CN109536454A - 工程化改造巨噬细胞及其在脓毒败血症中的应用 - Google Patents

工程化改造巨噬细胞及其在脓毒败血症中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备表达mIL4蛋白的巨噬细胞的方法。该方法包括如下步骤：使巨噬细胞表达mIL4蛋白，得到表达mIL4蛋白的巨噬细胞。按照该方法的步骤，本发明的发明人制备了慢病毒pCDH‑mIL4感染的RAW264.7细胞。实验证明，向小鼠脓毒败血症模型尾静脉注射慢病毒pCDH‑mIL4感染的RAW264.7细胞后，小鼠的存活率显著提高；向急性肺损伤的小鼠的气管注射慢病毒pCDH‑mIL4感染的RAW264.7细胞后，小鼠的存活率也显著提高。由此可见，慢病毒pCDH‑mIL4感染的RAW264.7细胞可以治疗脓毒败血症和急性肺损伤。本发明具有重要的应用价值。

Description

工程化改造巨噬细胞及其在脓毒败血症中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及工程化改造巨噬细胞及其在脓毒败血症中的应用。
背景技术
脓毒败血症是临床常见的急危重症，死亡率高，至今仍缺乏疗效高、副作用小的药物和治疗方法。细菌感染是导致脓毒败血症最常见的病因。细菌的产物，如细菌外壁成分LPS、外毒素等可直接或间接的刺激单核细胞、巨噬细胞、多形核中性粒白细胞等启动炎症进程，产生大量的TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎细胞因子，过多的促炎因子分泌导致严重的炎症反应，造成脓毒休克甚至机体的死亡。抑制巨噬细胞的炎症反应成为预防和治疗败血症的一个重要方向，但迄今尚未发现有效方法。
白细胞介素-4(IL-4)是具有免疫活性的细胞因子，主要由活化的T细胞分泌产生。IL-4在免疫系统中作为重要的免疫细胞因子，不仅可以促进机体中靶细胞的分化与增殖，同时也可以加强细胞对病原体微生物的杀伤效应和机体的抗感染能力。IL-4可直接诱导巨噬细胞向M2型极化。相对于M1型巨噬细胞，M2型巨噬细胞的TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12和IL-23等炎性因子表达量很低，但高表达抑炎因子IL-10、TGF-β、清道夫受体和精氨酸酶1，从而具有抑制炎症反应，促进损伤组织的修复的功能。但巨噬细胞自身并不分泌IL-4，且IL-4在体内的半衰期非常短，有效时间2-10min左右，很容易被机体所清除，这便使得直接注射IL-4很难在体内发挥抗炎作用。因此，开发一种长效缓释的IL-4释放体系十分必要，并具有迫切的临床需求和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是治疗脓毒败血症。
本发明首先保护一种制备表达mIL4蛋白的巨噬细胞的方法，可包括如下步骤：使巨噬细胞表达mIL4蛋白，得到表达mIL4蛋白的巨噬细胞。
上述方法中，所述“使巨噬细胞表达mIL4蛋白”可为将含有编码mIL4蛋白的基因的重组载体导入巨噬细胞，得到表达mIL4蛋白的巨噬细胞。
上述方法中，所述mIL4蛋白可为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
上述方法中，所述编码mIL4蛋白的基因可为如下b1)或b2)所示的DNA分子：
b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。
上述方法中，所述重组载体可为重组慢病毒载体。
上述任一所述方法可包括如下步骤：
(1)利用所述重组慢病毒载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞，培养，获得慢病毒；
(2)将步骤(1)得到的慢病毒感染巨噬细胞，从而获得表达mIL4蛋白的巨噬细胞。
