CN109549953A - 调控tfeb以减弱保护性自噬促进纳米银抗肿瘤治疗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种通过调控TFEB的水平来减弱保护性自噬从而促进纳米银抗肿瘤治疗的方法。本发明还提供TFEB敲除试剂在制备用于提高纳米银对肿瘤细胞的杀伤效果的药物中的用途。本发明进一步涉及一种用于杀伤肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒包含纳米银和TFEB敲除试剂。

Description

调控TFEB以减弱保护性自噬促进纳米银抗肿瘤治疗的方法

技术领域

本发明涉及一种纳米银与TFEB的基因敲减/敲除手段联用的抗肿瘤联合给药方法。本发明还提供TFEB敲除试剂在制备用于提高纳米银对肿瘤细胞的杀伤效果的药物中的用途。本发明进一步涉及一种用于杀伤肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒包含纳米银和TFEB敲除试剂。

背景技术

自噬是真核生物细胞内一种基本降解过程，当自噬发生时，双层膜包裹细胞内非必要的或者功能失常的大分子物质、蛋白、细胞器形成自噬体，自噬体与溶酶体融合对内容物进行降解，实现物质的再利用，这个过程可以维持细胞稳态，具有很重要的生理以及病理学意义。自噬在发育分化、癌症、神经退行性疾病、衰老、免疫等生理病理方面起着非常重要的作用。

纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺寸(0.1-100nm)或由它们作为基本单元构成的材料。很多纳米颗粒都已经被报道可以引起细胞自噬，比如金属及其氧化物纳米材料：纳米金、纳米银、纳米氧化铁、氧化锰、镍钴合金、氧化锌、氧化钛、氧化铝、氧化铈、氧化铜、氧化钒；碳基材料：水溶性纳米富勒烯C60、内嵌钕原子的C60@Nd、羧基化碳纳米管、氧化石墨烯；稀土材料：如氧化钐、氧化铕、氧化钆、氧化铽、氧化钇、氧化镧、氧化镱、上转化发光材料；另外还有量子点、二氧化硅、PAMAM树枝状高分纳米颗粒等都被报道可以引起细胞自噬现象。纳米材料引起的细胞自噬大多数情况是促进细胞死亡的，比如氧化锰纳米颗粒、氧化锌纳米颗粒、镍钴合金纳米颗粒、稀土金属氧化物、纳米金颗粒等，但也有少数纳米材料引起的为保护性的细胞自噬，包括二氧化钒纳米颗粒、氧化铜纳米颗粒、银纳米颗粒。

纳米银就是将粒径做到纳米级的金属银单质。由于纳米银具有广谱杀菌的效果，被应用于医疗领域，比如抗菌类医药及医疗器械，抗菌塑料及橡胶制品，抗菌纺织品及服装鞋袜等。纳米银还具有很多别的生物学效应，比如抗真菌、抗病毒、消炎。作为为数不多的已经被应用于临床的纳米材料，近年的细胞以及小鼠实验研究表明，纳米银还可能是一种潜在的抗肿瘤药物。纳米已经在多种癌细胞中被证实具有很强的细胞杀伤效果，包括造成氧化压力、DNA损伤、细胞周期停滞、凋亡、坏死等。

纳米银在动物模型中的抗肿瘤效果也得到了验证。在道尔顿淋巴腹水瘤小鼠模型中，相对于没加纳米银处理组，纳米银对腹水中癌细胞进行杀伤，很好的控制了腹水的体积。另外一项研究显示，纳米银对恶性黑色素瘤具有很好的杀伤效果，用细胞穿膜肽TAT修饰纳米银以增加其穿透细胞的效果后，黑色素瘤的杀伤效果得到了进一步的提升，与用阿霉素处理的抑瘤效果相似。不过阿霉素处理组小鼠体重明显下降，而纳米银处理组小鼠的体重还有一定程度的增加，显示了其更小的副作用。肿瘤血管的生成是肿瘤生长、侵润、转移过程中至关重要的一步，纳米银抗肿瘤的另外一个特点是抑制肿瘤血管的生长。在链唑霉素刺激诱导大鼠肿瘤模型中，可以见到明显的肿瘤血管生成，纳米银处理后，新肿瘤血管生成的现象被抑制。

申请人2014年发表于Autophagy上的研究结果显示，纳米银可以引起细胞自噬，并且无论通过自噬上游抑制剂wortmannin或者自噬下游抑制剂bafilomycin A1处理细胞，还是通过转染ATG5siRNA来减弱细胞内自噬水平，都会进一步增加纳米银处理导致的细胞死亡。这就表明纳米银引起的自噬起着保护癌细胞生存的作用。进一步B16黑色素瘤荷瘤鼠实验证实自噬抑制剂wortmannin可以显著增加纳米银对B16黑色素瘤的抑制效果。我们的研究从细胞水平和动物水平都证实了纳米银引起保护性的细胞自噬，所以抑制保护性自噬可能是一个有用的增强纳米银抗肿瘤效果的方案。

转录因子EB(transcription factor EB，TFEB)作为近几年研究最为热门的转录因子之一，被认为是调节自噬和溶酶体生成的主要调节因子。当细胞处于营养充足的情况时，TFEB被磷酸化滞留在细胞质中；当处于饥饿或自噬诱导剂处理状态时，TFEB去磷酸化，进核调控一系列与自噬和溶酶体相关的基因表达。比如自噬相关基因WIPI(WD repeatdomain,phosphoinositide interacting)、ATG9、SQSTM1、UVRAG(紫外线抵抗相关基因)、VPS11(vacuolar protein sorting 11)、VPS18；与溶酶体生成相关的基因有LAMP-1(lysosome-associated membrane glycoprotein 1)、溶酶体酶、质子泵等。

发明内容

本发明的发明人发现纳米银可以像饥饿、mTOR抑制剂Torin1处理一样，显著引起细胞内TFEB进核，考虑到饥饿引起的TFEB可以进一步调控细胞自噬水平以缓解饥饿对细胞造成的压力，所以发明人探究了纳米银导致的TFEB进核与自噬的关系，并首次提出将纳米银与TFEB敲除手段联用，减弱促癌细胞生存的细胞自噬，以增强纳米银抗肿瘤效果的方法。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.TFEB敲除试剂在制备用于提高纳米银对肿瘤细胞的杀伤效果的药物中的用途。

2.根据第1项所述的用途，其中所述TFEB敲除试剂是针对TFEB的siRNA。

3.一种用于杀伤肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒包含纳米银和TFEB敲除试剂。

4.根据第3项所述的试剂盒，其中所述TFEB敲除试剂是针对TFEB的siRNA。

5.一种提高纳米银对肿瘤细胞的杀伤效果的方法，所述方法包括以下步骤：

1)通过TFEB敲除试剂降低肿瘤细胞内TFEB的表达水平；以及

2)用纳米银处理TFEB的表达水平已降低的肿瘤细胞。

6.根据第5项所述的方法，其中所述TFEB敲除试剂是针对TFEB的siRNA。

附图说明

图1：合成的纳米银的扫描电镜结果，其显示合成的纳米银形貌均一、分散性好。

图2：扫描电镜结果分析，其显示合成的纳米银的粒径为26.8±5.2nm。

图3：与阳性对照Torin 1相同，10μg/mL纳米银处理细胞8小时引起EGFP-TFEB/HeLa细胞内EGFP-TFEB进核(scale bar＝20μm)。

