CN109512813A - 缬草醛在制备预防与治疗癫痫发作及脑损伤药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了缬草醛(baldrinal，BAL)在制备预防和治疗癫痫及癫痫脑损伤保护药物中的用途。本发明的实验结果表明在安全剂量范围内使用时可以显著延长小鼠惊厥发作潜伏期、降低死亡率，并恢复小鼠癫痫损伤后海马神经元的损伤及死亡，并且呈一定的剂量‑药效相关性，说明缬草醛具有延迟癫痫发生、改善其痫样活动及修复受损脑神经的作用。

Description

缬草醛在制备预防与治疗癫痫发作及脑损伤药物中的用途

技术领域

本发明涉及缬草醛的应用，特别涉及缬草醛在制备预防与治疗癫痫发作及脑损伤药物中的用途。

背景技术

癫痫是由多种病因引起的慢性脑部疾患，以脑部神经元过度放电所致的突然、反复和短暂的中枢神经系统功能失常为特征。流行病学研究显示，全球大约有6500万癫痫患者，患病率为4‰-10‰，每年大约有240 万的新增病例，在我国约有900万癫痫患者,其中600万为活动性患者，估计每年新发病患者在40万左右。反复癫痫发作可导致患者精神、心理障碍，生活能力降低，甚至自杀等不良后果，给社会和家庭造成极大的物质和精神负担。癫痫发病机制复杂多样，迄今尚未完全阐明。目前临床对癫痫主要采用药物治疗，迄今为止对其损伤后的治疗尚无根本性有力措施。如何通过有效的防止癫痫，干预和逆转癫痫引起的脑神经损伤及促进损伤后修复，改善预后，是神经医学领域的重大课题，寻求有效的抗癫痫药及神经保护药一直是研究的重点。

缬草作为药用植物，曾被我国药典收载，具有较好的镇静催眠作用。在国内外缬草属植物及提取物常被用于治疗中度失眠，肠激惹，抑郁等症。

缬草醛(Baldrinal，BAL)是从中药缬草中提取的一种环烯醚萜类化合物。已有研究表明，缬草醛具有镇静作用。然而，缬草醛是否通过调节脑内谷氨酸/γ-氨基丁酸能神经的平衡起到预防癫痫发作及改善脑神经损伤，目前未见相关报道。将其发展为预防与治疗癫痫发作及脑损伤药物具有极高的潜在价值与社会意义。

