CN109504605B - 细胞共培养方法、装置及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞共培养装置，利用所述细胞共培养装置的细胞共培养方法以及所述细胞共培养装置在共培养不同细胞中的应用。本发明的细胞共培养装置包括至少一个嵌入式共培养单元，其包括嵌入方式放置在第二容器中的第一容器，所述第二容器通过微孔滤膜与所述第一容器分隔开，并且所述第二容器在所述微孔滤膜的界面外侧还通过透析膜进一步与所述第一容器分隔开。本发明的细胞共培养装置可以实现跨种属共培养。

Description

细胞共培养方法、装置及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种细胞共培养方法。装置及其应用。

背景技术

细胞培养技术是目前体外实验中最常用的方法。现代生物技术对微生物或细胞的研究都始于纯培养，纯培养简单、易操作、易调控、研究因素单一，广泛应用于生物学的各个领域。但纯培养也存在不足，纯培养脱离了自然或体内复杂的生长环境，使性状趋于单一化，逐渐丧失了原有的生物学特性，从而出现与自然菌株或体内细胞完全不同的生理或代谢性质。纯培养由于不能完全模拟多细胞相互作用的体内环境、细胞趋向单一化，因而无法探讨多细胞间的相互关系，更不能满足研究者的需求。细胞共培养技术能弥补纯培养的缺陷，有利于构建更接近人体状态的体外生理或病理模型。细胞共培养又称为复合培养或混合培养，是指将两种或两种以上细胞或微生物放在同一培养系统中培养。细胞共培养技术主要用于研究诱导干细胞分化、提高代谢物产量、提高细胞生存能力、维持细胞功能和活性和体外组织的构建等。

目前，细胞共培养方法可包括直接接触共培养和间接接触共培养。直接接触共培养是将两种或两种以上细胞或微生物以直接接触方式放在同一体系中培养，仅适用于生长状态相近或自然状态下近邻的两者，虽然操作简单，但难以定性考察指标和区分不同的细胞/微生物。

间接接触共培养是现有技术中的主要应用方式。其又分为条件培养基共培养法和嵌入式细胞共培养法。条件培养基共培养法使用培养过某种细胞或微生物的培养基去培养另一种细胞或微生物。嵌入式细胞共培养法则是利用带有微孔膜的嵌入式小室区分两系统进行培养，例如常见的transwell小室培养系统。常艳等提到了一种Millicell插入式细胞培养皿(又称Transwell小室)，在进行细胞共培养时，将Transwell小室放入培养板中，分别在上室和下室中种入细胞A和细胞B，并且上室底部设有能够连通上室和下室的具有通透性的薄膜，使细胞B在其培养液中的成分影响到细胞A，从而研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A生长、运动等的影响(参见常艳，魏伟，《中国临床药理学与治疗学》,2009,14(7):827-832)。

上述间接接触共培养法虽然可以在一定程度上消除两系统的直接影响，并在一定程度上降低系统相容性带来的不可控因素。但是，间接接触共培养仍有很大的局限性，例如，一方面对培养对象有严格的要求，仅仅适用于性质相近的细胞或微生物，或者更具体地说仅适用于同一组织或种属的细胞或微生物；另一方面，对培养条件也有很大的局限性，通常仅同种培养基或组成相近的培养基才可适用。总之，无论是条件培养基共培养法还是嵌入式细胞共培养法，都存在局限性大、难以还原真实生长环境的明显缺点。

细胞培养产业技术的发展和不同场景下细胞培养的应用客观上要求开发出更具培养对象和培养基适应性的共培养方法，尤其是可以利用不同的培养基对种属差异大的培养对象进行共培养的方法及其装置。现有技术中迫切需要这样的细胞共培养方法和装置。

