CN118480059A - Tadf-稀土配合物体系、纳米微球、稀土发光试剂、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种TADF‑稀土配合物体系、纳米微球、稀土发光试剂、其制备方法和应用，TADF‑稀土配合物体系中TADF和稀土配合物之间物理混合或者以配位键连接，TADF‑稀土配合物体系的吸收波长为400～800nm。本发明将稀土发光试剂的激发波长调谐至可见光波长范围内，消除背景干扰，从而提高可见光激发检测结果的稳定性和准确性。

Description

TADF-稀土配合物体系、纳米微球、稀土发光试剂、其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及光学材料技术领域，具体地，涉及一种TADF-稀土配合物体系、纳米微球、稀土发光试剂、其制备方法和应用。
背景技术
在现有的免疫诊断领域，化学发光免疫检测因其高灵敏度、宽线性动态范围和良好的特异性等优点，在临床诊断中占据着举足轻重的地位。该技术通过检测特定化学反应产生的发光信号来定量分析各种生物标志物，从而提供关于疾病诊断和治疗监测的重要信息。然而，尽管化学发光免疫检测具有多项优势，但它在实际操作中仍面临一些技术挑战和局限性。
目前常见的问题包括背景干扰的影响，特别是由于使用了增白剂或荧光粉等物质，它们在紫外光激发下可能产生与待测信号相似的发光。这不仅对检测精度造成威胁，而且会使结果的可靠性受到质疑。荧光增白剂通常用于提高反应膜或检测卡的亮度和白度，但其产生的蓝光或蓝紫色光会与检测信号混合，造成信号解析上的干扰。此外，随着光源曝光时间的延长，增白剂的效力可能衰减，导致检测信号的不稳定性，这对于确保长期稳定的检测性能来说是不利的。
因此，亟需一种新型的发光免疫检测试剂，以有效减少或消除背景干扰，提供更为稳定和可靠的检测结果。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种TADF-稀土配合物体系、纳米微球、稀土发光试剂、其制备方法和应用，该试剂能够在不牺牲检测灵敏度和特异性的前提下，减少背景干扰，提高检测信号的稳定性，适用于发光成像、免疫检测、质量控制等多个领域。
根据本发明的第一方面，提供一种TADF-稀土配合物体系，所述TADF-稀土配合物体系中TADF和稀土配合物之间物理混合或者以配位键连接，所述TADF-稀土配合物体系的吸收波长为400～800nm。
TADF(Thermally Activated Delayed Fluorescence，热激发延迟荧光材料)是一种荧光机制，其中分子通过热能激活的过程从三重态到单重态的转变来发射光。TADF材料的特点是它们可以有效地利用激发态的三重态能量来发射光，从而显著提高发光效率。当与稀土元素结合时，这种体系可能会产生特定的发光特性，如尖锐的发射峰和长的发光寿命，这些特性对于减少背景噪声和提高信号与噪声比(SNR)都是有益的。在这种免疫检测试剂中，TADF-稀土体系的吸收波长为400～800nm意味着它能够吸收可见光中的蓝光及更长波长的光。这种特性对于减少背景干扰特别有益，尤其是在存在荧光增白剂时，这些增白剂往往在紫外光下会产生蓝色光发射，而TADF-稀土体系则可以避免受这些波长的光激发。通过选择合适的TADF分子和稀土元素，可以调整体系的发光波长和光谱特性，以适应不同的检测要求。这样的免疫检测试剂在提高检测灵敏度、减少背景干扰以及提供稳定的信号输出方面都具有潜在的优势，使其在临床诊断、生物分析和其他相关应用中具有广泛的应用前景。
TADF和稀土配合物之间存在分子间传能或者分子内传能。当TADF和稀土配合物之间物理混合时，TADF和稀土配合物之间为分子间传能，TADF和稀土配合物之间存在分子共轭效应和/或分子共振效应。TADF材料和稀土配合物之间的分子共轭效应是指分子的π电子系统通过空间接近(限制在纳米球中)实现能量或电子的交换；TADF分子通过其延迟荧光特性，可以将激发态的能量维持较长时间，在这期间，如果TADF分子的π电子系统与稀土配合物的局部电子系统能够相互作用，就可能发生能量的传递。这种π-π堆叠或相互作用可以促进能量从TADF分子转移到稀土配合物，实现高效的能量传递机制。分子共振效应是指分子间通过电磁波的共振来传递能量的一种方式。在TADF和稀土配合物的体系中，TADF分子在激发态下，其电子能级与稀土配合物的某些能级之间可能发生共振。这种共振可以促进能量的有效传递，因为当两个系统的能级匹配时，能量转移的效率会显著提高。共振效应依赖于两种分子之间能级差的匹配程度，以及它们之间距离的适宜性。当TADF和稀土配合物之间以配位键连接时，TADF和稀土配合物之间存在分子内传能。
可选地，稀土配合物可以是镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钪(Sc)、钇(Y)的化合物。由于稀土原子具有特殊的结构，且电子能级丰富，其表现出独特的光学性质。首先，稀土元素的电子层结构使其化合物具有多种荧光特性，由于稀土元素的4f电子可在7个4f轨道间任意分布，从而产生丰富的电子能级，可吸收和发射从紫外光、可见光到近红外区各个波段的光。其次，稀土元素由于4f电子处于内层轨道，受外层S和P轨道的有效屏蔽，受到外部环境的干扰较小，所以4f能级差较小，发光呈现出尖锐的线状光谱。最后，由于4f电子能级之间的自发跃迁概率较小，造成稀土元素的电子能级激发态平均给寿命较长，其发射光的寿命较长，因此可广泛用于检测分析。而稀土离子本身的光吸收能力较弱，其摩尔吸收吸光系数为1M-1cm-1，导致直接激发稀土离子本身的发光效率较低，因此引入其他介质来敏化稀土离子发光，一般而言有机配体在紫外光区有较强的吸收，其与稀土发光离子形成配合物后能有效地将激发态能量通过无辐射跃迁转移的方式将能量转移到中心离子的发射态，从而敏化稀土离子发光。由于传统的稀土配合物需要紫外光进行激发，这样用在免疫层析中就会产生很强的背景荧光，而TADF和稀土配合物之间，TADF几乎不会改变稀土配合物的特征发射峰，但是TADF会改变稀土配合物的吸收波长，导致其吸收波长红移至可见光区，这样在免疫层析检测时，只需要用可见光来激发即可，因而不会产生背景荧光。
TADF和稀土配合物的相互作用可以分为两种类型：分子间传能和分子内传能。分子间传能涉及TADF分子和稀土配合物之间的非键合相互作用。在这种情况下，TADF作为能量的供体，它在激发后可以通过分子共轭效应和/或分子共振效应将能量传递到稀土配合物。这些效应通常涉及电子的跃迁和分子轨道的相互作用。分子共轭效应可能涉及π-π相互作用，而共振效应则可能涉及磁偶极或电偶极之间的相互作用。分子共轭效应可以增强分子间传能的效率，因为它能够通过扩展共振结构稳定能量的供体和受体状态。分子共振效应则可以通过能量匹配来促进能量的有效传递。在分子内传能的机制中，TADF分子和稀土配合物通过配位键直接相连，这意味着能量传递过程是在一个复合分子内部发生的。配位键的形成使得能量传递过程可以更加高效，因为配位键提供了一个稳定的通道，使得从TADF到稀土中心的能量转移变得更加迅速和直接。这种能量传递的过程通常用于提高免疫检测试剂的灵敏度和特异性，使得它们能够在低浓度的生物标志物存在时也能发出足够的信号。在设计上，这样的TADF-稀土配合物系统可以高度定制，以适应特定的光谱特性和生物检测需求。