发明内容

本发明的目的是提供缬草醛在制备预防与治疗癫痫发作及脑损伤药物中的用途。本发明中使用的缬草醛可以用本领域常规的提取方法从天然药材中提取获得或者通过商购获得。

本发明通过以下技术方案来实现发明目的：

本发明提供缬草醛在制备预防与治疗癫痫发作及脑损伤药物中的用途，所述缬草醛的结构式如式(1)所示：

具体地，所述癫痫为惊厥或癫痫持续状态，脑损伤由癫痫所诱导。

优选地，所述脑损伤为急性期或修复期的癫痫引发的脑神经损伤。

具体地，所述缬草醛单次应用剂量为不引起镇静催眠的剂量。

具体地，所述缬草醛单次应用剂量为50-150mg/kg。

优选地，所述缬草醛单次应用剂量为100-150mg/kg。

优选地，所述缬草醛单次应用剂量为150mg/kg。

具体地，所述药物被配制为通过胃肠道或肠胃外给予的剂型。

优选地，所述药物的剂型可为药剂学上允许的口服剂型或注射剂型等。

具体地，所述的缬草醛作为唯一活性成分在制备预防与治疗癫痫发作及脑损伤药物中的用途。

本发明提供的缬草醛在制备预防与治疗癫痫发作及脑损伤药物中的用途具有以下有益效果：

(1)缬草醛在不引起镇静催眠的剂量下能显著延长癫痫发作潜伏期和降低死亡率；

(2)缬草醛能降低由癫痫引起的海马神经元损伤及死亡；

(3)缬草醛显著抑制了癫痫后脑组织NMDAR₁,BDNF,蛋白的表达以及促进GABAR_a1蛋白的表达。

本发明首次证实，缬草醛具有预防与治疗癫痫发作及脑损伤所致神经元损伤的作用，可用于制备癫痫发作及脑神经损伤的预防药物。

附图说明

图1为缬草醛对小鼠癫痫后海马组织CA3区病理变化影响的Nissl 染色图。放大倍数400；图1a为控制组，图1b为匹鲁卡品模型组，图 1c为丙戊酸钠组，图1d为缬草醛25mg/kg组，图1e为缬草醛 50mg/kg组，图1f为缬草醛100mg/kg组。

图2为缬草醛对小鼠癫痫后海马组织CA1区病理变化影响的Nissl 染色图。放大倍数400；图2a为控制组，图2b为匹鲁卡品模型组，图 2c为丙戊酸钠组，图2d为缬草醛25mg/kg组，图2e为缬草醛 50mg/kg组，图2f为缬草醛100mg/kg组。

图3为缬草醛对小鼠癫痫后海马组织CA3区存活的细胞通过计数分析结果。用均数±标准差表示；##p<0.05是和空白组比较，*p<0.05 和匹鲁卡品模型组比较，**p<0.01和匹鲁卡品模型组比较。

图4为缬草醛对小鼠癫痫后海马组织CA1区存活的细胞通过计数分析结果。用均数±标准差表示；##p<0.05是和空白组比较，*p<0.05 和匹鲁卡品模型组比较，**p<0.01和匹鲁卡品模型组比较。

图5为缬草醛苷对小鼠癫痫后脑组织BDNF蛋白的表达水平的影响。与控制组比较：^##P<0.01，与模型组比较：^＊P<0.05，^＊＊P<0.01( n＝6)。

图6为缬草醛苷对小鼠癫痫后脑组织NMDAR₁蛋白的表达水平的影响。与控制组比较：^##P<0.01，与模型组比较：^＊P<0.05，^＊＊P<0.01( n＝6)。

图7为缬草醛苷对小鼠癫痫后脑组织GABAR_a1蛋白的表达水平的影响。与控制组比较：^##P<0.01，与模型组比较：^＊P<0.05，^＊＊P<0.01( n＝6)。

图8为缬草醛苷对小鼠癫痫后脑组织GABAR_b1蛋白的表达水平的影响。与控制组比较：^##P<0.01，与模型组比较：^＊P<0.05，^＊＊P<0.01( n＝6)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，以下实施例中使用的缬草醛均为式(1)所示的化合物。

实施例1

缬草醛在制备预防与治疗癫痫发作及脑损伤药物中的用途，其中，脑损伤为急性期或修复期的癫痫引发的脑神经损伤，缬草醛单次应用剂量为小鼠100mg/kg，药物的剂型为注射液剂型。

实施例2

缬草醛在制备预防与治疗癫痫发作及脑损伤药物中的用途，其中，脑损伤为急性期或修复期的癫痫引发的脑神经损伤，缬草醛单次应用剂量为小鼠150mg/kg，药物的剂型为粉针剂型。

实施例3

缬草醛在制备预防与治疗癫痫发作及脑损伤药物中的用途，其中，脑损伤为急性期或修复期的癫痫引发的脑神经损伤，缬草醛单次应用剂量为小鼠100mg/kg，药物的剂型为粉针剂型。

下面的动物实验进一步说明了上述实施例1至3的效果：

一、实验材料

1.1动物处理

雄性ICR小鼠，体重为18-22g，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：NCXK(宁)2016-0005。喂养条件包括标准饲料，自来水，室温保持在(24±2)℃，湿度50-60％，每日光照与黑暗时间各 12h。实验前将动物置于实验环境适应3天。

