CN109535162B - 一种n-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法 - Google Patents
一种n-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109535162B CN109535162B CN201811528470.XA CN201811528470A CN109535162B CN 109535162 B CN109535162 B CN 109535162B CN 201811528470 A CN201811528470 A CN 201811528470A CN 109535162 B CN109535162 B CN 109535162B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- folic acid
- aminobenzoyl
- glutamyl
- impurity
- semi
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
- C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D487/04—Ortho-condensed systems
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于有机合成领域，具体涉及一种N‑对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，所述方法包括如下步骤：以叶酸和对氨基苯甲酰谷氨酸为原料，在有机溶剂中，加入有机碱，在缩合剂、缩合活化剂和催化剂的作用下，经缩合反应生成N‑对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，再经制备色谱分离，得到N‑对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸。本发明提供了一种N‑对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，用于叶酸的质量控制之中，有利于进一步研究N‑对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的产生机理及控制方法。
Description
技术领域
本发明属于有机合成领域，具体涉及一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法。
背景技术
叶酸(folic acid)，维生素B9，相当于蝶酰谷氨酸(pteroylglutamic acid，PGA)，是米切尔(H.K.Mitchell，1941)从菠菜叶中提取纯化的，故而命名为叶酸。有促进骨髓中幼细胞成熟的作用，人类如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，对孕妇尤其重要。叶酸是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。在体内叶酸以四氢叶酸的形式起作用，四氢叶酸在体内参与嘌呤核酸和嘧啶核苷酸的合成和转化。叶酸在制造核酸(核糖核酸、脱氧核糖核酸)上扮演重要的角色。叶酸帮助蛋白质的代谢，并与维生素B12共同促进红细胞的生成和成熟，是制造红血球不可缺少的物质。
叶酸成品在进入欧盟市场的时候，应符合欧洲药典EP的质量要求，即叶酸成品中杂质叶酸的含量≤0.5％。EP9.5中对杂质H提出了要求，杂质H即为N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸，化学名为(2S)-2-[4-[(4S)-4-[4-[[(2-氨基-4-氧代-1,4-二氢蝶啶-6-基)-甲基]氨基]苯甲酰氨基]-4-羧基丁酰胺基]苯甲酰氨基]戊二酸。
在叶酸质量研究中，需要得到纯度大于95％的N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸对照品，用于叶酸成品中杂质H定性及定量研究。EP9.5于2018年刚颁布，杂质H的制备方法尚未见报道，而此杂质H的标准品也难以购买或者价格昂贵，开发N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的合成制备方法意义深远。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，用于叶酸的质量控制之中。
本发明以叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸为原料，经缩合剂催化，发生酰胺化反应，得到杂质H，并显著提高H粗品的含量，再经制备色谱法分离，得到纯度98％以上的N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸。
本发明的研究有利于进一步研究N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的产生机理及控制方法，能有效提高叶酸质量控制水平。
本发明的具体方案是：
一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，包括
以叶酸和对氨基苯甲酰谷氨酸为原料，在有机溶剂中，加入有机碱，在缩合剂、缩合活化剂和催化剂的作用下，经缩合反应生成N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，再经制备色谱分离，得到N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸。
基于物质的量比例计算，上述叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：有机碱：缩合剂：缩合活化剂：催化剂＝1：1.5-2：1.5-2：2-4：2-4：0.05-0.1。
上述有机溶剂为极性大的有机溶剂，选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙二醇中的一种或多种，优选为DMF。
上述有机碱选自三乙胺(TEA)、N-甲基吗啡啉(NMM)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶中的一种，优选为三乙胺。
上述缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N'-羰基二咪唑(CDI)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)中的一种，缩合活化剂和催化剂各选自1-羟基苯并三唑(HOBT)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、4-吡咯烷基吡啶(4-PPY)、2-羟基-3a,4,4,7a-四氢-1H-4,7-甲基异吲哚-1,3(2H)-二酮(NHNI)中的一种，缩合活化剂和催化剂可以选择同一种物质。优选地，使用EDCI为缩合剂、HOBT为缩合活化剂、DMAP为催化剂。
上述反应在水浴中进行，水浴温度为25-60℃，反应时间为12-48小时。
上述反应进一步包括，使用HPLC跟踪反应，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度45-60℃，浓缩得到固体，冷却后加入纯化水100-500mL，室温搅拌打浆4-12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品。
上述制备色谱为半制备色谱，色谱柱为C1810μm 100a；半制备检测器波长为280nm，流速为20ml/min，半制备进样量每次10ml。
上述半制备流动相配制方法为：三水合磷酸氢二钾55g，磷酸氢二钾75g，用8000ml纯水溶解，另加900ml无水甲醇。
上述制备色谱分离得到N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的具体方法为：所述N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，流出液减压浓缩后用纯水稀释1-5倍，再进行半制备色谱分离，用质量分数5-20％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸。
上述稀释倍数优选为2倍，甲醇的质量分数优选为10-20％，再优选为10％。