可选地，所述TADF-稀土配合物体系为TADF-镧系配合物。
镧系配合物指的是镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)的配合物。由于镧系金属离子均具有独特的跃迁能级，特殊的4f-4f能级的跃迁禁阻使其发射光谱表现出狭窄、尖锐的谱带，其半峰宽通常小于10nm，因此产生的单个峰容易区分，发光光谱具有特异性，同时具有相对较长的发光寿命，但是其跃迁禁阻也使其电子跃迁几率较小，表现出较低的吸光效率以及较差的发光强度，因此需要敏化镧系元素发光，而设计镧系配合物兼具无机化合物良好的稳定性和有机化合物高量子产率的特点，这样可以提高免疫检测试剂的能量的转移效率、量子产率、光稳定性。
可选地，所述TADF-稀土配合物体系为TADF-铕配合物。
通常的铕配合物尽管可获得较高的发光量子产率，且其特征发射为红光，但是其激发波长通常位于紫外光区域，这些紫外光会对检测样本造成损坏。而TADF-铕配合物将激发波长红移至可见光区域，既增加了稳定性，也减少了背景荧光的干扰甚至无背景荧光的干扰。
可选地，所述TADF-铕配合物选自如下结构中的任意一种：
可选地，所述TADF包括二氰基苯咔唑类化合物、均三嗪类化合物、螺旋类化合物、二苯基砜类化合物、1,4-二氮杂菲类化合物和唑类化合物中的任意一种。
其中，二氰基苯咔唑类化合物平面具有较大的二面角，HOMO和LUMO分别分布在咔唑基团和二氰基苯上，氰基基团抑制了化合物的非辐射跃迁和激发态构型的改变，HOMO和LUMO在中间的苯环有适度重叠，使得化合物具有较高的发光效率。均三嗪类化合物具有较强的吸电子能力，可用作受体基团，且可在其2、4、6位进行不同取代基的修饰，增加了分子设计的多样性，其给体基团可以是咔唑及其衍生物、吩恶嗪、吩噻嗪、三芳胺等。螺旋类化合物的螺环结构可将给电子基团和受电子基团正交连接到π-共轭体系，降低HOMO和LUMO的空间重叠，进而可以降低能级差。二苯基砜类化合物考虑到给电子基团和受电子基团的π共轭程度及氧化还原电位，同时打断给受体基团之间的共轭。1,4-二氮杂菲类化合物包含3个稠合的苯环和氮杂环，因而具有较大的共轭面积和吸电子能力。唑类化合物由于具有较强的吸电子能力，可以通过改变中心原子实现对化合物的光色调节，且随着中心原子的原子序数增加(N、O、S)，化合物的共轭程度增加，荧光光谱发生红移。
可选地，所述TADF选自如下结构中的任意一种：
可选地，所述TADF-稀土配合物体系中TADF与稀土配合物的摩尔比为50:1～1:1。经过研究发现，在该摩尔比范围内，TADF-稀土配合物体系在可见光范围内存在较好的吸收，使得其激发波长红移至可见光区。
可选地，所述TADF-稀土配合物体系中TADF与稀土配合物的摩尔比为5:1～1:1。经过研究发现，在该摩尔比范围内，TADF-稀土配合物体系在可见光区激发的同时，TADF-稀土配合物体系中稀土配合物的荧光发射峰强度更好，发光更亮。
在光学检测系统中，能够在可见光区域进行激发和检测的材料具有诸多优势：可见光源比紫外光源更安全，更易于操作，更便宜；可见光激发与常规生物检测设备和荧光显微镜兼容性更好；紫外激发容易引起生物组织和塑料容器的自发荧光，使用可见光可以减少这种背景干扰；相比于紫外光，可见光对生物样本的损害小，可以减少样本退化或荧光标记的光漂白。因此，将TADF与稀土配合物以特定摩尔比混合使用，可以调整和优化光学特性，确保能量转移效率最大化。红移至可见光区的激发波长不仅是为了提升测试剂的应用安全性和方便性，也是为了增强其光化学稳定性和检测的灵敏度。
根据本发明的第二方面，提供一种TADF-稀土配合物纳米微球的制备方法，所述方法包括：
将纳米微球在溶胀剂中加热溶胀，形成溶胀的纳米微球；
将上述的TADF-稀土配合物体系与所述溶胀的纳米微球混合，形成混合溶液；优选地，采用超声方式，以使溶液混合均匀；
将所述混合溶液注入去离子水中，升温搅拌，再旋蒸浓缩过滤，得到TADF-稀土配合物纳米微球，即包覆有TADF-稀土配合物的纳米微球。
TADF和稀土配合物之间以配位键连接时由于分子间距离本来近，因此存在传能，而TADF和稀土配合物混合时，在纳米粒子的微环境内进行传能。上述方法所制备的TADF-稀土配合物纳米微球的粒径为50nm～500nm。
可选地，所述纳米微球为聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、硅微球和蛋白质微球中的任意一种。
可选地，所述纳米微球表面含有环氧基、羧基、氨基、醛基、羟基和酰胺基中的至少一种。
优选地，采用的纳米微球为羧基聚苯乙烯纳米微球，羧基聚苯乙烯提供亲水性的羧基，在水溶液中分散性更好。
优选地，采用的纳米微球为聚苯乙烯聚乙二醇羧基纳米微球，可以理解为聚苯乙烯固载聚乙二醇偶联羧基。
可选地，所述溶胀剂为正己烷、四氯化碳、二噁烷、四氢呋喃、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、环己烷、甲苯、氯仿、大豆油、甲醇、水、二甲苯和三甲苯中的至少一种。这些溶剂的极性较大，作为溶胀剂效果较好。
可选地，所述溶胀剂为正己烷、四氯化碳、甲苯、二噁烷、乙醚、大豆油和氯仿中的至少一种。
在本发明的技术方案中，优选采用聚苯乙烯微球及其功能化分子(如羧基聚苯乙烯纳米微球、聚苯乙烯聚乙二醇羧基纳米微球)作为载体，因为其提供了良好的化学稳定性、易于功能化的表面以及优良的分散性。特别是羧基和聚乙二醇偶联羧基的引入，不仅增加了纳米微球的亲水性，使其在水溶液中的分散性更好，而且可以提供更多的活性位点，便于TADF-稀土配合物的有效负载。通过以上步骤，可以制备出粒径在50～500nm之间的TADF-稀土配合物纳米微球，该尺寸范围适用于发光成像、免疫检测、质量控制领域。
根据本发明的第三方面，提供一种TADF-稀土配合物纳米微球，所述TADF-稀土配合物纳米微球利用上述的方法制备得到。
根据本发明的第四方面，提供一种稀土发光试剂的制备方法，所述方法包括：
提供上述的TADF-稀土配合物纳米微球；
将所述TADF-稀土配合物纳米微球离心复溶到BBS(硼酸盐)缓冲液中，并超声分散；
向分散后的体系中加入EDC(二氯乙烷)和NHSS(N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐)，反应结束后离心，再向其中加入捕获抗体，离心洗涤，得到稀土发光试剂，TADF和稀土配合物以一定的比例物理混合包被在纳米微球中。
根据本发明的第五方面，提供一种稀土发光试剂的制备方法，所述方法包括：