1.2实验药品及仪器

缬草醛(BAL)(上海，CAS号：18234-46-3)，以生理盐水配制，兔抗gamma-aminobutyric acid A receptor,alpha 1 (GABARA1),gamma-aminobutyric acid(GABA)Areceptor,beta1 (GABARB1),brain-derived neurotrophic factor(BDNF)和N- methyl-D-aspartate receptor(NMDAR₁)多克隆抗体(购自Proteintech公司)，酶标仪(1510，Thermo Fisher公司)，激光共聚焦显微镜(TCS-SP，德国公司)，透射电子显微镜((H-7650,日本 Hitachi公司)，电泳仪、电转仪(Powerpac basic,美国Bio-Rad公司)，凝胶成像分析仪(JS-860B,上海培清公司)，液体石蜡，生理盐水，EL-104精密电子天平(梅特勒-托利多一起(上海)有限公司)。

1.3实验动物分组及给药

ICR雄性小鼠随机分为控制组(正常组)、癫痫模型组(匹鲁卡品组)、阳性药物组(丙戊酸钠)、缬草醛不同剂量组(25mg/kg 50mg/kg、100mg/kg)。小鼠在注射匹鲁卡品(PILO)前30min给予BAL 腹腔给药一次，控制组与阳性药物组同法给予等量的生理盐水和丙戊酸钠。所有给药方式按照0.1ml/10g腹腔注射在给予PILO注射后进行小鼠行为学观察；在小鼠模型成功后72h进行组织病理与形态学改变与分子生物学表达变化等药效学评价。

1.4小鼠癫痫模型建立

ICR小鼠腹腔注射(i.p.)匹鲁卡品(PILO，280mg/kg，i.p.)。注射PILO前15min给予阿托品(1mg/kg，i.p.)以减轻胆碱能外周反应。注射PILO后密切观察小鼠的行为学变化：癫痫发作强度(强度标准按Racine分级)、第一次惊厥发作时间(潜伏期)、进入癫痫持续状态(SE)的比率和存活率，并按Racine标准判定癫痫发作的程度,达到4-5 级的小鼠被认为匹鲁卡品模型制作成功,归入试验组。进入癫痫持续状态 (SE)后1h给予地西泮(diazepam，4mg/kg，i.p.)终止，之后分笼饲养。

二、实验过程

(一)癫痫小鼠行为学观察

1.1实验方法：

ICR小鼠给予BAL预处理后30min腹腔注射PILO进行模型的建立，并密切观察小鼠的行为学变化：癫痫发作强度(强度标准按Racine分级)、第一次惊厥发作时间(潜伏期)、进入癫痫持续状态(SE)的时间与比率、小鼠存活率。

表1.缬草醛对PILO诱导癫痫ICR雄性小鼠行为学的影响(n＝14)

与控制组比较：^##p<0.01；^ap<0.01与模型组比较：^*p<0.05,^bp<0.05，^**p<0.01。

1.2实验结果：

由表1可以看出，单次腹腔注射缬草醛对PILO诱导的癫痫小鼠行为学变化呈现双向反应。单次腹腔注射缬草醛可显著延长小鼠癫痫潜伏期、进入癫痫持续状态的时间以及降低进入癫痫持续状态的比率和死亡率。随剂量增加抗癫痫样作用愈强，至100mg/kg时保护作用最强(与模型组对比^*P﹤0.05或^**P﹤0.01)，此后随剂量的增加保护作用减弱或几无，实验并设丙戊酸钠(200mg/kg)阳性药对照组。提示缬草醛(50mg/kg、100mg/kg)均具有抗癫痫样作用，缬草醛25mg/kg没有抗癫痫样作用。

(二)Nissl染色观察组织结构病理变化

2.1实验方法：

2.1.1Nissl染色

石蜡切片于70℃烘箱中烘烤20min，之后将玻片依次浸泡于二甲苯Ⅰ (10min)，二甲苯Ⅱ(5min)，无水乙醇Ⅰ(1min)，无水乙醇Ⅱ (1min)，95％乙醇(30s)，80％乙醇(30s)和70％乙醇(30s)，水洗3 次，之后将切片置于尼氏染液中56℃温箱浸染1h，去离子水洗去染色液，将切片置于分化液中分化数秒至2min,无水乙醇迅速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，置于显微镜下观察。

