JP5436650B1 - スーパーアパタイト超微細ナノ粒子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】平均粒径が50nm以下である炭酸アパタイト粒子が分散した水溶液。
【選択図】なし
Description
項1.
平均粒径が50nm以下である炭酸アパタイト粒子が分散した水溶液。
項2.
水溶液が生理食塩水等の生体投与可能な水溶液である、項1に記載の水溶液。
項3.
物質を細胞内に導入させるための運搬体である、項1又は2に記載の水溶液。
項4.
物質が薬剤である、項3に記載の水溶液。
項5.
薬剤が炭酸アパタイト粒子に内包されている、項1又は2に記載の水溶液。
項6.
更に、アルブミンを含む、項1〜5のいずれかに記載の水溶液。
項7.
従来の炭酸アパタイト粒子を含む水溶液を超音波振動処理することを含む、項1に記載の水溶液を製造する方法。
項8.アルブミンを含む、炭酸アパタイト粒子の凝集阻害剤。
項9.アルブミンを含む、炭酸アパタイト粒子の微細化促進剤。
本発明において使用できる炭酸アパタイト及び炭酸アパタイト粒子は公知である。炭酸アパタイトは、水酸アパタイト(Ca10(PO4)6(OH)2)の水酸基(OH- ) の一部を炭酸基(CO3 2- ) にて置換した化学構造を有し、一般式Ca10−mXm(PO4)6(CO3)1−nYnで表すことができる。ここで、Xは、炭酸アパタイトにおけるCaを部分的に置換しうる元素であればよく、例えば、Sr、Mn、希土類元素等を挙げることができる。mは、通常0以上1以下の正数であり、好ましくは0以上0.1以下であり、より好ましくは0以上0.01以下であり、更に好ましくは0以上0.001以下である。Yは、炭酸アパタイトにおけるCO3を部分的に置換しうる単位であり、OH、F、Cl等を例示することができる。nは、通常0以上0.1以下の正数であり、好ましくは0以上0.01以下であり、より好ましくは0以上0.001以下であり、更に好ましくは0以上0.0001以下である。
(1)DMEM溶液を用いたスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の製造
100mlの蒸留水に、1.35gのDMEM粉末及び0.37gのNaHCO3を順に添加して完全に溶解させ、1NのHClを用いてpHを7.5に調整した。このDMEM溶液(100ml)を直径0.2μmのフィルターでろ過し、1mlDMEM溶液当たり、4μlのCaCl2(1M)を混合し、37℃の水浴中で30分間インキュベートした。その後、15000rpm×5分で遠沈し、得られたペレットを蒸留水、細胞培養液又は生理食塩水等の細胞や生体に投与可能な水溶液に溶解し、10分間超音波振動処理をかけることにより、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子(以下、「粒子(1)」とする)を得た。超音波振動処理は、超音波振動機能を有するウォーターバスを用いて、20℃に設定した水に、プラスチック容器に収容したアパタイト粒子水溶液を浮かべ、高周波出力55W、発振周波数38kHzの条件で10分間行った。尚、スーパーアパタイト粒子をin vitro試験に用いる場合は、上記の遠沈を行う必要はない。顕微鏡を用いた粒径の測定を行う場合には、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を蒸留水に溶解した。動物実験に用いる場合は、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を生理食塩水に溶解調製した。細胞実験に用いる場合は、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子をDMEM溶液に溶解調製した。
100mlの蒸留水に、0.37gのNaHCO3、90μlのNaH2PO4・2H2O(1M)、及び180μlのCaCl2(1M)をこの順で添加して溶解させ、1NのHClでpHを7.5に調整した。これを直径0.2μmのフィルターでろ過した。得られたバッファー1ml当たりに4μlのCaCl2(1M)を混合し、37℃の水浴中で30分間インキュベートした後、15000rpm×5分で遠沈し、得られたペレットを、蒸留水、細胞培養液又は生理食塩水等の細胞や生体に投与可能な水溶液に溶解し、10分間超音波振動処理をかけることにより、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子(以下、「粒子(2)」とする)を得た。超音波振動処理は、超音波振動機能を有するウォーターバスを用いて、20℃に設定した水に、プラスチック容器に収容したアパタイト粒子水溶液を浮かべ、高周波出力55W、発振周波数38kHzの条件で10分間行った。尚、スーパーアパタイト粒子をin vitro試験に用いる場合は、上記の遠沈を行う必要はない。顕微鏡を用いた粒径の測定を行う場合には、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を蒸留水に溶解した。動物実験に用いる場合は、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を生理食塩水に溶解調製した。細胞実験に用いる場合は、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子をDMEM溶液に溶解調製した。
