CN109486944A

CN109486944A - 基因突变作为诊断mpls标志物的应用

Info

Publication number: CN109486944A
Application number: CN201811608612.3A
Authority: CN
Inventors: 吴南; 吴志宏; 林茂; 赵森
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-03-19

Abstract

本发明公开了一种诊断MPLS的基因缺失突变，所述突变是FBN1基因上c.8275_8291delGAGAAGACAGCCATCTT。本发明首先通过二代测序筛选出MPLS患者中存在c.8275_8291delGAGAAGACAGCCATCTT，而后利用体外细胞系证明该突变抑制FBN1基因表达产物正常发挥作用，因此可以断定该突变是MPLS的致病突变。根据本发明的研究成果，可以制备诊断MPLS的产品以及治疗MPLS的候选药物以应用于临床。

Description

基因突变作为诊断MPLS标志物的应用

技术领域

本发明属于医学诊断领域，涉及一种基因突变作为诊断MPLS标志物的应用。

背景技术

马凡综合征早衰脂肪代谢障碍综合征(Marfanoid-progeroid-lipodystrophysyndrome，MPLS)是一种最近阐明的原纤维病，也是一种以加速衰老、出生后脂肪代谢障碍、产后体重增加、在临床上很少报道的特征性畸形面部特征为主要特征的复杂疾病。最近的研究表明由FBN1基因座编码的命名为aprosin的潜在激素作为脂肪代谢障碍表型的调节分子。

Fibrillin-1(FBN1)基因编码大的糖蛋白，这些糖蛋白构成一大群细胞外蛋白，形成高度组织、扩展和普遍分布的聚集体(微纤维)的核心。与弹性纤维相关的自发和遗传结缔组织疾病光谱强调了原纤蛋白微纤维的重要意义。原纤维蛋白-1的主要构建组件包含47个表皮生长因子样(EGF)结构域，每个结构域由6个高度保守的半胱氨酸残基和7个转化生长因子-β结合蛋白样(TGFBP)结构域组成，其特征在于具有8个半胱氨酸残基。在这些EGF结构域中，43个是钙结合型(cb EGF)。此外，对微纤维组装有显著作用的原纤维蛋白-1和配体的相互作用是由cbEGF结构域介导的，而TGFBP结构域参与了各个原纤维蛋白-1分子间链间二硫键的形成。富含纤维蛋白的微纤维与基底膜和弹性纤维相互作用，为细胞外基质提供稳定性。

参考序列NM_000138.4的FBN1转录物中的总外显子计数为66，并且第一个外显子被转录成mRNA的非翻译部分。所有MPLS个体在第64个外显子中始终存在杂合截短突变(基于参考序列NM_000138.4，该突变位于第65个外显子，如果计数从FBN1的第一个密码子开始，则是第64个外显子)，这导致FBN1的C末端结构域出现过早终止密码子。本申请公开了中国人群中的第一例MPLS。通过功能测定确定了截短FBN1突变的潜在影响，其传递不同的显性失活等位基因和常染色体显性遗传(AD)疾病性状。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种诊断MPLS的基因突变。

本发明的目的之二在于提供前面所述的基因突变的用途。

为了实现上述发明目的，本发明采取了如下技术方案：

本发明提供了一种用于诊断MPLS的基因突变，所述基因突变是FBN1基因上的突变。

进一步，所述突变是c.8275_8291delGAGAAGACAGCCATCTT。即可以通过检测FBN1基因c.8275_8291区段是否存在缺失突变来诊断MPLS。

根据本发明的又一个方面，本发明还提供了前面所述的基因突变的检测试剂。

所述试剂包括可以应用于本发明的检测前面所述的基因突变的方法中使用的试剂。

可以通过本领域技术人员已知的某些方法来检测基因突变或变异，此类方法包括但不限于，DNA测序；引物延伸测定法，包括细胞突变特异性核苷酸掺入测定法和细胞突变特异性引物延伸测定法(例如细胞突变特异性PCR、细胞突变特异性连接链式反应(LCR)、和缺口-LCR)；突变特异性寡核苷酸杂交测定法(例如寡核苷酸连接测定法)；切割保护测定法，其中使用免受切割剂作用的保护来检测核酸双链体中的错配碱基；对MutS蛋白结合的分析；比较变异型和野生型核酸分子迁移率的电泳分析；变性梯度凝胶电泳(DGGE，如在例如Myers等(1985)Nature 313：495中的)；对RNA酶在错配碱基对处切割的分析；分析对异源双链DNA的化学或酶促切割；质谱术(例如MALDI-TOF)；遗传比特分析(geneticbitanalysis，GBA)；5’核酸酶测定法(例如TaqMan ^TM)；和采用分子信标的测定法。这些方法中的某些在下文有更详细的讨论。