上述方法中，所述慢病毒包装质粒可为pVSVg和psPAX2。所述慢病毒包装细胞可为293T细胞。
上述方法中，所述重组慢病毒载体可为将mIL4蛋白的编码基因(如序列表中序列1所示)插入到载体pCDH-MSCV-MCS-EF1α-copGFP-T2A-Puro的多克隆位点之间后得到的重组质粒。
所述重组慢病毒载体具体可为实施例提及的重组质粒pCDH-mIL4。所述重组质粒pCDH-mIL4可为向载体pCDH-MSCV-MCS-EF1α-copGFP-T2A-Puro的限制性内切酶EcoRI的识别位点和BamHI识别位点之间插入mIL4蛋白的编码基因(如序列表中序列1所示)，得到的重组质粒。
上述任一所述巨噬细胞可为RAW264.7细胞。
上述任一所述的方法制备得到的表达mIL4蛋白的巨噬细胞也属于本发明的保护范围。
本发明还保护(A1)或(A2)或(A3)或(A4)或(A5)或(A6)。
(A1)上述任一所述表达mIL4蛋白的巨噬细胞在制备用于预防和/或治疗由炎症引起的疾病的产品中的应用。
(A2)上述任一所述表达mIL4蛋白的巨噬细胞在预防和/或治疗由炎症引起的疾病中的应用。
(A3)上述任一所述表达mIL4蛋白的巨噬细胞在制备具有抑制炎症反应和/或促进损伤组织修复的产品中的应用。
(A4)上述任一所述表达mIL4蛋白的巨噬细胞在抑制炎症反应和/或促进损伤组织修复中的应用。
(A5)上述任一所述表达mIL4蛋白的巨噬细胞在制备用于治疗肺损伤的产品中的应用。
(A6)上述任一所述表达mIL4蛋白的巨噬细胞在治疗肺损伤中的应用。
上述任一所述的应用中，所述产品可为药物。
本发明还保护一种产品，其含有上述任一所述表达mIL4蛋白的巨噬细胞；所述产品的功能为(B1)或(B2)或(B3)：
(B1)预防和/或治疗由炎症引起的疾病；
(B2)抑制炎症反应和/或促进损伤组织修复；
(B3)治疗肺损伤。
所述产品可为药物。
上述任一所述由炎症引起的疾病可为败血症。所述败血症具体可为脓毒败血症。
上述任一所述肺损伤可为急性肺损伤。
本发明的发明人制备了表达mIL4蛋白的巨噬细胞，即实施例中的慢病毒pCDH-mIL4感染的RAW264.7细胞。实验证明，向小鼠脓毒败血症模型(通过腹腔注射LPS制备)尾静脉注射慢病毒pCDH-mIL4感染的RAW264.7细胞后，小鼠的存活率显著提高；向急性肺损伤的小鼠的气管注射慢病毒pCDH-mIL4感染的RAW264.7细胞后，小鼠的存活率也显著提高。由此可见，慢病毒pCDH-mIL4感染的RAW264.7细胞可以治疗脓毒败血症和急性肺损伤。同时实验证明慢病毒pCDH-mIL4感染的RAW264.7细胞可以长效释放抗炎因子白细胞介素-4，解决了蛋白药物IL-4在体内半衰期极短的问题。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中步骤三的实验结果。
图2为ELISA方法检测IL-4-RAW细胞培养上清中mIL4蛋白的表达。
图3为Western blot检测IL-4-RAW细胞中mIL4蛋白的表达。
图4为实施例2的实验结果。
图5为实施例3的实验结果。
图6为实施例4的实验结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
载体pCDH-MSCV-MCS-EF1α-copGFP-T2A-Puro为SBI公司的产品。293T细胞为ATCC公司的产品。1640培养基为Lonza公司的产品。胎牛血清为Gibco公司的产品。pVSVg和psPAX2均为AddGene公司的产品。Lipofectamine 2000为INVITROGEN公司的产品。IL-4Mouse Uncoated ELISA Kit with PlatesELISA试剂盒为Thermo Fisher公司的产品。P-STAT6抗体和STAT6抗体均为CST公司的产品。辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG为JacksonImmunoResearch公司的产品。ECL发光底物为Thermo Fisher公司的产品。超滤离心管为millipore公司的产品。
下述实施例中的常规培养基均为含10％(v/v)胎牛血清的1640培养基。
实施例1、稳定表达mIL4蛋白的巨噬细胞株(即慢病毒pCDH-mIL4感染的RAW264.7细胞或IL-4-RAW细胞)的获得和其分泌的mIL4蛋白的检测
一、重组质粒pCDH-mIL4的构建
向载体pCDH-MSCV-MCS-EF1α-copGFP-T2A-Puro的限制性内切酶EcoRI的识别位点和BamHI识别位点之间插入mIL4基因(核苷酸序列如序列表中序列1所示)，得到重组质粒pCDH-mIL4。
重组质粒pCDH-mIL4表达mIL4蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
二、慢病毒pCDH-mIL4浓缩液的获得
1、将生长至对数生长期的293T细胞接种于盛有10mL常规培养基的培养皿(直径为60mm)，37℃、5％CO2培养。
2、将1μg pVSVg、3μg psPAX2、4μg重组质粒pCDH-mIL4和100μL无血清的1640培养基温和混匀，得到混合液1。将16μLLipofectamine 2000和100μL无血清的1640培养基温和混匀，室温静置5min，得到混合液2。将混合液1和混合液2混匀，室温静置20min，得到混合液。
3、完成步骤2后，将混合液缓慢滴入完成步骤1的培养皿(此时培养皿中约含有5×106个293T细胞)，37℃、5％CO2培养8h或过夜(目的为进行慢病毒包装)。
4、完成步骤3后，取所述培养皿，弃上清液，加入5mL常规培养基，37℃、5％CO2培养16-28h，收集上清(命名为上清1)。
5、完成步骤4后，取所述培养皿，再加入5mL常规培养基，37℃、5％CO2培养至72h(此处的培养至72h是指：从步骤3混合液滴入培养皿的时间开始计时，经过步骤3、4和5，混合液在培养皿的培养时间为72h)，收集上清(命名为上清2)。
6、将所述上清1和所述上清2混合，得到上清液。取所述上清液，4℃、3000r离心5min，收集上清3。
7、取所述上清3，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液。
8、将所述滤液加入超滤离心管，4℃、5000r离心20min，得到约200μL慢病毒pCDH-mIL4浓缩液。
三、稳定表达mIL4蛋白的巨噬细胞株(即慢病毒pCDH-mIL4感染的RAW264.7细胞或IL-4-RAW细胞)的获得
1、取24孔板，向其中一个孔接种RAW264.7细胞(约1×103个)，然后加入0.5mL常规培养基和20μL慢病毒pCDH-mIL4浓缩液，37℃、5％CO2培养72h。
2、完成步骤1后，加入嘌呤霉素，得到体系；该体系中，嘌呤霉素的浓度为20ng/mL。
3、完成步骤2后，取所述体系，37℃、5％CO2培养24h，先弃掉上清液，用PBS缓冲液(Lonza公司的产品)洗涤一次；然后加入0.5mL常规培养基，获得慢病毒pCDH-mIL4感染的RAW264.7细胞(未感染慢病毒pCDH-mIL4的RAW264.7细胞培养时被嘌呤霉素杀死)。
将慢病毒pCDH-mIL4感染的RAW264.7细胞(以下简称IL-4-RAW或IL-4-RAW细胞)置于倒置荧光显微镜下，在激发光(450～490nm蓝光波长)照射下观察。
实验结果见图1(左图为40×物镜下的明场图，右图为40×物镜下的暗场图)。由于载体pCDH-MSCV-MCS-EF1α-copGFP-T2A-Puro能够表达绿色荧光蛋白，所以IL-4-RAW细胞可呈现出绿色荧光。
按照上述步骤二和三的方法，将步骤二中的重组质粒pCDH-mIL4替换为质粒pCDH-CON(即载体pCDH-MSCV-MCS-EF1α-copGFP-T2A-Puro)，其它步骤均不变，得到慢病毒pCDH-CON浓缩液，进而得到慢病毒pCDH-CON感染的RAW264.7细胞(以下简称CON-RAW或CON-RAW细胞)。