图4：核质分离结果，其显示1μM Torin1和10μg/mL纳米银引起EGFP-TFEB/HeLa细胞内EGFP-TFEB进核。

图5：不同浓度纳米银处理EGFP-TFEB/HeLa细胞8小时后拍照，并对EGFP-TFEB进核细胞占所有细胞的比例进行统计。

图6：不同浓度纳米银处理EGFP-TFEB/HeLa细胞8小时后，蛋白印迹法(westernblotting)检测结果显示，随纳米银浓度增加细胞自噬逐渐增强。

图7：在EGFP-TFEB/HeLa细胞中，10μg/mL纳米银处理细胞，于不同时间点拍照分析EGFP-TFEB进核细胞占所有细胞的比例。

图8：在EGFP-TFEB/HeLa细胞中，10μg/mL纳米银处理细胞，于不同时间点收样检测细胞自噬情况。蛋白印迹法检测结果显示，随纳米银处理时间增加，细胞自噬逐渐增强。

图9：蛋白印迹法显示，HeLa细胞中，TFEB siRNA转染细胞可以敲低TFEB表达，并减弱纳米银导致的细胞自噬。

图10：EGFP-LC3/HeLa细胞中，TFEB siRNA转染细胞后，减弱了纳米银导致的EGFP-LC3荧光点聚集积累(scale bar＝20μm)。

图11：HeLa细胞中，蛋白印迹法结果显示，TFEB siRNA有效敲低了TFEB表达。

图12：MTT分析显示，HeLa细胞转染对照siRNA后，纳米银处理导致细胞活力减弱26.76％，HeLa细胞转染TFEB siRNA后减弱自噬水平后，纳米银处理造成细胞活性进一步减弱25.04％。

图13：ANXA5-FITC PI流式分析显示，HeLa细胞转染对照siRNA后，纳米银处理导致细胞死亡增加50.70％，HeLa细胞转染TFEB siRNA后，纳米银对Hela细胞杀伤效果进一步增强了27.00％。

具体实施方式

实施例1.电化学法合成水溶性纳米银颗粒

我们用基于连续流技术的电化学法合成了PVP包裹的纳米银颗粒，将分散于去离子水中的纳米银溶液制样，用透射电子显微镜进行观察拍照，透射电镜结果表明我们合成的纳米银为形貌均一的单分散颗粒(图1)。直接用拍得的图片进行纳米银粒径分析，通过Image J软件分析超过800个纳米颗粒的粒径,统计后得到纳米银的平均粒径、标准差和大小分布，结果显示我们合成的纳米银的粒径为26.8±5.2nm(图2)。

实施例2.纳米银处理引起TFEB进核

我们构建了稳定转染EGFP-TFEB的HeLa细胞系，以便在荧光显微镜下直观的观察TFEB进核情况。在24孔板中，当细胞长到40-60％密度时，加入10微克/毫升纳米银，1微摩Torin1作为阳性对照。从图中可以看出，阴性对照组中EGFP-TFEB绿色荧光都均匀的分散在细胞质中，核内很少观察到荧光，Torin1处理1小时即可观察到所有细胞中EGFP-TFEB绿色荧光进入细胞核内。纳米银处理8小时后于显微镜下观察，可以明显的观察到大多数细胞内EGFP-TFEB绿色荧光进入细胞核内(图3)。通过核质分离试剂盒对细胞核和细胞质的成分分别进行裂解，western blotting检测EGFP-TFEB分布情况，可以看出，阴性对照组细胞核中无EGFP-TFEB蛋白，但是Torin1和纳米银处理组中有大量EGFP-TFEB从细胞质转移到了细胞核内(图4)。上述结果表明，纳米银处理会导致EGFP-TFEB进核。

实施例3.纳米银引起TFEB进核和自噬的剂量效应和时间效应

当EGFP-TFEB/HeLa细胞长到约60％密度时，加不同浓度(0、2、4、6、8、10微克/毫升)的纳米银处理细胞8小时，拍照并对发生EGFP-TFEB进核的细胞比率进行统计分析(图5)。同时，相同处理的细胞用细胞裂解液收样，通过western blotting检测自噬标志性蛋白LC3-II产生情况(图6)。我们发现随着纳米银使用浓度的增加，引起的TFEB进核细胞比例及细胞的自噬效果逐渐增强。可以显著的引起EGFP-TFEB进核的纳米银浓度为4微克/毫升，同时引起LC3-II显著增加的纳米银浓度也为4微克/毫升，这就提示我们纳米银导致TFEB进核和引起自噬可能存在联系。