上述浓缩为真空浓缩，浓缩温度45℃、真空度≤-0.09MPa，时间12小时。
上述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥温度≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12-36小时，优选为24h。
经检测，所述叶酸杂质H，按照欧洲药典叶酸液相分析方法，叶酸保留时间约8.5min，H保留时间约为叶酸的2.5倍，与药典中杂质H的相对保留时间(2.25)基本保持一致。
本发明还涉及上述方法制备得到的N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸在叶酸质量控制中的应用。
与现有技术相比，本发明采用全新的角度，即从制备高纯度N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的角度去研究其合成机理及控制方法，所制备得到的N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸具有高达98％的纯度，适用于对N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的性质和合成机理进行深入的研究过程，为有效提高叶酸质量控制水平奠定了基础。
另一方面，本发明在制备N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的过程中，对合成步骤与提纯步骤进行了系统优化，两者有机结合，并通过制备过程参数以及提纯过程操作参数的密切配合，实现了产物高纯化。本发明获得了一整套体系的适用于制备高纯N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的方法，有重要的现实意义。
附图说明
图1为叶酸粗品的HPLC图。
图2为实施例1中合成的杂质H粗品的HPLC具体数据图。
图3为实施例1中杂质H粗品经制备纯化后的的HPLC具体数据图。
图4为实施例1中纯化后的杂质H高分辨质谱图。
图5为实施例1中纯化后的杂质H的1H NMR图谱。
图6为实施例1中纯化后的杂质H的13C NMR图谱。
图7为实施例1中纯化后的杂质H的DEPT135图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或者改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明实施例中所用的各种原料和试剂如无特别说明均为市售购买。
本发明实施例中，采用北京创新通恒的LC300高效液相色谱仪进行制备，柱子型号C1810μm 100a；半制备检测器波长至280nm，流速至20mL/min；半制备进样量每次10mL。
半制备流动相配制方法为：三水合磷酸氢二钾55g，磷酸氢二钾75g，用8000mL纯水溶解，另加900mL无水甲醇。
依据EP9.5叶酸检测方法及条件对制备得到的H进行HPLC检测，得到其纯度。HPLC型号为岛津LC-20AT，柱子型号LiChrospher 100RP-8endcapped(5μm)250-4。
高分辨质谱仪器型号为AB Sciex Triple TOF 5600+三重四级杆飞行时间质谱仪。测试条件为ESI源，Negative模式。
采用Bruker Avance 400型核磁共振波谱仪完成所有的NMR测试，质子共振频率为400.13MHz.实验所用溶剂均为DMSO-d6，TMS为内标物，实验温度均为25℃。
实施例1
(1)叶酸杂质H粗品的合成
将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，EDCI，HOBT，催化剂DMAP溶于500mL DMF中，加入TEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：EDCI：HOBT：DMAP＝1：1.5：1.5：2：2：0.05。控制水浴反应温度30℃，反应搅拌时间24h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度60℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水300mL，室温搅拌打浆4小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度14.0％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间36小时。
(2)叶酸杂质H的提纯
叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。
得到的叶酸杂质H的纯度为98.5％。
如图1所示，叶酸粗品种，叶酸的保留时间为9.456min，其含量为98.2％；杂质H的保留时间为23.552min，含量为0.08％；H的相对叶酸的保留实际为2.49，与EP杂质H相对保留时间2.5保持一致。
图2、图3分别为合成的杂质H粗品、纯化后H的HPLC图谱。杂质H粗品中，H含量14.0％，经制备纯化后，杂质H含量达到98.5％。
如图2所示，叶酸的保留时间为8.990min，其含量为41.5％；杂质H的保留时间为21.79min，含量为14.0％；H的相对叶酸的保留实际为2.42，与EP杂质H相对保留时间2.5基本一致。
如图3所示，叶酸的保留时间为8.548min，与EP药典中叶酸保留时间约8.5min基本一致，其含量为0.11％；杂质H的保留时间为19.95min，含量为98.5％；H的相对叶酸的保留实际为2.25，与EP杂质H相对保留时间2.5基本一致。
经高分辨质谱检测(图4)，样品H的HRESI-MS负离子质谱图中，在m/z 688.2115处具有较强的离子峰，为样品的[M-H]-，该离子的准确分子式为C31H30N9O10，说明样品的准确分子式为C31H31N9O10，与H的分子式一致。
其1H NMR、13C NMR、DEPT135分别见附图5、6、7，数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.68(s,1H),10.37(s,1H),8.64(s,1H),8.50(d,J＝7.6Hz,1H),8.23(d,J＝7.5Hz,1H),7.84(d,J＝8.4Hz,2H),7.71(s,2H),7.69(s,2H),7.10(s,1H),6.99(s,1H),6.65(d,J＝8.4Hz,2H),4.54-4.48(m,2H),4.40-4.35(m,2H),2.43-2.27(m,4H),2.11-1.90(m,4H)；13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ173.93,173.85,173.45,171.29,166.53,166.02,160.94,156.34,153.98,150.87,148.57,148.50,141.78,129.15,128.38,128.27,127.95,121.17,118.44,111.19,53.95,51.92,45.91,30.65,30.44,26.78,25.94；DEPT13513C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ148.33,128.90,128.02,118.17,110.93,53.70,51.68,45.65,30.41,30.19,26.53,25.69.
实施例2
(1)叶酸杂质H粗品的合成
将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，EDCI，HOBT，催化剂DMAP溶于500mL DMF中，加入TEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：EDCI：HOBT：DMAP＝1：1.5：2：3：3：0.05。控制水浴反应温度30℃，反应搅拌时间36h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度60℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水300mL，室温搅拌打浆4小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度10.64％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间36小时。
(2)叶酸杂质H的提纯
叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。