四、IL-4-RAW细胞分泌的mIL4蛋白的检测
1、ELISA方法检测IL-4-RAW细胞中mIL4蛋白的表达
待测细胞为IL-4-RAW细胞或CON-RAW细胞。
(1)取六孔板，先加入1×105个待测细胞，然后加入2mL常规培养基，37℃、5％CO2培养，分别于培养第0h、第1h、第6h和第48h，取100μL上清。
(2)完成步骤(1)后，取所述上清，按照IL-4Mouse Uncoated ELISA Kit withPlatesELISA试剂盒的操作步骤，检测上清中mIL4蛋白的浓度。
以培养时间为横坐标，上清中mIL4蛋白的浓度为纵坐标，绘制曲线。
结果见图2。结果表明，IL-4-RAW细胞在培养第1h即有mIL4蛋白的表达，且随着培养时间的延长，mIL4蛋白的表达量也在不断的增加；CON-RAW细胞中则没有mIL4蛋白的表达。
2、Western blot检测IL-4-RAW细胞中mIL4蛋白的表达
由于信号传导与转录激活因子6(signal transducer and activator oftranscription 6，Stat6)能被mIL4蛋白活化，表现为stat6被磷酸化(p-STAT6)，因此可以通过Western blot检测Stat6是否磷酸化确定待测细胞能否分泌mIL4蛋白。
待测细胞为IL-4-RAW细胞、CON-RAW细胞或RAW264.7细胞。
(1)取六孔板，加入待测细胞(约1×105个)和2mL培养基(待测细胞和培养基的组合形式详见表1)，37℃、5％CO2培养24h。
表1
注：CON-RAW SUP混合培养基由1体积份CON-RAW细胞的培养上清和1体积份常规培养基混合而成。IL-4-RAW SUP混合培养基由1体积份IL-4-RAW细胞的培养上清和1体积份常规培养基混合而成。IL-4TXSUP混合培养基由1体积份包装了慢病毒pCDH-mIL4的293T细胞的培养上清和1体积份常规培养基混合而成。
(2)完成步骤(1)后，弃培养基，加入1mL PBS缓冲液(Lonza公司的产品)洗涤一遍，弃洗涤液。
(3)完成步骤(2)后，每孔加入150μL RIPA裂解液(含150mM NaCl、1mM EDTA、1％(v/v)NP-40、10％(v/v)Glycerol、0.5％(m/v)SDS和pH7.4、50mM Tris-HCl的水溶液)裂解细胞2min；然后每孔再加入150μL 2×SampleBuffer(含100mM DTT、4％(m/v)SDS、0.2％(m/v)溴酚蓝、20％(v/v)甘油和pH6.8、100mM Tris-HCl的水溶液)，得到混合液。将该混合液移入1.5mL离心管，98℃煮样15min，得到上样液。
(4)完成步骤(3)后，将上样液使用12％SDS-PAGE凝胶进行Western blot。使用P-STAT6抗体作为一抗检测p-STAT6。使用STAT6抗体作为一抗检测STAT6。使用辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG作为二抗。使用ECL发光底物显影。
实验结果见图3(NT为用常规培养基培养的RAW264.7细胞(即第1个孔)，CON-RAWSUP为用CON-RAW SUP混合培养基培养的RAW264.7细胞(即第2个孔)，IL-4-RAW SUP为用IL-4-RAW SUP混合培养基培养的RAW264.7细胞(即第3个孔)，IL-4TX SUP为用IL-4TX SUP混合培养基培养的RAW264.7细胞(即第4个孔)，CON-RAW为用常规培养基培养的CON-RAW细胞(即第5个孔)，IL-4-RAW为用常规培养基培养的IL-4-RAW细胞(即第6个孔))。结果表明，使用IL-4-RAW SUP混合培养基培养的RAW264.7细胞中，Stat6能被磷酸化，可见，IL-4-RAW能分泌mIL4蛋白至上清；使用常规培养基培养的IL-4-RAW细胞中，Stat6能被磷酸化，可见IL-4-RAW能分泌mIL4蛋白作用于自身。