可以使用本领域中公知技术通过靶核酸的分子克隆和测序来实现靶核酸中突变或变异的检测。或者，可以使用扩增技术诸如聚合酶链式反应(PCR)来直接自来自基因组DNA制备物扩增靶核酸序列。然后可以测定扩增序列的核酸序列，并自此鉴定变异。扩增技术是本领域中公知的，例如聚合酶链式反应记载于Saiki等，Science 239：487，1988；美国专利号4,683,203和4,683,195。

还可以使用连接酶链式反应(其是本领域中已知的)来扩增靶核酸序列。参见例如Wu等，Genomics 4：560-569(1989)。另外，还可以修饰并使用称为等位基因特异性PCR的技术来检测体细胞突变(例如替代)。参见例如Ruano和Kidd(1989)Nucleic AcidsResearch17：8392；McClay等(2002)Analytical Biochem.301：200-206。在此技术的某些实施方案中，使用突变特异性引物，其中所述引物的3’端核苷酸与靶核酸中的特定变异互补(即能够与靶核酸中的特定变异发生特异性碱基配对)。若不存在所述特定变异，则观察不到扩增产物。还可以使用扩增受阻突变系统(Amplification Refractory MutationSystem，ARMS)来检测变异(例如替代)。ARMS记载于例如欧洲专利申请公开文本No.0332435，及Newton等，Nucleic Acids Research，17：7，1989。

对于检测突变或变异(例如替代)有用的其它方法包括但不限于(1)突变特异性核苷酸掺入测定法，诸如单碱基延伸测定法(参见例如Chen等(2000)Genome Res.10：549-557；Fan等(2000)Genome Res.10：853-860；Pastinen等(1997)Genome Res.7：606-614；及Ye等(2001)Hum.Mut.17：305-316)；(2)突变特异性引物延伸测定法(参见例如Ye等(2001)Hum.Mut.17：305-316；和及Shen等Genetic Engineering News，卷23，2003年3月15日)，包括体细胞突变特异性PCR；(3)5’核酸酶测定法(参见例如De La Vega等(2002)BioTechniques 32：S48-S54(记载了TaqMan ^TM测定法)；Ranade等(2001)Genome Res.11：1262-1268；和Shi(2001)Clin.Chem.47：164-172)；(4)采用分子信标的测定法(参见例如Tyagi等(1998)NatureBiotech.16：49-53；和Mhlanga等(2001)Methods 25：463-71)；和(5)寡核苷酸连接测定法(参见例如Grossman等(1994)Nuc.Acids Res.22：4527-4534；专利申请公开文本No.US2003/0119004A1；PCT国际公开文本No.WO 01/92579A2；和美国专利号6,027,889)。

还可以通过错配检测方法来检测突变或变异。错配指不是100％互补的杂交的核酸双链体。缺乏完全互补性可能是由于删除、插入、倒位、或替代。错配检测方法的一个例子是错配修复检测(Mismatch Repair Detection，MRD)测定法，其记载于例如Faham等，Proc.NatlAcad.Sci.USA 102：14717-14722(2005)和Faham等，Hum.Mol.Genet.10：1657-1664(2001)。错配切割技术的另一个例子是RNA酶保护方法，其详细记载于Winter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：7575，1985，和Myers等，Science 230：1242，1985。例如，本发明的方法可以牵涉与人野生型靶核酸互补的经标记核糖核酸探针的使用。将核糖核酸探针与自组织样品衍生的靶核酸一起退火(杂交)，随后用能够检测双链RNA结构中的一些错配的酶RNA酶A消化。若RNA酶A检测出错配，则其在错配位点处切割。如此，在电泳凝胶基质上将退火的RNA制备物分开时，若RNA酶A已经检测出并切割错配，则会看到比核糖核酸探针和mRNA或DNA的全长双链RNA小的RNA产物。核糖核酸探针不必是靶核酸的全长，而可以是靶核酸的一部分，前提是其涵盖怀疑具有变异的位置。