取TADF和稀土配合物分散于溶剂中，形成有机相；
将纳米微球复溶到去离子水中超声，形成纳米微球水溶液，向纳米微球水溶液中加入十二烷基苯磺酸钠(SDBS)和乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚醚，搅拌得到溶液A；
将所述有机相迅速加入所述溶液A中，然后逐渐升温至35～60℃，如50℃，搅拌后离心除去多余的TADF-稀土配合物，清洗后得到稀土发光试剂，TADF和稀土配合物以共价键形成的大分子结构包被在纳米微球中。将稀土发光试剂保存在去离子水中，避光放于常温下备用。
优选地，纳米微球为为聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、硅微球和蛋白质微球中的任意一种。
可选地，所述纳米微球表面含有环氧基、羧基、氨基、醛基、羟基和酰胺基中的至少一种。
优选地，采用的纳米微球为羧基聚苯乙烯纳米微球，羧基聚苯乙烯提供亲水性的羧基，在水溶液中分散性更好。
优选地，采用的纳米微球为聚苯乙烯聚乙二醇羧基纳米微球，可以理解为聚苯乙烯固载聚乙二醇偶联羧基。
十二烷基苯磺酸钠作为一种阴离子表面活性剂，可以降低界面张力，促进TADF和稀土配合物在水溶液中更好地分散。通过减少水与有机相之间的界面张力，十二烷基苯磺酸钠促进了有机相中的分散物质向水溶液中的转移，从而有利于纳米微球对TADF-稀土配合物的包裹和稳定。此外，十二烷基苯磺酸钠还有助于形成更为均匀和稳定的乳液体系，提高最终产品的质量和一致性。乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚醚作为一种非离子型表面活性剂，能够提高体系的稳定性和TADF-稀土配合物的包裹效率。该嵌段聚醚能够通过其亲水部分与水相互作用，同时其疏水部分与有机相中的TADF-稀土配合物相互作用，从而在纳米微球的表面形成稳定的保护层，有助于防止纳米微球的凝聚和沉降，确保了稀土发光试剂的均一性和长期稳定性。十二烷基苯磺酸钠通过降低界面张力促进了有机相物质的分散，而乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚醚则通过形成稳定的保护层来提高纳米微球的包裹效率和最终产品的稳定性。这两种物质的联合使用可以确保TADF和稀土配合物能够有效且均匀地包裹在纳米微球内部，从而得到高质量的稀土发光试剂。优选地，十二烷基苯磺酸钠的质量浓度为20％，乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚醚的质量浓度为10％。
优选地，用去离子水和乙醇清洗两次。
本发明通过在稀土配合物中引入TADF分子，TADF和稀土配合物之间物理混合或者以配位键连接，形成TADF-稀土配合物，利用该TADF-稀土配合物形成的TADF-稀土配合物纳米微球，制成稀土发光试剂，将稀土发光试剂的激发波长调谐至可见光波长范围内以消除背景干扰，且可见光激发检测结果更稳定。
根据本发明的第六方面，提供一种上述方法制备得到的稀土发光试剂的应用，将所述检测试剂用于发光成像、免疫检测和质量控制领域中的任意一种。
进一步地，所述稀土发光试剂在发光成像领域应用的形态为纳米微球，在免疫检测领域应用的形态为纳米微球，在质量控制领域应用的形态为纳米微球、薄膜和玻璃中的任意一种。
进一步地，所述免疫检测包括免疫层析检测、病理检测和均相检测中的任意一种。
在免疫层析中，这些经过表面修饰的TADF-稀土配合物纳米微球可以被用作荧光探针，与抗体或其他生物识别分子共轭，用于特异性检测特定的抗原或抗体。由于TADF-稀土配合物具有较长的寿命和较高的量子产率，因此相比传统有机染料，这种配合物可以提供更亮的信号和更高的检测灵敏度，尤其适用于要求高灵敏度和精确性的免疫检测。
为了使TADF-稀土配合物能够特异性地靶向并标记生物结构，需要通过表面修饰或共价结合引入特定的生物识别分子(如抗体、肽段或寡核苷酸等)。首先选择所需观察的生物样本，如细胞、组织切片或活体动物模型，然后将功能化的TADF-稀土配合物与生物样本孵育，允许其与特定的生物分子或结构特异性结合，再后使用合适的成像设备(如荧光显微镜、共聚焦显微镜或活体成像系统)观察和记录标记后的样本。TADF-稀土配合物的独特光谱特性允许其在特定的激发和发射波长下进行高对比度、低背景的成像。最后对获得的图像数据进行分析，以了解生物标记的分布、动态变化或与生物学过程的相关性。
在生物成像中，TADF-稀土配合物具有高量子产率和长寿命荧光，使得成像信号亮度高，便于捕捉细微的生物结构和过程，稀土元素的长寿命荧光特性使得这种探针适用于长时间的生物过程跟踪和动态成像。通过选择不同稀土元素的TADF-稀土配合物，可以实现多色成像，用于同时标记和观察多个生物目标，通过合理的设计和表面修饰，TADF-稀土配合物可以具备良好的生物相容性和低毒性，适合长期或活体成像应用。因此，TADF-稀土配合物在生物成像领域的应用，提供了一种新型的高性能荧光探针，特别适合于高分辨率、长时间和多参数的生物成像研究。
在质量控制中，首先，从生产线上获取需要检测的样品，将TADF-稀土配合物加入到样品中或将样品浸泡在探针溶液中，使其与目标物质发生反应或结合。然后，使用适合的激发光源激发TADF-稀土配合物，并利用光谱仪或荧光检测器收集其荧光发射信号。通过探针的荧光强度变化来定量分析样品中目标物质的含量。最后，对获得的荧光数据进行分析，通过比较控制样品和测试样品的荧光强度差异，评估产品中目标物质的含量是否符合质量标准。
在上述方案中，TADF-稀土配合物具有高量子效率和长荧光寿命，使得即使在非常低的浓度下也能被检测到，适用于对痕量物质的敏感检测。通过分子设计，TADF-稀土配合物可以特异性地与目标物质反应，降低背景干扰，提高检测的准确性。荧光检测方法是非破坏性的，不会对样品造成损害，适用于连续监控和在线质量控制。配合物的快速反应性和荧光信号的即时读出允许实时监测生产过程，从而能够及时发现和调整质量问题。
与现有技术相比，本发明具有如下至少之一的有益效果：
本发明通过在稀土配合物中引入TADF分子，TADF和稀土配合物之间物理混合或者以配位键连接，形成TADF-稀土配合物，TADF-稀土配合物中TADF和稀土配合物之间存在分子间传能或者分子内传能，可以使得其吸收波长红移至可见光区，利用该TADF-稀土配合物形成的TADF-稀土配合物纳米微球，制成稀土发光试剂，应用于发光成像、免疫检测和质量控制等领域中，可以将激发波长调谐至可见光波长范围内，并降低背景荧光信号甚至无背景荧光信号，从而提高检测结果的稳定性和准确性。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是现有技术中的检测卡在紫外光照射下的拍摄图；
图2是本发明实施例中的Eu(TTA)3、Cz-PyTrz-Eu(TTA)3、tBuCz-PyTrz-Eu(TTA)3的吸收光谱图；
图3是本发明实施例中的Eu(TTA)3、Cz-PyTrz-Eu(TTA)3、tBuCz-PyTrz-Eu(TTA)3的荧光发射光谱图；
图4是本发明实施例中的Cz-PyTrz-Eu(TTA)3包被后的纳米微球电镜图；
图5是本发明实施例中检测卡分别用紫外光365nm激发和可见光激发的背景信号图；
图6是本发明实施例中TADF和稀土配合物摩尔比不同时的荧光强度图；
图7是本发明实施例在不同溶剂中DPA-DCPP-Eu(TTA)3Phen用作检测试剂的发光图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
在本申请中，术语“TADF(thermally activated delayed fluorescence)”为热活性型延迟荧光材料，该材料可以将三重态激子反系间跨越(RISC)到单重态能级而发出延迟荧光，理论上内部量子效率可达100％。
在本申请中，术语“红移”是指取代基或溶剂效应引起吸收带向长波长方向移动。
在本申请中，提及紫外波段的波长范围一般为200～400nm，提及可见光的波长范围一般为400～800nm。
在申请中，“免疫层析”是一种基于免疫学原理，利用抗原和抗体之间的特异性结合反应进行物质定性或定量分析的技术。
在申请中，“生物成像”是一种用于观察和分析生命体内部结构、功能以及生物过程的技术手段。它涵盖从分子和细胞级别到器官和整个生物体级别的各种成像技术，包括但不限于显微成像、分子成像、功能成像、体内成像等。
在申请中，“质量控制”指的是一系列旨在确保体外诊断试剂和设备在生产、存储、运输和使用过程中保持其预期性能的过程和措施。这些措施包括但不限于检测产品的稳定性、准确性、特异性和灵敏度，以及确保产品在整个有效期内的一致性和可靠性。
在本申请中，除非特别相反地说明，否则某部分“包括”某些构成要素的描述意指还能够包括其他构成要素，并且不排除其他构成要素。
在本申请中，在马库什型表达中包括的术语“其组合”意指选自马库什型表达中描述的构成要素中的一者或更多者的混合或组合，并且意指包括选自所述构成要素中的一者或更多者。
在本申请的结构式中，Ph意指苯基，Me意指甲基。
根据本申请的一个实施方案的化合物可以使用稍后描述的制备方法来制备。
为了便于实施例的阐述，将分子结构式与简式列出，参见下表1：
表1分子结构式与简式列表
免疫层析检测已经广泛用于肿瘤标志物、感染性疾病、内分泌及代谢性疾病、心血管疾病、免疫功能、自身免疫性疾病相关抗体等的检测，因此具有广阔的应用市场，同时对免疫层析检测也提出了更高的要求，例如检测的灵敏度、准确度、线性范围、特异性等，而目前对于免疫层析检测而言，还存在一个重要问题，就是检测卡的反应膜上存在一些增白剂或者荧光粉，在紫外光的激发下，会产生很多背景信号，参见图1，图1中检测区和加样区相比，存在很严重的蓝光或者蓝紫光，而免疫层析主要是通过特定能量的化学反应产生发光的现象，采用激发光源照射检测区，并捕捉检测区的荧光信号，将其和光信号-浓度的标准曲线对应，从而获得待测物的浓度，而检测区产生蓝色或者蓝紫色的背景信号，这就会严重干扰检测的结果。基于此，本发明提出了一种新型的免疫检测试剂，该检测试剂无需用紫外光激发，从而避免了该背景信号的干扰。
实施例1
Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)用作免疫层析检测试剂
首先，将Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)溶于甲苯溶液中，将溶液混合均匀，配置成浓度为10μM的Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)荧光染料溶液，取50μL于石英比色皿中，使用紫外-可见分光光度计测定待测染料在甲苯溶液中的吸收光谱，参见图2，Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)除了在345～365nm附近存在一个较宽的共轭吸收峰外，在400～450nm之间也存在一定程度的吸收，而该处的吸收峰位于可见光范围内，然后以该吸收光谱测得的最大吸收波长作为激发波长，使用荧光仪在稳态荧光模式下测定Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)在甲苯中的荧光发射光谱，参见图3，可以看出Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)的发射峰还是主要表现为Eu的特征发射峰，波长在620nm附近。
继而，将Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)染料、聚苯乙烯微球和四氢呋喃的混合物进行超声处理，得到澄清溶液，混合物快速注入5mL去离子水，在通风橱中升温至50℃搅拌2h，然后旋蒸浓缩，将溶液通过膜过滤器过滤，制备得到包被的Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)染料纳米粒子，保存在4℃以下备用，扫描电镜下制备的纳米粒子如图4所示，可以看出包被后的粒子在纳米尺度范围内。
再次，将上述方法制备得到的包有Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)的纳米粒子离心，复溶到pH 7.4的BBS缓冲液中，超声分散，得到分散体系，再向该分散体系中分别加入EDC和NHSS，室温下反应2h，反应结束后，离心洗涤，复溶到10mL pH 7.4的BBS缓冲液中，向其中加入5mg捕获抗体，室温下反应4h，反应结束后，离心洗涤，复溶到10mLpH 7.4的BBS缓冲液中，向其中加入100mg BSA，室温下反应2h；反应结束后，离心洗涤，复溶到pH 7.4的BBS缓冲液中，4℃保存备用。
最后，使用PBS缓冲液(添加有1％BSA，1％蔗糖，50mM NaCl和0.5％TWEEN 20)分别将PCT抗原的MALB抗体和羊抗鸡lgY分别以1mg/mL和1mg/mL的浓度且以8mm的间隔，用划膜仪划于硝酸纤维素膜上，放于37℃过夜烘干。再取制备好的荧光探针，离心处理，用喷膜缓冲液(1％BSA，1％蔗糖)复溶为16.5mg/mL，通过喷膜仪将荧光探针以1.2μL/cm的速度喷于玻璃纤维上，并于37℃烘烤过夜。在白色PVC底板上依次相互交错3mm地贴上前面制备的样品垫及制备的NC膜(划有MALB抗体的T线和羊抗鸡lgY的C线)，最后贴上吸水纸，接着将组装好的层析板通过高速斩切机切割成3.8mm宽的试纸条，然后再用配套的上下两个塑料卡壳固定试纸条，即得到免疫层析试纸条。
对上述免疫层析试纸条以该吸收光谱测得的最大吸收波长400nm作为激发波长进行激发，收集背景信号，参见图5，从图中可以看出，以Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)的纳米粒子作为检测试剂的背景信号低于80，意味着Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)的纳米粒子作为检测试剂背景信号几乎只剩下激发光源的光束由于本身的散射等原因引起极微弱的信号，这对检测结果及准确度的影响极小。
对比例1
Eu(TTA)3用作免疫层析检测试剂
本对比例中的吸收光谱检测方法、荧光光谱测定方法、背景信号检测方法、Eu(TTA)3的包被方法、以及其用作免疫检测试剂的处理方法同实施例1，只是将实施例1中的Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)替换成Eu(TTA)3，结果得知，其吸收波长在350nm，单独的Eu(TTA)3染料在可见光范围几乎没有吸收，这与实施例1中的Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)形成对比，因此Eu(TTA)3用作检测试剂时只能在紫外光范围激发，而无法使用可见光范围的波长进行激发，其发射波长在615nm附近，其荧光强度比Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)的纳米粒子的大，这可能是由于溶剂效应引起的，同时检测的背景信号值比Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)高，参见图5，其背景信号值基本在300以上。
实施例2
Eu(TTA)3(tBuCz-Me-PyTrz)用作免疫层析检测试剂
本实施例中的吸收光谱检测方法、荧光光谱测定方法、背景信号检测方法、Eu(TTA)3(tBuCz-Me-PyTrz)的包被方法、以及其用作免疫检测试剂的处理方法同实施例1，只是将实施例1中的Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)替换成Eu(TTA)3(tBuCz-Me-PyTrz)，参考图2，结果得知，其吸收波长在430nm，这也与对比例1中的Eu(TTA)3形成对比，同时检测Eu(TTA)3(tBuCz-Me-PyTrz)用作免疫层析检测试剂的背景信号值为55。
上述实施例1-实施例2中TADF和稀土Eu配合物之间主要是以配位键的形式结合，在原本的稀土配合物中引入给体和受体基团，减少分子的最高占有分子轨道(the highestoccupied molecular orbital,HOMO)与最低未占有分子轨道(the lowest unoccupiedmolecular orbital,LUMO)的重叠，同时TADF分子内受体和供体片段之间发生分子内电荷转移，导致吸收波长的红移。
为了研究TADF分子和稀土Eu配合物之间物理混合并限定在纳米空间内对吸收波长的影响，下面以部分TADF分子为例，以Eu(TTA)3Phen为稀土配合物，研究不同比例混合对其性能的影响。
实施例3
4CzIPN-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的吸收光谱检测方法、荧光光谱测定方法、背景信号检测方法、4CzIPN-Eu(TTA)3Phen的包被方法、以及其用作免疫检测试剂的处理方法同实施例1，只是将实施例1中的Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)替换成4CzIPN-Eu(TTA)3Phen，不同的是实施例1中的TADF和稀土配合物之间形成的分子内配位键，本实施例中的是物理混合，4CzIPN和Eu(TTA)3Phen之间的摩尔比为1:1，结果得知，其吸收波长在450nm附近，这也与对比例1中的Eu(TTA)3形成对比，其荧光强度为7×105，同时检测4CzIPN-Eu(TTA)3Phen(1:1)用作免疫层析检测试剂的背景信号值为35。
实施例4
4CzIPN-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例3，不同的是将4CzIPN和Eu(TTA)3Phen的摩尔比由1:1换成2:1。结果得知，其吸收波长在450nm附近，这也与对比例1中的Eu(TTA)3形成对比，其荧光强度为6.5×105，同时检测4CzIPN-Eu(TTA)3Phen(2:1)用作免疫层析检测试剂的背景信号值为42。
实施例5
4CzIPN-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例3，不同的是将4CzIPN和Eu(TTA)3Phen的摩尔比由1:1换成3:1。结果得知，其吸收波长在450nm附近，这也与对比例1中的Eu(TTA)3形成对比，其荧光强度为6×105，同时检测4CzIPN-Eu(TTA)3Phen(3:1)用作免疫层析检测试剂的背景信号值为38。
实施例6
4CzIPN-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例3，不同的是将4CzIPN和Eu(TTA)3Phen的摩尔比由1:1换成5:1。结果得知，其吸收波长在450nm附近，这也与对比例1中的Eu(TTA)3形成对比，其荧光强度为5.7×105，同时检测4CzIPN-Eu(TTA)3Phen(5:1)用作免疫层析检测试剂的背景信号值为42。
实施例7
4CzIPN-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例3，不同的是将4CzIPN和Eu(TTA)3Phen的摩尔比由1:1换成10:1。结果得知，其吸收波长在450nm附近，这也与对比例1中的Eu(TTA)3形成对比，其荧光强度为4.5×105，同时检测4CzIPN-Eu(TTA)3Phen(10:1)用作免疫层析检测试剂的背景信号值为55。
实施例8
4CzIPN-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例3，不同的是将4CzIPN和Eu(TTA)3Phen的摩尔比由1:1换成20:1。结果得知，其吸收波长在450nm附近，这也与对比例1中的Eu(TTA)3形成对比，其荧光强度为4.0×105，同时检测4CzIPN-Eu(TTA)3Phen(20:1)用作免疫层析检测试剂的背景信号值为47。
实施例9
4CzIPN-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例3，不同的是将4CzIPN和Eu(TTA)3Phen的摩尔比由1:1换成30:1。结果得知，其吸收波长在450nm附近，这也与对比例1中的Eu(TTA)3形成对比，其荧光强度为3.0×105，同时检测4CzIPN-Eu(TTA)3Phen(30:1)用作免疫层析检测试剂的背景信号值为65。
实施例10
4CzIPN-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例3，不同的是将4CzIPN和Eu(TTA)3Phen的摩尔比由1:1换成50:1。结果得知，其吸收波长在450nm附近，这也与对比例1中的Eu(TTA)3形成对比，其荧光强度为2.0×105，同时检测4CzIPN-Eu(TTA)3Phen(50:1)用作免疫层析检测试剂的背景信号值为58。
以上结果表明，当4CzIPN与Eu(TTA)3Phen以不同的比例混合时，会影响稀土配合物的发射峰强度，从而影响4CzIPN-Eu(TTA)3Phen的荧光强度，参照图6，这与通常不同的是，并不是TADF的比例越高越高，而是二者的摩尔比在1:1时荧光强度最佳。
为了验证其他TADF分子也有相同的吸收波长红移的技术效果，以下对不同的TADF分子和Eu(TTA)3Phen混合时进行探究。
实施例11
4CzPN-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例3，TADF分子和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1，所不同的是将4CzIPN换成4CzPN，4CzPN和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1。结果得知，其吸收波长在415nm附近，同时检测4CzPN-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂的背景信号值为60。
实施例12
5CzPN-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例11，所不同的是将4CzPN换成5CzPN，5CzPN和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1。结果得知，其吸收波长在418nm附近，同时检测5CzPN-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂的背景信号值为67。
实施例13
TCTA-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例11，所不同的是将4CzPN换成TCTA，TCTA和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1。结果得知，其吸收波长在435nm附近，同时检测TCTA-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂的背景信号值为76。
实施例14
4CzIPN-tBu-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例11，4CzIPN-tBu和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1，所不同的是将4CzPN换成4CzIPN-tBu。结果得知，其吸收波长在410nm附近，同时检测4CzIPN-tBu-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂的背景信号值为73。
实施例15
DtBuCzB-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例11，DtBuCzB和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1，所不同的是将4CzPN换成DtBuCzB。结果得知，其吸收波长在418nm附近，同时检测DtBuCzB-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂的背景信号值为68。
以上不同的TADF分子和稀土Eu配合物混合，都可以使得吸收波长红移至可见光区，因此对于用在免疫层析检测试剂中具有相同的技术效果。
为了进一步研究不同溶剂对发光性能的影响，下面实施例以DPA-DCPP作为TADF分子，以Eu(TTA)3Phen作为稀土Eu配合物，对于不同溶胀剂进行研究。
实施例16
DPA-DCPP-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例11，所不同的是将4CzPN换成DPA-DCPP，及将溶胀剂四氢呋喃替换成正己烷，DPA-DCPP和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1。
实施例17
DPA-DCPP-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例16，DPA-DCPP和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1，所不同的是将溶胀剂四氢呋喃替换成四氯化碳。
实施例18
DPA-DCPP-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例16，DPA-DCPP和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1，所不同的是将溶胀剂四氢呋喃替换成甲苯。
实施例19
DPA-DCPP-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例16，DPA-DCPP和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1，所不同的是将溶胀剂四氢呋喃替换成1,4-二噁烷。
实施例20
DPA-DCPP-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例16，DPA-DCPP和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1，所不同的是将溶胀剂四氢呋喃替换成氯仿。
实施例21
DPA-DCPP-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例16，DPA-DCPP和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1，所不同的是将溶胀剂四氢呋喃替换成乙醚。
实施例22
DPA-DCPP-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例16，DPA-DCPP和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1，所不同的是将溶胀剂四氢呋喃替换成去离子水。
实施例23
DPA-DCPP-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例16，DPA-DCPP和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1，所不同的是将溶胀剂四氢呋喃替换成大豆油。
实施例24
DPA-DCPP-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例16，DPA-DCPP和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1，所不同的是将溶胀剂四氢呋喃替换成甲醇。
实施例25
DPA-DCPP-Eu(TTA)3Phen用作免疫层析检测试剂
本实施例中的检测方法、纳米粒子包被方法及用作免疫层析检测试剂的方法同实施例11，所不同的是将4CzPN换成DPA-DCPP，DPA-DCPP和Eu(TTA)3Phen的摩尔比为1:1。
实施例16～实施例25DPA-DCPP-Eu(TTA)3Phen在不同溶剂中的荧光照片图参照图7，可以看出即便是同一种染料，不同溶剂对其发光强度也存在影响，这可能与溶剂的极性等参数有关，相对较好的溶剂为正己烷、四氯化碳、甲苯、二噁烷、乙醚、大豆油、氯仿。
上述实施例中相关检测方法如下：
吸收光谱的测定方法：
将待测的染料溶于甲苯溶液中，将溶液混合均匀，配置成浓度为10μM的荧光染料溶液，取适量体积于石英比色皿中，使用紫外-可见分光光度计测定待测染料在甲苯溶液中的吸收光谱。
荧光光谱测定方法：
以上述吸收光谱测得的最大吸收波长作为激发波长，使用荧光仪在稳态荧光模式下测定对应化合物在溶剂中的荧光发射光谱。
背景信号检测：
首先将MALB抗体高浓度校准品用PBS缓冲液配制成0、10、20、50、100、200、400mg/L这7个浓度点标品，并分别取5μL加上495μL样本稀释液进行100倍稀释，混匀待用，然后分别取100μL稀释好的标品加入两种检测卡中，反应10min后进行上机检测，10min后在长波长和短波长激发状态下分别测定相应的检测卡，得到背景信号的数值。
上述提及的免疫分析检测具体可包括荧光免疫分析、化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析。
实施例26
Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)用于生物成像
Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)是一种含有稀土元素铕(Eu)的配合物，具有稳定的荧光特性和良好的生物相容性，适合用于生物成像。具体实验过程如下：
将HeLa细胞培养在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养至70-80％融合度。用PBS缓冲液轻柔洗涤已培养的细胞两次，然后将Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)配合物稀释至所需浓度(如10μM)，加入到细胞培养盘中，共孵育1小时。移除含有Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)的培养基，用PBS洗细胞两次，然后用4％多聚甲醛溶液固定细胞15分钟。随后用PBS洗涤三次，使用DAPI对细胞核进行染色。使用荧光显微镜观察并拍摄Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)在细胞中的定位和荧光情况。选择激发波长365nm，观察其发出的特有荧光。
结果显示，Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)在细胞中显示出明亮的红色荧光，表明该配合物能够有效穿透细胞膜并在细胞内稳定存在，荧光信号主要分布在细胞质中，少量分布在细胞核周围，说明Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)在细胞内的分布是非特异性的。在连续观察下，Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)的荧光稳定性良好，未观察到明显的荧光强度衰减。
对比例2
Eu(TTA)3用于生物成像
实验过程参照实施例26，所不同的是将Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)替换成Eu(TTA)3。
与Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)相比，Eu(TTA)3在细胞中的荧光较弱，且分布不均匀，表明其穿透细胞膜的能力较差。荧光信号在细胞中的分布相对零散，主要聚集在细胞质中，少部分可见于细胞核周围，反映了Eu(TTA)3的细胞内递送效率和目标定位能力较低。Eu(TTA)3作为生物成像探针，其在细胞成像应用中的效果不如Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)，主要体现在荧光强度、稳定性以及细胞递送效率上。
实施例27
Eu(TTA)3(tBuCz-Me-PyTrz)用于质量控制
制备含有不同浓度的Eu(TTA)3(tBuCz-Me-PyTrz)标准溶液，浓度范围包括预期在体外诊断试剂中使用的浓度。使用荧光光谱仪测量各标准溶液的荧光强度，记录下相应的激发和发射波长下的荧光强度，并建立标准曲线。取体外诊断试剂中的Eu(TTA)3(tBuCz-Me-PyTrz)，按照上述方法测试其荧光强度，并通过标准曲线计算实际浓度；测定Eu(TTA)3(tBuCz-Me-PyTrz)的pH稳定性、时间稳定性以及温度稳定性等参数，以评估其在储存和使用过程中的稳定性；将实验所得数据与参比标准物质的数据进行对比，分析结果。
上述实验中荧光测量条件为激发波长为340nm，发射波长为615nm；环境温度为25℃；pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；在测量时间上，采用立即测量，以及开盖后的24小时、48小时、1周和1个月，评估长期稳定性。
结果显示，Eu(TTA)3(tBuCz-Me-PyTrz)显示了良好的线性响应，荧光强度与浓度成正比关系。在不同时间点的测量中，荧光强度未显示明显变化，表明Eu(TTA)3(tBuCz-Me-PyTrz)具有良好的时间稳定性；pH和温度的变化对荧光强度影响较小，表明良好的环境稳定性。与参比标准物质的荧光性能相比，Eu(TTA)3(tBuCz-Me-PyTrz)在体外诊断试剂中的表现满足质量控制的要求。
实施例28
4CzIPN-Eu(TTA)3Phen用作病理检测试剂
将病理样本(细胞)培养在适当的培养基中，将4CzIPN-Eu(TTA)3Phen配合物稀释至适宜的浓度后，加入到细胞培养物中，允许与细胞共孵育1-2h，使用PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤3次去除未结合的4CzIPN-Eu(TTA)3Phen配合物。使用荧光显微镜观察并记录标记后细胞的荧光信号。根据需要调整激发和发射波长。收集荧光信号的强度和分布，与对照样本(标准荧光标记物标记的样本)进行比较，分析4CzIPN-Eu(TTA)3Phen在病理检测中的性能。
结果显示，在连续观察中，4CzIPN-Eu(TTA)3Phen标记的荧光信号保持稳定，无显著衰减，表明其在细胞内的良好稳定性。
实施例29
Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)用作均相检测试剂
将Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)配合物溶解在缓冲溶液中，在包含Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)配合物的溶液中添加不同浓度的分析物，充分混合，以便Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)和分析物之间能够充分反应，建立一系列测试样本，将混合后的样本在室温下孵育30min，使用发光光谱仪测量每个样本的发光强度。将测得的发光强度与分析物浓度进行对比，绘制标准曲线。
结果显示，样本的发光强度随分析物浓度的增加而增强，表明Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)能够特异性地与分析物结合，产生发光信号。Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)中，TTA为配体，Cz-Me-PyTrz为增强荧光强度的辅助配体。Eu(TTA)3(Cz-Me-PyTrz)作为均相发光检测试剂，在特定条件下，能够高灵敏度和高特异性地检测特定的分析物。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。上述各优选特征在互不冲突的情况下，可以任意组合使用。

Claims (18)

1.一种TADF-稀土配合物体系，其特征在于，所述TADF-稀土配合物体系中TADF和稀土配合物之间物理混合或者以配位键连接，所述TADF-稀土配合物体系的吸收波长为400～800nm。
2.根据权利要求1所述的TADF-稀土配合物体系，其特征在于，所述稀土配合物为La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Sc、Y的配合物。
3.根据权利要求1所述的TADF-稀土配合物体系，其特征在于，所述稀土配合物为Eu和Tb的配合物。
4.根据权利要求1所述的TADF-稀土配合物体系，其特征在于，所述TADF为二氰基苯咔唑类化合物、均三嗪类化合物、螺旋类化合物、二苯基砜类化合物、1,4-二氮杂菲类化合物和唑类化合物中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的TADF-稀土配合物体系，其特征在于，所述TADF-稀土配合物体系选自如下结构中的任意一种：
6.根据权利要求1所述的TADF-稀土配合物体系，其特征在于，所述TADF-稀土配合物体系中TADF与稀土配合物的摩尔比为50:1～1:1。
7.根据权利要求1所述的TADF-稀土配合物体系，其特征在于，所述TADF-稀土配合物体系中TADF与稀土配合物的摩尔比为5:1～1:1。
8.一种TADF-稀土配合物纳米微球的制备方法，其特征在于，包括：
将纳米微球在溶胀剂中加热溶胀，形成溶胀的纳米微球；
将权利要求1-7任一项所述的TADF-稀土配合物体系与所述溶胀的纳米微球混合，形成混合溶液；
将所述混合溶液注入去离子水中，升温搅拌，再旋蒸浓缩过滤，得到TADF-稀土配合物纳米微球。
9.根据权利要求8所述的TADF-稀土配合物纳米微球的制备方法，其特征在于，所述纳米微球为聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、硅微球和蛋白质微球中的任意一种。
10.根据权利要求8所述的TADF-稀土配合物纳米微球的制备方法，其特征在于，所述纳米微球表面含有环氧基、羧基、氨基、醛基、羟基和酰胺基中的至少一种。
11.根据权利要求8所述的TADF-稀土配合物纳米微球的制备方法，其特征在于，所述溶胀剂为正己烷、四氯化碳、二噁烷、四氢呋喃、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、环己烷、甲苯、氯仿、大豆油、甲醇、水、二甲苯和三甲苯中的至少一种。
12.根据权利要求8所述的TADF-稀土配合物纳米微球的制备方法，其特征在于，所述溶胀剂为正己烷、四氯化碳、甲苯、二噁烷、乙醚、大豆油和氯仿中的至少一种。
13.一种TADF-稀土配合物纳米微球，其特征在于，利用权利要求8-12任一项所述的方法制备得到。
14.一种稀土发光试剂的制备方法，其特征在于，包括：
提供权利要求13所述的TADF-稀土配合物纳米微球；
将所述TADF-稀土配合物纳米微球离心复溶到BBS缓冲液中，并超声分散；
向分散后的体系中加入二氯乙烷和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，反应结束后离心，再向其中加入捕获抗体，离心洗涤，得到稀土发光试剂。
15.一种稀土发光试剂的制备方法，其特征在于，包括：
取TADF和稀土配合物分散于溶剂中，形成有机相；
将纳米微球复溶到去离子水中超声，形成纳米微球水溶液，向纳米微球水溶液中加入十二烷基苯磺酸钠和乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚醚，搅拌得到溶液A；
将所述有机相迅速加入所述溶液A中，然后逐渐升温至35～60℃，搅拌后离心除去多余的TADF-稀土配合物，清洗后得到稀土发光试剂。
16.一种利用权利要求14或15所述的方法制备得到的稀土发光试剂的应用，其特征在于，将所述稀土发光试剂用于发光成像、免疫检测和质量控制领域中的任意一种。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述稀土发光试剂在发光成像领域应用的形态为纳米微球，在免疫检测领域应用的形态为纳米微球，在质量控制领域应用的形态为纳米微球、薄膜和玻璃中的任意一种。
18.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述免疫检测包括免疫层析检测、病理检测和均相检测中的任意一种。
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