发明内容

本发明人在大量研究中意外发现，对于现有技术中的嵌入式细胞共培养装置而言，如果在两培养液(基)界面之间额外增加一层透析膜，可以实现上述目的。具体来说，以现有技术中使用的Transwell共培养装置为例，该类装置通常表现为可置于孔板中的杯子，杯子底部有微孔滤膜与杯外环境隔离和沟通。据此，杯内与杯外形成两个相对独立的体系。本发明人通过实验发现，如果在杯外环境与杯内环境之间(例如孔板与微孔滤膜之间)额外增加透析膜，则可以更好地保持两培养体系的相对独立性，允许对利用不同的培养基对种属差异大的培养对象(例如，不同的细胞或微生物)进行共培养。

基于上述发现，在本发明的第一个方面，提供了一种细胞共培养装置，其包括至少一个嵌入式共培养单元，其中所述嵌入式共培养单元包括嵌入放置在第一容器中的第二容器，所述第一容器和第二容器分别用于容纳有相同或不同的培养基，所述第二容器通过微孔滤膜与所述第一容器分隔开，并且所述第二容器在所述微孔滤膜的界面外侧还通过透析膜进一步与所述第一容器分隔开。

在本发明的细胞共培养装置中，其可以包括一个或多个嵌入式共培养单元。

在本发明的细胞共培养装置中，所述嵌入式共培养单元优选为有通透性支架的膜滤器；更优选地，所述嵌入式共培养单元为置于培养孔板中的Transwell小室，特别典型的嵌入式共培养单元可以是例如Corning公司的Transwell小室共培养体系。

在本发明的细胞共培养装置中，所述第一容器和第二容器优选是由选自玻璃和塑料(例如聚苯乙烯)的材料制成的容器。

在本发明的细胞共培养装置中，所述微孔滤膜的孔径范围为0.1微米至15微米，优选为0.4微米至12微米，特别优选0.4微米至3微米。

在本发明的细胞共培养装置中，所述透析膜的孔径范围为0.1nm至1.5nm。

在一些优选的实施方案中，所述微孔滤膜的孔径范围为0.1微米至15微米，且所述透析膜的孔径范围为0.1nm至1.5nm。

在一些优选的实施方案中，所述述透析膜为截留分子量500Da或1000Da的透析膜。

在一些优选实施方案中，所述所述第一容器和第二容器中分别有不同的培养基。

在一些优选实施方案中，所述第一容器、第二容器以及将所述第一容器和第二容器分隔开的微孔滤膜共同构成嵌入式Transwell小室。

在本发明的另一方面，提供了本发明所述的细胞共培养装置在共培养不同细胞中的应用。在本发明的应用中，所述“不同细胞”在含义上包括不同细胞的和/或微生物。在一些优选的实施方案中，本发明所述的细胞共培养装置用于共培养两种或两种以上的不同细胞；在一些优选的实施方案中，本发明所述的细胞共培养装置用于共培养两种或两种以上的不同微生物；在一些优选的实施方案中，本发明所述的细胞共培养装置用于共培养两种或两种以上的不同细胞和微生物。

在本发明所述的细胞共培养装置的应用中，所述不同细胞选自种内不同细胞、种间不同细胞、原代细胞和传代细胞，以及其组合。在一些优选的实施方案中，所述共培养的细胞选自真核细胞和原核细胞。

在本发明的又一方面，提供了一种细胞共培养方法，其采用本发明所述的细胞共培养装置，所述方法包括以下步骤：

(1)将两种细胞分别接种在第一容器和第二容器中的培养基中；和

(2)将两种细胞进行共培养。

本发明的细胞共培养方法并不限于对两种细胞进行共培养，当存在多个嵌入式共培养单元的情况下，可以对两种以上的细胞分别接种于各个嵌入式共培养单元的第一容器中和第二容器中的培养基中，并将所述多种细胞进行共培养。应当清楚，在本发明的上下文中，对于本发明的方法、装置和应用而言，所述“不同细胞”在含义上是宽泛的，可包括不同的细胞的和/或微生物。

