CN109504694A - 一种编码f5基因突变体的核酸及其应用 - Google Patents

一种编码f5基因突变体的核酸及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种编码F5基因突变体的核酸及其应用，属于基因工程技术领域。该突变体与野生型相比，具有c.587G>T突变或c.5195C>T突变或c.587G>T和c.5195C>T复合杂合突变，其编码的多肽的氨基酸序列具有p.Gly196Val突变或p.Ser1732Leu突变或p.Gly196Val和p.Ser1732Leu复合突变。通过检测该新突变体是否存在，可有效筛选出易患遗传性因子V缺乏症的生物样品，且本发明的检测方法快速、准确、高效。

Description

一种编码F5基因突变体的核酸及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种F5基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离的编码F5突变体的核酸、分离的F5突变体多肽、含F5突变体核酸的重组细胞，以及筛选易患遗传性因子V缺乏症的生物样品的方法。
背景技术
遗传性因子V缺乏症是一种罕见的出血性疾病，患病率为百万分之一。该病症状可以首发于任何年龄开始，但严重患者通常在童年期即表现出症状。遗传性因子V缺乏症常常会导致鼻衄、淤青、皮下出血、牙龈出血、手术后长期或持续性出血、外伤或分娩时出血过多等。妇女缺乏凝血因子V时可有月经过多。严重患者关节腔积血、颅内出血风险、肺内出血、消化道出血风险明显增加，可能危及生命。
遗传性因子V缺乏症通常由F5基因突变引起，其编码了凝血因子V。该蛋白质在凝血系统中起关键作用，凝血系统是响应于血管受伤害后发生的一系列化学反应。引起因子V缺乏的F5基因突变阻止功能性凝血因子V的产生或者严重降低血流中蛋白质的量。患者血液中凝血因子V通常低于正常水平10％；最严重的不到1％。功能性凝血因子V的量减少阻止血液正常凝固，引起严重的异常出血。遗传性因子V缺乏症以常染色体隐性模式遗传，这意味着每个细胞中的F5基因的两个拷贝都具有突变。携带一个F5基因杂合突变的个体往往无明显临床出血症状。由于遗传性因子V缺乏症非常罕见，因此中国人遗传性因子V缺乏症的报道十分有限，具有诊断价值的致病位点较少。
因而，目前遗传性因子V缺乏症的致病基因的确定以及遗传性因子V缺乏症的检测方法仍有待深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种F5基因突变体，并提出一种能够有效筛选易患遗传性因子V缺乏症的生物样品的方法。
本发明是基于发明人的下列工作完成的：
出血性疾病是一类由于止血机制异常所致的疾病统称，疾病种类繁多，发病机制各异，包括血管壁异常、血小板异常、凝血因子数量及质量异常引起的凝血功能障碍、抗凝与纤溶异常等，其中遗传性凝血功能障碍疾病牵涉到的基因众多。为了提高出血性疾病的临床诊断效率，高通量的第二代测序技术应用越来越广泛。第二代测序通常是利用设计的DNA序列探针将目标基因或全基因组中的外显子区域捕获下来，然后针对每个外显子进行深度测序。利用该技术流程寻找出凝血功能障碍的致病基因已成研究热点。Janicki PK等(Janicki P K,Vaida S,Almondhiry H A B.Targeted Next-Generation Resequencingof F5 Gene Identifies Novel Multiple Variants Pattern in Severe HereditaryFactor V Deficiency[J].Case Reports in Genetics,2013(14):941684.)利用第二代测序技术在一个家系中发现了多个F5基因的致病突变，与患者孕期出血、流产等症状有关。由此可见，第二代测序技术在凝血功能障碍的临床诊断和机制研究中发挥了重要作用。
因而，发明人针对一名凝血功能障碍导致的消化道出血患儿及其双亲，采用福建福君基因生物科技有限公司提供的凝血功能障碍相关的24基因panel，通过目标区域捕获的高通量第二代测序技术，并联合Sanger测序验证的方法进行致病突变挖掘和验证，最终确定了遗传性因子V缺乏症的2个新致病突变位点——F5基因的c.587G>T和c.5195C>T突变，且c.587G>T和c.5195C>T的复合杂合突变导致了遗传性因子V缺乏症的发生。
发明人一方面提出了一种分离的编码F5突变体的核酸。所述核酸的基因序列与SEQ ID NO:1相比，具有c.587G>T突变，或者c.5195C>T突变，或者c.587G>T和c.5195C>T的复合杂合突变。该突变体与遗传性因子V缺乏症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在复合杂合突变，可以有效地检测生物体是否易患遗传性因子V缺乏症。
进一步的，提出了一种检测编码F5基因突变体核酸的试剂盒，所述试剂盒包括适于检测与SEQ ID NO:1相比具有c.587G>T和c.5195C>T突变的F5基因突变体的试剂。进一步的，所述试剂盒包括第5外显子特异性的引物，核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，用以检测F5基因是否存在c.587G>T突变，以及第15外显子特异性的引物，核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，用以检测F5基因是否存在c.5195C>T突变。
进一步的，提出了一种用于筛选易患遗传性因子V缺乏症的生物样品的方法，该方法可用于检测生物样品是否存在F5基因突变，从而能够有效地筛选出易患遗传性因子V缺乏症的生物样品。包括以下步骤：
(1)从生物样品提取核酸样本，所述的生物样品是指来源于人体的各类样品，包括但不限于血液、唾液、组织、毛发或口腔黏膜。所述生物样品可用于分离获得编码F5基因突变体的核酸，或者是通过反转录反应获得cDNA样本以构成所述核酸样本；