2.2实验结果：

如图1-4，单次腹腔注射缬草醛对PILO诱导的癫痫小鼠脑组织结构病理变化影响呈现双向反应。图1-4，对比癫痫模型组缬草醛的海马CA1 与CA3区损伤性病理变化减轻，受损或死亡的神经元大量减少。实验并设丙戊酸钠(200mg/kg)阳性药对照组，提示缬草醛(50mg/kg、 100mg/kg)具有减轻PILO诱导癫痫小鼠脑组织细胞结构病理性损伤的作用；而缬草醛25mg/kg没有作用。

(三)Western blot检测PILO诱导的癫痫小鼠海马组织GABAR_a1, GABGAR_b1,NMDAR₁，BDNF，蛋白的表达

3.1实验方法：

使用凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA蛋白含量检测试剂盒测定样本总蛋白质浓度并标定蛋白统一浓度。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，用将硝酸纤维素膜(NC膜)进行湿法转膜。转膜结束后取出硝酸纤维素膜，将膜置入5％脱脂奶粉封闭液中封闭1h。封闭结束孵育5％脱脂奶粉稀释的一抗，4℃过夜，室温复温1h，洗膜孵育二抗。用PBST洗NC膜3 次，每次10min。滴加蛋白化学发光剂(ECL)，NC膜固定于片盒内，压入胶片进行曝光。取出胶片，放入显影液和定影液中各1min，最后清水清洗。凝胶图像分析成像系统(培清，JS-860B)对胶片上每个目的条带进行扫描和图像分析。

3.2实验结果：

如图5-8所示，与模型组比较，缬草醛(100mg/kg)组PILO诱导的癫痫小鼠脑组织NMDAR₁,BDNF蛋白表达明显减少(^*P﹤0.05,)和 GABAR_a1蛋白表达明显增加(^##P<0.01)。提示缬草醛的保护作用可能通过上调GABAR_a1蛋白的表达，降低NMDAR₁、BDNF的表达，减少癫痫后神经元凋亡的发生,从而促进癫痫后神经元的存活，对癫痫引发的脑损伤起到一定的保护作用。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.缬草醛在制备预防和治疗癫痫发作及脑损伤保护的药物中的用途，其特征在于：所述缬草醛的结构式如式(1)所示：

2.根据权利要求1所述缬草醛在制备预防和治疗癫痫发作及脑损伤保护的药物中的用途，其特征在于：所述癫痫为惊厥或癫痫持续状态，所述脑损伤由癫痫所诱导。

3.根据权利要求2所述缬草醛在制备预防和治疗癫痫发作及脑损伤保护的药物中的用途，其特征在于：所述脑损伤为急性期或修复期的癫痫引发的脑神经损伤。

4.根据权利要求1所述缬草醛在制备预防和治疗癫痫发作及脑损伤保护的药物中的用途，其特征在于：所述缬草醛单次应用剂量为不引起镇静催眠的剂量。

5.根据权利要求4所述缬草醛在制备预防和治疗癫痫发作及脑损伤保护的药物中的用途，其特征在于：所述缬草醛单次应用剂量为100-150mg/kg。

6.根据权利要求5所述缬草醛在制备预防和治疗癫痫发作及脑损伤保护的药物中的用途，其特征在于：所述缬草醛单次应用剂量为150-200mg/kg。

7.根据权利要求6所述缬草醛在制备预防和治疗癫痫发作及脑损伤保护的药物中的用途，其特征在于：所述缬草醛单次应用剂量为100-200mg/kg。

8.根据权利要求7所述缬草醛在制备预防和治疗癫痫发作及脑损伤保护的药物中的用途，其特征在于：所述缬草醛单次应用剂量为200mg/kg。

9.根据权利要求1-8中任一项所述缬草醛在制备预防和治疗癫痫发作及脑损伤保护的药物中的用途，其特征在于：所述药物被配制为通过胃肠道或肠胃外给予的剂型。

10.根据权利要求9所述缬草醛在制备预防和治疗癫痫发作及脑损伤保护的药物中的用途，其特征在于：所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射剂型或粉针剂。