CN109498842A - 一种具备可诱导性的人工骨及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具备可诱导性的人工骨,包含羟基磷灰石、蚕丝提取物、胶原。本发明所述的人工骨拉伸断裂生长率为4.795%‑11.436%,拉伸断裂应力为2.313‑15.921MPa,弯曲模量为109.37‑526.63MPa、压缩模量为413.19‑893.93MPa。该材料是在宏观形态与微观结构方面都与人体自体骨高度相近的材料,可作为骨修复材料。同时,本发明还提供一种所述具备可诱导性的人工骨的制备方法。所述制备方法中蚕丝提取物中的丝素蛋白,可以为成骨细胞的生长提供附着位点,有利于成骨细胞的生长,起到了诱导骨生长的作用,同时经过处理过的丝素蛋白的降解性等得到提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料领域,尤其是一种具备可诱导性的人工骨及其制备方法。
背景技术
人工骨材料中使用较多的为羟基磷灰石。尽管羟基磷灰石具有良好的生物相容性和生物活性,是一种优良的硬组织替代材料,而且由于羟基磷灰石的晶粒具有表面效应和体积效应,在植入人体后能通过氢键与人体组织键合达到完美亲和,无免疫排异现象并且具有一定的骨传导性能,在力学和生物学方面具有很大的优越性和应用潜力,是一种理想的组织植入材料。但是,羟基磷灰石的脆性大且韧性低,不能用于负重部位骨缺损的修复,并且在体内难降解,限制了它在骨修复中的应用。
丝素是一种坚韧而有弹性的蛋白质。占蚕丝纤维总量的70-80%,其组成氨基酸,以甘氨酸、丙氨酸为最多,此二氨基酸的氮,约占总氮的80%。丝素蛋白本身具有良好的机械性能和理化性质,如良好的柔韧性和抗拉伸强度、透气透湿性生物相容性、缓释性等。研究表明其在人体内可降解并被吸收的高分子蛋白,有促进新骨生成的作用,对人体安全、亲和,无致敏反应。随着对其独特氨基酸组成及结晶结构等理化特性研究的深入,国内外对丝素的应用正从传统的纺织领域积极向多领域探索,丝素蛋白在生物医学材料领域的应用也日趋广泛和深入。除此之外,由于丝素蛋白经天然蚕丝提取得到,而蚕丝又是一种可再生资源,因此将丝素作为人工骨材料的添加成分,还能够降低其制造成本,满足医疗界和患者对人工骨的需求。
现有技术中对蚕丝中丝素蛋白取多用酶解脱胶法、尿素脱胶法、Na2CO3脱胶法等。但如果作为人工骨植入材料而言,其中的杂质的处理问题,对生物相容性产生了影响。而且,有研究表明:植入活体的丝素纤维,两个月内,其力学强度仍高于植入前力学强度的50%。植入体内的丝素纤维在一年里仍保持一定张力,而完全分解大约需要两年。这与新骨形成的速度相差较大,对骨诱导生长会产生一定影响。因此,目前人工骨的降解和力学性能、骨诱导能力、生物相容性等较差。
发明内容
基于此,本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具备可诱导性的人工骨。所述人工骨能有效解决丝素在人体内弱降解性,使其与骨生长速率保持一致;由此提高人工骨的降解和力学性能以及拥有良好的骨诱导和生物相容性等特性。
为实现上述目的,本发明所采取的技术方案为:一种具备可诱导性的人工骨,包含羟基磷灰石、蚕丝提取物、胶原。
优选地,所述的具备可诱导性的人工骨,包含以下重量份的成分:羟基磷灰石55-80份、蚕丝提取物15-45份、胶原5-15份、交联剂0-10份。
更优选地,所述的具备可诱导性的人工骨,包含以下重量份的成分:羟基磷灰石55-70份、蚕丝提取物15-30份、胶原5-10份、交联剂1-8份。
优选地,所述交联剂为PEG-4000或PEG-6000。
优选地,所述人工骨上具有相互连通的微孔。
更优选地,所述人工骨的孔径为120-450微米、孔隙率为50-80%。孔径和孔隙率的限制都保持与人自体骨相似。
为了解决现有人工骨中诱导新骨生长能力差或者诱导新骨生成过程中产生的副作用,人工骨力学性能不足,同时,本发明还提供一种所述的具备可诱导性的人工骨的制备方法,包括以下步骤:
(1)将蚕丝提取物、胶原与交联剂混合后搅拌,使其发生交联反应,得到混合液;其中,所述交联反应的温度为40℃-50℃,所述交联反应的时间为18h-36h;
(2)将羟基磷灰石粉末加入到步骤(1)得到的混合液中,搅拌至糊状,将糊状物通过挤压设备挤压进模具中进行成型,然后经过低温冷冻干燥、密封分装、辐照灭菌,即得所述具备可诱导性的人工骨。