实施例2、IL-4-RAW细胞的应用
C57BL/6野生型小鼠为北京华阜康生物科技股份有限公司的产品。
PBS缓冲液为pH7.2-7.4、67mM PO4(不含Ca和Mg)的PBS缓冲液。
1、取24只、6-8周的C57BL/6野生型小鼠，腹腔注射LPS(通过腹腔注射LPS制备小鼠脓毒败血症模型)，注射剂量为20mg/kg。
2、完成步骤1后1h，将24只C57BL/6野生型小鼠随机分成PBS组、CON-RAW组和IL-4-RAW组三组(每组8只)。然后进行如下处理：
PBS组(阴性对照组)：每只小鼠尾静脉注射200μLPBS缓冲液。
CON-RAW组(阴性对照组)：每只小鼠尾静脉注射200μL CON-RAW细胞悬液。
CON-RAW细胞悬液的制备方法为：收集CON-RAW细胞，然后用PBS缓冲液重悬，得到细胞浓度为5×107个/mL的CON-RAW细胞悬液。
IL-4-RAW组(实验组)：每只小鼠尾静脉注射200μL IL-4-RAW细胞悬液。
IL-4-RAW细胞悬液的制备方法为：收集IL-4-RAW细胞，然后用PBS缓冲液重悬，得到细胞浓度为5×107个/mL的IL-4-RAW细胞悬液。
3、完成步骤2后，观察各组小鼠的生存情况，并计算各组的存活率。存活率＝生存小鼠的只数/8只×100％。
以完成步骤2后小鼠的生存时间为横坐标，存活率为纵坐标，绘制各组的生存曲线。生存分析采用Log Rank检验，P<0.05。
实验结果见图4(PBS为PBS组，CON-RAW为CON-RAW组，IL-4-RAW为IL-4-RAW组)。结果表明，PBS组和CON-RAW组小鼠在50h内全部死亡，而IL-4-RAW组在100h时存活率在50％以上，IL-4-RAW组存活率高于PBS组和CON-RAW组，IL-4-RAW组生存时间也长于PBS组和CON-RAW组，差异均有统计学意义。
由此可见，实施例1制备的IL-4-RAW细胞可以用于治疗脓毒败血症。
实施例3、IL-4-RAW细胞长效释放白细胞介素-4
雌性健康C57BL/6J小鼠为北京华阜康生物科技有限公司的产品。
PBS缓冲液为pH7.2-7.4、67mM PO4(不含Ca和Mg)的PBS缓冲液。
1、取12只、7-8周的雌性健康C57BL/6J小鼠，每只小鼠腹腔注射氯胺酮(用于麻醉)，注射剂量为220mg/kg；小鼠麻醉后，使其仰卧固定在实验台上，剪去颈部毛，消毒，纵向切口剪开颈部皮肤，充分暴露气管，用注射器经两气管软骨环之间刺入气管内，滴注LPS溶液，注射剂量为15mg/kg。
2、完成步骤10.5h后，将12只雌性健康C57BL/6J小鼠随机分成PBS组、IL-4组和IL-4-RAW组三组(每组4只)。然后进行如下处理：
PBS组(阴性对照组)：每只小鼠气管注射25μL PBS缓冲液。
IL-4-RAW组(实验组)：每只小鼠气管注射25μL IL-4-RAW细胞悬液。
IL-4-RAW细胞悬液的制备方法为：收集IL-4-RAW细胞，然后用PBS缓冲液重悬，得到细胞浓度为2.5×105个/mL的IL-4-RAW细胞悬液。
IL-4组(阳性对照组)：每只小鼠气管注射25μLIL-4蛋白溶液，注射剂量为10ng/g。
3、完成步骤21h、3h、6h、12h、24h或48h后，处死小鼠，取出全肺匀浆，然后按照IL-4Mouse Uncoated ELISA Kit with PlatesELISA试剂盒的操作步骤，检测肺组织中IL-4蛋白的浓度。
检测结果见图5(PBS为PBS组，IL-4-RAW为IL-4-RAW组，IL-4为IL-4组)。结果表明，PBS组的IL-4蛋白浓度一直处于较低水平；IL-4组的IL-4蛋白浓度在注射1h即达到顶峰，后逐渐回落，在注射12h时降至PBS组的水平；IL-4-RAW组的IL-4蛋白浓度在注射12h达到顶峰，高水平的IL-4浓度能一直持续到48h，达到了长效缓释的作用。IL-4-RAW细胞长效释放白细胞介素-4，有利于脓毒败血症的治疗。