以类似的方式，可以使用DNA探针来检测错配，例如经由酶促或化学切割来实现。参见例如Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：4397，1988；和Shenk等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72：989，1975。或者，可以通过错配双链体相对于匹配双链体的电泳迁移率的变动来检测错配。参见例如Cariello，HumanGenetics，42：726，1988。用核糖核酸探针或DNA探针，可以在杂交前扩增怀疑包含变异的靶核酸。还可以使用Southern杂交来检测靶核酸中的变化，尤其若所述变化是总的重排，诸如删除和插入。

可以使用针对靶核酸或周围标志基因的限制性片段长度多态性(RFLP)探针来检测变异，例如插入或删除。还可以通过对靶核酸的克隆、测序和扩增来检测插入和删除。还可以使用单链构象多态性(Single stranded conformation polymorphism，SSCP)分析来检测细胞突变的碱基变化变体。参见例如Orita等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2766-2770，1989，和Genomics，5：874-879，1989。可以修改SSCP来检测细胞突变。SSCP通过单链PCR产物的电泳迁移率的改变来鉴定碱基差异。可以通过加热或以其它方式使双链PCR产物变性来生成单链PCR产物。单链核酸可重折叠或形成部分依赖于碱基序列的次级结构。单链扩增产物的不同电泳迁移率与SNP位置处的碱基序列差异有关。变性梯度凝胶电泳(DGGE)根据多态性DNA内在的不同序列依赖性稳定性和解链特性及变性梯度凝胶中电泳迁移样式的相应差异来区分SNP等位基因。

还可以使用微阵列来检测基因突变或变异。微阵列指一种多路技术，其通常使用排列好的一系列数以千计的在高严格性条件下与例如cDNA或cRNA样品杂交的核酸探针。通常通过检测荧光团，银，或化学发光标记的靶物来检测和定量探针-靶物杂交以测定靶物中核酸序列的相对丰度。在典型的微阵列中，探针通过与化学基质的共价键附着至固体表面(经由环氧硅烷，氨基硅烷，赖氨酸，聚丙烯酰胺等等)。固体表面指例如玻璃，硅片，或显微珠。多种微阵列是商品化的，包括那些例如Affymetrix公司和Illumina公司制造的。

用于检测细胞突变或基因突变的另一种方法基于质谱术。质谱术利用DNA的四种核苷酸每种的独特质量。可以通过质谱术通过测量具有细胞突变的核酸的质量差异来毫无疑义地分析潜在包含突变的核酸。MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离-飞行时间)质谱术技术可用于极其精确地测定分子量，诸如包含细胞突变的核酸的。已经开发了众多基于质谱术的核酸分析办法。例示性的基于质谱术的方法包括引物延伸测定法，其也可以与其它办法(诸如传统的基于凝胶的形式和微阵列)组合使用。

进一步，所述试剂包括针对前面所述的基因突变位点的特异性扩增引物。

进一步，所述试剂还包括dNTPs、Taq酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液等PCR扩增反应中常规试剂。

本发明提供了前面所述的基因突变在制备前面所述的试剂中的应用。本领域技术人员根据基因突变位点上下游序列设计特异性扩增引物或者特异性检测探针。引物和探针的设计方法是本领域的常规技术。

本发明还提供了前面所述的基因突变在制备MPLS诊断产品中的应用。

本发明还提供了前面所述的试剂在制备MPLS诊断产品中的应用。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、或者试纸。

具体地，所述产品包括前面所述的试剂。

进一步，所述诊断产品通过检测样本中前面所述的基因突变是否存在来诊断个体是否患有MPLS。

在本发明的具体实施方案中，所述样本来源是血液。

本发明还提供了一种MPLS诊断产品，所述诊断产品包括检测前面所述的基因突变是否存在的试剂。

进一步，所述诊断产品包括试剂盒、芯片、或者试纸。

本文“Glu2759Cysfs*9”、“p.Glu2759Cysfs*9”、“E2759Cfs*9”同义。

本文“Gly2003Arg”、“G2003R”与“p.G2003R”同义。

如本文中使用的，术语“基因”指经由其模板或信使RNA编码特定肽、多肽、或蛋白质特征性氨基酸序列的DNA序列。术语“基因”还指编码RNA产物的DNA序列。如本文中关于基因组DNA使用的，术语基因包括居间的非编码区以及调节区，而且可包括5′和3′末端。

