳米颗粒，其中K¹，K²，K³和K⁴独立地选自N，O，S和CH。

9.权利要求3的荧光微粒和/或纳米颗粒，其中K¹，K²，K³和K⁴都是N。

10.权利要求3的荧光微粒和/或纳米颗粒，其中S⁴，S⁷，S⁸，S⁹，S¹⁰，S¹¹，S¹²，S¹³和S¹⁴都是烷基。

11.权利要求1-10任一项的荧光微粒和/或纳米颗粒，其中荧光微粒和/或纳米颗粒存在于荧光微粒和/或纳米颗粒群中，且其中：

(i)所述群包含多种不同的荧光微粒和/或纳米颗粒；

(ii)每种不同的荧光微粒和/或纳米颗粒与一种或多种不同的卟啉大环相缔合；和

(iii)每种不同的卟啉大环都有这样的发射波段，其具有小于约25nm的半峰全宽，且与群中任何其他不同的卟啉大环的半峰全宽相隔至少5nm。

12.权利要求1-11任一项的荧光微粒和/或纳米颗粒，其中聚合物基质是聚苯乙烯，任选地其中聚合物基质包含聚苯乙烯珠粒。

13.权利要求1-12任一项的荧光微粒和/或纳米颗粒，其中至少一个卟啉大环通过与荧光微粒和/或纳米颗粒的外部非共价缔合存在，由荧光微粒和/或纳米颗粒包封，或前述两者。

14.包含多种不同的权利要求1-13中任一项的荧光微粒和/或纳米颗粒的群，其中

(i)每种荧光微粒和/或纳米颗粒包含聚合物基质和至少一种卟啉大环；且

(ii)所述群包含至少两种不同的包含不同卟啉大环的荧光微粒和/或纳米颗粒。

15.权利要求14的群，其中每种不同的荧光微粒和/或纳米颗粒与一种或多种不同的卟啉大环缔合；且每种不同的卟啉大环具有这样的发射波段，其具有小于约25nm的半峰全宽，且与群中任何其他不同的卟啉大环的半峰全宽相隔至少5nm。

16.权利要求14或15的群，其中所述群包含至少三种，四种，五种，六种，七种或八种不同的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒。

17.权利要求14-16任一项的群，其中所述聚合物基质包含聚苯乙烯。

18.权利要求14-17任一项的群，其中所述群中的每种不同的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒能够通过单一波长的光和/或约320nm至约450nm的光激发。

19.权利要求14-18任一项的群，其中所述不同的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的至少亚组包括选自以下的卟啉大环：卟啉(包括17,18-didehydrophorbines)，二氢卟酚(包括phorbines)，菌绿素(包括bacteriophorbines)和异菌绿素(包括含有稠合“E”环的异菌绿素)。

20.权利要求14-19任一项的群，其中所述至少一种卟啉大环中的一种或多种具有选自式I和II的结构：

其中：

M是金属或不存在；

X选自Se，NH，CH₂，O和S；且

21.权利要求20的群，其中R¹，R²，R⁵，R⁷和R⁸各自为H；R³和R⁴各自为烷基；且R⁶是任选取代的芳基。

22.权利要求20的群，其中R¹，R²，R⁵，R⁷和R⁸各自为H；R³和R⁴各自为甲基；且R⁶是对甲苯基。

23.权利要求20的群，其中M存在并且选自Pd，Pt，Mg，Zn，Al，Ga，In，Sn，Cu，Ni和Au。

24.权利要求20的群，其中M是Zn或Mg。

25.权利要求20的群，其中K¹，K²，K³和K⁴独立地选自N，O，S和CH。

26.权利要求20的群，其中K¹，K²，K³和K⁴都是N。

27.权利要求20的群，其中S⁴，S⁷，S⁸，S⁹，S¹⁰，S¹¹，S¹²，S¹³和S¹⁴都是烷基。

28.权利要求20的群，其中至少一种卟啉大环中的一个或多种选自：氢化卟啉SE197、SE211、SE420、SE357、SE355、B56、B62、B66及其组合，且其中氢化卟啉SE197、SE211、SE420、SE357、SE355、B56、B62和B66具有以下结构：

29.包含多种不同的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的群，任选地其中每种不同的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒：

(a)通过将至少一种卟啉大环在溶剂中的溶液与包含聚合物基质的微粒的水溶液混合，然后除去溶剂来制备，所述溶剂任选地是四氢呋喃(THF)；和

(b)具有有这样半峰全宽的发射波段，所述半峰全宽(i)小于约25nm，且(ii)与群中任何其他不同的荧光聚合物微粒的发射波段的半峰全宽相隔至少5nm。

30.包含多种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的群，其通过包含以下的方法获得：

(a)制备一种或多种卟啉大环在溶剂中的第一溶液，所述溶剂任选地是四氢呋喃(THF)，和进一步任选地其中第一溶液包含约0.25μg/ml至约20μg/ml的氢化卟啉；

(b)将第一溶液加入包含聚合物微粒和/或纳米颗粒、水和聚合物表面活性剂的第一混合物中，从而提供第二混合物，任选地，其中加入第一溶液以提供包含约33％溶剂的第二混合物和/或其中聚合物微粒和/或纳米颗粒包含聚苯乙烯和/或其中聚合物表面活性剂是聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)嵌段共聚物；

(c)将第二混合物混合一段时间，任选地其中所述一段时间为约15分钟；

(d)从第二混合物中除去溶剂以提供第一荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒，任选地其中所述除去包括离心第二混合物和/或漂洗微粒；