所以接下来我们做了纳米银导致TFEB进核与自噬的时间效应。当EGFP-TFEB/HeLa细胞长到约60％密度时，加入10微克/毫升的纳米银处理细胞，分别于0、1、2、4、8、12小时拍照，并对发生EGFP-TFEB进核的细胞比率进行统计分析，我们发现随着时间的增加，EGFP-TFEB进核的细胞比率就越大(图7)，相同处理的细胞收养进行western blotting检测，结果表明随着处理时间的增加，纳米银引起的细胞自噬就越强(图8)。并且EGFP-TFEB进核发生的时间明显早于自噬发生的时间，纳米银处理4小时的时候即可观察到约70％的细胞发生EGFP-TFEB进核，但是纳米银引起自噬水平显著升高是在8小时，这就暗示我们自噬水平的显著升高可能是TFEB进核导致的。

实施例4.敲低TFEB减弱纳米银引起的细胞自噬

为了证明纳米银导致TFEB进核并进一步促进自噬水平的上升，我们用到了TFEBsiRNA。在24孔板中，当HeLa细胞密度长到约20-30％时，利用RNAimax转染20nM TFEB siRNA或者对照siRNA，转染48小时后加纳米银处理8小时并收样，通过western blotting检测TFEB siRNA对TFEB表达的敲减的效果，以及对细胞自噬的影响。结果显示TFEB siRNA可以有效的敲低细胞内源TFEB表达，并且敲低TFEB表达后可以减弱纳米银引起的细胞自噬。自噬发生的时候，胞质分散的LC3-I会转换为膜结合的LC3-II，稳定转染EGFP-LC3的HeLa细胞中可以直观的观察到细胞中EGFP-LC3-II荧光点聚集的产生情况，所以我们在EGFP-LC3/HeLa细胞中也进行了上述测试，结果表明，TFEB siRNA处理细胞后，纳米银导致的EGFP-LC3点聚集产生情况也有所减弱。两个实验都证明了敲低细胞内TFEB表达可以减弱纳米银导致的细胞自噬，表明TFEB在自噬的上游，调控自噬的增强(图9和10)。

实施例5.敲低TFEB促进纳米银对肿瘤细胞的杀伤

我们已发表的数据显示，纳米银引起的自噬为促进肿瘤细胞生存的，所以抑制自噬可以促进纳米银抗肿瘤的效果。考虑到敲低TFEB表达同样可以起到减弱细胞自噬的作用，我们接下来检测了敲低TFEB表达对细胞生存的影响。当24孔板里面的HeLa细胞长到约20％-30％密度后，利用RNAimax转染20nM TFEB siRNA或者对照siRNA，转染48小时后收样通过western blotting检测TFEB siRNA对TFEB表达的敲减的效果。我们发现我们有效的敲减了细胞内TFEB表达水平(图11)。这个时候利用10微克/毫升的纳米银处理转染TFEBsiRNA的细胞24小时，与用10微克/毫升的纳米银处理的转染对照siRNA的细胞相比，TFEBsiRNA处理过的细胞对纳米银处理表现得更加敏感，我们通过MTT和ANXA5-FITC/PI流式分析两种方法对细胞凋亡情况进行了检测。MTT分析显示，HeLa细胞转染control siRNA后，纳米银处理导致细胞活力减弱26.76％，HeLa细胞转染TFEB siRNA后减弱自噬水平后，纳米银处理造成细胞活性进一步减弱25.04％，单独敲低TFEB并不会导致明显的细胞活力降低(图12)。ANXA5-FITC/PI流式分析显示，HeLa细胞转染control siRNA后，纳米银处理导致细胞死亡增加50.70％，HeLa细胞转染TFEB siRNA后，纳米银对Hela细胞杀伤效果进一步增强了27.00％(图13)。单独敲低TFEB并不会导致明显的细胞凋亡或坏死。