(2)利用F5基因的第5和第15外显子特异性的引物或探针，对核酸样本进行PCR扩增，针对所得的扩增产物构建核酸测序文库并进行测序；所述F5基因的第5外显子特异性的引物或探针，具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；第15外显子特异性的引物或探针，具有如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
(3)将测序核苷酸图谱与人参考基因组序列比对，F5基因(NM_000130.4)具有2个突变体，其中之一为杂合变异c.587G>T(p.Gly196Val)，即编码区第587位碱基由G突变为T，该变异导致所编码多肽第196位氨基酸由甘氨酸(Gly)突变成缬氨酸(Val)；另一个变异c.5195C>T(p.Ser1732Leu)，即编码区第5195位碱基由C突变为T，该变异导致所编码多肽第1732位氨基酸由丝氨酸(Ser)突变成亮氨酸(Leu)。
发明人发现F5基因如SEQ ID NO:1所示序列中的2个新的致病突变位点，即编码区第587位碱基由G突变为T，导致所编码第196位氨基酸由甘氨酸(Gly)突变成缬氨酸(Val)；以及编码区第5195位碱基由C突变为T，导致所编码蛋白第1732位氨基酸由丝氨酸(Ser)突变成亮氨酸(Leu)，这2个突变体导致功能性凝血因子V水平的显著降低。基于此，本发明提供了F5基因突变的检测方法。通过该方法能够筛选易患遗传性因子V缺乏症的生物样品。
另一方面提出了一种分离的F5突变体多肽，所述多肽是由编码F5突变体的核酸所编码的，与SEQ ID NO:2相比，其氨基酸序列具有p.Gly196Val突变，或者p.Ser1732Leu突变，或者p.Gly196Val和p.Ser1732Leu复合突变。
进一步的，提出了一种分离的多肽的检测试剂盒，所述的多肽由F5基因突变体核酸编码，所述的试剂盒包括适于检测与SEQ ID NO:2相比具有p.Gly196Val突变的多肽的试剂和p.Ser1732Leu突变的多肽的试剂。利用所述的试剂盒检测生物样品中是否存在突变的多肽，可以筛选出患遗传性因子V缺乏症的生物样品。
第三方面提出了一种重组细胞，所述的重组细胞是由编码F5基因突变体的核酸构建的遗传载体转化受体细胞获得的。
进一步的，所述的重组细胞在筛选治疗遗传性因子V缺乏症的药物中的应用。利用所述的重组细胞能够有效筛选治疗遗传性因子V缺乏症的药物。
区别于现有技术，上述技术方案的有益效果如下：
(1)本发明的检测方法快速、准确、高效、简便，能够有效筛选出易患遗传性因子V缺乏症的生物样品。
(2)本发明可用于遗传性因子V缺乏症患者的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断，并且检测结果可以为遗传性因子V缺乏症的早期诊断、鉴别诊断、治疗方案的制定提供科学依据。
附图说明
图1为具体实施方式所述的遗传性因子V缺乏症患者的家系图谱，图中箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，半实心图标为携带者；
图2为具体实施方式所述的遗传性因子V缺乏症患者家系中患者及家系内正常人的F5基因c.587G>T突变位点的正向引物Sanger测序图，图中中间长方形框标出的为突变位点所在位置；
图3为具体实施方式所述的遗传性因子V缺乏症患者家系中患者及家系内正常人的F5基因c.5195C>T突变位点的正向引物Sanger测序图，图中中间长方形框标出的为突变位点所在位置。
具体实施方式
F5基因突变体
第一方面，发明人提出了一种分离的编码F5基因突变体的核酸。与SEQ ID NO:1相比，所述核酸具有c.587G>T突变,或者c.5195C>T突变，或者c.587G>T和c.5195C>T复合杂合突变。在本发明中所使用的表达方式“编码F5基因突变体的核酸”，是指与编码F5基因突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与F5突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据实施例，所述的编码F5基因突变体的核酸为DNA。
根据实施例，发明人确定了F5基因的新突变体，该突变体与遗传性因子V缺乏症的发病密切相关，从而通过检测上述突变体在生物样品中是否同时存在，可以达到有效地预测生物体是否易患遗传性因子V缺乏症的目的。
对于本发明中，提及核酸，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本发明中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。本领域技术人员可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
编码F5基因突变体的核酸，是发明人通过目标区域基因外显子组测序分析联合Sanger测序验证的方法确定的遗传性因子V缺乏症致病基因上的新致病突变。该致病突变位点为新的，在现有技术中并未被提到。
其中，野生型F5基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列：
ATGTTCCCAGGCTGCCCACGCCTCTGGGTCCTGGTGGTCTTGGGCACCAGCTGGGTAGGCTGGGGGAGCCAAGGGACAGAAGCGGCACAGCTAAGGCAGTTCTACGTGGCTGCTCAGGGCATCAGTTGGAGCTACCGACCTGAGCCCACAAACTCAAGTTTGAATCTTTCTGTAACTTCCTTTAAGAAAATTGTCTACAGAGAGTATGAACCATATTTTAAGAAAGAAAAACCACAATCTACCATTTCAGGACTTCTTGGGCCTACTTTATATGCTGAAGTCGGAGACATCATAAAAGTTCACTTTAAAAATAAGGCAGATAAGCCCTTGAGCATCCATCCTCAAGGAATTAGGTACAGTAAATTATCAGAAGGTGCTTCTTACCTTGACCACACATTCCCTGCGGAGAAGATGGACGACGCTGTGGCTCCAGGCCGAGAATACACCTATGAATGGAGTATCAGTGAGGACAGTGGACCCACCCATGATGACCCTCCATGCCTCACACACATCTATTACTCCCATGAAAATCTGATCGAGGATTTCAACTCGGGGCTGATTGGGCCCCTGCTTATCTGTAAAAAAGGGACCCTAACTGAGGGTGGGACACAGAAGACGTTTGACAAGCAAATCGTGCTACTATTTGCTGTGTTTGATGAAAGCAAGAGCTGGAGCCAGTCATCATCCCTAATGTACACAGTCAATGGATATGTGAATGGGACAATGCCAGATATAACAGTTTGTGCCCATGACCACATCAGCTGGCATCTGCTGGGAATGAGCTCGGGGCCAGAATTATTCTCCATTCATTTCAACGGCCAGGTCCTGGAGCAGAACCATCATAAGGTCTCAGCCATCACCCTTGTCAGTGCTACATCCACTACCGCAAATATGACTGTGGGCCCAGAGGGAAAGTGGATCATATCTTCTCTCACCCCAAAACATTTGCAAGCTGGGATGCAGGCTTACATTGACATTAAAAACTGCCCAAAGAAAACCAGGAATCTTAAGAAAATAACTCGTGAGCAGAGGCGGCACATGAAGAGGTGGGAATACTTCATTGCTGCAGAGGAAGTCATTTGGGACTATGCACCTGTAATACCAGCGAATATGGACAAAAAATACAGGTCTCAGCATTTGGATAATTTCTCAAACCAAATTGGAAAACATTATAAGAAAGTTATGTACACACAGTACGAAGATGAGTCCTTCACCAAACATACAGTGAATCCCAATATGAAAGAAGATGGGATTTTGGGTCCTATTATCAGAGCCCAGGTCAGAGACACACTCAAAATCGTGTTCAAAAATATGGCCAGCCGCCCCTATAGCATTTACCCTCATGGAGTGACCTTCTCGCCTTATGAAGATGAAGTCAACTCTTCTTTCACCTCAGGCAGGAACAACACCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAGGAATACAGAGGGCAGCAGACATCGAACAGCAGGCTGTGTTTGCTGTGTTTGATGAGAACAAAAGCTGGTACCTTGAGGACAACATCAACAAGTTTTGTGAAAATCCTGATGAGGTGAAACGTGATGACCCCAAGTTTTATGAATCAAACATCATGAGCACTATCAATGGCTATGTGCCTGAGAGCATAACTACTCTTGGATTCTGCTTTGATGACACTGTCCAGTGGCACTTCTGTAGTGTGGGGACCCAGAATGAAATTTTGACCATCCACTTCACTGGGCACTCATTCATCTATGGAAAGAGGCATGAGGACACCTTGACCCTCTTCCCCATGCGTGGAGAATCTGTGACGGTCACAATGGATAATGTTGGAACTTGGATGTTAACTTCCATGAATTCTAGTCCAAGAAGCAAAAAGCTGAGGCTGAAATTCAGGGATGTTAAATGTATCCCAGATGATGATGAAGACTCATATGAGATTTTTGAACCTCCAGAATCTACAGTCATGGCTACACGGAAAATGCATGATCGTTTAGAACCTGAAGATGAAGAGAGTGATGCTGACTATGATTACCAGAACAGACTGGCTGCAGCATTAGGAATCAGGTCATTCCGAAACTCATCATTGAATCAGGAAGAAGAAGAGTTCAATCTTACTGCCCTAGCTCTGGAGAATGGCACTGAATTCGTTTCTTCAAACACAGATATAATTGTTGGTTCAAATTATTCTTCCCCAAGTAATATTAGTAAGTTCACTGTCAATAACCTTGCAGAACCTCAGAAAGCCCCTTCTCACCAACAAGCCACCACAGCTGGTTCCCCACTGAGACACCTCATTGGCAAGAACTCAGTTCTCAATTCTTCCACAGCAGAGCATTCCAGCCCATATTCTGAAGACCCTATAGAGGATCCTCTACAGCCAGATGTCACAGGGATACGTCTACTTTCACTTGGTGCTGGAGAATTCAAAAGTCAAGAACATGCTAAGCATAAGGGACCCAAGGTAGAAAGAGATCAAGCAGCAAAGCACAGGTTCTCCTGGATGAAATTACTAGCACATAAAGTTGGGAGACACCTAAGCCAAGACACTGGTTCTCCTTCCGGAATGAGGCCCTGGGAGGACCTTCCTAGCCAAGACACTGGTTCTCCTTCCAGAATGAGGCCCTGGAAGGACCCTCCTAGTGATCTGTTACTCTTAAAACAAAGTAACTCATCTAAGATTTTGGTTGGGAGATGGCATTTGGCTTCTGAGAAAGGTAGCTATGAAATAATCCAAGATACTGATGAAGACACAGCTGTTAACAATTGGCTGATCAGCCCCCAGAATGCCTCACGTGCTTGGGGAGAAAGCACCCCTCTTGCCAACAAGCCTGGAAAGCAGAGTGGCCACCCAAAGTTTCCTAGAGTTAGACATAAATCTCTACAAGTAAGACAGGATGGAGGAAAGAGTAGACTGAAGAAAAGCCAGTTTCTCATTAAGACACGAAAAAAGAAAAAAGAGAAGCACACACACCATGCTCCTTTATCTCCGAGGACCTTTCACCCTCTAAGAAGTGAAGCCTACAACACATTTTCAGAAAGAAGACTTAAGCATTCGTTGGTGCTTCATAAATCCAATGAAACATCTCTTCCCACAGACCTCAATCAGACATTGCCCTCTATGGATTTTGGCTGGATAGCCTCACTTCCTGACCATAATCAGAATTCCTCAAATGACACTGGTCAGGCAAGCTGTCCTCCAGGTCTTTATCAGACAGTGCCCCCAGAGGAACACTATCAAACATTCCCCATTCAAGACCCTGATCAAATGCACTCTACTTCAGACCCCAGTCACAGATCCTCTTCTCCAGAGCTCAGTGAAATGCTTGAGTATGACCGAAGTCACAAGTCCTTCCCCACAGATATAAGTCAAATGTCCCCTTCCTCAGAACATGAAGTCTGGCAGACAGTCATCTCTCCAGACCTCAGCCAGGTGACCCTCTCTCCAGAACTCAGCCAGACAAACCTCTCTCCAGACCTCAGCCACACGACTCTCTCTCCAGAACTCATTCAGAGAAACCTTTCCCCAGCCCTCGGTCAGATGCCCATTTCTCCAGACCTCAGCCATACAACCCTTTCTCCAGACCTCAGCCATACAACCCTTTCTTTAGACCTCAGCCAGACAAACCTCTCTCCAGAACTCAGTCAGACAAACCTTTCTCCAGCCCTCGGTCAGATGCCCCTTTCTCCAGACCTCAGCCATACAACCCTTTCTCTAGACTTCAGCCAGACAAACCTCTCTCCAGAACTCAGCCATATGACTCTCTCTCCAGAACTCAGTCAGACAAACCTTTCCCCAGCCCTCGGTCAGATGCCCATTTCTCCAGACCTCAGCCATACAACCCTTTCTCTAGACTTCAGCCAGACAAACCTCTCTCCAGAACTCAGTCAAACAAACCTTTCCCCAGCCCTCGGTCAGATGCCCCTTTCTCCAGACCCCAGCCATACAACCCTTTCTCTAGACCTCAGCCAGACAAACCTCTCTCCAGAACTCAGTCAGACAAACCTTTCCCCAGACCTCAGTGAGATGCCCCTCTTTGCAGATCTCAGTCAAATTCCCCTTACCCCAGACCTCGACCAGATGACACTTTCTCCAGACCTTGGTGAGACAGATCTTTCCCCAAACTTTGGTCAGATGTCCCTTTCCCCAGACCTCAGCCAGGTGACTCTCTCTCCAGACATCAGTGACACCACCCTTCTCCCGGATCTCAGCCAGATATCACCTCCTCCAGACCTTGATCAGATATTCTACCCTTCTGAATCTAGTCAGTCATTGCTTCTTCAAGAATTTAATGAGTCTTTTCCTTATCCAGACCTTGGTCAGATGCCATCTCCTTCATCTCCTACTCTCAATGATACTTTTCTATCAAAGGAATTTAATCCACTGGTTATAGTGGGCCTCAGTAAAGATGGTACAGATTACATTGAGATCATTCCAAAGGAAGAGGTCCAGAGCAGTGAAGATGACTATGCTGAAATTGATTATGTGCCCTATGATGACCCCTACAAAACTGATGTTAGGACAAACATCAACTCCTCCAGAGATCCTGACAACATTGCAGCATGGTACCTCCGCAGCAACAATGGAAACAGAAGAAATTATTACATTGCTGCTGAAGAAATATCCTGGGATTATTCAGAATTTGTACAAAGGGAAACAGATATTGAAGACTCTGATGATATTCCAGAAGATACCACATATAAGAAAGTAGTTTTTCGAAAGTACCTCGACAGCACTTTTACCAAACGTGATCCTCGAGGGGAGTATGAAGAGCATCTCGGAATTCTTGGTCCTATTATCAGAGCTGAAGTGGATGATGTTATCCAAGTTCGTTTTAAAAATTTAGCATCCAGACC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NO:1)。
其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：
MFPGCPRLWVLVVLGTSWVGWGSQGTEAAQLRQFYVAAQGISWSYRPEPTNSSLNLSVTSFKKIVYREYEPYFKKEKPQSTISGLLGPTLYAEVGDIIKVHFKNKADKPLSIHPQGIRYSKLSEGASYLDHTFPAEKMDDAVAPGREYTYEWSISEDSGPTHDDPPCLTHIYYSHENLIEDFNSGLIGPLLICKKGTLTEGGTQKTFDKQIVLLFAVFDESKSWSQSSSLMYTVNGYVNGTMPDITVCAHDHISWHLLGMSSGPELFSIHFNGQVLEQNHHKVSAITLVSATSTTANMTVGPEGKWIISSLTPKHLQAGMQAYIDIKNCPKKTRNLKKITREQRRHMKRWEYFIAAEEVIWDYAPVIPANMDKKYRSQHLDNFSNQIGKHYKKVMYTQYEDESFTKHTVNPNMKEDGILGPIIRAQVRDTLKIVFKNMASRPYSIYPHGVTFSPYEDEVNSSFTSGRNNTMIRAVQPGETYTYKWNILEFDEPTENDAQCLTRPYYSDVDIMRDIASGLIGLLLICKSRSLDRRGIQRAADIEQQAVFAVFDENKSWYLEDNINKFCENPDEVKRDDPKFYESNIMSTINGYVPESITTLGFCFDDTVQWHFCSVGTQNEILTIHFTGHSFIYGKRHEDTLTLFPMRGESVTVTMDNVGTWMLTSMNSSPRSKKLRLKFRDVKCIPDDDEDSYEIFEPPESTVMATRKMHDRLEPEDEESDADYDYQNRLAAALGIRSFRNSSLNQEEEEFNLTALALENGTEFVSSNTDIIVGSNYSSPSNISKFTVNNLAEPQKAPSHQQATTAGSPLRHLIGKNSVLNSSTAEHSSPYSEDPIEDPLQPDVTGIRLLSLGAGEFKSQEHAKHKGPKVERDQAAKHRFSWMKLLAHKVGRHLSQDTGSPSGMRPWEDLPSQDTGSPSRMRPWKDPPSDLLLLKQSNSSKILVGRWHLASEKGSYEIIQDTDEDTAVNNWLISPQNASRAWGESTPLANKPGKQSGHPKFPRVRHKSLQVRQDGGKSRLKKSQFLIKTRKKKKEKHTHHAPLSPRTFHPLRSEAYNTFSERRLKHSLVLHKSNETSLPTDLNQTLPSMDFGWIASLPDHNQNSSNDTGQASCPPGLYQTVPPEEHYQTFPIQDPDQMHSTSDPSHRSSSPELSEMLEYDRSHKSFPTDISQMSPSSEHEVWQTVISPDLSQVTLSPELSQTNLSPDLSHTTLSPELIQRNLSPALGQMPISPDLSHTTLSPDLSHTTLSLDLSQTNLSPELSQTNLSPALGQMPLSPDLSHTTLSLDFSQTNLSPELSHMTLSPELSQTNLSPALGQMPISPDLSHTTLSLDFSQTNLSPELSQTNLSPALGQMPLSPDPSHTTLSLDLSQTNLSPELSQTNLSPDLSEMPLFADLSQIPLTPDLDQMTLSPDLGETDLSPNFGQMSLSPDLSQVTLSPDISDTTLLPDLSQISPPPDLDQIFYPSESSQSLLLQEFNESFPYPDLGQMPSPSSPTLNDTFLSKEFNPLVIVGLSKDGTDYIEIIPKEEVQSSEDDYAEIDYVPYDDPYKTDVRTNINSSRDPDNIAAWYLRSNNGNRRNYYIAAEEISWDYSEFVQRETDIEDSDDIPEDTTYKKVVFRKYLDSTFTKRDPRGEYEEHLGILGPIIRAEVDDVIQVRFKNLASRPYSLHAHGLSYEKSSEGKTYEDDSPEWFKEDNAVQPNSSYTYVWHATERSGPESPGSACRAWAYYSAVNPEKDIHSGLIGPLLICQKGILHKDSNMPMDMREFVLLFMTFDEKKSWYYEKKSRSSWRLTSSEMKKSHEFHAINGMIYSLPGLKMYEQEWVRLHLLNIGGSQDIHVVHFHGQTLLENGNKQHQLGVWPLLPGSFKTLEMKASKPGWWLLNTEVGENQRAGMQTPFLIMDRDCRMPMGLSTGIISDSQIKASEFLGYWEPRLARLNNGGSYNAWSVEKLAAEFASKPWIQVDMQKEVIITGIQTQGAKHYLKSCYTTEFYVAYSSNQINWQIFKGNSTRNVMYFNGNSDASTIKENQFDPPIVARYIRISPTRAYNRPTLRLELQGCEVNGCSTPLGMENGKIENKQITASSFKKSWWGDYWEPFRARLNAQGRVNAWQAKANNNKQWLEIDLLKIKKITAIITQGCKSLSSEMYVKSYTIHYSEQGVEWKPYRLKSSMVDKIFEGNTNTKGHVKNFFNPPIISRFIRVIPKTWNQSIALRLELFGCDIY(SEQ ID NO:2)。
与野生型F5基因的SEQ ID NO:1所示序列相比，发明人发现F5基因具有2个突变体，其中之一具有c.587G>T变异，即编码区第587位碱基由G突变为T，该变异导致其所编码的产物与野生型F5(SEQ ID NO:2)相比，具有p.Gly196Val的错义突变，即其第196位氨基酸由甘氨酸(Gly)突变成缬氨酸(Val)。另一个具有c.5195C>T变异，即编码区第5195位碱基由C突变为T，该变异导致其所编码的产物与野生型F5(SEQ ID NO:2)相比，具有p.Ser1732Leu的错义突变，即第1732位氨基酸由丝氨酸(Ser)突变成亮氨酸(Leu)。
发明人首次提出F5基因的c.587G>T和c.5195C>T的复合杂合突变导致患者出现遗传性因子V缺乏症的症状，从而通过检测该两个新突变体在生物样品中是否同时存在，可达到有效地预测生物体是否易感遗传性因子V缺乏症的目的。
筛选易患遗传性因子V缺乏症的生物样品的方法
第二方面，提供了一种检测编码F5基因突变体核酸的试剂盒，所述试剂盒包括适于检测与SEQ ID NO:1相比具有c.587G>T突变和c.5195C>T突变的F5基因突变体的试剂。
第三方面，利用所述试剂盒提供了一种筛选易患遗传性因子V缺乏症的生物样品的方法。包括以下实施步骤：
第一，从所述生物样品提取核酸样本。生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品F5基因是否存在突变的核酸样本即可。根据实施例，生物样品包括但不限于血液、唾液、组织、毛发或口腔黏膜。这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中F5基因是否存在突变的样本，包括但不限于从生物样品中提取的基因组DNA、总RNA和mRNA。根据实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患遗传性因子V缺乏症的生物样品的效率。
第二，确定所述核酸样本的核酸序列。确定所述核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。可采用但不限于核酸测序的方法确定核酸样本的核酸序列。根据实施例，核酸测序的方法和设备并不受特别限制，可采用第二代测序技术，也可以采用第一代、第三代等各种性能的测序技术。根据实施例，采用第二代测序技术确定核酸样本的核酸序列的步骤还包括：针对核酸样本，构建测序文库，利用测序设备对测序文库进行测序，达到获得包含F5基因信息的测序结果。根据实施例，所述测序设备包括但不限于Novaseq系列、Hiseq系列、Nexeseq系列、BGIseq系列第二代核酸测序仪。根据实施例，构建测序文库的试剂和方法包括但不限于Nextera、TruSeq、Yeasen，具体流程可参见厂家说明书，本领域技术人员可以根据不同的测序平台进行适当选择。根据实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集F5基因的外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据实施例，设计并合成特异性扩增F5基因外显子区域的引物，利用所述引物扩增基因组DNA样本，利用扩增产物构建核酸测序文库。所述利用F5基因外显子特异性引物进行PCR扩增的方法，可有效提高筛选易患遗传性因子V缺乏症的生物样品的效率。
