CN109503695B

CN109503695B - 熊果酸锂及其合成方法与在预防和治疗阿尔茨海默病中的应用

Info

Publication number: CN109503695B
Application number: CN201811042743.XA
Authority: CN
Inventors: 温金华; 周健; 张伟; 曹力; 洪泸敏; 黎玉华; 潘德城; 孙波
Original assignee: First Affiliated Hospital of Nanchang University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Nanchang University
Priority date: 2018-09-07
Filing date: 2018-09-07
Publication date: 2020-05-22
Anticipated expiration: 2038-09-07
Also published as: CN109503695A

Abstract

本发明涉及一种熊果酸锂及其合成方法与在预防和治疗阿尔茨海默病中的应用，熊果酸锂是采用熊果酸和含锂物质作为反应原料制备而成；含锂物质选自氢氧化锂、正丁基锂和碳酸锂中的一种。本发明提供的熊果酸锂，与氯化锂相比，具有更强的抑制GSK3β活性与降低tau蛋白的磷酸化作用，在40μM时就呈现较好的药理学效应，意味熊果酸锂在极低剂量时就具有较强的抑制磷酸化tau的生成，这对AD疾病的治疗具有较重要的价值。

Description

熊果酸锂及其合成方法与在预防和治疗阿尔茨海默病中的应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种熊果酸锂及其合成方法与在预防和治疗阿尔茨海默病中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病,临床上以近期记忆功能减退为早期表现、并且进行性加重，伴有语言、记忆、认知、推理、定向力和判断等多种功能障碍，进而影响日常生活能力。AD患者脑内主要病理改变为前脑基底、海马及大脑皮质等处以β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)为核心的细胞外老年斑和以异常磷酸化的Tau蛋白为核心的细胞内神经元纤维缠结，主要表现为脑萎缩，同时还伴有神经元和突触的丢失、大脑萎缩等；镜下可见神经炎性斑、神经原纤维缠结、神经元减少、脑淀粉样血管病等主要病理改变。2015年全球约有4680万阿尔茨海默病患者，预计每20年患病人数将翻一倍，到2030年将达到7470万人，2050年更将突破1.3亿人，AD已成为21世纪影响人类健康的重要威胁与挑战。AD的病因和发病机制尚不明确，目前认为与Aβ、Tau蛋白异常修饰(磷酸化tau)、遗传，神经细胞凋亡、氧化应激、环境、免疫和基因等因素有关。其中，减少Aβ沉积与tau的磷酸化是目前主要的治疗手段，也是较多抗AD治疗药物的目标。但目前对AD的治疗尚无较理想的药物。

熊果酸(ursolic acid，UA，又名乌索酸)属五环三萜类的天然化合物，广泛存在于山楂、枇杷叶、吕贞子、乌梅、车前草、白花蛇草等多种植物中。多年来，学者们对熊果酸的药理作用进行了大量的研究工作，其具有广泛的生物活性如抗微生物，抗炎抗变态反应，抗肿瘤，利尿、降压，调血脂，降血糖，抗焦虑、抗抑郁、改善学习记忆等神经保护作用。同时，近年来研究发现熊果酸在治疗阿尔茨海默病中可能具有一定的作用，研究发现其可抑制AChE活性，减少Aβ诱导的氧化损伤如自由基的形成和脂质过氧化，能抑制A与小胶质细胞结合，减少促炎细胞因子和神经毒性作用。

锂已被用于精神病学治疗双相障碍多年，现在仍然被认为是治疗双相情感障碍的急性和长期治疗的一线疗法。同时，越来越多的研究发现锂盐还具有保护细胞凋亡和神经保护作用。此外，锂对神经形成、脑重塑、血管生成、间充质干细胞功能和炎症调节的积极作用。特别引人关注的是越来越多的研究发现锂对阿尔茨海默病(AD)具有较好的治疗作用。研究表明，与安慰剂组相比，慢性低剂量锂治疗的患者在AD评估量表的认知量表上表现更高，并且脑脊液(CSF)中磷酸化tau的浓度降低。但锂的治疗窗口狭窄，易导致肝肾等毒副作用。因此，如何提高锂的治疗效果同时降低毒副作用成为目前学者较为关注的一个课题。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种熊果酸锂及其合成方法与在预防和治疗阿尔茨海默病中的应用，与氯化锂相比，该熊果酸锂盐具有更强的抑制GSK3β活性与降低tau蛋白的磷酸化作用，在40μM时就呈现较好的药理学效应，意味熊果酸锂在极低剂量时就具有较强的抑制磷酸化tau的生成，这对AD疾病的治疗具有较重要的价值。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明提供了一种化合物(熊果酸锂盐)，其特征在于：化合物的结构式如式(Ⅰ)所示：