得到的叶酸杂质H的纯度为97.3％。
实施例3
(1)叶酸杂质H粗品的合成
将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，EDCI，HOBT，催化剂DMAP溶于500mLDMF中，加入TEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：EDCI：HOBT：DMAP＝1：2：2：4：4：0.1。控制水浴反应温度30℃，反应搅拌时间24h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度50℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水300mL，室温搅拌打浆12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.8％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间36小时。
(2)叶酸杂质H的提纯
叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。
得到的叶酸杂质H的纯度为97.9％。
实施例4
(1)叶酸杂质H粗品的合成
将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，EDCI，HOBT，催化剂DMAP溶于500mL DMF中，加入TEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：EDCI：HOBT：DMAP＝1：2：2：4：4：0.1。控制水浴反应温度30℃，反应搅拌时间48h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度60℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水300mL，室温搅拌打浆8小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.95％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间36小时。
(2)叶酸杂质H的提纯
叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。
得到的叶酸杂质H的纯度为96.6％。
实施例5
(1)叶酸杂质H粗品的合成
将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，DCC，HOAT，催化剂4-PPY溶于500mL DMSO中，加入DIPEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：DIPEA：DCC：HOAT：4-PPY＝1：1.5：1.5：2：2：0.05。控制水浴反应温度25℃，反应搅拌时间12h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度50℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水400mL，室温搅拌打浆4小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度12.5％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间36小时。
(2)叶酸杂质H的提纯
叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。
得到的叶酸杂质H的纯度为97.1％。
实施例6
(1)叶酸杂质H粗品的合成
将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，CDI，NHNI，催化剂4-PPY溶于500mL甲醇中，加入碱NMM，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：NMM：CDI：NHNI：4-PPY＝1：2：2：4：4：0.1。控制水浴反应温度35℃，反应搅拌时间18h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度45℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水300mL，室温搅拌打浆8小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.6％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间24小时。
(2)叶酸杂质H的提纯
叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。
得到的叶酸杂质H的纯度为96.9％。
实施例7
(1)叶酸杂质H粗品的合成
将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，HATU，4-PPY，催化剂HOBT溶于500mL乙二醇中，加入碱吡啶，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：NMM：CDI：NHNI：4-PPY＝1：1.5：2：3：3：0.05。控制水浴反应温度35℃，反应搅拌时间18h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度45℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水500mL，室温搅拌打浆12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度12.8％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间24小时。
(2)叶酸杂质H的提纯
叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。
得到的叶酸杂质H的纯度为97.0％。
实施例8
(1)叶酸杂质H粗品的合成
将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，DIC，DMAP，催化剂NHNI溶于500mL混合溶剂(DMF:DMSO＝1:1)中，加入碱TEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：DIC：DMAP：NHNI＝1：1.5：2：2：2：0.1。控制水浴反应温度50℃，反应搅拌时间24h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度55℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水500mL，室温搅拌打浆12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.7％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间24小时。
(2)叶酸杂质H的提纯
叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。
得到的叶酸杂质H的纯度为97.6％。
实施例9
(1)叶酸杂质H粗品的合成
将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，HBTU，DMAP，催化剂4-PPY溶于500mL DMF中，加入碱DIPEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：DIC：DMAP：NHNI＝1：1.5：2：3：3：0.1。控制水浴反应温度35℃，反应搅拌时间24h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度55℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水500mL，室温搅拌打浆10小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.4％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间24小时。
