CN109553676A - 一种抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，包括以下步骤：S1.获取肌球蛋白原液；S2.将肌球蛋白原液的装入透析袋，放入在pH 7.0‑9.0的处理液中进行透析，所述处理液包括20‑200 mmol/L的盐溶液、30‑110 mmol/L的渗透剂，透析1.5‑4h；S3.采用梯度升温的方式将处理液加热至55‑85℃，保温继续透析0.5‑2.5h；S4.在梯度升温的过程中，向处理液中分别加入稳定剂A和稳定剂B，并使稳定剂A的终浓度在150‑350 mmol/L，稳定剂B的终浓度在280‑460 mmol/L；S5.将透析后的肌球蛋白原液倒出，冰水浴中冷却至4℃。经本发明方法处理后，肌球蛋白的蛋白液浊度、肌球蛋白溶解度以及溶液中的颗粒均有明显改善，肌球蛋白体系浊度小，溶解度大，肌球蛋白溶液体系聚集体数量减少，平均粒径降低。
Description
技术领域
本发明涉及水产品品质改良技术领域，具体涉及一种抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，尤其是抑制罗非鱼鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法。
背景技术
肌球蛋白是构成肌肉蛋白的主要肌球蛋白，约占肌球蛋白的40%~50%，与蛋白质的功能特性密切相关，是重要的研究对象。肌球蛋白是长形不对称大分子，形状如“Y”字，分子量约470000Da。肌球蛋白通过两条完全相同的长肽链和两对短肽链组成，其中长肽链的分子量约220000Da，称重链；短链分子量约15000-30000Da，称轻链，且轻链又分为必须轻链（Essential Light Chain，ELC）和非必须轻链（Regulatory Light Chain，RLC）。两条重链的氨基末端与两对轻链结合形成两个球状头部（S1）和颈部调节结构域（Neck），其余重链部分组成肌球蛋白的α-双螺旋杆状尾部（Tail），长约150nm。
热处理是食品加工中的重要步骤，如蒸煮、喷雾干燥、热杀菌等，它能有效改善工业化生产中蛋白质的功能性质，但也是引起蛋白质聚集的主要因素，蛋白质变性聚集与蛋白质在食品体系中的应用密切相关。肌球蛋白的稳定性取决于分子间或分子内的疏水作用、氢键、范德华力等次级键以及肽键内的二硫键。在热处理过程中，肌球蛋白分子肽链受热后化学键断裂，蛋白质的二级和三级结构改变，分子间和分子内的静电相互作用和疏水性相互作用发生了变化，形成了二硫键，使得蛋白质原有的卷曲的肽链构象变得松散；且由于分子结构展开，包埋在分子内部的疏水基团大量暴露于分子表面，表面疏水活性增大，引起分子相互碰撞发生聚集，导致肌球蛋白溶解性降低，影响蛋白质的乳化性、凝胶性等功能特性。肌球蛋白热聚集行为主要受pH值、离子强度、热处理温度、热处理时间等的强烈影响。
水产蛋白资源广泛，其所含必需氨基酸种类丰富、营养均衡，有陆地蛋白资源无法替代的优越性。水产蛋白作为主要的食物来源和食品成分，因其功能、营养特性，有着不容忽视的商业市场。热处理在水产蛋白食品加工中不可避免，而热变性聚集引起的功能特性的变化很大程度上制约着水产蛋白的广泛利用。因此，改善蛋白质的热稳定性，成为了各国科学家最为关注的问题之一。同时，随着经济的发展，人民生活水平的提高， 随之出现如高血脂、高血压、高血糖等所谓的富贵病严重损害人民的身体健康。为提倡健康的日常饮食生活，需要复合低盐、低脂肪、高蛋白等饮食原则。因此，低盐食品是目前食品行业的开发热点。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，尤其是抑制罗非鱼鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，本发明提供了低盐条件下抑制蛋白热变性聚集的有效方法，经本发明方法处理后，肌球蛋白的蛋白液浊度、肌球蛋白溶解度以及溶液中的颗粒均有明显改善，肌球蛋白体系浊度小，溶解度大，肌球蛋白溶液体系聚集体数量减少，平均粒径降低，并且该方法对蛋白质功能特性及分子结构性质的均不会产生不利影响，具有广泛的可行性，从而为罗非鱼资源的深加工提供理论依据，进而扩大水产蛋白的应用范围。
本发明的技术方案为：一种抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将鲜鱼宰杀，取其白肉部分，提取肌球蛋白,获取肌球蛋白原液；
S2.将肌球蛋白原液的装入透析袋，放入在pH 7.0-9.0的处理液中进行透析，所述处理液包括20-200 mmol/L的盐溶液、30-110 mmol/L的渗透剂，透析1.5-4h；
S3.采用梯度升温的方式将处理液加热至55-85℃，保温继续透析0.5-2.5h；