上記(1)と同様に、100mlの蒸留水に、1.35gのDMEM粉末及び0.37gのNaHCO3を順に添加して完全に溶解させ、1NのHClを用いてpHを7.5に調整した。このDMEM溶液(100ml)を直径0.2μmのフィルターでろ過し、1mlのDMEM溶液あたり、2μgのsiRNA、4μlのCaCl2(1M)を混合し、37℃の水浴中で30分間インキュベートした。バッファーを用いて作製する場合は、上記(2)と同様に、100mlの蒸留水に、0.37gのNaHCO3、90μlのNaH2PO4・2H2O(1M)、及び180μlのCaCl2(1M)をこの順に添加して溶解させ、1NのHClでpHを7.5に調整した。これを直径0.2μmのフィルターでろ過した。得られたバッファー1ml当たりに2μgのsiRNA、4μlのCaCl2(1M)を混合し、37℃の水浴中で30分間インキュベートした。その後、15000rpm×5分で遠沈し、得られたペレットを蒸留水、細胞培養液又は生理食塩水等の細胞や生体に投与可能な水溶液に溶解し、10分間超音波振動処理をかけることにより、siRNAを包含したスーパーアパタイト超微細ナノ粒子(以下、「粒子(3)」とする)を得た。ここでは、Alexa Fluor448で蛍光標識したsiRNA(AllStars Neg.siRNA AF488(QIAGEN社製))を用いた。超音波振動処理は、超音波振動機能を有するウォーターバスを用いて、20℃に設定した水に、プラスチック容器に収容したアパタイト粒子水溶液を浮かべ、高周波出力55W、発振周波数38kHzの条件で10分間行った。尚、スーパーアパタイト粒子をin vitro試験に用いる場合は、上記の遠沈を行う必要はない。顕微鏡を用いた粒径の測定を行う場合には、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を蒸留水に溶解した。動物実験に用いる場合は、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を生理食塩水に溶解調製した。細胞実験に用いる場合は、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子をDMEM溶液に溶解調製した。
実施例1で作製したスーパーアパタイト超微細ナノ粒子(1)〜(3)の粒径及び形態等をマイクロカンチレバー(OMCL−AC240TS−RS,オリンパス社製)を備えた走査型プローブ顕微鏡(SPM−9500,島津製作所製)をダイナミックモードで使用して測定した。測定は、超音波振動処理後30秒以内に2回ずつ実施した。カバーガラスの表面に約10μlのサンプル水溶液を滴下し、5分の真空乾燥後、CCDカメラにて、平滑面を選択し、1〜5平方μmの範囲について測定した。その結果を以下の表1に示す。また、測定範囲について得られた2次元解析画像及び粒子の大きさのその数の分布を示すグラフを図1に示す。図1−1は粒子(1)であり、図1−2は粒子(2)であり、図1−3は粒子(3)である。これらの結果から、超音波振動処理によって、アパタイト粒子の粒径が10nm以下にすることが可能であることが確認された。また、siRNAを包含している場合にも同様であることも確認された。
上記実施例1の(1)と超音波処理を行わない以外は同様にして炭酸アパタイト粒子を作製し、粒径及び形態の測定を実施例2と同様に実施した。その2次元解析画像を図2に示す。図2から、超音波振動処理をせずに作製した従来型の炭酸アパタイト粒子は、互いに凝集し、大部分がもはやミクロレベルでも粒径を保持していないことが確認された。このように従来型の炭酸アパタイト粒子は凝集しているため、個々の粒子の粒径を測定することはできないが、図2に示す解析画像から、個々の粒子が横方向に凝集し、幅が数μmオーダーであることは明らかである。
3種類のヒト癌細胞株(KM12sm、22Rv1、及びFaDu)を24ウェルプレートに均等に播種し(約3×105細胞/ディッシュ)、一晩培養した。KM12smは、ヒト大腸癌細胞株、22Rv1株はヒト前立腺癌細胞株であり、FaDu株はヒト頭頚部癌細胞株である。KM12sm株及びFaDu株の培養には、10%のウシ胎仔血清を添加したDMEM培地を用いた。22Rv1株の培養には、10%のウシ胎仔血清を添加したRPMI培地を用いた。培養は、5%CO2、37℃の条件で行った。