(2)叶酸杂质H的提纯
叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。
得到的叶酸杂质H的纯度为96.8％。
实施例10
(1)叶酸杂质H粗品的合成
将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，HCTU，4-PPY，催化剂NHNI溶于500mL混合溶剂(甲醇：乙二醇＝4:1)中，加入碱NMM，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：NMM：HCTU：4-PPY：NHNI＝1：1.5：2：2：2：0.05。控制水浴反应温度30℃，反应搅拌时间24h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度55℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水500mL，室温搅拌打浆12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.5％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间24小时。
(2)叶酸杂质H的提纯
叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。
得到的叶酸杂质H的纯度为98.2％。
实施例11
(1)叶酸杂质H粗品的合成
将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，TBTU，DMAP，催化剂4-PPY溶于500mL DMF中，加入碱TEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：TBTU：DMAP：4-PPY＝1：1.5：2：3：3：0.1。控制水浴反应温度35℃，反应搅拌时间24h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度50℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水500mL，室温搅拌打浆12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.8％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间24小时。
(2)叶酸杂质H的提纯
叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。
得到的叶酸杂质H的纯度为98.0％。
实施例12
(1)叶酸杂质H粗品的合成
将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，TBTU，DMAP，催化剂4-PPY溶于500mL DMF中，加入碱TEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：TBTU：DMAP：4-PPY＝1：1.5：2：2：2：0.05。控制水浴反应温度60℃，反应搅拌时间24h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度50℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水500mL，室温搅拌打浆12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.3％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间24小时。
(2)叶酸杂质H的提纯
叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。
得到的叶酸杂质H的纯度为97.2％。
需要说明的是，尽管通过参照本发明的实施例，已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (14)
1.一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，包括
以叶酸和对氨基苯甲酰谷氨酸为原料，在有机溶剂中，加入有机碱，在缩合剂、缩合活化剂和催化剂的作用下，经缩合反应生成N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，再经制备色谱分离，得到N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸。
2.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，基于物质的量比例计算，所述叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：有机碱：缩合剂：缩合活化剂：催化剂＝1：1.5-2：1.5-2：2-4：2-4：0.05-0.1。
3.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自DMF、DMSO、甲醇、乙二醇中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为DMF。
5.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，上述有机碱选自三乙胺、N-甲基吗啡啉、N,N-二异丙基乙胺、吡啶中的一种。
6.根据权利要求5所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述有机碱为三乙胺。
7.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，缩合剂选自EDCI、DCC、DIC、CDI、HATU、HBTU、HCTU、TBTU中的一种，缩合活化剂和催化剂各选自HOBT、HOAT、DMAP、4-PPY、NHNI中的一种，。
8.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，使用EDCI为缩合剂、HOBT为缩合活化剂、DMAP为催化剂。
9.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述反应在水浴中进行，水浴温度为25-60℃，反应时间为12-48小时。
10.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述反应进一步包括，使用HPLC跟踪反应，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度45-60℃，浓缩得到固体，冷却后加入纯化水100-500mL，室温搅拌打浆4-12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品。
11.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述制备色谱为半制备色谱，色谱柱为C1810μm 100a；半制备检测器波长为280nm，流速为20ml/min，半制备进样量每次10ml。
12.根据权利要求11所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，半制备流动相配制方法为：三水合磷酸氢二钾55g，磷酸氢二钾75g，用8000ml纯水溶解，另加900ml无水甲醇。
13.根据权利要求12所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述制备色谱分离得到N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的具体方法为：所述N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，流出液减压浓缩后用纯水稀释1-5倍，再进行半制备色谱分离，用质量分数5-20％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸。