附图说明

图1是现有技术中的一个Transwell共培养装置的纵切面示意图。

图2是本发明的一个细胞共培养装置的具体实施方案的纵切面示意图。

图3是共培养前后对河豚肝细胞进行定点镜检的图，其中图a和图b分别为采用500Da的膜共培养前的镜检图，图c和图d分别为采用1000Da的膜共培养前的镜检图，图A和图B分别为500Da的膜共培养24h后的镜检图，图C和图D分别为采用1000Da的膜共培养24h后镜检图。

具体实施方案

在本发明的第一个方面，提供了一种细胞共培养装置，其包括至少一个嵌入式共培养单元，所述嵌入式共培养单元包括嵌入放置在第一容器中的第二容器，其中所述第一容器和第二容器分别用于容纳相同或不同的培养基，所述第二容器通过微孔滤膜与所述第一容器分隔开，并且所述第二容器在所述微孔滤膜的界面外侧还通过透析膜进一步与所述第一容器分隔开。

在一些优选的实施方案中，所述嵌入式共培养单元是基于现有技术中的嵌入式Transwell小室，换言之，所述第一容器、第二容器以及将所述第一容器和第二容器分隔开的微孔滤膜共同构成嵌入式Transwell小室。

现有技术中的嵌入式Transwell小室通常可具有多孔板结构(例如6孔板结构、24孔板结构等)，其外形可以为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell可有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。所述小杯子底层有通透性膜(带微孔)，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样的。这层通透性微孔膜的孔径大小一般为0.1至12.0μm。所述微孔膜根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜。应用时，可将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。本发明的嵌入式共培养单元在所述第二容器(即所述Transwell小室)底部的微孔滤膜向外一侧还通过透析膜进一步与所述第一容器(即所述培养板)分隔开。换言之，在所述上室和下室之间多了透析膜以进一步区隔不同培养环境。

在本发明中，微孔滤膜意指是利用高分子化学材料致孔添加剂经特殊处理后制作而成的薄滤膜，其孔径范围通常在0.1微米至15微米之间。

在本发明中，透析膜是指以浓度差为推动力的分离膜，在膜上有孔径均匀的微孔，其孔径范围通常在0.1nm至1.5nm之间。

在一些优选的具体实施方案中，所述透析膜与所述微孔滤膜之间存在适当间隔，所述间隔可以根据实际情况确定，例如装置中各部件的尺寸、制造工艺和设备；在另外一些具体实施方案中，所述透析膜和所述微孔滤膜基本贴附在一起。在一些具体的实审方案中，所述透析膜与所述微孔滤膜之间的间隔距离为0.3cm至5cm。

在本发明的细胞共培养装置中，所述透析膜的材料可以选自纤维素膜和合成高分子聚合膜，所述纤维素膜的材料可以选自再生纤维素和纤维素衍生物(如醋酸纤维素)，所述合成高分子聚合膜的材料选自聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、乙烯基乙烯醇共聚物、聚砜、聚酰胺和聚氨酯。所述微孔滤膜的材料选择混合纤维素酯、尼龙、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜和聚丙烯(PP)。

在本发明的第二个方面，提供了本发明所述的细胞共培养装置在共培养不同细胞中的应用。所述不同细胞可选自种内不同细胞、种间不同细胞、原代细胞和传代细胞，以及其组合。在一些优选的实施方案中，所述共培养的细胞选自真核细胞和原核细胞。

在本发明的又一方面，提供了细胞共培养方法，其采用本发明所述的细胞共培养装置，所述方法包括以下步骤：

(1)将两种细胞分别接种在第一容器和第二容器中的培养基中；和

(2)将两种细胞进行共培养。

如前面所述，所述“细胞”在含义上是宽泛的，可包括不同的细胞的和/或微生物。

在本发明的方法中，在一些实施方案中，所述第一容器和第二容器中的培养基是不同的培养基，所述培养基具有不同的pH值。在另一些实施方案中，所述第一容器和第二容器中的培养基是相同的培养基。