实施例4、IL-4-RAW细胞治疗小鼠急性肺损伤
雌性健康C57BL/6J小鼠为北京华阜康生物科技有限公司的产品。
PBS缓冲液为pH7.2-7.4、67mM PO4(不含Ca和Mg)的PBS缓冲液。
1、取24只、7-8周的雌性健康C57BL/6J小鼠，每只小鼠腹腔注射氯胺酮(用于麻醉)，注射剂量为220mg/kg；小鼠麻醉后，使其仰卧固定在实验台上，剪去颈部毛，消毒，纵向切口剪开颈部皮肤，充分暴露气管，用注射器经两气管软骨环之间刺入气管内，滴注LPS溶液，注射剂量为15mg/kg。
2、完成步骤1 0.5h后，将24只雌性健康C57BL/6J小鼠随机分成PBS组、CON-RAW组和IL-4-RAW组三组(每组8只)。然后进行如下处理：
PBS组(阴性对照组)：每只小鼠气管注射25μL PBS缓冲液。
IL-4-RAW组(实验组)：每只小鼠气管注射25μL IL-4-RAW细胞悬液。
IL-4-RAW细胞悬液的制备方法为：收集IL-4-RAW细胞，然后用PBS缓冲液重悬，得到细胞浓度为2.5×105个/mL的IL-4-RAW细胞悬液。
CON-RAW组(阴性对照组)：每只小鼠气管注射25μL CON-RAW细胞悬液。
CON-RAW细胞悬液的制备方法为：收集CON-RAW细胞，然后用PBS缓冲液重悬，得到细胞浓度为2.5×105个/mL的CON-RAW细胞悬液。
3、完成步骤2后，观察各组小鼠的生存情况，并计算各组的存活率。存活率＝生存小鼠的只数/8只×100％。
以完成步骤2后小鼠的生存时间为横坐标，存活率为纵坐标，绘制各组的生存曲线。生存分析采用Log Rank检验，P<0.05。
实验结果见图6(PBS为PBS组，CON-RAW为CON-RAW组，IL-4-RAW为IL-4-RAW组)。结果表明，PBS组和CON-RAW组最早出现小鼠死亡，且24h后IL-4-RAW组小鼠的生存率在任一时间点都远远高于PBS组和CON-RAW组。由此可见，IL-4-RAW细胞可以治疗小鼠急性肺损伤。
<110> 中国人民解放军第三〇七医院
<120> 工程化改造巨噬细胞及其在脓毒败血症中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
atgggtctca acccccagct agttgtcatc ctgctcttct ttctcgaatg taccaggagc 60
catatccacg gatgcgacaa aaatcacttg agagagatca tcggcatttt gaacgaggtc 120
acaggagaag ggacgccatg cacggagatg gatgtgccaa acgtcctcac agcaacgaag 180
aacaccacag agagtgagct cgtctgtagg gcttccaagg tgcttcgcat attttattta 240
aaacatggga aaactccatg cttgaagaag aactctagtg ttctcatgga gctgcagaga 300
ctctttcggg cttttcgatg cctggattca tcgataagct gcaccatgaa tgagtccaag 360
tccacatcac tgaaagactt cctggaaagc ctaaagagca tcatgcaaat ggattactcg 420
<210> 2
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
Met Gly Leu Asn Pro Gln Leu Val Val Ile Leu Leu Phe Phe Leu Glu
1 5 10 15
Cys Thr Arg Ser His Ile His Gly Cys Asp Lys Asn His Leu Arg Glu
20 25 30