S4.在梯度升温的过程中，向处理液中分别加入稳定剂A和稳定剂B，并使稳定剂A的终浓度在150-350 mmol/L，稳定剂B的终浓度在280-460 mmol/L；
S5.将透析后的肌球蛋白原液倒出，冰水浴中冷却至4℃。
进一步的，所述梯度升温的方式为控制升温速率约为0.5-5℃/min，温度每升高5-10℃，保温1-10min，直至肌球蛋白原液中心温度达到终温度。
进一步的，所述步骤S4中，当肌球蛋白原液中心温度达到38-45℃时，加入稳定剂A；当肌球蛋白原液中心温度达到55-62℃时，加入稳定剂B。
通过梯度升温的方式，在每个温度节点再保温一段时间，可以防止蛋白质因温度的改变，尤其是在到达某些临界温度时，发生二级结构的改变，造成不可逆的热变性。
进一步的，所述渗透剂包括以下重量份数的组分：天冬氨酸 17-24、精氨酸 11-18、酪氨酸 12-21、甘露糖 8-17。本发明中的渗透剂，对肌球蛋白抗热变性聚集具有贡献，通过在透析过程中，渗透剂的成分进入到肌球蛋白内部，使得蛋白质的热稳定性能够得到明显的改善，显著降低蛋白质的聚集程度，主要是通过引起轻酶解肌球蛋白伸长，抑制了肌球蛋白粗丝的形成；与蛋白质发生静电结合作用，提高蛋白质易于聚集的折叠中间体的溶解度及复性收率，进而达到抑制蛋白质聚集的途径实现。
进一步的，所述稳定剂A包括以下重量份数的组分：十二烷基硫酸钠 6-14、海藻酸钠 13-21、海藻糖 10-22、大豆生物活性肽 9-17。本发明中的稳定剂A，可以确保在中温、中高温的加热区域蛋白质不会发生热变性聚集。
随着加热时间的延长，由于蛋白质分子与结合水的结合状态被破坏，导致蛋白质变性，使鱼肌球蛋白Ca2+-ATPase活性下降，肌球蛋白的ATP酶活性被广泛用来作为鱼肉蛋白变性的指标。十二烷基硫酸钠与大豆生物活性肽作用可以有效阻止鱼肌球蛋白Ca2+-ATPase活性下降，同时使得溶解性增大，聚集体粒径减小，ANS-S0显著升高，α-螺旋含量增大，且保护了蛋白质的二级结构，达到了很好的抑制蛋白质热变性聚集的效果，改善了肌球蛋白的热稳定性。
蛋白质的结构稳定性、易变性以及酶的催化作用等大多是由于自由基SH和二硫键所引起的结果。加热温度过高会使埋藏在分子内部的巯基暴露出来，进而被氧化成二硫键，导致巯基含量减少，本发明中的海藻酸钠与海藻糖共同作用，可形成单层网络结构，将暴露的巯基包裹，再通过大豆生物活性肽的作用，抑制氧化的进程，对于肌球蛋白总巯基含量下降的抑制作用最好。
本申请发明人通过大量的创造性试验发现，当十二烷基硫酸钠、海藻酸钠、海藻糖、大豆生物活性肽协效复配时，可以达到很好的抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的效果。
特别的，所述大豆生物活性肽可以是现有技术中的任一食源性大豆生物活性肽。
进一步的，所述稳定剂B为长链膳食纤维，所述长链膳食纤维的聚合度为13-20。本发明中采用的稳定剂B，可以确保在高温的加热区域蛋白质不会发生热变性聚集。膳食纤维具有良好的特性，如膨胀性、吸水性等，能有效改善和提高鱼肉蛋白的品质，而长链的膳食纤维可以使鱼肉蛋白形成的网络结构具有很好的保水性，能明显改善鱼糜蛋白的凝胶弹性，同时避免在高温下热变性聚集。本发明中的长链膳食纤维可以是现有技术中的任一膳食纤维，比如大豆膳食纤维、小麦膳食纤维等。
进一步的，所述肌球蛋白的提取方法为：取新鲜搅碎的鱼肉，加5倍鱼肉重量的溶液A在20 000 r/min高速匀浆30s，静置15 min后离心取沉淀，重复上述过程3次；向所得沉淀中加入3倍重量的溶液B，搅拌均匀后离心；纱布过滤，取滤液用冰蒸馏水稀释，静置后离心得沉淀，向沉淀中加入1/5倍溶液C，混匀后放置2 h，混合体系中添加1/10倍溶液D，搅拌1h；加入饱和硫酸铵至饱和度40%时离心取上清液，继续加饱和硫酸铵至饱和度45%时离心取沉淀；沉淀于透析液E中透析至无SO4 2-检出，然后离心分离，所得上清液即为肌球蛋白溶液。
进一步的，所述溶液A包括20 mmol/L PBS、2 mmol/L PMSF、0.02%叠氮钠，溶液pH为6.9。
进一步的，所述溶液B包括 0.35 mol/L KCl、5 mmol/L ATP、7 mmol/L MgCl2、0.3mmol/L DTT，溶液pH6.2。
进一步的，所述溶液C包括0.12 mol/L Tris-maleic acid、1.6 mol/L KCl、0.6mmol/L DTT，溶液pH为7.4。
进一步的，所述溶液D包括0.13 mol/L ATP、48 mmol/L MgCl2、5.5 mmol/L EGTA、pH 7.5。
进一步的，所述透析液E包括18 mmol/L PBS、1mol/L NaCl，溶液pH 6.8。