优选地,所述步骤(1)中的蚕丝提取物通过以下方法制备所得:
(1a)将经过清洗及裁料的天然蚕丝放入纯水中煮沸30-60min,滤出溶液,得到预处理后的蚕丝;
(1b)使用柠檬酸溶液处理步骤(1a)得到的蚕丝,其中,处理温度为80-100℃;
(1c)将经步骤(1b)处理后的蚕丝进行水洗、干燥,得到所述蚕丝提取物。
本发明所述蚕丝提取物的制备方法,能有效减少丝素提取工艺中额外增加的杂质难清理及制备过程中成本问题,由此提高人工骨的降解和力学性能以及拥有良好的骨诱导和生物相容性等特性。
优选地,所述步骤(1b)中,所述柠檬酸溶液中,柠檬酸的浓度为10-20g/L;所述蚕丝与所述柠檬酸溶液的浴比为:1:(50-80)。
更优选地,所述步骤(1b)中,所述柠檬酸溶液中,柠檬酸的浓度为15g/L;所述蚕丝与所述柠檬酸溶液的浴比为:1:65。
优选地,所述步骤(1b)中,所述处理温度为70℃-100℃。
更优选地,所述处理温度为95℃。此温度下的提取效果最佳。
优选地,所述交联反应的温度为40℃,所述交联反应的时间为24h。
相对于现有技术,本发明的有益效果为:
本发明所述的人工骨拉伸断裂生长率为4.795%-11.436%,拉伸断裂应力为2.313-15.921MPa,弯曲模量为109.37-526.63MPa,压缩模量为413.19-893.93MPa。该材料是在宏观形态与微观结构方面都与人体自体骨高度相近的材料,可作为骨修复材料。
本发明人工骨材料中所添加的蚕丝提取物中的丝素蛋白,可以为成骨细胞的生长提供附着位点,有利于成骨细胞的生长,起到了诱导骨生长的作用,同时经过处理过的丝素蛋白的降解性等得到提高,可通过增加柠檬酸的处理时间对其降解效果加以控制。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明所述具备可诱导性的人工骨的一种实施例,本实施例人工骨主要用于非承重部分的骨缺损修复,本实施例所述具备可诱导性的人工骨包含以下重量份的成分:
羟基磷灰石70份、蚕丝提取物15份、胶原15份、交联剂1份;所述人工骨上具有相互连通的微孔,所述人工骨的孔径为120-450微米、孔隙率为50-80%。
本实施例所述人工骨通过以下方法制备所得:
S1:蚕丝提取物的制备:
a、天然蚕丝的预处理:蚕丝的清洗及裁料;
b、蚕丝的脱胶处理:将经过预处理的天然蚕丝放入纯水中煮沸30-60min,滤出溶液;
c、使用柠檬酸溶液处理经过步骤b得到的蚕丝,处理温度为95℃;所述的柠檬酸浓度为15g/L;所述蚕丝与所述柠檬酸溶液的浴比为:1:65;
d、将步骤c得到的蚕丝进行水洗、干燥,制得蚕丝提取物;
S2:人工骨材料的制备:
a、配置PEG溶液;
b、按上述人工骨材料配比,称取蚕丝提取物、胶原与配好的PEG溶液混合后搅拌,使其发生交联反应;交联反应的温度为40℃,交联反应的时间为24h;
c、将羟基磷灰石粉末加入到上述制备好的混合液中,用高速搅拌设备搅拌至糊状。将糊状物通过挤压设备挤压进模具中。成型的混合物,经过低温冷冻干燥处理后,无菌条件下密封分装,辐照灭菌后即得人工骨材料。
实施例2
本发明所述具备可诱导性的人工骨的一种实施例,本实施例人工骨主要用于非承重部分的骨移植以及骨缺损修复,本实施例所述具备可诱导性的人工骨包含以下重量份的成分:
羟基磷灰石65份、蚕丝提取物25份、胶原9份、交联剂1份;所述人工骨上具有相互连通的微孔,所述人工骨的孔径为120-450微米、孔隙率为50-80%。
本实施例所述人工骨通过以下方法制备所得:
S1:蚕丝提取物的制备:
a、天然蚕丝的预处理:蚕丝的清洗及裁料;
b、蚕丝的脱胶处理:将经过预处理的天然蚕丝放入纯水中煮沸30-60min,滤出溶液;
c、使用柠檬酸溶液处理经过步骤b得到的蚕丝,处理温度为80℃;所述的柠檬酸浓度为20g/L;所述蚕丝与所述柠檬酸溶液的浴比为:1:65;
d、将步骤c得到的蚕丝进行水洗、干燥,制得蚕丝提取物;
S2:人工骨材料的制备:
a、配置PEG溶液;
b、按上述人工骨材料配比,称取蚕丝提取物、胶原与配好的PEG溶液混合后搅拌,使其发生交联反应;交联反应的温度为40℃,交联反应的时间为36h;
c、将羟基磷灰石粉末加入到上述制备好的混合液中,用高速搅拌设备搅拌至糊状。将糊状物通过挤压设备挤压进模具中。成型的混合物,经过低温冷冻干燥处理后,无菌条件下密封分装,辐照灭菌后即得人工骨材料。