在本发明的装置、应用或方法中，在一些优选实施方案中，当共培养体系内均为细胞或微生物时，微孔膜孔径可分别为选择4微米或0.2微米；当共培养体系为细胞-微生物时，微孔膜优选选择0.2微米以下。

本发明中，透析膜可按照实际培养需要选择不同的截留分子量，或者不同的孔径。通常，透析膜可选择100-1000Da的截留分子量；在一些情况下，若需要维持某种活性药物分子流通，可适当提高透析膜的截留分子量，但原则上优先选用尽量小的截留分子量。

在本发明的装置、应用或方法中，所述第一容器和第二容器中的培养基优选具有pH缓冲体系，所述pH缓冲体系可选用碳酸氢钠缓冲体系或羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲体系。对于采用Transwell小室的情形，在一些优选实施方案中，小室内外分别接种，选用20mmol/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)pH缓冲体系。

在本发明的装置、应用或方法中，细胞可同时接种或先后接种在第一容器和第二容器中。若培养两相不多于1种细胞，则优选将细胞接种于小室外侧，这样便于培养后的观察和测量活性；若第一容器内和第二容器内接种的均为细胞，则优选将贴壁细胞接种于小室外侧。

接种量可以根据实际需要和本领域常识确定，以6孔板为例，细胞接种量一般不超过10⁷个/ml，细菌接种量一般不超过10⁶CFU。

培养温度可以根据实际需要确定，优选采用适于细胞生长的最佳培养温度。

在本发明的方法中，共培养的培养方式优先考虑各细胞培养适合的条件，且各培养基优选不含有对其他培养体系有害的试剂或组分，例如，存在细菌的体系中不含有抗生素。

在本发明的装置、应用或方法中，优选包括蠕动泵，通过蠕动泵在不同容器、嵌入式培养单元之间形成动态培养模式，也可以定时或定量地更换不同容器内的培养基。

在本发明的装置、应用或方法中，用于分隔所述第二容器与所述第一容器的所述透析膜可以是一层膜，也可以是两层或多层膜。在一些实施方案中，所述透析膜为一层膜；在另一些实施方案中，所述透析膜为彼此分开的两层膜或多层膜；在另一些优选实施方案中，所述嵌入式共培养单元有多个，一些共培养单元中有一层透析膜，另一些共培养单元中有两层或多层透析膜。

在本发明的装置、应用或方法中，所述第一容器、第二容器及其间部分之间的界面(由微孔滤膜和透析膜组成的界面)可以是平面形式的，也可以是曲面形式的。与之相适应，本发明的装置可以设计制作成适应平面界面形式或适应曲面界面形式。就曲面界面形式而言，所述微孔滤膜可以为中空纤维型微孔滤膜和管状型微孔滤膜，透析膜也可以与之相适应为中空纤维型或管状型的形式。就平面界面形式而言，其包括前述利用Transwell小室形成界面的技术方案。平面界面形式具有结构和工艺简单等优势，曲面界面形式则具有更大的界面面积和适应产业规模等优势。

本发明的装置或方法可用于不同领域，包括细胞培养，微流控芯片、药物ADME研究以及细胞迁移等领域。

不受理论限制，本发明中透析膜的应用可以截留特定分子量以上的大分子，使界面两侧培养基维持大分子成分的独立性和小分子成分的透过性。本发明的共培养装置或方法通过微孔滤膜与透析膜的组合，实现了在保持不同培养环境相对独立性前提下不同培养体系间成分间的共作用，从而允许种属差异很大甚至是完全不同种属的细胞或微生物在不同的培养基条件下的共培养，这样的效果是出乎意料的，并且将会为细胞培养，微流控芯片、药物ADME研究以及细胞迁移等领域带来全新的思路和有利的解决方案。