总的说来，前面的实验证明了，纳米银具有一项独特的生物学效应——引起TFEB进核，纳米银进核后调控一系列与自噬相关基因的表达，进而促进自噬。敲低TFEB表达不仅会减弱纳米银导致的自噬效应，同时，还会促进纳米银对肿瘤细胞的杀伤效果，所以将纳米银与TFEB敲除试剂联用能取得更好的抗肿瘤效果。

实验方法和材料

1.纳米银合成及表征

我们用基于连续流技术的电化学法合成了PVP包裹的纳米银颗粒，具体方法为，将纯的银棒进行抛光和清洗，然后安装在密封容器的盖子上，通电电压为15V，反应过程中每分钟变化一次电极方向，反应温度为90℃。将5毫克/毫升的PVP K30(30154484,SinopharmChemical Reagent Co.,Ltd)溶液通过注射器以100毫升/小时的速度持续匀速注入容器，最后，将收集到的银颗粒溶胶通过0.22微米的滤膜进行过滤即得到了我们需要的纳米银颗粒。将分散于去离子水中的纳米银溶液滴到铜网的碳膜上，室温干燥，无需染色，直接用透射电子显微镜(JEOL,Tokyo,Japan)进行观察拍照。

2.细胞培养以及稳转细胞系构建

细胞培养试剂均购买于GIBICO(Carlsbad,CA)。在本研究中用到的细胞均连续单层培养于含有10％FBS的DMEM培养基中，培养条件为37℃，含5％CO₂。构建EGFP-TFEB/HeLa和EGFP-LC3/HeLa细胞系时，用Lipofectamine 3000分别转染pEGFP-TFEB(Addgene,#38119)和pEGFP-LC3(Addgene,#11546)到人宫颈癌细胞HeLa细胞(购于中国科学院上海细胞库)中，具体操作为：

1)分HeLa细胞24孔板，1x 10⁵个细胞/孔；

2)次日，将800ng质粒和1μL P3000溶于25μL opti-MEM培养基中，1μL lipo 3000溶于25μL双无培养基，将二者混匀室温静置5分钟；

3)直接将混合液均匀滴入培养基中转染细胞；

4)转染24小时后，用添加了0.5mg/mL G418(Promega,Madison,WI,USA)的DMEM培养基进行选择培养；

5)用添加G418的培养基持续培养大约10天后，经过扩大培养就获得了在荧光显微镜下强烈表达绿色荧光的细胞克隆。

4.EGFP-TFEB进核细胞比例分析

1)分EGFP-TFEB/HeLa细胞24孔板，1x 105个细胞/孔；

2)当EGFP-TFEB/HeLa细胞长到约60％密度时，根据实验需要加不同浓度纳米银处理细胞；

3)处理到指定时间后拍照；

4)对图片中细胞核内EGFP荧光强于细胞质荧光的细胞占总细胞数的比率进行统计分析。此实验需要两个不同的实验者进行双盲实验。

5.Western blot蛋白印迹实验

1)细胞样品处理及制作电泳用样品：胰酶消化收集处理后的细胞，800xg离心后去除上清，加入含有蛋白酶抑制剂(Sigma,P8340)的细胞裂解液(1％Nonidet P-40(Beyotime,ST366),1％sodium deoxycholate(Pierce,#89905),25mM Tris-HCl,150mMNaCl,pH 7.6)于冰上裂解细胞，然后加入等体积2x SDS电泳上样缓冲液。置沸水中煮样10分钟制成SDS电泳样品。