ヒト大腸癌細胞であるHCT116株をμ−ディッシュ(35mm,high:ibidi社製)に均等に播種し(1×105細胞/ディッシュ)、10%のFBSを含有するDMEM培地で24時間培養した。その後、実施例3で用いたAlexa Fluor 488で蛍光標識したコントロールsiRNAを包含するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子又はリポフェクタミン2000を含有する新たなDMEM培地(2ml)に培地を交換して培養を継続した。尚、ネガティブコントロールとして、siRNAの包含しないスーパーアパタイト超微細ナノ粒子及びリポフェクタミン2000を用いた。培地交換後、0時間、4時間、及び12時間の時点で培地を取り除き、PBSで2回洗浄して、4%のPFAを用いて30分間固定化した。そして、DAPIが添加されたプロロングゴールド褐色防止剤(Invitorogen社製)を培養ディッシュに一滴添加し、4℃で24時間インキュベートした。その後、共焦点レーザー走査型顕微鏡(FV1000−D,オリンパス社製)を用いて解析した。
7週齢のBALB/cAヌードマウス(日本クレア社製)の背部左右に、ヒト大腸癌細胞であるHCT116株又はHT29株を皮下注射し、固形腫瘍を有するモデルマウスを作製した。腫瘍が10mmの大きさに達した時点でマウスをランダムに3グループに分けた:コントロール群、naked‐siRNA投与群、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子投与群。naked‐siRNA投与群には、6−FAMで蛍光標識したコントロールsiRNA(KOKEN社製)を40μg含有する生理食塩水を尾静脈注射によって投与した。実施例1の(3)と同様の手順で6−FAMで標識したコントロールsiRNAを包含するスーパーアパタイト粒子を作製し、naked‐siRNA投与群への投与量と同量を、スーパーアパタイト粒子投与群に尾静脈投与した。投与量の調整は、J.Control Release,147,101−108(2010)に記載される手法に従って行った。尚、従来型のアパタイト粒子は、比較例1に示す通り凝集して非常に大きな塊を形成しているため、静脈内へ投与すれば血管内で詰まるため、そのような投与はできない。
上記の実施例からスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を利用することによって、より効率的に物質を細胞に導入することが可能であることが示された。そこで、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を利用して導入されたsiRNAが実際に細胞中で機能しているのか否かを抗サバイビンsiRNA(KOKEN社製)を用いて検証した。実施例1の(3)の手順に従い、抗サバイビンsiRNAを包含するスーパーアパタイト粒子を作製した。また、製品のプロトコールに従って、抗サバイビンsiRNAを含むリポフェクタミン2000を作製した。これらを実施例4と同様にして、HCT116株に導入した。導入後24時間及び48時間の時点でウェスタンブロットによってサバイビンタンパク質の存在を確認した。その結果を図11に示す。図11の左は、リポフェクタミン2000の結果であり、右はスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いた結果である。図11から、リポフェクタミン2000を用いた場合は、48時間後にサバイビンタンパク質が完全に消失しているのが確認されたのに対し、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を使用した場合は、24時間の時点でサバイビンタンパク質の完全な消失が確認された。これより、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子で導入されたsiRNAが細胞中で機能することが確認されただけでなく、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子の利用によってリポフェクタミンよりも迅速にsiRNAを細胞内に導入し、機能させることが可能であることが確認された。
上記実施例6に引き続き、HCT116株の細胞増殖に対する影響をWST−8アッセイ(同仁化学研究所製)で評価した。HCT116株を96ウェルプレートに均等に播種し(1×104細胞/ウェル)、24時間培養後に培地を抗サバイビンsiRNAを包含するスーパーアパタイト粒子又はリポフェクタミン2000を含む新たな培地(100μl)と交換した。その後48時間及び72時間の時点で細胞の生存率をマイクロプレートリーダー(680XR,Bio−Rad社製)を用いた分光光度分析によって評価した。その結果を図12に示す。図12から、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子で抗サバイビンsiRNAを導入した場合にのみ顕著な細胞生存率の低下が確認された。