根据实施例，F5基因外显子特异性引物不受特别限制，针对c.587G>T和c.5195C>T突变，发明人进行了优选设计，所述F5基因第5外显子的特异性引物具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：
上游引物F：GAAGACAGTGTGGCACCAGATT(SEQ ID NO:3)
下游引物R：CCTCGTGTTACCTGGCATTG(SEQ ID NO:4)
所述F5基因第15外显子的特异性引物具有如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列：
上游引物F：GAAAAATCATCAGAGGGAAAGAC(SEQ ID NO:5)
下游引物R：ATGCCATCTTCTGTAAATGTAGG(SEQ ID NO:6)
需要说明的是，这里所使用的术语“核酸序列”泛指所有包含F5基因编码信息的核酸序列和信息数据，包括但不限于测序(sanger)直接获得的核酸序列信息、测序数据进行组装后得到的完整的核酸序列信息、测序设备产生的原始测序数据(reads)、测序数据经计算机处理后的数据信息(Bam文件等)。
第三，所述核酸序列与基因组参考序列的比对。具体地，基于核酸样本的核酸序列或其互补序列与SEQ ID NO:1相比。如具有c.587G>T和c.5195C>T复合杂合突变，则提示生物体易患遗传性因子V缺乏症。核酸序列与SEQ ID NO:1进行比对的方法并不受特别限制，可以采用人工比对，也可以给予任意计算机软件，根据实施例，可以采用Novocraft公司的NovoAlign软件比对。
需要说明的是，采用第二代测序技术，针对一个遗传性因子V缺乏症综合征患者进行24个与凝血功能障碍相关基因的外显子测序分析，并联合Sanger测序对患者本人及其父母进行验证，最终发现了遗传性因子V缺乏症的两个新复合杂合突变位点——F5基因的c.587G>T和c.5195C>T突变。与第一代测序技术、经典的连锁分析策略相比，高通量的第二代测序技术具有通量高、速度快、检测成本低等优点，可以快速、准确的定位遗传性因子V缺乏症的致病突变位点，进而为阐明遗传性因子V缺乏症的分子发病机制，为疾病早期诊断和治疗提供科学的依据。
第四方面，根据获得的突变基因提出了一种分离的多肽。与野生型F5相比，所述分离的多肽具有p.Gly196Val和p.Ser1732Leu突变。所述的多肽是由前述分离的编码F5基因突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达上述多肽，可以达到有效地检测生物体是否患遗传性因子V缺乏症的目的。
根据实施例，提供了筛选患遗传性因子V缺乏症的生物样品的试剂盒，包括适用于检测F5基因突变体核酸编码的多肽的试剂，所述F5基因突变体核酸编码的多肽为与SEQ IDNO:2相比，具有p.Gly196Val突变和p.Ser1732Leu突变。利用所述试剂，检测出同时存在上述两种多肽的生物样品，即可有效地筛选出患遗传性因子V缺乏症的生物样品。
作为对本发明的衍生应用，提出了一种重组细胞，所述的重组细胞是由编码F5基因突变体的核酸构建的遗传载体转化受体细胞获得的。其中，所述的受体细胞的种类不受特别的限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。所述的遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。所述的遗传载体可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。所述的重组细胞能够表达遗传载体所携带的F5基因突变体。
进一步的，利用所述的重组细胞能够有效筛选治疗遗传性因子V缺乏症的药物。
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案进行详细说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1确定遗传性因子V缺乏症致病突变
1、样本来源
来自中国福建省的一个名12岁消化道出血女患者(先证者)，先证者以黑色柏油便1天为主诉就诊，并收住院。先证者平时皮肤破损后易止血，碰撞后易留下瘀点或瘀斑。父母为非近亲结婚，均无出血史，实验室检查发现其血浆凝血酶原时间(PT)54.3S(对照为9.8-12.1S)、活化部分凝血活酶时间(APTT)168.7S(对照为22.7-31.8S)、凝血酶时间(TT)15.2S(对照为14.0-21.0S)，凝血因子V活性测定(FV:C)1.2％(对照为60-150％)，初步诊断为凝血因子V缺乏症。该出血家系谱如图1所示，箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，半实心图标为携带者。获得所有参与者的知情同意书，并进行静脉血采集。
2、基因组DNA提取
取上述家系所有成员的外周血，分别采用HiPure Blood&Tissue DNA Kit(Magen)全血DNA提取方法从外周血样品中提取基因组DNA，用Nanodrop one测量DNA的纯度，所得各基因组DNA的OD260nm/OD280nm均应位于1.7-2.0之间，用Nanodrop one测量DNA的浓度，所得各基因组DNA的浓度为50-100ng/μL，总量为5-10μg。
3、目标外显子捕获测序