(e)重复步骤(a)-(d)以提供一种或多种另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒，其中所述一种或多种另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种包含与第一荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒或任何其他另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒不同的卟啉大环或卟啉大环混合物；且

(f)将第一荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒与一种或多种另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的至少一种混合，

从而提供包含多种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的群，其中每种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒包含聚合物基质和至少一种卟啉大环，其中当群被光激发时，多种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种可被分别和/或同时检测，任选地其中所述光在约320nm和约450nm之间，并且进一步任选地其中所述光具有单一波长。

31.权利要求14-30任一项的群，其中多种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种具有不同的发射波长，特征为半峰全宽小于约25nm，和/或与任一其他荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的发射波段的半峰全宽相隔至少约5nm。

32.权利要求14-31任一项的群，其中多种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种的发射波段在约590nm和约750nm之间。

33.权利要求14-32任一项的群，其中所述群能够被405nm的光激发。

34.权利要求14-33任一项的群，其中每种荧光微粒和/或纳米颗粒包含聚合物基质和一种卟啉大环。

35.权利要求14-34任一项的群，包含1至5种荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒，其中1至5种荧光微粒和/或纳米颗粒中的每种包含卟啉大环，其选自氢化卟啉SE197、SE211、SE420、SE357、SE355、B56、B62和B66及其组合，并且其中氢化卟啉SE197、SE211、SE420、SE357、SE355、B56、B62和B66具有以下结构：

36.制备用于多重测定中的可分别检测的荧光微粒和/或纳米颗粒的组的方法，所述方法包括：

(a)制备一种或多种卟啉大环在溶剂中的第一溶液，所述溶剂任选地是四氢呋喃(THF)，和进一步任选地其中第一溶液包含约0.25μg/ml至约20μg/ml的一种或多种卟啉大环；

(b)将第一溶液加入包含聚合物微粒和/或纳米颗粒、水和聚合物表面活性剂的第一混合物中，从而提供第二混合物，任选地，其中加入第一溶液以提供包含约33％溶剂的第二混合物和/或其中聚合物微粒和/或纳米颗粒包含聚苯乙烯和/或其中聚合物表面活性剂是聚亚烷基二醇嵌段共聚物；

(d)从第二混合物中除去溶剂以提供第一荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒，任选地其中所述除去包括离心第二混合物和/或用水漂洗微粒和/或纳米颗粒一或多次；和

(e)重复步骤(a)-(d)以提供一种或多种另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒，其中所述一种或多种另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种包含与第一荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒或任何其他另外的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒不同的卟啉大环或卟啉大环混合物，

其中在该组中的荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的吸附波段重叠，且其中该组中荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒中的每种具有不同的发射波段，特征为半峰全宽小于约25nm，和/或与在任一其他荧光聚合物微粒的发射波段的半峰全宽相隔至少约5nm。

37.权利要求36的方法，还包括将一种或多种微粒和/或纳米颗粒缀合至由分子、蛋白质、抗体、抗体片段、核酸和细胞组成的组中的一种。

38.通过权利要求36的方法或权利要求37的方法制备的可分别检测的荧光微粒和/或纳米颗粒的组。

39.权利要求38的可分别检测的荧光微粒和/或纳米颗粒的组在用于校准流式细胞仪的方法中的用途。

40.与颗粒缀合的包含卟啉大环的二合体(dyad)，任选地所述颗粒是微粒和/或纳米颗粒，进一步任选地其中所述微粒和/或纳米颗粒为珠粒。

41.权利要求40的包含卟啉大环的二合体，其中所述珠粒是聚苯乙烯珠粒。

42.权利要求40和41之一的包含卟啉大环的二合体，其中所述珠粒还包含多种不同的包含卟啉大环的二合体，使得所述珠粒包含至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的荧光分子。

43.权利要求40-42之一的包含卟啉大环的二合体，其中第一荧光分子包含二氢卟酚，且第二荧光分子包含菌绿素，并且其中在用紫光激发时，二合体发射红光和近红外光。

44.权利要求40-43之一的包含卟啉大环的二合体，其中第二荧光分子包括荧光共振能量转移(FRET)供体，并且其中FRET供体的特征在于发射光谱与第一荧光分子的最大发射重叠。

45.权利要求40-44之一的包含卟啉大环的二合体在多激光流式细胞仪的校准、共焦荧光显微镜的对准和/或校准、或细胞和/或其他生物分子的差异标记中的用途。

46.权利要求45的用途，其中其它生物分子为抗体和/或其含有互补位的片段或衍生物。

47.荧光微粒和/或纳米颗粒的群用于差异标记多壁板的孔的用途，方法包括用不同的荧光微粒和/或纳米颗粒涂覆多壁板的多个孔中的每一个，使得基于源自本文特定荧光微粒和/或纳米颗粒的激发光谱，涂覆的孔可以彼此区分。

48.荧光聚合物微粒和/或纳米颗粒的群用于差异标记细胞的用途，方法包括将不同的荧光微粒和/或纳米颗粒引入细胞中，使得基于源自本文特定荧光微粒和/或纳米颗粒的激发光谱，单个细胞可以彼此区分。

49.与权利要求1-13任一项的荧光微粒和/或纳米颗粒和/或与权利要求40-44任一项的包含卟啉大环的二合体共价缀合的抗体或其片段或衍生物。

50.权利要求49的抗体或其片段或衍生物，其中所述卟啉大环选自卟啉大环SE197、SE211、SE420、SE357、SE355、B56、B62、B66和/或其任意组合，和/或权利要求40-44任一项的包含卟啉大环的二合体，包含至少一种选自卟啉大环SE197、SE211、SE420、SE357、SE355、B56、B62和B66，和/或其任意组合的卟啉大环。