実施例5と同様にしてHCT116株由来の腫瘍を形成したマウスを作成し、腫瘍の大きさが5〜6mmになった時点で抗サバイビンsiRNA又はコントロールsiRNAを包含するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の尾静脈投与を開始した。0日、2日、4日、7日、9日、11日、14日、16日及び18日に各15μgの抗サバイビンsiRNA内包スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を投与した。抗腫瘍活性を腫瘍のサイズに基づいて測定した。腫瘍の大きさは次の式に基づいて算出した:V=a×b2/2(ここで、Vは大きさ、aは長径、bは短径を意味する)。尚、n数は10である。結果を図13に示す。図13に示される結果から、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いて抗サバイビンsiRNAを投与することによって、初期の段階から継続して腫瘍の増大を抑制する効果が得られることが確認された。本試験においてマウスに投与されたsiRNAの全量は135μgであり、この値は既に報告されている他の手段を用いた投与に必要な量の約6分の1〜11分の1である。よって、この結果は、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子が従来の手法よりも効果的であることを示す。
100mlの蒸留水に0.37gのNaHCO3、90μlのNaH2PO4・2H2O(1M)、及び180μlのCaCl2(1M)をこの順に添加して溶解させ1NのHClでpHを7.5に調整した。これを直径0.2μmのフィルターでろ過した。20gのマウス一匹に一回静脈投与に必要な抗癌剤包含スーパーナノアパタイト粒子は、以下のように作製した。即ち、上記のように得られたバッファー40ml当たりに、1.28mlのドキソルビシン(5mM)及び200μlのCaCl2(1M)を混合し、37℃の水浴中で30分間インキュベートした後、15000rpm×5分で遠沈し、得られたペレットを250μlの生理食塩水に溶解し、10分間超音波振動処理をかけることにより、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を得た。
実施例1の(2)と同様にしてスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を作製した。但し、ここでは、水溶液にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子ペレットを溶解した後、5mg/mlのアルブミンを添加して、10分間超音波振動処理を行った。超音波振動処理は、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を含む蒸留水又は生理食塩水を50ml容量のチューブ(BD Falcon社製)に入れ、洗浄槽を30℃以下の水で満たした超音波洗浄器にそれを浮かべて、55Wの高周波出力、38kHzの発振周波数10分間の条件で超音波振動処理を行った。コントロールとして、アルブミンを添加せずに同様の処理を行って作製したスーパーアパタイト超微細ナノ粒子、並びにアルブミンの添加及び超音波振動処理を行わずに作製した炭酸アパタイト粒子を使用した。このようにして調製したスーパーアパタイト粒子の粒径を実施例2と同様にして測定した。その結果を下記の表2及び図15に示す。
実施例1及び比較例1に従って、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子(2)及び(3)並びに従来型の炭酸アパタイト粒子を作製した。遠沈後、各粒子のペレットを1mlの生理食塩水で溶解した。各サンプルに対して1NのHClを滴下して、低下する各pHに対する各サンプルの混濁度をマイクロプレートリーダー(680XR,Bio−Rad社製)を用いた分光光度分析によってOptical Densityとして評価した。なお、pH測定は、微小pH電極(Microelectrodes, Inc.)を備えたDocu pH meter(sartorius社製)を用いた。
Claims (5)
- 平均粒径が50nm以下である炭酸アパタイト粒子が分散した血管内投与に適した水溶液であり、
前記炭酸アパタイト粒子に、抗腫瘍活性を有する薬剤が内包されてなり、且つ
血管内投与される腫瘍治療剤として使用される、水溶液。 - 抗腫瘍活性を有する薬剤が内包されている前記炭酸アパタイト粒子が超音波振動処理によって得られたものである、請求項1に記載の水溶液。
- 水溶液が生理食塩水である、請求項1又は2に記載の水溶液。
- 更に、アルブミンを含む、請求項1〜3のいずれかに記載の水溶液。
- 抗腫瘍活性を有する薬剤を内包した炭酸アパタイト粒子を含む水溶液を収容した容器に対して、溶媒を介して超音波振動与える超音波振動処理を行う工程を含む、請求項1に記載の水溶液を製造する方法。
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