14.根据权利要求13所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述稀释倍数为2倍，甲醇的质量分数为10％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811528470.XA CN109535162B (zh) | 2018-12-13 | 2018-12-13 | 一种n-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811528470.XA CN109535162B (zh) | 2018-12-13 | 2018-12-13 | 一种n-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109535162A CN109535162A (zh) | 2019-03-29 |
| CN109535162B true CN109535162B (zh) | 2020-03-24 |
Family
ID=65855261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811528470.XA Active CN109535162B (zh) | 2018-12-13 | 2018-12-13 | 一种n-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109535162B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11117899B2 (en) | 2017-04-07 | 2021-09-14 | Medshine Discovery Inc. | [1,2,4]triazolo[1,5-c]pyrimidine derivative as A2A receptor inhibitor |
| CN110845570A (zh) * | 2019-11-25 | 2020-02-28 | 杭州澳医保灵药业有限公司 | 一种n-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2386474A1 (en) * | 1999-09-20 | 2001-03-29 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Melanin concentrating hormone antagonist |
| WO2011035143A2 (en) * | 2009-09-17 | 2011-03-24 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for inhibiting rho-mediated diseases and conditions |
| CN106632341A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-05-10 | 天津阿尔塔科技有限公司 | 一种d‑叶酸的合成方法 |
-
2018
- 2018-12-13 CN CN201811528470.XA patent/CN109535162B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109535162A (zh) | 2019-03-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109535162B (zh) | 一种n-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法 | |
| Usuki et al. | Extraction and isolation of shikimic acid from Ginkgo biloba leaves utilizing an ionic liquid that dissolves cellulose | |
| KR20110011704A (ko) | 카스포펀진 불순물 ａ를 함유하지 않는 카스포펀진 | |
| CN111072756B (zh) | 一种河鲀ace抑制肽及其制备方法 | |
| EP3156413A1 (en) | Ganirelix precursor and method for preparing ganirelix acetate by using anirelix precursor | |
| Dremina et al. | A methodology for simultaneous fluorogenic derivatization and boronate affinity enrichment of 3-nitrotyrosine-containing peptides | |
| Gu et al. | Post-synthetic modification of tryptophan containing peptides via NIS mediation | |
| CN111100186A (zh) | 一种具有ace抑制活性的河鲀多肽及其制备方法 | |
| EP2657272A1 (en) | Purification method for carboxyl-containing polyoxyethylene derivative | |
| Liu et al. | Dynamic combinatorial libraries of hydrazone-linked pseudo-peptides: dependence of diversity on building block structure and chirality | |
| CN106929006A (zh) | 一种以萘酰亚胺为母核的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针及其制备与应用 | |
| EP4059943A1 (en) | Method for producing oligonucleic acid compound | |
| CN110240631B (zh) | 手性异吲哚酮并环六肽衍生物、其制备办法及用途 | |
| WO2011047192A2 (en) | Protected amine labels and use in detecting analytes | |
| EP3950700A1 (en) | Peptide complex and production method therefor, and use of said peptide complex | |
| CN113845527B (zh) | 手性大环分子及其制备方法、水溶性手性大环分子及其制备方法与应用 | |
| CN114716509B (zh) | 一种兼具抗氧化和降血压作用的活性肽及其应用 | |
| EP4144720A1 (en) | Compound as ubr-box domain ligand | |
| CN111704570B (zh) | 具有七甲川花菁结构的近红外反应型荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN111205213A (zh) | 一种化学交联剂及其制备和应用 | |
| CN107236055A (zh) | 一种新型葡聚糖衍生物及其应用 | |
| CN110845570A (zh) | 一种n-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法 | |
| CN111978213B (zh) | 用于多肽环化的多官能团化合物及其制备方法和用途 | |
| CN113603721B (zh) | 一种合成saicar的方法 | |
| CN114560846B (zh) | 一种多功能化学交联剂及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20190329 Assignee: ZHEJIANG SILVER-ELEPHANT BIO-ENGINEERING Co.,Ltd. Assignor: ZHEJIANG SHENGDA BIO-PHARM Co.,Ltd. Contract record no.: X2021330000155 Denomination of invention: A preparation method of n-p-aminobenzoyl glutamyl folic acid Granted publication date: 20200324 License type: Common License Record date: 20210828 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |