CN109517815A - 一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法 - Google Patents

一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α‑半乳糖苷酶表达量的新方法。本发明通过向10L的发酵罐体系中酿酒酵母细胞表面展示α‑半乳糖苷酶的诱导培养基里加入限定浓度的硫酸铵0.05‑0.5％，并创新地以持续流加的方式补充诱导剂使其浓度维持在1‑3％，实现酿酒酵母的菌体生长量及酿酒酵母细胞表面展示α‑半乳糖苷酶表达量的大幅提高。采用本发明的方法，酿酒酵母细胞表面展示α‑半乳糖苷酶的单位酶活性及回收总酶活性是一般培养的3.7倍和7.9倍。为工业化制备生产酿酒酵母细胞表面展示α‑半乳糖苷酶提供了新途径。

Description

一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表 达量的新方法
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的方法。
背景技术
α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,EC3.2.1.22)属外切类糖苷酶，广泛存在于植物、动物和微生物中，可专一性催化半乳低聚糖和多糖中α-1,6半乳糖苷键的水解。在食品工业、饲料工业、医疗制药业、轻工业等领域具有广泛的应用。目前市场中，天然提取的或异源表达的α-半乳糖苷酶存在稳定性差，分离纯化步骤多，成本高，不能重复利用的问题。
酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶是将α-半乳糖苷酶锚定于酿酒酵母细胞表面，免去了纯化与固定的步骤，解决了目前市场中天然提取的或异源表达的α-半乳糖苷酶稳定性差，分离纯化步骤多，成本高，不能重复利用的现实问题，且酿酒酵母作为GRAS级菌株，可安全使用于食品医药领域。目前酿酒酵母细胞表面展示表达酶蛋白仍存在表达活性不高，产量偏低等缺陷。已报道的在酵母细胞表面展示系统中表达的木聚糖酶活力最高为137U/g，漆酶为159U/g，酶活力的表达尚不能达到理想水平。
发酵罐培养是大量制备微生物菌体及其代谢产物的常用方法，可以缩短发酵周期，提高生产效率，降低生产成本，在大肠杆菌基因工程菌及毕赤酵母基因工程菌的大量培养中有广泛的应用。酿酒酵母细胞表面展示菌株由于受到自身培养条件及诱导条件的限制，通过发酵罐大量制备酿酒酵母细胞表面展示酶蛋白的成功案例尚未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术中酿酒酵母细胞表面展示酶蛋白存在的大量培养及表达的问题，公开一种提高发酵罐大量培养酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法。
本发明采用的技术方案是：一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，包括如下步骤：
1)制备种子液：将酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶基因工程菌株置于含葡萄糖的YNB-CAA培养基中，培养至菌体OD600＝2.0～3.0时，回收菌体，得种子液；
2)诱导表达：于10L发酵罐中，将种子液以2～5％的接种量，接种于含半乳糖和补充氮源的YNB-CAA培养基中，搅拌转速为100rpm，以0.5L/min速度通入空气，20～30℃下，诱导表达30～40h，离心收集菌体。
进一步的，上述的一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，步骤2)中，在诱导表达全过程中，以流加方式持续加入半乳糖，保持10L发酵罐中，培养基中半乳糖浓度为1～3％。
进一步的，上述的一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，所述的酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶基因工程菌株的制备方法如下：将α-半乳糖苷酶基因与载体pYD1连接后获得重组质粒，将重组质粒转化至酵母EBY100中，获得酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶基因工程菌株。
进一步的，上述的一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，步骤1)中，所述的含葡萄糖的YNB-CAA培养基的组成为：0.67％YNB，0.5％酸水解酪蛋白，2％葡萄糖，余量水。
进一步的，上述的一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，步骤2)中，所述的含半乳糖和补充氮源的YNB-CAA培养基的组成为：0.67％YNB，0.5％酸水解酪蛋白，2％半乳糖，0.05～0.5％补充氮源，余量水。
进一步的，上述的一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，所述的补充氮源为硫酸铵。
本发明的有益效果是：
1、本发明针对现有技术中酿酒酵母细胞表面展示酶蛋白存在大量培养及表达的问题，突破酿酒酵母细胞表面展示酶蛋白的一般表达培养模式，通过额外添加优选的补充氮源，创新地以流加的方式补充表达诱导剂半乳糖，提供了一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，为工业化制备生产酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶提供了新途径。
2、本发明，添加额外的氮源，氮源经筛选确定为硫酸铵，其浓度范围限定在0.05％-0.5％。额外添加的优选氮源硫酸铵在限定的浓度范围内主要促进了菌体生长，并且表达量有一定提高。添加过量，则会严重影响酶蛋白的表达。
3、本发明，在诱导表达过程中，以流加方式持续加入半乳糖于发酵罐中的培养基中，保持培养基中半乳糖浓度限定值为1～3％。通过实验发现，半乳糖只有在限定浓度范围内以流加方式添加才能高效提高酶的表达量，同时作为碳源补充剂，促进了菌体生长。而只在初始培养基中增加半乳糖浓度则适得其反。
4、采用本发明的方法，显著提高了酿酒酵母细胞表面展示的α-半乳糖苷酶表达量，单位酶活力为630.2U/g，回收总酶活力为19632.0U，分别是对照组的3.7倍和7.9倍。
附图说明
图1为不同补充氮源对α-半乳糖苷酶表达量的影响；
处理1：含有2％半乳糖+0.5％硫酸铵的YNB-CAA培养基，诱导表达α-半乳糖苷酶；
处理2：含有2％半乳糖+1％硫酸铵的YNB-CAA培养基，诱导表达α-半乳糖苷酶；
处理3：含有2％半乳糖+0.5％尿素的YNB-CAA培养基，诱导表达α-半乳糖苷酶；
处理4：含有2％半乳糖+0.5％精氨酸的YNB-CAA培养基，诱导表达α-半乳糖苷酶。
图2为流加半乳糖对α-半乳糖苷酶表达量的影响；
处理1：含有2％半乳糖+0.5％硫酸铵的YNB-CAA培养基，不进行流加；
处理2：含有5％半乳糖的YNB-CAA培养基，不进行流加；
处理3：含有2％半乳糖+0.5％硫酸铵的YNB-CAA培养基，持续流加半乳糖。
具体实施方式
酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶基因工程菌株的制备：α-半乳糖苷酶基因来源于oryza sativa L.subsp.japonica var.Nipponbare,Genbank编号:AP005737.3。α-半乳糖苷酶基因与载体pYD1连接后获得重组质粒，将重组质粒转化至酵母EBY100中，获得酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶基因工程菌株。
将酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶基因工程菌株置于含葡萄糖的YNB-CAA培养基(0.67％YNB，0.5％酸水解酪蛋白，2％葡萄糖，余量水)中，培养至菌体OD600＝2.0时，回收菌体，得到酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶种子液，所得种子液用于以下所有实验。
对照组：于10L发酵罐中，将酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶种子液以2.5％的接种量，接种于含有2％半乳糖的YNB-CAA培养基(0.67％YNB，0.5％酸水解酪蛋白，2％半乳糖，余量水)中，搅拌转速为100rpm，以0.5L/min速度通入空气，20℃下诱导表达30h，诱导表达α-半乳糖苷酶，离心收集菌体。用pH＝5的McIlvaine缓冲液以0.1g/mL浓度重悬菌体，测定单位酶活力为：170.3U/g，回收的总酶活力为2473.0U。作为以下实施例的对照组。
α-半乳糖苷酶活性测定以pNP-半乳糖为底物，在405nm波长处测其OD值，以对硝基苯酚的生成量表示酶活力。一个酶活力单位(U)定义为每分钟分解pNP-半乳糖释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量。
实施例1
于10L发酵罐中，将酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶种子液以2.5％的接种量接种于含有0.5％硫酸铵和2％半乳糖的YNB-CAA培养基(0.67％YNB，0.5％酸水解酪蛋白，2％半乳糖，0.5％硫酸铵)中，搅拌转速100rpm，以0.5L/min速度通入空气，20℃下，诱导表达30h，诱导表达α-半乳糖苷酶，离心收集菌体，用pH＝5的McIlvaine缓冲液以0.1g/mL浓度重悬菌体，测定单位酶活力，结果如图1(对应于图1中的处理1)所示。添加0.5％硫酸铵获得单位酶活力为187.5U/g，回收的总酶活力为4095.8U，分别为对照组的1.1倍和1.7倍。
对照例1：将实施例1中0.5％硫酸铵换成1.0％硫酸铵，获得单位酶活力为71.4U/g，回收的总酶活力为2338.1U，对应于图1中处理2。
对照例2：将实施例1中0.5％硫酸铵换成1.0％尿素，获得单位酶活力为110.7U/g，回收的总酶活力为1960.1U，对应于图1中处理3。
对照例3：将实施例1中0.5％硫酸铵换成3.0％精氨酸，获得单位酶活力为43U/g，回收的总酶活力为1331.3U，对应于图1中处理4。
额外添加的氮源优选为硫酸铵且在限定的浓度范围内主要促进了菌体生长，并且表达量有一定提高。添加过量，则会严重影响酶蛋白的表达。
实施例2
于10L发酵罐中，将酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶种子液以2.5％的接种量接种于含0.5％硫酸铵及2％半乳糖的YNB-CAA培养基(0.67％YNB，0.5％酸水解酪蛋白，2％半乳糖，0.5％硫酸铵)中，搅拌转速100rpm，以0.5L/min速度通入空气，20℃下，诱导表达30h，诱导过程中，持续流加20％的半乳糖，保证培养基中半乳糖浓度为1～3％，离心收集菌体，用pH＝5的McIlvaine缓冲液以0.1g/mL浓度重悬菌体，结果如图2(对应于图2中的处理3)所示，测定单位酶活力为630.2U/g，回收的总酶活力为19632.0U，分别是对照组的3.7倍和7.9倍。
对照例1：实施例2中，在诱导表达30h的诱导过程中不流加半乳糖，测定单位酶活力为187.5U/g，回收的总酶活力为4095.8U，分别为对照组的1.1倍和1.7倍，对应于图2中处理1。
对照例2：实施例2中在诱导表达30h的诱导过程中不流加半乳糖，将培养基中初始半乳糖浓度提高至5％，且不添加补充氮源硫酸铵(YNB-CAA培养基：0.67％YNB，0.5％酸水解酪蛋白，5％半乳糖)，测定单位酶活力为120.6U/g，回收的总酶活力为2149.1U，低于对照组，对应于图2中处理2。
半乳糖只有在限定浓度范围内以流加方式添加才能高效提高酶的表达量，同时作为碳源补充剂，促进了菌体生长。只在初始培养基中增加半乳糖浓度则适得其反。
最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例，显然，本发明不仅限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的科研人员从本发明公开的内容直接或间接联想到的所有形变，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备种子液：将酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶基因工程菌株置于含葡萄糖的YNB-CAA培养基中，培养至菌体OD600＝2.0～3.0时，回收菌体，得种子液；
2)诱导表达：于10L发酵罐中，将种子液以2～5％的接种量，接种于含半乳糖和补充氮源的YNB-CAA培养基中，搅拌转速为100rpm，以0.5L/min速度通入空气，20～30℃下，诱导表达30～40h，离心收集菌体。
2.根据权利要求1所述的一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，其特征在于，步骤2)中，在诱导表达全过程中，以流加方式持续加入半乳糖，保持10L发酵罐中，培养基中半乳糖浓度为1～3％。
3.根据权利要求1或2所述的一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，其特征在于，所述的酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶基因工程菌株的制备方法如下：将α-半乳糖苷酶基因与载体pYD1连接后获得重组质粒，将重组质粒转化至酵母EBY100中，获得酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶基因工程菌株。
4.根据权利要求1或2所述的一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，其特征在于，步骤1)中，所述的含葡萄糖的YNB-CAA培养基的组成为：0.67％YNB，0.5％酸水解酪蛋白，2％葡萄糖，余量水。
5.根据权利要求1或2所述的一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，其特征在于，步骤2)中，所述的含半乳糖和补充氮源的YNB-CAA培养基的组成为：0.67％YNB，0.5％酸水解酪蛋白，2％半乳糖，0.05～0.5％补充氮源，余量水。
6.根据权利要求1或2所述的一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，其特征在于，步骤2)中，所述的补充氮源为硫酸铵。
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