水产蛋白在一系列的贮藏加工过程中容易发生变性，导致其溶解性和相关功能特性丧失，在食品工业中的开发及应用受到很大限制。热处理是食品加工中常用的手段，如热杀菌、喷雾干燥等，热处理下蛋白质变性聚集对其化学结构有着决定性的影响。一般认为，热处理后，蛋白质的高级结构会发生去折叠，由有序而紧密的构造变成无特定空间结构的肽链，导致蛋白质发生变性，溶解度降低，形成絮凝沉淀。热处理对蛋白质溶解度及结构的影响与体系 p H 值、离子强度、热处理温度及时间有较大的关系。肌球蛋白是肌肉蛋白的重要组成部分，同时也是具有重要生物学功能的盐溶性蛋白质。肌球蛋白通常被认为只在高离子强度条件下溶解，而在低盐条件下，因其较差的溶解度及热稳定性限制了肌球蛋白的加工特性，也不利于低盐制品的生产和研发。而研究发现，部分蛋白质稳定剂能有效通过提高天然蛋白的热稳定性、抑制变性蛋白的热聚集、提高热聚集体的分散性或辅助复性等方式来保证热处理后产品的溶解性等功能性质。
本申请发明人在现有理论研究的基础上，通过大量的创造性试验，获得了在低盐条件下抑制蛋白热变性聚集的有效方法，经本发明方法处理后，肌球蛋白的蛋白液浊度、肌球蛋白溶解度以及溶液中的颗粒均有明显改善，肌球蛋白体系浊度小，溶解度大，肌球蛋白溶液体系聚集体数量减少，平均粒径降低，并且该方法对蛋白质功能特性及分子结构性质的均不会产生不利影响，具有广泛的可行性，从而为罗非鱼资源的深加工提供理论依据，进而扩大水产蛋白的应用范围。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将鲜鱼宰杀，取其白肉部分，提取肌球蛋白,获取肌球蛋白原液；
S2.将肌球蛋白原液的装入透析袋，放入在pH 7.0的处理液中进行透析，所述处理液包括20 mmol/L的盐溶液、30 mmol/L的渗透剂，透析1.5h；
S3.采用梯度升温的方式将处理液加热至55℃，保温继续透析0.5h；
S4.在梯度升温的过程中，向处理液中分别加入稳定剂A和稳定剂B，并使稳定剂A的终浓度在150 mmol/L，稳定剂B的终浓度在280 mmol/L；
S5.将透析后的肌球蛋白原液倒出，冰水浴中冷却至4℃。
进一步的，所述梯度升温的方式为控制升温速率约为0.5℃/min，温度每升高5℃，保温1min，直至肌球蛋白原液中心温度达到终温度。
进一步的，所述步骤S4中，当肌球蛋白原液中心温度达到38℃时，加入稳定剂A；当肌球蛋白原液中心温度达到55℃时，加入稳定剂B。
进一步的，所述渗透剂包括以下重量份数的组分：天冬氨酸 17、精氨酸 11、酪氨酸 12、甘露糖 8。
进一步的，所述稳定剂A包括以下重量份数的组分：十二烷基硫酸钠 6、海藻酸钠13、海藻糖 10、大豆生物活性肽 9。
进一步的，所述稳定剂B为长链膳食纤维，所述长链膳食纤维的聚合度为13。
进一步的，所述肌球蛋白的提取方法为：取新鲜搅碎的鱼肉，加5倍鱼肉重量的溶液A在20 000 r/min高速匀浆30s，静置15 min后离心取沉淀，重复上述过程3次；向所得沉淀中加入3倍重量的溶液B，搅拌均匀后离心；纱布过滤，取滤液用冰蒸馏水稀释，静置后离心得沉淀，向沉淀中加入1/5倍溶液C，混匀后放置2 h，混合体系中添加1/10倍溶液D，搅拌1h；加入饱和硫酸铵至饱和度40%时离心取上清液，继续加饱和硫酸铵至饱和度45%时离心取沉淀；沉淀于透析液E中透析至无SO4 2-检出，然后离心分离，所得上清液即为肌球蛋白溶液。
进一步的，所述溶液A包括20 mmol/L PBS、2 mmol/L PMSF、0.02%叠氮钠，溶液pH为6.9。
进一步的，所述溶液B包括 0.35 mol/L KCl、5 mmol/L ATP、7 mmol/L MgCl2、0.3mmol/L DTT，溶液pH6.2。
进一步的，所述溶液C包括0.12 mol/L Tris-maleic acid、1.6 mol/L KCl、0.6mmol/L DTT，溶液pH为7.4。
进一步的，所述溶液D包括0.13 mol/L ATP、48 mmol/L MgCl2、5.5 mmol/L EGTA、pH 7.5。
进一步的，所述透析液E包括18 mmol/L PBS、1mol/L NaCl，溶液pH 6.8。
实施例2
一种抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将鲜鱼宰杀，取其白肉部分，提取肌球蛋白,获取肌球蛋白原液；
S2.将肌球蛋白原液的装入透析袋，放入在pH 9.0的处理液中进行透析，所述处理液包括200 mmol/L的盐溶液、110 mmol/L的渗透剂，透析4h；
S3.采用梯度升温的方式将处理液加热至85℃，保温继续透析2.5h；
S4.在梯度升温的过程中，向处理液中分别加入稳定剂A和稳定剂B，并使稳定剂A的终浓度在350 mmol/L，稳定剂B的终浓度在460 mmol/L；
S5.将透析后的肌球蛋白原液倒出，冰水浴中冷却至4℃。
进一步的，所述梯度升温的方式为控制升温速率约为5℃/min，温度每升高10℃，保温10min，直至肌球蛋白原液中心温度达到终温度。