2)SDS-PAGE电泳：根据所需蛋白的大小配制合适浓度的SDS电泳凝胶，待测样品等量上样后进行电泳分离(上层浓缩胶恒压80伏特，下层分离胶恒压120伏特)。

3)转膜：SDS-PAGE电泳完成后进行转膜(若为硝酸纤维素膜则直接使用，PVDF膜需要用甲醇激活才能使用)，350安培恒流90分钟，转膜过程在冰水浴中进行。

4)封闭：转膜完成后，将载有蛋白的膜置于TBST缓冲液配置的5％脱脂牛奶中，摇床室温封闭1小时。

5)一抗孵育：根据蛋白抗体的使用说明或预实验结果，配制合适浓度的一抗，封闭后的转移膜室温孵育一抗3小时或4℃过夜。

6)洗涤一抗：用TBST缓冲液于室温摇床震荡清洗3次，每次5分钟。

7)二抗孵育：用一抗相对应的二抗室温摇床孵育膜40分钟到1小时。

8)洗涤二抗：用TBST缓冲液于室温摇床震荡清洗3次，每次5分钟。

9)显色检验：膜上的蛋白含量信号用ECL显影试剂盒(Biological Industries,Beit Haemek,Israel)于分子成像仪进行显色检测。

6.siRNA转染细胞实验

TFEB siRNA(正义5’-AGACGAAGGUUCAACAUCA-3’；反义5’-UGAUGUUGAACCUUCGUCU-3’)及阴性对照(正义：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；反义：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’)购自上海生工生物工程有限公司。实验步骤为：待24孔板中细胞20-30％细胞密度时，每孔转染20nM siRNA，RNAimax(Invitrogen,13778-075)用作转染试剂，转染操作为：将20nMsiRNA溶于100μL opti-MEM培养基中，2μL RNAimax溶于100μL opti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温静置5分钟；将两管轻轻混匀，室温放置20分钟，24孔板中预先加入300μL含10％FBS的DMEM培养基，将混合物转染细胞。24小时后换液。转染48小时后，加纳米银进行处理。

7.MTT细胞活力分析

噻唑蓝(MTT)比色法检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。实验步骤为：

1)HeLa细胞培养于96孔板中，当细胞接近1x 10⁴个细胞/孔的时候，根据实验设计加样处理指定时间，每个组5个复孔。

2)加入5毫克/毫升的MTT至终浓度0.5mg/mL，于37℃细胞培养箱中培养4小时。

3)除去孔内培养基，每孔加入150μL DMSO，置摇床上摇晃至结晶物充分溶解均匀。

4)在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔吸光值(Elx800,BioTek,Winooski,VT,USA)。

8.细胞凋亡检测

检测原理：ANXA5选择性结合磷酯酰丝氨酸。正常情况下，磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)则是利用了这一原理，用FITC标记的重组人ANXA5直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜已经不完整，AnnexinV-FITC可以进入到细胞质内，与细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而使坏死细胞也呈现绿色荧光。

实验步骤：

1)把处理后的细胞培养液吸出至合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶消化细胞。消化好后加入之前收集的细胞培养液，终止消化，这样可以保证收集到已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞。

2)将收集到的细胞1000xg离心5分钟，弃上清，用PBS轻轻重悬细胞并计数。

3)取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀避光染色10分钟。

4)离心去上清，加入190μL结合液和10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，置于冰浴中，随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

Claims (6)

1.一种提高纳米银对肿瘤细胞的杀伤效果的方法，所述方法包括以下步骤：

1)通过TFEB敲除试剂降低肿瘤细胞内TFEB的表达水平；以及

2)用纳米银处理TFEB的表达水平已降低的肿瘤细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述TFEB敲除试剂是针对TFEB的siRNA。

3.TFEB敲除试剂在制备用于提高纳米银对肿瘤细胞的杀伤效果的药物中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述TFEB敲除试剂是针对TFEB的siRNA。

5.一种用于杀伤肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒包含纳米银和TFEB敲除试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述TFEB敲除试剂是针对TFEB的siRNA。