本发明提供了一种化合物(熊果酸锂盐)的合成方法，其是采用熊果酸和含锂物质作为反应原料。

含锂物质选自氢氧化锂、正丁基锂和碳酸锂中的一种。

优选地，化合物(熊果酸锂盐)合成方法包括步骤：S101：将LiOH·H₂O溶于无水乙醇中，得到氢氧化锂的乙醇溶液；S102：将熊果酸溶于氢氧化锂的乙醇溶液中，室温搅拌至溶液变为澄清，然后减压除去乙醇，得到残留物；S103：在残留物中加入无水乙醚，搅拌，析出白色固体；然后过滤，将收集的固体物质采用无水乙醚洗涤，得到化合物。

S101中，LiOH·H₂O的摩尔数和无水乙醇的体积的比值为0.2mol：100mL；S102中，熊果酸和LiOH·H₂O的摩尔比为1：1；S103中，加入的无水乙醚的体积和LiOH·H₂O的摩尔数的比值为100mL：0.2mol。

优选地，化合物(熊果酸锂盐)的合成方法包括步骤：S201：将熊果酸溶于无水四氢呋喃中，然后降温至-78℃，得到熊果酸的四氢呋喃溶液；S202：将正丁基锂的环己烷溶液滴加到熊果酸的四氢呋喃溶液中，保持-78℃搅拌反应0.5小时，然后升温至0℃，减压除去四氢呋喃，得到残留物；S203：在残留物中加入无水乙醚，搅拌，析出白色固体；然后过滤，将收集的固体物质采用无水乙醚洗涤，得到化合物。

S201中，熊果酸的摩尔数和无水四氢呋喃的体积的比值为0.2mol：80mL；S202中，熊果酸和正丁基锂的摩尔比为1：1；正丁基锂的环己烷溶液中正丁基锂的摩尔浓度为2.5mol/L，无水四氢呋喃和正丁基锂的环己烷溶液中正丁基锂的体积比为1：1；S203中，加入的无水乙醚的体积和熊果酸的摩尔数的比值为100mL：0.2mol。

优选地，化合物(熊果酸锂盐)的合成方法包括步骤：S301：将熊果酸和碳酸锂溶于无水乙醇中，将得到的混合物加热到40℃，搅拌反应，待溶液变为澄清，减压除去乙醇，得到残留物；S302：在残留物中加入无水乙醚，搅拌，析出白色固体；然后过滤，将收集的固体物质采用无水乙醚洗涤，得到化合物。

S301中，熊果酸和碳酸锂的摩尔比为2：1；熊果酸的摩尔数和无水乙醇的体积的比值为0.2mol：150mL；S302中，加入的无水乙醚的体积和熊果酸的摩尔数的比值为100mL：0.2mol。

本发明还保护化合物(熊果酸锂盐)在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物和/或药物添加剂中的应用。

本发明还保护化合物(熊果酸锂盐)在制备预防和治疗精神神经病、皮肤病药物和/或药物添加剂中的应用。

本发明还保护熊果酸部分结构修饰后与锂盐结合形成的部分化合物及它们在治疗和阿尔茨海默病药物和/或药物添加剂中的应用。

本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明提供的熊果酸锂盐，是将熊果酸与锂化合物有效结合而成，与氯化锂相比，具有更强的抑制GSK3β活性与降低tau蛋白的磷酸化作用，在40μM时就呈现较好的药理学效应，意味熊果酸锂在极低剂量时就具有较强的抑制磷酸化tau的生成，这对AD疾病的治疗具有较重要的价值；(2)本发明首次成功合成熊果酸锂盐，并且提供了三种不同的合成路线，收率均超过95％，转化率高，操作简便，可重复性强。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例1中的化合物(熊果酸锂)的¹H-NMR谱图；

图2为本发明实施例1中的化合物(熊果酸锂)的¹³C-NMR谱图；

图3为本发明实施例1中的化合物(熊果酸锂)的质谱图；

图4为本发明实施例5中熊果酸锂(UAL)和氯化锂(LC)在SH-SY 5Ycells中对pGSK3β(Ser⁹)表达的影响结果图；

图5为本发明实施例5中熊果酸锂(UAL)和氯化锂(LC)在SH-SY 5Ycells中对-total GSK3β表达的影响结果图；

图6为本发明实施例5中熊果酸锂(UAL)在HEK293/htau cells中对p-tau表达的影响结果图；

图7为本发明实施例5中熊果酸锂(UAL)在HEK293/htau cells中对total tau表达的影响结果图；

图8为本发明实施例5中氯化锂(LC)在HEK293/htau cells中对p-tau表达的影响结果图；

图9为本发明实施例5中氯化锂(LC)在HEK293/htau cells中对total tau表达的影响结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