进一步的，所述步骤S4中，当肌球蛋白原液中心温度达到45℃时，加入稳定剂A；当肌球蛋白原液中心温度达到62℃时，加入稳定剂B。
进一步的，所述渗透剂包括以下重量份数的组分：天冬氨酸 24、精氨酸 18、酪氨酸 21、甘露糖 17。
进一步的，所述稳定剂A包括以下重量份数的组分：十二烷基硫酸钠 14、海藻酸钠21、海藻糖 22、大豆生物活性肽17。
进一步的，所述稳定剂B为长链膳食纤维，所述长链膳食纤维的聚合度为20。
进一步的，所述肌球蛋白的提取方法为：取新鲜搅碎的鱼肉，加5倍鱼肉重量的溶液A在20 000 r/min高速匀浆30s，静置15 min后离心取沉淀，重复上述过程3次；向所得沉淀中加入3倍重量的溶液B，搅拌均匀后离心；纱布过滤，取滤液用冰蒸馏水稀释，静置后离心得沉淀，向沉淀中加入1/5倍溶液C，混匀后放置2 h，混合体系中添加1/10倍溶液D，搅拌1h；加入饱和硫酸铵至饱和度40%时离心取上清液，继续加饱和硫酸铵至饱和度45%时离心取沉淀；沉淀于透析液E中透析至无SO4 2-检出，然后离心分离，所得上清液即为肌球蛋白溶液。
进一步的，所述溶液A包括20 mmol/L PBS、2 mmol/L PMSF、0.02%叠氮钠，溶液pH为6.9。
进一步的，所述溶液B包括 0.35 mol/L KCl、5 mmol/L ATP、7 mmol/L MgCl2、0.3mmol/L DTT，溶液pH6.2。
进一步的，所述溶液C包括0.12 mol/L Tris-maleic acid、1.6 mol/L KCl、0.6mmol/L DTT，溶液pH为7.4。
进一步的，所述溶液D包括0.13 mol/L ATP、48 mmol/L MgCl2、5.5 mmol/L EGTA、pH 7.5。
进一步的，所述透析液E包括18 mmol/L PBS、1mol/L NaCl，溶液pH 6.8。
实施例3
一种抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将鲜鱼宰杀，取其白肉部分，提取肌球蛋白,获取肌球蛋白原液；
S2.将肌球蛋白原液的装入透析袋，放入在pH 8.2的处理液中进行透析，所述处理液包括170mmol/L的盐溶液、90mmol/L的渗透剂，透析3h；
S3.采用梯度升温的方式将处理液加热至82℃，保温继续透析2.2h；
S4.在梯度升温的过程中，向处理液中分别加入稳定剂A和稳定剂B，并使稳定剂A的终浓度在320 mmol/L，稳定剂B的终浓度在430 mmol/L；
S5.将透析后的肌球蛋白原液倒出，冰水浴中冷却至4℃。
进一步的，所述梯度升温的方式为控制升温速率约为4℃/min，温度每升高8℃，保温8min，直至肌球蛋白原液中心温度达到终温度。
进一步的，所述步骤S4中，当肌球蛋白原液中心温度达到43℃时，加入稳定剂A；当肌球蛋白原液中心温度达到60℃时，加入稳定剂B。
进一步的，所述渗透剂包括以下重量份数的组分：天冬氨酸 22、精氨酸 16、酪氨酸 19、甘露糖 16。
进一步的，所述稳定剂A包括以下重量份数的组分：十二烷基硫酸钠 12、海藻酸钠19、海藻糖 20、大豆生物活性肽 15。
进一步的，所述稳定剂B为长链膳食纤维，所述长链膳食纤维的聚合度为19。
进一步的，所述肌球蛋白的提取方法为：取新鲜搅碎的鱼肉，加5倍鱼肉重量的溶液A在20 000 r/min高速匀浆30s，静置15 min后离心取沉淀，重复上述过程3次；向所得沉淀中加入3倍重量的溶液B，搅拌均匀后离心；纱布过滤，取滤液用冰蒸馏水稀释，静置后离心得沉淀，向沉淀中加入1/5倍溶液C，混匀后放置2 h，混合体系中添加1/10倍溶液D，搅拌1h；加入饱和硫酸铵至饱和度40%时离心取上清液，继续加饱和硫酸铵至饱和度45%时离心取沉淀；沉淀于透析液E中透析至无SO4 2-检出，然后离心分离，所得上清液即为肌球蛋白溶液。
进一步的，所述溶液A包括20 mmol/L PBS、2 mmol/L PMSF、0.02%叠氮钠，溶液pH为6.9。
进一步的，所述溶液B包括 0.35 mol/L KCl、5 mmol/L ATP、7 mmol/L MgCl2、0.3mmol/L DTT，溶液pH6.2。
进一步的，所述溶液C包括0.12 mol/L Tris-maleic acid、1.6 mol/L KCl、0.6mmol/L DTT，溶液pH为7.4。
进一步的，所述溶液D包括0.13 mol/L ATP、48 mmol/L MgCl2、5.5 mmol/L EGTA、pH 7.5。
进一步的，所述透析液E包括18 mmol/L PBS、1mol/L NaCl，溶液pH 6.8。
实施例4
一种抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将鲜鱼宰杀，取其白肉部分，提取肌球蛋白,获取肌球蛋白原液；
S2.将肌球蛋白原液的装入透析袋，放入在pH 7.8的处理液中进行透析，所述处理液包括80 mmol/L的盐溶液、45mmol/L的渗透剂，透析2.2h；
S3.采用梯度升温的方式将处理液加热至65℃，保温继续透析0.8h；
S4.在梯度升温的过程中，向处理液中分别加入稳定剂A和稳定剂B，并使稳定剂A的终浓度在180 mmol/L，稳定剂B的终浓度在310 mmol/L；
S5.将透析后的肌球蛋白原液倒出，冰水浴中冷却至4℃。
进一步的，所述梯度升温的方式为控制升温速率约为1.5℃/min，温度每升高7℃，保温1-10min，直至肌球蛋白原液中心温度达到终温度。
进一步的，所述步骤S4中，当肌球蛋白原液中心温度达到40℃时，加入稳定剂A；当肌球蛋白原液中心温度达到57℃时，加入稳定剂B。
进一步的，所述渗透剂包括以下重量份数的组分：天冬氨酸 17、精氨酸 12、酪氨酸 14、甘露糖 10。
进一步的，所述稳定剂A包括以下重量份数的组分：十二烷基硫酸钠 8、海藻酸钠15、海藻糖 12、大豆生物活性肽 11。
进一步的，所述稳定剂B为长链膳食纤维，所述长链膳食纤维的聚合度为15。
进一步的，所述肌球蛋白的提取方法为：取新鲜搅碎的鱼肉，加5倍鱼肉重量的溶液A在20 000 r/min高速匀浆30s，静置15 min后离心取沉淀，重复上述过程3次；向所得沉淀中加入3倍重量的溶液B，搅拌均匀后离心；纱布过滤，取滤液用冰蒸馏水稀释，静置后离心得沉淀，向沉淀中加入1/5倍溶液C，混匀后放置2 h，混合体系中添加1/10倍溶液D，搅拌1h；加入饱和硫酸铵至饱和度40%时离心取上清液，继续加饱和硫酸铵至饱和度45%时离心取沉淀；沉淀于透析液E中透析至无SO4 2-检出，然后离心分离，所得上清液即为肌球蛋白溶液。
进一步的，所述溶液A包括20 mmol/L PBS、2 mmol/L PMSF、0.02%叠氮钠，溶液pH为6.9。
进一步的，所述溶液B包括 0.35 mol/L KCl、5 mmol/L ATP、7 mmol/L MgCl2、0.3mmol/L DTT，溶液pH6.2。
进一步的，所述溶液C包括0.12 mol/L Tris-maleic acid、1.6 mol/L KCl、0.6mmol/L DTT，溶液pH为7.4。
进一步的，所述溶液D包括0.13 mol/L ATP、48 mmol/L MgCl2、5.5 mmol/L EGTA、pH 7.5。
进一步的，所述透析液E包括18 mmol/L PBS、1mol/L NaCl，溶液pH 6.8。
实施例5
一种抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将鲜鱼宰杀，取其白肉部分，提取肌球蛋白,获取肌球蛋白原液；
S2.将肌球蛋白原液的装入透析袋，放入在pH 8.0的处理液中进行透析，所述处理液包括100 mmol/L的盐溶液、60 mmol/L的渗透剂，透析2.5h；
S3.采用梯度升温的方式将处理液加热至80℃，保温继续透析1h；
S4.在梯度升温的过程中，向处理液中分别加入稳定剂A和稳定剂B，并使稳定剂A的终浓度在220 mmol/L，稳定剂B的终浓度在380 mmol/L；
S5.将透析后的肌球蛋白原液倒出，冰水浴中冷却至4℃。
进一步的，所述梯度升温的方式为控制升温速率约为1℃/min，温度每升高8℃，保温2min，直至肌球蛋白原液中心温度达到终温度。
进一步的，所述步骤S4中，当肌球蛋白原液中心温度达到42℃时，加入稳定剂A；当肌球蛋白原液中心温度达到58℃时，加入稳定剂B。
进一步的，所述渗透剂包括以下重量份数的组分：天冬氨酸 19、精氨酸 15、酪氨酸 17、甘露糖 13。
进一步的，所述稳定剂A包括以下重量份数的组分：十二烷基硫酸钠 11、海藻酸钠16、海藻糖 17、大豆生物活性肽 13。
进一步的，所述稳定剂B为长链膳食纤维，所述长链膳食纤维的聚合度为18。
进一步的，所述肌球蛋白的提取方法为：取新鲜搅碎的鱼肉，加5倍鱼肉重量的溶液A在20 000 r/min高速匀浆30s，静置15 min后离心取沉淀，重复上述过程3次；向所得沉淀中加入3倍重量的溶液B，搅拌均匀后离心；纱布过滤，取滤液用冰蒸馏水稀释，静置后离心得沉淀，向沉淀中加入1/5倍溶液C，混匀后放置2 h，混合体系中添加1/10倍溶液D，搅拌1h；加入饱和硫酸铵至饱和度40%时离心取上清液，继续加饱和硫酸铵至饱和度45%时离心取沉淀；沉淀于透析液E中透析至无SO4 2-检出，然后离心分离，所得上清液即为肌球蛋白溶液。
进一步的，所述溶液A包括20 mmol/L PBS、2 mmol/L PMSF、0.02%叠氮钠，溶液pH为6.9。
进一步的，所述溶液B包括 0.35 mol/L KCl、5 mmol/L ATP、7 mmol/L MgCl2、0.3mmol/L DTT，溶液pH6.2。
进一步的，所述溶液C包括0.12 mol/L Tris-maleic acid、1.6 mol/L KCl、0.6mmol/L DTT，溶液pH为7.4。