发明人利用Illumina公司的Nextera DNA Exome试剂盒结合Illumina高通量测序技术，对上述遗传性因子V缺乏症患者的临床外显子组序列进行了测序。
具体如下：
1)利用Illumina公司的Nextera DNA Exome试剂盒将各基因组DNA样本随机打断成200-1000bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库。
2)文库经纯化后，用Nanodrop检测文库，并等量混合，混合后浓度>100ng/μL，用经过Nextera Rapid Capture Enrichment捕获试剂，结合Illumina公司的Nextera DNAExome试剂盒进行杂交富集，再经过扩增，文库检测合格后即可上机测序，获得原始测序数据。其中，测序平台为Illumina Hiseq X Ten，PE150，各样本的20X平均测序覆盖度≥96％。
使用Novocraft NovoAlign将NGS测序结果和人类参考基因组UCSC NCBI37/hg19进行比对，获得比对到基因组上的唯一比对序列。利用VarScan mpileup2snp和VarScanmpileup2indel检测确定靶区域的变异。利用Remove Run Common Variants和RemoveGlobal Common Variants去除dbSNP和ExAC数据库中的常见变异。然后利用InteractiveBiosoftware Alamut Batch对变异进行注释。注释用到的数据库包括：dbSNP、ExAC、1000G、ClinVar、OMIM等。利用filterAlamut.py将注释后的变异按照High、Medium、Low排序。在High和Medium分组中，给予变异一个优先级值和分级理由。所有的变异最初都在Low组别中，当一个变异符合某些标准时，则可以被划分为更高级别的变异。并利用FATHMM、FATHMMMKL、METALR、METASVM、MUTATIONASSESSOR、MUTATIONTASTERAGVGD、AGVGD、LRT,PROVEAN、SIFT软件进行SNP功能预测。
上述流程中分析的目标基因共24个，主要为凝血功能障碍相关基因，包括：
F10,F11,F12,F13A1,F13B,F2,F5,F7,F8,F9,FGA,FGB,FGG,GGCX,GP1BA,KLKB1,KNG1,LMAN1,MCFD2,PLG,SERPINE1,SERPINF2,VKORC1,VWF。
发明人发现了两个新的F5基因变异体c.587G>T(p.Gly196Val)和c.5195C>T(p.Ser1732Leu)。其中杂合变异c.587G>T(p.Gly196Val)，即编码区第587位碱基由G突变为T，该变异导致所编码多肽第196位氨基酸由甘氨酸(Gly)突变成缬氨酸(Val)。该变异(p.Gly196Val)尚未在HGMD和gnomAD数据库中收录。甘氨酸和缬氨酸的理化性质存在一定差异(Grantham dist.:109)。氨基酸保守性分析表明该位点的野生型氨基酸(Gly196)在分析的12(12)种灵长类动物、60(61)种哺乳动物和25(25)种非哺乳脊椎动物中保守，提示该位点发生变异将不被容忍。该错义突变在1个预测软件中提示有害(SIFT)，1个预测软件中提示可容忍(AGVGD)。依据ACMG指南，发明人认为该变异为临床意义未明变异。
另一个变异c.5195C>T，即编码区第5195位碱基由C突变为T，该变异导致所编码多肽第1732位氨基酸由丝氨酸(Ser)突变成亮氨酸(Leu)，该变异(p.Ser1732Leu)尚未在HGMD和gnomAD数据库中收录。丝氨酸和亮氨酸的理化性质存在一定差异(Grantham dist.:145)。氨基酸保守性分析表明该位点的野生型氨基酸(Ser1732)在分析的96种脊椎动物中保守，提示该位点发生变异将不被容忍，并可能对蛋白质的结构和/或功能产生不良影响。该错义突变在1个预测软件中提示有害(SIFT)，1个预测软件中提示可容忍(AGVGD)。依据ACMG指南，发明人认为该变异为临床意义未明变异。
由于F5基因是遗传性因子V缺乏症的致病基因，且患者临床表现与遗传性因子V缺乏症相符，因此发明人判断患者可能罹患遗传性因子V缺乏症，并建议通过Sanger测序收集更多的变异分类证据。
实施例2Sanger法测序验证
分别对实施例1中所述的遗传性因子V缺乏症患者家系中的家系成员(包括1个患者和2个正常家系成员)的F5基因进行检测：针对F5基因的c.587G>T和c.5195C>T突变设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得突变位点有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证F5基因的c.587G>T和c.5195C>T突变与遗传性因子V缺乏症之间的相关性。
具体方法步骤如下：
1、DNA提取
参照实施例1中所述的提取DNA的方法。
2、引物设计及PCR反应
首先，参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，分别针对F5基因的c.587G>T和c.5195C>T突变所在的第5和第15外显子设计特异性引物，具体序列如下：
F5基因第5外显子引物：
上游引物F：GAAGACAGTGTGGCACCAGATT(SEQ ID NO:3)
上游引物R：CCTCGTGTTACCTGGCATTG(SEQ ID NO:4)
F5基因第15外显子引物：
上游引物F：GAAAAATCATCAGAGGGAAAGAC(SEQ ID NO:5)
上游引物R：ATGCCATCTTCTGTAAATGTAGG(SEQ ID NO:6)
接着，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应，50μL反应体系包括：10×buffer 5μL、基因组DNA 1μL、上游引物F(SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5)2μL、下游引物R(SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6)2μL、10mM dNTP 5μL、Taq酶1μL、ddH2O34μL。PCR反应条件：95℃5min，30个循环(95℃15s，60℃30s，72℃45s)，72℃5min，4℃保温。最终获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。