术语“引物”指能够与核酸杂交并容许互补核酸聚合(一般通过提供游离3’-OH基团)的单链多核苷酸。

术语“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记成分偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体支持物。5′和3′末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2′-氧-甲基、2′-氧-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR。

术语“扩增”指生成参照核酸序列或其互补物的一个或多个拷贝的过程。扩增可以是线性或指数性的(例如聚合酶链式反应(PCR))。“拷贝”不必然表示相对于模板序列的完全序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包含核苷酸类似物诸如脱氧肌苷、有意的序列改变(诸如经由包含与模板可杂交但不完全互补的序列的引物引入的序列改变)和/或扩增期间发生的序列错误。

术语“检测”包括任何检测手段，包括直接和间接检测。

术语“诊断”在用于本文时指分子或病理状态、疾病或状况的鉴定或分类。“诊断”还可以指特定亚型的疾病的分类，例如通过分子特征(例如以特定基因或核酸区域中的核苷酸变异表征的患者亚群)来进行。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：

(1)本发明提供了能够诊断MPLS的生物标志物；通过检测受试者血液基因组DNA上的FBN1基因c.8275_8291区段是否存在缺失突变，即可判断出该受试者是MPLS。

(2)本发明提供了一种非侵入式的，无创的方式用于诊断MPLS。

附图说明

图1显示受试者XH601的临床表现，其中A：脊柱侧凸和身材矮小的摄像图；B：皮下脂肪减少；C：手双侧蜘蛛脚样指；D：足双侧蜘蛛脚样指；E：整个脊柱X-ray图像显示严重脊柱侧凸的正面图；F：整个脊柱X-ray图像显示严重脊柱侧凸的侧面图；G：显示双侧掌指关节脱臼、骨间萎缩、爪手和细长指的手部放射照片；H：显示双侧掌指关节脱臼、骨间萎缩、爪手和细长指的足部放射照片；

图2显示受试者XH601及其父母基因组DNA Sanger序列结果；

图3显示SDD-AGE的蛋白电泳图；

图4显示Western blot结果图，其中A：蛋白显影图；B：灰度统计图。

具体实施方案

除非另有定义，本文中所使用的所有技术术语，符号及其它科学术语意图具有本发明所属领域中技术人员通常所理解的含意。在有些情况中，为了清楚和/或便于提及，本文对具有通常所理解含意的术语给出了定义，而且本文中这些定义的内含不应必然解释为代表了与本领域通常所理解含意的实质差异。本文中所描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通常利用常规方法得以采用，诸如例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第2版(1989)Cold Spring HarborLaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y中记载的广泛使用的分子克隆方法。适当时，涉及使用商品化试剂盒和试剂的规程一般依照制造商规定的方案和/或参数进行，除非另有记载。在描述所述方法、试剂盒及其用途前，应理解本发明不限于特定的方法学、方案、细胞系、动物种或属、构建体，且如此描述的试剂当然可以变化。还应理解本文中使用的术语学仅用于描述具体实施方案的目的，且不意图限制本发明的范围，这将仅由所附权利要求限制。

实施例1与MPLS相关的基因突变筛选

1、参与者招募

通过北京协和医院(PUMCH)的脊柱侧凸&合并症(DISCO)解读障碍研究(www.discostudy.org)招募了1名MPLS病人。至少有两名临床专家独立证实了MPLS的临床诊断。在登记时年龄为18岁或以上的患者或其父母(入组时18岁以下的参与者)提供书面知情同意书。从受影响的先证者和相应的未受影响的父母(如果有的话)收集种系DNA。