Ile Ile Gly Ile Leu Asn Glu Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Cys Thr
35 40 45
Glu Met Asp Val Pro Asn Val Leu Thr Ala Thr Lys Asn Thr Thr Glu
50 55 60
Ser Glu Leu Val Cys Arg Ala Ser Lys Val Leu Arg Ile Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Lys His Gly Lys Thr Pro Cys Leu Lys Lys Asn Ser Ser Val Leu Met
85 90 95
Glu Leu Gln Arg Leu Phe Arg Ala Phe Arg Cys Leu Asp Ser Ser Ile
100 105 110
Ser Cys Thr Met Asn Glu Ser Lys Ser Thr Ser Leu Lys Asp Phe Leu
115 120 125
Glu Ser Leu Lys Ser Ile Met Gln Met Asp Tyr Ser
130 135 140

Claims (10)

1.一种制备表达mIL4蛋白的巨噬细胞的方法，包括如下步骤：使巨噬细胞表达mIL4蛋白，得到表达mIL4蛋白的巨噬细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述“使巨噬细胞表达mIL4蛋白”为将含有编码mIL4蛋白的基因的重组载体导入巨噬细胞，得到表达mIL4蛋白的巨噬细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述mIL4蛋白为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述重组载体为重组慢病毒载体。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)利用所述重组慢病毒载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞，培养，获得慢病毒；
(2)将步骤(1)得到的慢病毒感染巨噬细胞，从而获得表达mIL4蛋白的巨噬细胞。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述重组慢病毒载体为将mIL4蛋白的编码基因插入到载体pCDH-MSCV-MCS-EF1α-copGFP-T2A-Puro的多克隆位点之间后得到的重组质粒。
7.权利要求1至6任一所述的方法制备得到的表达mIL4蛋白的巨噬细胞。
8.(A1)或(A2)或(A3)或(A4)或(A5)或(A6)：
(A1)权利要求7所述表达mIL4蛋白的巨噬细胞在制备用于预防和/或治疗由炎症引起的疾病的产品中的应用；
(A2)权利要求7所述表达mIL4蛋白的巨噬细胞在预防和/或治疗由炎症引起的疾病中的应用；
(A3)权利要求7所述表达mIL4蛋白的巨噬细胞在制备具有抑制炎症反应和/或促进损伤组织修复的产品中的应用；
(A4)权利要求7所述表达mIL4蛋白的巨噬细胞在抑制炎症反应和/或促进损伤组织修复中的应用；
(A5)权利要求7所述表达mIL4蛋白的巨噬细胞在制备用于治疗肺损伤的产品中的应用；
(A6)权利要求7所述表达mIL4蛋白的巨噬细胞在治疗肺损伤中的应用。
9.一种产品，其含有权利要求7所述表达mIL4蛋白的巨噬细胞；所述产品的功能为(B1)或(B2)或(B3)：
(B1)预防和/或治疗由炎症引起的疾病；
(B2)抑制炎症反应和/或促进损伤组织修复；
(B3)治疗肺损伤。
10.如权利要求8所述的应用或权利要求9所述的产品，其特征在于：所述由炎症引起的疾病为败血症。
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