实施例1

本实施例提供一种化合物(熊果酸锂)，结构式如通式(Ⅰ)所示：

该化合物(熊果酸锂)的质谱数据为MS m/z(ESI)：455.1(M-Li)^-。

该化合物(熊果酸锂)的核磁共振谱为：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ5.00(1H,s),4.35(1H,s),3.00(1H,J＝3.66.8,dd),2.20(1H,J＝7.6,d),1.99(1H,m),1.79(2H,m),1.69(1H,m),1.00(3H,s),0.89(6H,overlapping),0.86(3H,s),0.79(3H,J＝4.4,d),0.77(3H,s),0.67(3H,s)。

¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)：δ181.10(C-28),139.87(C-13),122.96(C-12),76.87(C-3),54.92(C-5),53.10(C-18),47.28(C-17),47.04(C-9),41.79(C-14),40.06(C-8),39.19(C-4),38.94(C-19),38.40(C-20),38.32(C-1),37.14(C-22),36.61(C-10),33.06(C-7),31.15(C-21),28.32(C-15),28.03(C-23),27.04(C-2),24.64(C-16),23.29(C-11),22.88(C-27),21.55(C-29),18.11(C-6),17.64(C-26),17.47(C-30),16.11(C-24),15.28(C-25)。

该化合物(熊果酸锂)的¹H-NMR谱图如图1所示；¹³C-NMR谱图如图2所示；质谱图如图3所示。

实施例2

本实施例提供一种合成实施例1的化合物(熊果酸锂)的方法，包括步骤：于250mL茄形瓶中，称取LiOH·H₂O(8.64g，0.2mol)溶于100mL无水乙醇，搅拌30分钟，溶解均匀；再称取熊果酸(91.34g，0.2mol)溶于氢氧化锂的乙醇溶液中，室温搅拌2小时至溶液变为澄清，待反应完全后，减压除去乙醇溶剂，残留物加入无水乙醚(100mL)搅拌，析出白色固体，过滤并用无水乙醚(50mL)洗涤，得到产品，即化合物(熊果酸锂)。

合成路线为：

结果：得到的化合物(熊果酸锂)干燥称重为88.0g，收率为95.1％。

对应的质谱数据为MS m/z(ESI)：455.1(M-Li)^-。

实施例3

本实施例提供一种合成实施例1的化合物(熊果酸锂)的方法，包括步骤：于250mL三口瓶中，称取熊果酸(91.34g，0.2mol)溶于80mL无水四氢呋喃，溶解均匀，降温至-78℃；量取正丁基锂-环己烷溶液(80mL，0.2mol，2.5mol/L)滴加到熊果酸的四氢呋喃溶液中，并保持-78℃搅拌反应0.5小时，待反应完全后升温至0℃，减压除去四氢呋喃溶剂，残留物加入无水乙醚(100mL)搅拌，析出白色固体，过滤并用无水乙醚(50mL)洗涤，得到产品，即化合物(熊果酸锂)。

合成路线为：

结果：得到的化合物(熊果酸锂)干燥称重88.5g，收率95.6％。

对应的质谱数据为MS m/z(ESI)：455.1(M-Li)^-。

实施例4

本实施例提供一种合成实施例1的化合物(熊果酸锂)的方法，包括步骤：于250mL茄形瓶中，称取碳酸锂(7.39g，0.1mol)和熊果酸(91.34g，0.2mol)溶于150mL无水乙醇，混合物加热到40℃搅拌12小时，待溶液变为澄清，反应完全后，减压除去乙醇溶剂，残留物加入无水乙醚(100mL)搅拌，析出白色固体，过滤并用无水乙醚(50mL)洗涤，得到产品，即化合物(熊果酸锂)。

合成路线为：

结果：得到的化合物(熊果酸锂)干燥称重87.9g，收率95.0％。

对应的质谱数据为MS m/z(ESI)：455.1(M-Li)^-。

实施例5

利用实施例1的化合物(熊果酸锂)，探索其对pGSK3β(Ser⁹)及p-tau(Thr²³¹)表达的影响。

实验材料与方法：

1、细胞培养

SH-SY5Y细胞用含10％DMEM/F-12的培养基培养。HEK293/tau细胞用10％DMEM的培养基培养。

2、抗体

一抗：抗phosphor-GSK3β(Ser9，Thermo Fisher Scientific)，抗total GSK3β(Thermo Fisher Scientific，美国)，抗phosphor-tau(Thr231，EMD Millipore，Billerica，MA，美国)，和抗total tau(tau12，sigma，美国)；二抗体分别为抗兔Ig G和抗小鼠Ig G。

3、储备液配置

将252mg氯化锂(99.99％，Sigma-Aldrich，USA)溶解于12mL甲醇(浓度为500mm)中作为氯化锂工作储备溶液；将300mg熊果酸锂溶解于5mL甲醇(浓度为130mm)中作为熊果酸锂工作储备溶液。