2、样品制备

从参与者收集外周血样品。根据制造商的说明用QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN，Germany)提取基因组DNA。通过溴化乙锭染色后的目视检查和使用1％琼脂糖凝胶电泳的大小分级来表征提取的DNA的质量和纯度。通过QubitBR测量(Invitrogen，USA)对基因组DNA进行定量，用于下一代测序(NGS)文库制备。

3、靶向二代测序

为了建立一个最大限度覆盖涉及椎体畸形表型的孟德尔疾病病因的已知基因的NGS(next-generation sequencing)panel，本研究对先天性脊柱侧凸(CS)相关疾病进行了系统的文献和数据库检索。人工审核后，共发现344个基因，相当于457个CS相关的单基因表型。也包括另外一组220个基因，其涉及与脊椎发育相关的途径或在动物模型中诱导CS表型，但尚未与具有CS表型的人类疾病相关联。靶向panel包含564个基因，6458个外显子和侧翼30bp区域，总基因组大小2.97Mb。设计用于靶标捕获的DNA探针并在线购自NimbleGen(Roche，Switzerland)(https://design.nimblegen.com/nimbledesign/app)。预计最终的一组DNA探针覆盖99.7％的目标区域。除了先前发表的具有复合杂合遗传模型的TBX6基因之外，FBN1基因也是panel中的靶标。按照常规技术手段制备靶向序列富集文库。对于每个样品，使用1μg基因组DNA作为起始材料。将基因组DNA片段化至～200-250bp的大小。将片段化的DNA进行末端修复，用A尾加盖并进行索引衔接子的连接。在5个PCR扩增循环后，合并每个索引产物并与在一个溶液捕获反应中靶向捕获的DNA探针杂交。靶向富集DNA的产物进一步进行14个PCR扩增循环，然后通过Bioanalyzer分析(Agilent，USA)和qPCR定量进行最终文库产量验证。在Illumina Hiseq2500测序仪上使用PE100模式进行测序。

4、变体处理，过滤和注释

生成原始序列数据后，使用perl脚本删除低质量和被适配器污染的reads。使用BWA映射器将剩余的reads定位到人参考基因组hg19(GRCh37，http：//genome.ucsc.edu/)上。此外，使用GATK生物信息学包调用单核苷酸变体(SNV)和小插入和缺失(indel)。使用内部开发的注释管道对变体进行注释。在公共数据库(1000Genomes Project，ExomeSequencing Project 6500(可从以下网站获取：http：//evs.gs.washington.edu/EVS/)，ExAC(可从http://exac.broadinstitute.org获得)或内部WES控制数据集)中筛选出具有常见和高频率(次要等位基因频率>1％)的变体。本研究还使用基于人类基因突变数据库(HGMD)和人类在线孟德尔遗传(OMIM)的定制数据库(可从以下网址获取：https：//omim.org/)注释检测到的变体。

6、sanger测序

对来自所有个体的基因组DNA进行Sanger测序，以正确确认所有鉴定的变体。使用Primer Premier 5软件设计引物以包含FBN1基因的特定变体。使用SNAPGENE软件分析Sanger读数。

7、结果

患有MPLS疾病个体的临床表征和新的等位基因变体

受试者XH601。先证者是一名9岁的中国女孩(图1A，B)。当第一次评估时她4岁，身高为101厘米(P25；-1SD)，体重非常轻，12公斤(P3；-3SD)。体格检查显示手足双侧蜘蛛脚指样异常(图1C，D)，不均匀的不对称背部弯曲和先天性髋关节脱位。全脊柱X线检查显示严重的右胸椎侧凸，主要Cobb角为117度(图1E，F)。经胸超声心动图显示前后二尖瓣小叶脱垂和中度二尖瓣关闭不全，在Valsalva(翻译)或主动脉根部解剖的鼻窦没有明显的主动脉直径增大。眼部系统异常表明双侧向下倾斜的眼睑裂，内眦赘皮和眼睛散光。然而，没有异位症状的症状。计算机断层扫描(CT)成像未发现硬脑膜扩张或突出髋臼的明显证据。该患者的主要特征是极度先天性皮下脂肪缺乏，该特征与体检显示的脂肪代谢障碍相一致，以及随后的身体前列腺外观。然而，这个先证者不符合经典MFS的修订后的Ghent标准。对先证者进行了连续的随访和评估。当她9岁时，先证者出现了基因型驱动的反向表型，上段和下段的比例基本正常，比率为0.87。先证者的身高为136厘米(P50，0)。相比之下，她父亲的身高测量值为170厘米，母亲身高为160厘米。先证者的体重指数(BMI)极低(11.1kg/m2)可能是由于年龄增长不成比例。更具体地说，患者具有极薄的体型，体重为20.5Kg(P3；-3SD)。此外，能评估“骨龄”的手足射线照片提示该先证者双侧掌指关节脱臼，骨间萎缩和多发性萎缩(图1G，H)。在回顾了先前报道的涉及相关表型的文献后，先证者最终被诊断为患有MPLS。通过靶向NGS，在先证者中鉴定出c.8275_8291delGAGAAGACAGCCATCTT(p.Glu2759Cysfs*9)的17bp移码缺失的FBN1杂合变体。因此，通过亲本Sanger测序和三重分析证实了受试者XH601ad的变体确实是新生的(图2)。