实施例3
本发明所述具备可诱导性的人工骨的一种实施例,本实施例人工骨主要用于承重部分的骨修复及骨移植替代,本实施例所述具备可诱导性的人工骨包含以下重量份的成分:
羟基磷灰石55份、蚕丝提取物30份、胶原10份、交联剂5份;所述人工骨上具有相互连通的微孔,所述人工骨的孔径为120-450微米、孔隙率为50-80%。
本实施例所述人工骨通过以下方法制备所得:
S1:蚕丝提取物的制备:
a、天然蚕丝的预处理:蚕丝的清洗及裁料;
b、蚕丝的脱胶处理:将经过预处理的天然蚕丝放入纯水中煮沸30-60min,滤出溶液;
c、使用柠檬酸溶液处理经过步骤b得到的蚕丝,处理温度为95℃;所述的柠檬酸浓度为10g/L;所述蚕丝与所述柠檬酸溶液的浴比为:1:65;
d、将步骤c得到的蚕丝进行水洗、干燥,制得蚕丝提取物;
S2:人工骨材料的制备:
a、配置PEG溶液;
b、按上述人工骨材料配比,称取蚕丝提取物、胶原与配好的PEG溶液混合后搅拌,使其发生交联反应;交联反应的温度为50℃,交联反应的时间为18h;
c、将羟基磷灰石粉末加入到上述制备好的混合液中,用高速搅拌设备搅拌至糊状。将糊状物通过挤压设备挤压进模具中。成型的混合物,经过低温冷冻干燥处理后,无菌条件下密封分装,辐照灭菌后即得人工骨材料。
实施例4
本发明所述具备可诱导性的人工骨的一种实施例,本实施例人工骨主要用于承重部分的骨修复及骨移植替代,本实施例所述具备可诱导性的人工骨包含以下重量份的成分:
羟基磷灰石80份、蚕丝提取物45份、胶原5份、交联剂8份;所述人工骨上具有相互连通的微孔,所述人工骨的孔径为120-450微米、孔隙率为50-80%。
本实施例所述人工骨的制备方法同实施例1。
实施例5
本发明所述具备可诱导性的人工骨的一种实施例,本实施例人工骨主要用于承重部分的骨修复及骨移植替代,本实施例所述具备可诱导性的人工骨包含以下重量份的成分:
羟基磷灰石75份、蚕丝提取物30份、胶原7份、交联剂10份;所述人工骨上具有相互连通的微孔,所述人工骨的孔径为120-450微米、孔隙率为50-80%。
本实施例所述人工骨的制备方法同实施例1。
对实施例1~5所述具备可诱导性的人工骨分别进行以下性能检测。
1、生物相容性
取1克丝素贝壳人工骨试件,粉碎后置于100ml生理盐水中,在37±1℃下浸提24h,常温下8000rpm离心5min,取上清液作为供试液,并配置生理盐水作阴性对照。随机抽取10只小白鼠,雌雄各半。其中2只为对照。分别用0.5ml供试液对各小白鼠进行腹腔注射,观察15min内小白鼠有无爪搔鼻、喷嚏、竖毛、干呕或咳嗽三声以上、抽搐、呼吸困难、大小便失禁、休克和死亡等反应,并记录结果;第3天,进行第二次腹腔注射;第5天,进行第三次腹腔注射;第14天,进行第一次尾静脉攻击,观察15min内小白鼠的反应,并记录结果;第15天、第16天、第17天陆续完成静脉注射;第19天,进行第二次尾静脉攻击。以上测试中小白鼠均未出现明显的上述过敏现象,因此可认为受试品不会引起过敏反应。
2、孔隙率
以水作为液相介质,通过比重天平,根据阿基米德排水法测定样品的孔隙率,测得孔隙率均为50-80%。
3、力学性能
通过万能材料试验机测试多孔生物陶瓷支架试样的抗压强度,加载速率1mm/min,测得人工骨拉伸断裂生长率均为4.795%-11.436%,拉伸断裂应力均为2.313-15.921MPa,弯曲模量均为109.37-526.63MPa、压缩模量均为413.19-893.93MPa。
4、体外降解性
将上述5组实施例材料制作的大小统一、重量记为m1的试件(Φ10mm×13mm)分别置于初始pH为7的模拟体液SBF溶液中,于37℃的恒温摇床内,低速摇动,每组材料制作10个平行样。分别于2、4、6、8、10、12、14、16周的同一时间,每组取出一份材料,放于烘箱内40℃干燥、称重,记为m2。溶胀过程中样品的质量损失率为:
D=(m1-m2)/m1×100%
式中:m1为降解前的质量;m2为降解后的质量。
不同材料在模拟体液中失重率(降解率)的变化见表1。
表1不同材料在模拟体液中降解率的变化
组别 | 第2周 | 第4周 | 第8周 | 第12周 | 第16周 |
实施例1 | 8.51±0.26 | 15.59±0.66 | 24.15±0.32 | 26.77±0.25 | 27.29±0.17 |