4、Western blot分析

SH-SY5Y细胞在24孔板中培养(2.5×10⁵/孔)，细胞贴壁后，用熊果酸锂和氯化锂(浓度分别为0、20、40、60和120μm、0、20、40、60、120、240、480μm)分别孵育18h，然后用PBS洗涤细胞3次，用细胞裂解缓冲液溶解15min。收集细胞裂解缓冲液，高速冷冻离心(1.4×10⁴rpm)20分钟，用Western blot检测上清液中GSK3β和phosphor-GSK3β(Ser9)的表达。HEK293细胞在24孔板中培养，密度为3.5×10⁵/孔，用四环素(1：1000)处理24h后，用熊果酸锂和氯化锂(浓度均为0、20、40、60、120、240、480μm)分别孵育18h，用PBS洗涤3次，用细胞裂解缓冲液溶解15min。收集细胞裂解缓冲液，高速冷冻离心(1.4×10⁴rpm)20分钟，Westernblot法对上清液phosphor-tau(Thr231)和总Tau蛋白表达进行分析。

实验结果：

结果显示，与氯化锂比较，熊果酸锂具有更强的抑制GSK3β活性(图4和图5)与降低tau蛋白的磷酸化作用(图6、图7、图8和图9)，在40μM时就呈现较好的药理学效应，意味熊果酸锂在极低剂量时就具有较强的抑制磷酸化tau的生成，这对AD疾病的治疗具有较重要的价值。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims

1.一种化合物，其特征在于：所述化合物的结构式如式(Ⅰ)所示，

所述式(Ⅰ)为：

2.一种权利要求1所述的化合物的合成方法，其特征在于：

所述方法是采用熊果酸和含锂化合物作为反应原料；所述含锂化合物选自氢氧化锂、正丁基锂和碳酸锂中的一种。

3.根据权利要求2所述的化合物的合成方法，其特征在于，包括步骤：

S101：将LiOH·H₂O溶于无水乙醇中，得到氢氧化锂的乙醇溶液；

S102：将熊果酸溶于所述氢氧化锂的乙醇溶液中，室温搅拌至溶液变为澄清，然后减压除去乙醇，得到残留物；

S103：在所述残留物中加入无水乙醚，搅拌，析出白色固体；然后过滤，将收集的固体物质采用无水乙醚洗涤，得到所述化合物。

4.根据权利要求3所述的化合物的合成方法，其特征在于：

S101中，所述LiOH·H₂O的摩尔数和所述无水乙醇的体积的比值为0.2mol：100mL；

S102中，所述熊果酸和所述LiOH·H₂O的摩尔比为1：1；

S103中，所述加入的无水乙醚的体积和所述LiOH·H₂O的摩尔数的比值为100mL：0.2mol。

5.根据权利要求2所述的化合物的合成方法，其特征在于，包括步骤：

S201：将熊果酸溶于无水四氢呋喃中，然后降温至-78℃，得到熊果酸的四氢呋喃溶液；

S202：将正丁基锂的环己烷溶液滴加到所述熊果酸的四氢呋喃溶液中，保持-78℃搅拌反应0.5小时，然后升温至0℃，减压除去四氢呋喃，得到残留物；

S203：在所述残留物中加入无水乙醚，搅拌，析出白色固体；然后过滤，将收集的固体物质采用无水乙醚洗涤，得到所述化合物。

6.根据权利要求5所述的化合物的合成方法，其特征在于：

S201中，所述熊果酸的摩尔质量为0.2mol；所述无水四氢呋喃的体积为80mL；

S202中，所述正丁基锂的环己烷溶液中正丁基锂的摩尔浓度为2.5mol/L，所述无水四氢呋喃和所述正丁基锂的环己烷溶液的体积比为1：1，所述正丁基锂的环己烷溶液的摩尔质量为0.2mol；

S203中，所述加入的无水乙醚的体积为100mL。

7.根据权利要求2所述的化合物的合成方法，其特征在于，包括步骤：

S301：将熊果酸和碳酸锂溶于无水乙醇中，将得到的混合物加热到40℃，搅拌反应，待溶液变为澄清，减压除去乙醇，得到残留物；

S302：在所述残留物中加入无水乙醚，搅拌，析出白色固体；然后过滤，将收集的固体物质采用无水乙醚洗涤，得到所述化合物。

8.根据权利要求7所述的化合物的合成方法，其特征在于：

S301中，所述熊果酸和所述碳酸锂的摩尔比为2：1；所述熊果酸的摩尔数和所述无水乙醇的体积的比值为0.2mol：150mL；

S302中，所述加入的无水乙醚的体积和所述熊果酸的摩尔数的比值为100mL：0.2mol。

9.权利要求1所述的化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物和/或药物添加剂中的应用。