实施例2候选突变功能验证

1、质粒构建和诱变

通过PCR扩增含有衍生自人肌肉cDNA和合适限制性位点的全长FBN1cDNA的DNA片段，并克隆到NheI和SacII消化的载体pEGFP中。用限制酶KpnI和EcoRI消化PCR产物，并连接到pEGFP的相同限制性位点，产生重组质粒pEGFP-FBN1。通过定点诱变产生突变EGFP-FBN1质粒。先前在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)病例中报道的Gly2003Arg被用作阳性对照。根据制造商的说明利用QuikChange Lightning定点诱变试剂盒(Agilent Technologies，SantaClara，CA，USA)将Glu2759Cysfs*9和G2003R的突变引入野生型(WT)pEGFP-FBN1。通过Sanger二脱氧测序对得到的2种突变质粒pEGFP-FBN1-Glu2759Cysfs*9和pEGFP-FBN1-Gly2003Arg进行测序，以确认掺入所需的碱基变化。

2、细胞培养和转染

HEK293T细胞在培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium(Gibco，Waltham，MA，USA)+10％胎牛血清(Biological Industries，Cromwell，USA)+1％青霉素/链霉素(Gibco-Life Technologies，USA))中于37℃、含5％二氧化碳的细胞培养箱中培养。根据制造商的说明，使用Lipofectamine3000(Invitrogen，CA，USA)，用突变体或/和WT pEGFP-FBN1转染/共转染细胞。转染后6小时，用新鲜的完全DMEM培养基替换培养基，并将细胞进一步培养48小时。提取总RNA和蛋白质并分别通过Western印迹和SDD-AGE分析。

3、蛋白质印迹

用改良的RIPA(50mM Tris-HCL，1％NP40，0.25％Na-脱氧胆酸，150mM NaCl和1mMEDTA；CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物)裂解细胞，并用BCA-测定蛋白质浓度。在8％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离总量为5mg的蛋白质，对蛋白质进行电泳并转移到硝酸纤维素膜上。将膜在室温下(RT，25摄氏度)于奶粉中封闭30分钟，加入一抗(Phospho-Smad2(Ser245/250/255)抗体，Cell Signaling Technology；抗GAPDH，Millipore)在4℃孵育过夜。洗涤后，将相应的辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔二抗(KPL)在室温(25摄氏度)温育1小时。用WesternBright ECL化学发光系统(Advansta，CA，USA)使条带可视化。用不同的细胞裂解物进行该实验三次。使用ImageJ定量化学发光信号。

4、SDD-AGE

为了进行半变性洗涤剂-琼脂糖凝胶电泳(SDD-AGE)，将HEK293T细胞与野生型(pEGFP-FBN1)和突变体(pEGFP-FBN1-Glu2759Cysfs*9)共转染6小时，然后温育48小时。在37℃下用5％CO₂在热罐中温育48小时后，通过在3000rcf离心2分钟收获细胞，重悬于200μL水中，随后离心。然后向每个孔中加入约100μl酸洗细胞，接着加入120μL裂解缓冲液(100mMTris pH 8，1％Triton X-100，50mMβ-巯基乙醇，3％HALT蛋白酶抑制剂混合物，30mM N-乙基马来酰亚胺和12.5U/mL核酸酶)。然后用橡胶垫(Nunc 276002)密封块，在QiagenTissuelyzer 2上以最大速度振荡两次，持续3分钟。然后向每个孔中加入35μL 4X样品缓冲液(2X TAE，20％甘油，8％SDS，0.01％溴酚蓝)。然后将块短暂涡旋并使其在室温下孵育3分钟，然后在3000rcf下离心2分钟以除去细胞碎片。然后进行Hybond ECL硝酸纤维素电泳和毛细管印迹。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并用充分表征的抗纤维蛋白1的单克隆抗体(Abcam ab124334，Cambridge，UKAbcam)进行检测。