3、测序
将步骤2中获得的各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物直接进行DNA测序。测序采用ABI3730型测序仪进行正反向测序。将测序结果与F5基因如SEQ ID NO:1所示核酸序列进行比对。基于比对结果，可以排查遗传性因子V缺乏症家系成员中是否存在F5基因的c.587G>T，或c.5195C>T突变位点。比对发现，该家系中患者(先证者)同时携带了c.587G>T和c.5195C>T复合杂合突变，该突变体编码的多肽与F5的如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列比较，具有p.Gly196Val和p.Ser1732Leu变异。如图2所示，中间长方形框内为变异所在位点，先证者和表型正常的母亲携带了c.587G>T杂合突变，而父亲该位点为野生型。如图3所示，中间长方形框内为变异所在位点，先症者与表型正常的父亲携带了c.5195C>T杂合突变，而母亲该位点为野生型。上述结果符合遗传性因子V缺乏症常染色体隐性遗传的特点。由此，进一步证明F5基因的c.587G>T(p.Gly196Val)，或c.5195C>T(p.Ser1732Leu)是遗传性因子V缺乏症的新的致病位点，F5基因的c.587G>T和c.5195C>T的复合杂合突变能够导致该病。
实施例3F5基因突变体检测试剂盒
F5基因突变体的检测试剂盒，包含能够检测F5基因c.587G>T突变的引物和c.5195C>T突变的引物，用于筛选易患的生物样品。其中这些引物为F5基因的特异性引物，其序列如实施例2中所述SEQ ID NO：3-6所示。
利用上述试剂盒筛选易患遗传性因子V缺乏症的生物样品的具体步骤为：按照实施例1的步骤2所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述F5基因的特异性引物进行PCR反应，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否同时具有c.587G>T和c.5195C>T突变，能够有效地检测F5基因突变体在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患遗传性因子V缺乏症，进一步的，能够从待测者中筛选出易患遗传性因子V缺乏症的生物样品。
实施例4F5基因突变体编码的多肽的检测试剂盒
F5基因突变体编码的多肽的检测试剂盒，包含抗p.Gly196Val变异的多肽的特异性抗体和抗p.Ser1732Leu变异的多肽的特异性抗体，用于筛选患遗传性因子V缺乏症的生物样品。其中抗体是用多肽免疫动物后获得的多克隆抗体或者单克隆抗体。
利用上述试剂盒筛选患遗传性因子V缺乏症的生物样品的具体步骤为：将待测样本(包括血清或血浆)分别加入到含有抗p.Gly196Val变异的多肽的特异性抗体的试剂和含有抗p.Ser1732Leu变异的多肽的特异性抗体的试剂中，通过判断抗体与待测样本中的多肽是否发生了抗原抗体间的免疫学反应，从而得知F5基因突变体编码的多肽在待测样本中是否存在，即可从中筛选出患遗传性因子V缺乏症的生物样品。
结果判断：若抗p.Gly196Val变异的多肽的特异性抗体和抗p.Ser1732Leu变异的多肽的特异性抗体均与待测样本发生了免疫反应，则该待测样本为患遗传性因子V缺乏症的生物样品。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中，且不做特定指代。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (9)

1.一种编码F5基因突变体的核酸，其特征在于，与SEQ ID NO:1相比，所述核酸的基因序列具有c.587G>T突变，或c.5195C>T突变，或c.587G>T和c.5195C>T复合杂合突变。
2.一种用于检测编码F5基因突变体的核酸的引物，其特征在于，所述的引物的序列如下：
F5基因第5外显子引物：
上游引物F：GAAGACAGTGTGGCACCAGATT(SEQ ID NO:3)，
下游引物R：CCTCGTGTTACCTGGCATTG(SEQ ID NO:4)；
F5基因第15外显子引物：
上游引物F：GAAAAATCATCAGAGGGAAAGAC(SEQ ID NO:5)，
下游引物R：ATGCCATCTTCTGTAAATGTAGG(SEQ ID NO:6)。
3.一种编码F5基因突变体的核酸的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包括权利要求2所述的引物。
4.一种如权利要求1所述的编码F5基因突变体的核酸在制备检测易患遗传性因子V缺乏症的生物样品的试剂中的应用。
5.一种如权利要求2所述的用于检测编码F5基因突变体的核酸的引物在制备检测易患遗传性因子V缺乏症的生物样品的试剂中的应用。
6.一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽由权利要求1所述的编码F5基因突变体的核酸编码，与SEQ ID NO:2相比，所述的多肽的氨基酸序列具有p.Gly196Val突变，或p.Ser1732Leu突变，或p.Gly196Val和p.Ser1732Leu复合突变。
7.一种如权利要求6所述的分离的多肽在制备检测患遗传性因子V缺乏症的生物样品的试剂中的应用。
8.一种重组细胞，其特征在于，所述的重组细胞是由权利要求1所述的编码F5基因突变体的核酸构建的遗传载体转化受体细胞获得的。
9.一种如权利要求8所述的重组细胞在筛选治疗遗传性因子V缺乏症的药物中的应用。
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