进一步的，所述溶液D包括0.13 mol/L ATP、48 mmol/L MgCl2、5.5 mmol/L EGTA、pH 7.5。
进一步的，所述透析液E包括18 mmol/L PBS、1mol/L NaCl，溶液pH 6.8。
对比例1
一种抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将鲜鱼宰杀，取其白肉部分，提取肌球蛋白,获取肌球蛋白原液；
S2.将肌球蛋白原液的装入透析袋，放入在pH 8.0的处理液中进行透析，所述处理液包括100 mmol/L的盐溶液、60 mmol/L的渗透剂，透析2.5h；
S3.采用梯度升温的方式将处理液加热至80℃，保温继续透析1h；
S4.在梯度升温的过程中，向处理液中加入稳定剂B，并使稳定剂B的终浓度在380mmol/L；
S5.将透析后的肌球蛋白原液倒出，冰水浴中冷却至4℃。
进一步的，所述梯度升温的方式为控制升温速率约为1℃/min，温度每升高8℃，保温2min，直至肌球蛋白原液中心温度达到终温度。
进一步的，所述步骤S4中，当肌球蛋白原液中心温度达到58℃时，加入稳定剂B。
进一步的，所述渗透剂包括以下重量份数的组分：天冬氨酸 19、精氨酸 15、酪氨酸 17、甘露糖 13。
进一步的，所述稳定剂B为长链膳食纤维，所述长链膳食纤维的聚合度为18。
进一步的，所述肌球蛋白的提取方法为：取新鲜搅碎的鱼肉，加5倍鱼肉重量的溶液A在20 000 r/min高速匀浆30s，静置15 min后离心取沉淀，重复上述过程3次；向所得沉淀中加入3倍重量的溶液B，搅拌均匀后离心；纱布过滤，取滤液用冰蒸馏水稀释，静置后离心得沉淀，向沉淀中加入1/5倍溶液C，混匀后放置2 h，混合体系中添加1/10倍溶液D，搅拌1h；加入饱和硫酸铵至饱和度40%时离心取上清液，继续加饱和硫酸铵至饱和度45%时离心取沉淀；沉淀于透析液E中透析至无SO4 2-检出，然后离心分离，所得上清液即为肌球蛋白溶液。
进一步的，所述溶液A包括20 mmol/L PBS、2 mmol/L PMSF、0.02%叠氮钠，溶液pH为6.9。
进一步的，所述溶液B包括 0.35 mol/L KCl、5 mmol/L ATP、7 mmol/L MgCl2、0.3mmol/L DTT，溶液pH6.2。
进一步的，所述溶液C包括0.12 mol/L Tris-maleic acid、1.6 mol/L KCl、0.6mmol/L DTT，溶液pH为7.4。
进一步的，所述溶液D包括0.13 mol/L ATP、48 mmol/L MgCl2、5.5 mmol/L EGTA、pH 7.5。
进一步的，所述透析液E包括18 mmol/L PBS、1mol/L NaCl，溶液pH 6.8。
对比例2
一种抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将鲜鱼宰杀，取其白肉部分，提取肌球蛋白,获取肌球蛋白原液；
S2.将肌球蛋白原液的装入透析袋，放入在pH 8.0的处理液中进行透析，所述处理液包括100 mmol/L的盐溶液，透析2.5h；
S3.采用梯度升温的方式将处理液加热至80℃，保温继续透析1h；
S4.在梯度升温的过程中，向处理液中分别加入稳定剂A和稳定剂B，并使稳定剂A的终浓度在220 mmol/L，稳定剂B的终浓度在380 mmol/L；
S5.将透析后的肌球蛋白原液倒出，冰水浴中冷却至4℃。
进一步的，所述梯度升温的方式为控制升温速率约为1℃/min，温度每升高8℃，保温2min，直至肌球蛋白原液中心温度达到终温度。
进一步的，所述步骤S4中，当肌球蛋白原液中心温度达到42℃时，加入稳定剂A；当肌球蛋白原液中心温度达到58℃时，加入稳定剂B。
进一步的，所述稳定剂A包括以下重量份数的组分：十二烷基硫酸钠 11、海藻酸钠16、海藻糖 17、大豆生物活性肽 13。
进一步的，所述稳定剂B为长链膳食纤维，所述长链膳食纤维的聚合度为18。
进一步的，所述肌球蛋白的提取方法为：取新鲜搅碎的鱼肉，加5倍鱼肉重量的溶液A在20 000 r/min高速匀浆30s，静置15 min后离心取沉淀，重复上述过程3次；向所得沉淀中加入3倍重量的溶液B，搅拌均匀后离心；纱布过滤，取滤液用冰蒸馏水稀释，静置后离心得沉淀，向沉淀中加入1/5倍溶液C，混匀后放置2 h，混合体系中添加1/10倍溶液D，搅拌1h；加入饱和硫酸铵至饱和度40%时离心取上清液，继续加饱和硫酸铵至饱和度45%时离心取沉淀；沉淀于透析液E中透析至无SO4 2-检出，然后离心分离，所得上清液即为肌球蛋白溶液。
进一步的，所述溶液A包括20 mmol/L PBS、2 mmol/L PMSF、0.02%叠氮钠，溶液pH为6.9。