5、统计分析

SPSS软件，版本17.0(SPSS)，用于进行双尾t检验，比较测试样本和对照样本的值。P值小于0.05被认为具有统计学意义。

6、结果

将表达突变体的质粒(pEGFP-FBN1-Glu2759Cysfs*9)和WT质粒(pEGFP-FBN1)共转染到HEK293T细胞中。表达48小时后，通过SDD-AGE分析表达EGFP-FBN1融合体的细胞的裂解物。用SDD-AGE和Western印迹研究瞬时表达EGFP-FBN1融合体的HEK293T细胞裂解物中SDD-AGE对SDS抗性聚集体的检测。诱导蛋白质表达48小时并用单克隆FBN1特异性抗体检测。值得注意的是，WT质粒(EGFP-FBN1融合体)具有淀粉样蛋白质结构的SDS抗性。由于淀粉样蛋白的形成是时间和浓度依赖性的，将瞬时表达的时间设定为48小时。在48小时表达后，WT质粒(EGFP-FBN1融合体)聚集，而pEGFP-FBN1-Glu2759Cysfs*9和WT质粒的共转染导致存在一小部分单体蛋白。这表明pEGFP-FBN1-Glu2759Cysfs*9显然禁止WT质粒表达产物的天然聚集过程，揭示细胞内显性失活机制(图3)，图3中FBN1-E2759Cfs*9是指FBN1-Glu2759Cysfs*9。

以前的研究表明，导致马凡综合征的有害FBN1突变导致内源性转化生长因子β(TGF-β)受体信号上调。这种信号传导可以在血浆中测量或通过下游靶标的异常激活间接测量，包括SMAD2(pSMAD2)，ERK1/2和JNK1的过度磷酸化。为了确定MPLS患者中新截短FBN1变体p.Glu2759Cysfs*9的功能性结果，将表达突变体EGFP-FBN1cDNA的质粒转染到HEK293T细胞中。具有截短的FBN1变体Glu2759Cysfs*9(P＝0.017)和Gly2003Arg(P＝0.006)的转染细胞显示Western印迹中SMAD2(pSMAD2)的磷酸化显着升高(增加的)。WT质粒(图4)，图4中p.E2759Cfs*9是指p.Glu2759Cysfs*9。

实施例3MPLS诊断试剂盒

1、试剂盒组成：引物/Taq酶/缓冲液/dNTP

从待检测的生物体样本中提取和纯化基因材料(DNA样本)。

2、使用方法：

(1)基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。

(2)先采用PCR引物、Taq酶、样本基因组DNA、缓冲液、dNTP等进行PCR扩增反应；

(3)对PCR扩增产物进行纯化；

(4)对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

(5)对BiyDye反应产物纯化；

(6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种用于诊断MPLS的基因突变，其特征在于，所述基因突变是FBN1基因上的突变。

2.根据权利要求1所述的基因突变，其特征在于，所述突变位点是FBN1基因上的c.8275_8291位，所述突变是c.8275_8291delGAGAAGACAGCCATCTT。

3.权利要求1或2所述的基因突变的检测试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括所述基因突变位点的特异性扩增引物。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括dNTPs、Taq酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液。

6.权利要求1或2所述的突变在制备权利要求3-5中任一项所述的试剂中的应用。

7.权利要求1或2所述的突变或权利要求3-5中任一项所述的试剂在制备MPLS诊断产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述诊断产品通过检测样本中权利要求1或2所述的突变来诊断个体是否患有MPLS。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述样本来源是血液。

10.一种MPLS诊断产品，其特征在于，所述诊断产品包括权利要求3-5中任一项所述的试剂。