实施例2 | 6.97±0.18 | 12.28±0.13 | 21.84±0.18 | 24.76±0.71 | 25.17±0.46 |
实施例3 | 5.37±0.03 | 10.68±0.45 | 18.35±0.13 | 21.12±0.31 | 22.87±0.08 |
实施例4 | 4.91±0.13 | 8.05±0.92 | 15.35±0.72 | 18.63±0.88 | 20.58±0.91 |
实施例5 | 5.68±0.16 | 13.78±0.88 | 19.34±0.52 | 20.25±0.76 | 21.17±0.22 |
由上表可以看出,随降解时间增加,所有材料的质量不断降低,但降解速度逐渐减慢。其中,对实施例1的降解速率明显高于其他实施例,原因可能是由于此人工骨中所含蚕丝提取物较少,而且交联剂也比较少;实施例4的降解速率最慢,是由于其中所含蚕丝提取物占比更多,同时交联剂的用量也比较多。综上,本发明提供的人工骨降解速率适宜,能够适应新生骨功能的恢复过程。
5、成骨诱导活性
所有实施例样品经BMSCs细胞诱导培养后(完全培养基为对照),活细胞密度呈倍生长,14天培养后无死细胞出现,贴附率接近100%,ALP值为341.92-457.7(pNPP mM/min)/(μgDNA),活性显著高于完全培养基培养皿中的活性62.3(pNPP mM/min)/(μgDNA),且有钙结节产生。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种具备可诱导性的人工骨,其特征在于,包含羟基磷灰石、蚕丝提取物、胶原。
2.如权利要求1所述的具备可诱导性的人工骨,其特征在于,包含以下重量份的成分:羟基磷灰石55-80份、蚕丝提取物15-45份、胶原5-15份、交联剂0-10份。
3.如权利要求2所述的具备可诱导性的人工骨,其特征在于,包含以下重量份的成分:羟基磷灰石55-70份、蚕丝提取物15-30份、胶原5-10份、交联剂1-8份。
4.如权利要求2所述的具备可诱导性的人工骨,其特征在于,所述交联剂为PEG-4000或PEG-6000。
5.如权利要求1~4任一项所述的具备可诱导性的人工骨,其特征在于,所述人工骨上具有相互连通的微孔。
6.如权利要求5所述的具备可诱导性的人工骨,其特征在于,所述人工骨的孔径为120-450微米、孔隙率为50-80%。
7.一种如权利要求1~6任一项所述的具备可诱导性的人工骨的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将蚕丝提取物、胶原与交联剂混合后搅拌,使其发生交联反应,得到混合液;其中,所述交联反应的温度为40℃-50℃,所述交联反应的时间为18h-36h;
(2)将羟基磷灰石粉末加入到步骤(1)得到的混合液中,搅拌至糊状,将糊状物通过挤压设备挤压进模具中进行成型,然后经过低温冷冻干燥、密封分装、辐照灭菌,即得所述具备可诱导性的人工骨。
8.如权利要求7所述的具备可诱导性的人工骨的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中的蚕丝提取物通过以下方法制备所得:
(1a)将经过清洗及裁料的天然蚕丝放入纯水中煮沸30-60min,滤出溶液,干燥,得到预处理后的蚕丝;
(1b)将步骤(1a)得到的蚕丝加入到柠檬酸溶液中处理,其中,处理温度为80-100℃;
(1c)将经步骤(1b)处理后的蚕丝进行水洗、干燥,得到所述蚕丝提取物。
9.如权利要求8所述的具备可诱导性的人工骨的制备方法,其特征在于,所述步骤(1b)中,所述柠檬酸溶液中,柠檬酸的浓度为10-20g/L;所述蚕丝与所述柠檬酸溶液的浴比为:1:(50-80)。
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- 2018-12-04 CN CN201811471948.XA patent/CN109498842B/zh active Active
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CN109498842B (zh) | 2020-12-08 |
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