进一步的，所述溶液B包括 0.35 mol/L KCl、5 mmol/L ATP、7 mmol/L MgCl2、0.3mmol/L DTT，溶液pH6.2。
进一步的，所述溶液C包括0.12 mol/L Tris-maleic acid、1.6 mol/L KCl、0.6mmol/L DTT，溶液pH为7.4。
进一步的，所述溶液D包括0.13 mol/L ATP、48 mmol/L MgCl2、5.5 mmol/L EGTA、pH 7.5。
进一步的，所述透析液E包括18 mmol/L PBS、1mol/L NaCl，溶液pH 6.8。
对比例3
一种抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将鲜鱼宰杀，取其白肉部分，提取肌球蛋白,获取肌球蛋白原液；
S2.将肌球蛋白原液的装入透析袋，放入在pH 8.0的处理液中进行透析，所述处理液包括100 mmol/L的盐溶液、60 mmol/L的渗透剂，透析2.5h；
S3.采用梯度升温的方式将处理液加热至80℃，保温继续透析1h；
S4.在梯度升温的过程中，向处理液中加入稳定剂A，并使稳定剂A的终浓度在220mmol/L；
S5.将透析后的肌球蛋白原液倒出，冰水浴中冷却至4℃。
进一步的，所述梯度升温的方式为控制升温速率约为1℃/min，温度每升高8℃，保温2min，直至肌球蛋白原液中心温度达到终温度。
进一步的，所述步骤S4中，当肌球蛋白原液中心温度达到42℃时，加入稳定剂A。
进一步的，所述渗透剂包括以下重量份数的组分：天冬氨酸 19、精氨酸 15、酪氨酸 17、甘露糖 13。
进一步的，所述稳定剂A包括以下重量份数的组分：十二烷基硫酸钠 11、海藻酸钠16、海藻糖 17、大豆生物活性肽 13。
进一步的，所述肌球蛋白的提取方法为：取新鲜搅碎的鱼肉，加5倍鱼肉重量的溶液A在20 000 r/min高速匀浆30s，静置15 min后离心取沉淀，重复上述过程3次；向所得沉淀中加入3倍重量的溶液B，搅拌均匀后离心；纱布过滤，取滤液用冰蒸馏水稀释，静置后离心得沉淀，向沉淀中加入1/5倍溶液C，混匀后放置2 h，混合体系中添加1/10倍溶液D，搅拌1h；加入饱和硫酸铵至饱和度40%时离心取上清液，继续加饱和硫酸铵至饱和度45%时离心取沉淀；沉淀于透析液E中透析至无SO4 2-检出，然后离心分离，所得上清液即为肌球蛋白溶液。
进一步的，所述溶液A包括20 mmol/L PBS、2 mmol/L PMSF、0.02%叠氮钠，溶液pH为6.9。
进一步的，所述溶液B包括 0.35 mol/L KCl、5 mmol/L ATP、7 mmol/L MgCl2、0.3mmol/L DTT，溶液pH6.2。
进一步的，所述溶液C包括0.12 mol/L Tris-maleic acid、1.6 mol/L KCl、0.6mmol/L DTT，溶液pH为7.4。
进一步的，所述溶液D包括0.13 mol/L ATP、48 mmol/L MgCl2、5.5 mmol/L EGTA、pH 7.5。
进一步的，所述透析液E包括18 mmol/L PBS、1mol/L NaCl，溶液pH 6.8。
测试例
浊度的测定：取适量经实施例、对比例处理过的蛋白样液用对应的缓冲液稀释至0.5mg/mL，使用紫外分光光度计，在350nm的波长下，测定蛋白质溶液的吸光值即为蛋白质样品的浊度，用A350nm表示。每个样品重复三次。
溶解度的测定：将经实施例、对比例处理后的肌球蛋白溶液离心（50,000×g，15min，4℃）取上清液，采用lowry法检测其蛋白含量。肌球蛋白的溶解度按离心所得上清液蛋白浓度占未处理前溶液中总蛋白浓度的百分比计算。每个样品重复三次。
粒径的测定：采用Zetasizer Nano纳米粒度分析仪，利用动态光散射技术（DLS），采用He-Ne激光在633nm下对实施例、对比例处理前后罗非鱼肌球蛋白（1.0mg/mL）的粒径进行测定，获得罗非鱼肌球蛋白的粒径差值，采用90°散射角对样品进行除尘。经过处理的样品加入样品池中，在室温下稳定1min后进行粒径测试。每个样品重复三次。
测试结果如下表所示。
| 实验组 | 浊度（A<sub>350nm</sub>） | 溶解度（%） | 粒径（nm） |
| 实施例1 | 0.27 | 82.3 | 3400 |
| 实施例2 | 0.29 | 81.6 | 3700 |
| 实施例3 | 0.19 | 93.5 | 1200 |
| 实施例4 | 0.21 | 92.8 | 1500 |
| 实施例5 | 0.16 | 95.1 | 800 |
| 对比例1 | 1.22 | 21.1 | 17400 |
| 对比例2 | 0.97 | 38.5 | 13500 |
| 对比例3 | 1.06 | 32.9 | 15200 |
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过任一现有技术实现。