实施例：

下面的实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：

河豚肝细胞-细菌共培养装置的构建。

本实施例以河豚肝细胞和产河豚毒素细菌为例,说明基于本发明的细胞共培养装置和体系的构建，并验证本发明的细胞共培养装置、方法的相容性。

现有技术中已知多种能产出河豚毒素(TTX)的细菌，此类细菌广泛存在于含河豚毒素的生物体内，而河豚肝细胞能富集TTX。因此，如果可以利用本发明构建的细菌-河豚肝细胞体系进行对TTX进行富集，则可大大提高TTX的丰度，降低TTX的纯化成本。

为了证明本系统广泛的共培养相容性，以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)为例，与河豚肝细胞建立共培养系统，模拟TTX的生产与富集过程，共培养过后若细胞能保持较高存活率，则系统可行。哈维氏弧菌是现有技术中已知的弧菌，可以通过文献报道和例如菌种编号BNCC 337376得到(http://www.bnbio.com/p_76/p_337376.html)。

1共培养装置与材料

嵌入式共培养单元是基于现有技术中的嵌入式Transwell小室(细胞6孔板(外侧)购自Corning公司，小室(内侧)购自美国VWR,0.1μm微孔滤膜，材料为聚酯薄膜(PET))，透析膜采用500Da截留分子量的再生纤维素透析膜，购自spectrumlab。细胞培养试剂均购自gibco，其余试剂均采购自阿拉丁试剂公司。

2实验方法

2.1实验步骤和条件

6孔板内加入2ml的PBS，小室内侧分别加入2ml的0.5mg/ml的BSA和5μg/ml的TTX标准品，30℃培养箱静止24h，bradford法检测小室外侧的BSA浓度，HPLC-FLD法检测小室外侧的TTX浓度。Bradford法：向96孔板分别加入50μl梯度稀释的BSA标准品溶液和样品，再加入200μl考马斯亮蓝，静置10min后，检测OD595，对照标准曲线计算BSA透过率.HPLC-FLD色谱条件：C18柱(250*4.6mm,5um,Hypersil BDS,Thermo fisher scientific)，流动相为乙酸铵缓冲液：乙腈＝98:2，乙酸铵缓冲液含0.46％乙酸铵，0.202％庚烷磺酸钠，乙酸调节pH至5.0。程序:乙酸铵缓冲液：乙腈＝98:2等度15分钟，柱温30℃。

2.2组建共培养系统

无菌条件下取出河豚肝脏，使用含抗生素的PBS浸泡2min。将肝脏切成1mm³大小的块状，使用含0.25％胰酶和0.02％EDTA混合消化液在37℃温浴消化20min。加入L15完全培养基(20％胎牛血清，20mmol/L HEPES，1X青霉素链霉素双抗)终止消化，200目筛网过滤后200×g离心10分钟。以2×10⁶接种至6孔板内(细胞小室外侧)，加入2mL L15完全培养基过夜待用。

取哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)，使用ORI(Ocean Research Institute)培养基培养。将2ml 10⁵CFU的细菌接种于细胞小室内侧。

表1 ORI培养基组成

2.3培养系统相容性评价

共培养前后对细胞进行定位镜检，观察共培养后细胞形态。共培养24h后，取出细菌小室，将河豚肝脏细胞消化并收集，通过台盼蓝染色方法鉴定细胞存活率，计数在3min内完成。活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100

3结果

3.1共培养系统的透过性

由大分子BSA(分子量66,43KDa)和小分子TTX(相对分子质量319)检测共培养系统的透过性，标准溶液加入至小室内测，外侧加入PBS，24h后检测内外浓度，即可得出膜的截留性质。此实验使用500和1000Da两种截留分子量的再生纤维素透析膜。