Claims (8)
1.一种抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将鲜鱼宰杀，取其白肉部分，提取肌球蛋白,获取肌球蛋白原液；
S2.将肌球蛋白原液的装入透析袋，放入在pH 7.0-9.0的处理液中进行透析，所述处理液包括20-200 mmol/L的盐溶液、30-110 mmol/L的渗透剂，透析1.5-4h；
S3.采用梯度升温的方式将处理液加热至55-85℃，保温继续透析0.5-2.5h；
S4.在梯度升温的过程中，向处理液中分别加入稳定剂A和稳定剂B，并使稳定剂A的终浓度在150-350 mmol/L，稳定剂B的终浓度在280-460 mmol/L；
S5.将透析后的肌球蛋白原液倒出，冰水浴中冷却至4℃。
2.根据权利要求1所述的抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，所述梯度升温的方式为控制升温速率约为0.5-5℃/min，温度每升高5-10℃，保温1-10min，直至肌球蛋白原液中心温度达到终温度。
3.根据权利要求1所述的抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，所述步骤S4中，当肌球蛋白原液中心温度达到38-45℃时，加入稳定剂A；当肌球蛋白原液中心温度达到55-62℃时，加入稳定剂B。
4. 根据权利要求1所述的抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，所述渗透剂包括以下重量份数的组分：天冬氨酸 17-24、精氨酸 11-18、酪氨酸 12-21、甘露糖 8-17。
5. 根据权利要求1所述的抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，所述稳定剂A包括以下重量份数的组分：十二烷基硫酸钠 6-14、海藻酸钠 13-21、海藻糖 10-22、大豆生物活性肽 9-17。
6.根据权利要求1所述的抑制鱼肉肌球蛋白热变性聚集的方法，其特征在于，所述稳定剂B为长链膳食纤维，所述长链膳食纤维的聚合度为13-20。
7. 根据权利要求1所述的增加鱼肉肌球蛋白溶解度的方法，其特征在于，所述肌球蛋白的提取方法为：取新鲜搅碎的鱼肉，加5倍鱼肉重量的溶液A在20 000 r/min高速匀浆30s，静置15 min后离心取沉淀，重复上述过程3次；向所得沉淀中加入3倍重量的溶液B，搅拌均匀后离心；纱布过滤，取滤液用冰蒸馏水稀释，静置后离心得沉淀，向沉淀中加入1/5倍溶液C，混匀后放置2 h，混合体系中添加1/10倍溶液D，搅拌1 h；加入饱和硫酸铵至饱和度40%时离心取上清液，继续加饱和硫酸铵至饱和度45%时离心取沉淀；沉淀于透析液E中透析至无SO4 2-检出，然后离心分离，所得上清液即为肌球蛋白溶液。
8. 根据权利要求7所述的增加鱼肉肌球蛋白溶解度的方法，其特征在于，所述溶液A包括20 mmol/L PBS、2 mmol/L PMSF、0.02%叠氮钠，溶液pH为6.9；所述溶液B包括 0.35 mol/L KCl、5 mmol/L ATP、7 mmol/L MgCl2、0.3 mmol/L DTT，溶液pH6.2；所述溶液C包括0.12mol/L Tris-maleic acid、1.6 mol/L KCl、0.6 mmol/L DTT，溶液pH为7.4；所述溶液D包括0.13 mol/L ATP、48 mmol/L MgCl2、5.5 mmol/L EGTA、pH 7.5；所述透析液E包括18 mmol/L PBS、1mol/L NaCl，溶液pH 6.8。
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|---|---|---|---|---|
| US20100119655A1 (en) * | 2007-07-25 | 2010-05-13 | Nagasaki Prefectural Government | Muscular protein denaturation inhibitor, additive for a fish meat-origin ground meat, fish meat-origin ground meat containing the same and method of producing the same |
| CN103554243A (zh) * | 2013-11-08 | 2014-02-05 | 南京农业大学 | 一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法 |
-
2018
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