由表2表3结果可见，经过24小时的平衡，BSA由于分子量大，几乎都被透析膜截留，只有少量的多肽透过透析膜转移至小室外侧，说明大分子蛋白或细菌/细胞产生的蛋白均能维持在各自的培养体系中，保持培养基的相对独立性；而TTX则均能自由扩散，形成小室内外的等浓度。因此无论使用500或1000Da的透析膜，由任一体系生产的TTX都能透过透析膜扩散到富集体系中，由河豚肝细胞富集低浓度的TTX，大大提高TTX在细胞的丰度，降低富集难度和成本。

表2 BSA的膜透过性

表3 TTX的膜透过性

3.2河豚肝细胞镜检

共培养前后，对肝细胞进行定点镜检，观察肝细胞的变化，结果如图3所示。

左列(图a至d)为共培养前肝细胞形态数量图，加入含10⁵CFU未知细菌的细胞，共培养24h后，得到右列细胞图(图A至D)。总体来说，不论是使用500或1000Da透析膜的实验组，共培养后细胞数量均有一定的损失。但使用500Da透析膜的肝细胞增殖速度较快，图片上能看出分裂出不少的小细胞(图A和B)，相对使用1000Da透析膜的实验组肝细胞分裂则明显较低，小型细胞很少，可见是分子量在500-1000Da区间段有影响细胞生长代谢的细菌产物。因此500Da截留分子量的透析膜是更合适的共培养滤膜。

3.3河豚肝细胞染色测活

河豚肝细胞接种前与共培养后均进行台盼蓝染色，评估细胞存活率，前后对比可知共培养系统对细胞的影响。由表4结果可见，共培养24h后，500Da膜系统的肝细胞仍有71.3％存活率，比1000Da的系统要高，证明透析膜确实可以提高细胞在差别极大的两相培养基中的存活率。

表4肝细胞染色法测活

4总结

上述实施例结果证实了使用包含透析膜的本发明共培养细胞装置和方法一方面能截留大分子，保持各个培养系统培养基的独立性，同时又能使目标小分子化合物自由通过，使细胞在共培养一定时间内能保持活性。

Claims (12)

1.一种细胞共培养装置，其包括至少一个嵌入式共培养单元，其中所述嵌入式共培养单元包括放置在第一容器中的第二容器，其中所述第一容器和第二容器中分别有相同或不同的培养基，所述第二容器的底部通过微孔滤膜与所述第一容器分隔开，并且所述第二容器底部的微孔滤膜向外一侧还通过透析膜进一步与所述第一容器分隔开。

2.根据权利要求1的细胞共培养装置，其中所述微孔滤膜的孔径范围为0.1微米至15微米。

3.根据权利要求1或2的细胞共培养装置，其中所述透析膜的孔径范围为0.1nm至1.5nm。

4.根据权利要求1或2的细胞共培养装置，其中所述透析膜为截留分子量500Da或1000Da的透析膜。

5.根据权利要求1或2的细胞共培养装置，其中所述第一容器和第二容器中分别有不同的培养基。

6.根据权利要求1或2的细胞共培养装置，其中所述第一容器、第二容器以及将所述第一容器和第二容器分隔开的微孔滤膜共同构成嵌入式Transwell小室。

7.根据权利要求1或2的细胞共培养装置，其包括两个或更多个共培养单元。

8.根据权利要求1或2的细胞共培养装置，其中由所述微孔滤膜和所述透析膜组成的界面呈平面形式或中空纤维型或管状型的形式。

9.权利要求1至8中任一项所述的细胞共培养装置在共培养不同细胞中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中所述不同细胞选自种内不同细胞、种间不同细胞、原代细胞或传代细胞。

11.根据权利要求10的应用，其中所述细胞选自真核细胞或原核细胞。

12.一种细胞共培养方法，其采用权利要求1至8中任一项所述细胞共培养装置，所述方法包括以下步骤：

(1)将两种细胞分别接种在第一容器和第二容器中的培养基中；和

(2)将两种细胞进行共培养。

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