CN109476611B - 一种卤代化合物及其轴手性异构体 - Google Patents

Abstract

一种卤代化合物及其轴手性异构体，及其在制备与治疗尿酸水平异常密切相关病症的药物中的应用。

Description

一种卤代化合物及其轴手性异构体

技术领域

本发明涉及一种卤代化合物及其轴手性异构体，及其在制备与尿酸水平异常密切相关病症的药物中的应用。

背景技术

尿酸是人和动物体内嘌呤类化合物代谢的产物。由于人体内缺乏将尿酸继续氧化降解成水溶性更好的尿囊素的尿酸酶，所以尿酸在人体内将作为嘌呤代谢的最终产物通过肠道和肾脏排出体外，其中肾脏排泄是人体内尿酸排泄的主要途径。对正常人而言，人体内正常的尿酸浓度范围的上限是：男性400umol/L(6.8mg/dL)，女性360umol/L(6mg/dL)。人体内尿酸水平异常往往是由于尿酸生成的增加或者尿酸排泄的减少，通常有尿酸生成增多型，尿酸排泄减少型以及混合型三种。与尿酸水平异常密切相关的病症有高尿酸血症，痛风性关节炎(也简称痛风)，肾结石，尿路结石，高血压等。

高尿酸血症是指人体内嘌呤的物质的新陈代谢发生紊乱，致使人体尿酸的合成增加或排出减少，血液中尿酸水平异常高的病症。当尿酸在人体血液中浓度超过7mg/dL时，尿酸会以单钠盐的形式沉积在关节、软骨和肾脏中，导致身体免疫系统过度反应(敏感)而造成痛苦，这种症状称为痛风性关节炎。急性痛风一般发作部位为大拇趾关节，踝关节，膝关节等关节末端，发作部位出现红、肿、热、剧烈疼痛，一般多在子夜发作，可使人从睡眠中惊醒。高尿酸血症是痛风性关节炎的病理基础，使用药物降低血内尿酸浓度是预防痛风性关节炎的常用方法之一。

近年来，随着人们生活习惯的改变，高尿酸血症和痛风疾病的发作呈现逐年上升态势。在欧美，流行病学研究表明痛风性关节炎的发病人数占总人口的1-2％，是成年男性最主要的关节炎类型。彭博社预估在2021年将有1770万痛风患者。在中国，调查显示在20至74年龄段人口中，25.3％人口血尿酸含量偏高，0.36％人口患有痛风疾病。目前，临床治疗药物主要包括1)抑制尿酸生成类药物，比如黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇和非布索坦；2)促尿酸排泄类药物，比如丙磺舒和苯溴马隆；3)炎症抑制剂，比如秋水仙碱等。这些药物在治疗上都有一定的缺陷，疗效差，副作用大，花费大是其临床应用的一些主要瓶颈。据报道，40％-70％患者在接受标准流程治疗后，血尿酸的含量没有达到预期治疗目标(<6mg/dL)。

URAT1是一个重要的肾脏阴离子转运体，位于肾小管的上皮细胞刷状缘膜上，特异性地从肾小管中转运尿酸到上皮细胞，是尿酸在肾小管中重吸收的主要动力。因此，如果能显著抑制尿酸盐转运体URAT1，将会增加体内尿酸的排泄，从而降低血尿酸水平，降低痛风发作的可能性。

2015年12月，美国FDA批准了阿斯利康第一个靶向性URAT1抑制剂Lesinurad，如下式，并批准了其200mg/天剂量与黄嘌呤氧化酶抑制剂XOI(如Febuxostat等)联用用于高尿酸血症和痛风性关节炎的治疗，但是联合用药与黄嘌呤氧化酶抑制剂单独用药对比，其附加效应并不十分显著。同时，Lesinurad 400mg/天剂量未获批准，原因在于高剂量下观察到的显著增加的毒副作用(肾相关的不良事件发生率特别是肾结石的发病率较高)，尽管高剂量下联合用药展现出较高的附加效应。因此，FDA要求Lesinurad标签加注黑框警告，警示医务人员Lesinurad引起急性肾衰竭的风险，特别是在不与XOI联用的情况下更常见，如果超批准剂量使用Lesinurad，引起肾衰竭的风险更高。同时，FDA要求Lesinurad上市后，阿斯利康继续进行对肾脏和心血管安全性的考察。对于一个代谢类疾病的长期用药，药物的安全问题就显得特别重要。因此，开发一种安全的降血尿酸药物成为该领域的强烈需求。

阿斯利康在披露的新药申报报告中详细报道了化合物Lesinurad在体外多种属动物肝微粒体和肝细胞代谢产物鉴定实验的结果。数据表明：Lesinurad在猴和人肝细胞中代谢时显著地被检测到了M3和M4两个主要代谢产物，但是在狗和大鼠肝细胞中上未能检测到M3和M4，如下表-1所示。

表-1

同时，阿斯利康也报道了Lesinurad在多种属动物体内给药后的主要代谢产物和代谢途径，其中双羟基代谢产物M4在人体代谢产物中被特异性地检测到：

这点和Lesinurad在人临床上的数据相一致。实验数据表明，M3,M4是人临床中发现的最主要代谢产物，如下表-2所示。

表-2

M4代谢产物的产生途径，经过研究可以确定为细胞色素CYP2C9和灵长类动物环氧化物水解酶mEH共作用的结果。该mEH代谢途径是灵长类属种所特有的，这点解释了在大鼠和狗上未观察到M4的原因：

发明内容

鉴于Lesinurad到M3c再到M4的特殊代谢途径，代谢产物M3，M4及其中间体M3c(M3c不稳定，不能在体内检测到)，都有可能是造成人临床毒副作用的原因之一。如果能够有效降低化合物代谢物M3和M4的量，特别是环氧中间体M3c的量，理论上应该可以降低化合物Lesinurad在人临床上发现的毒副作用。而这些氧化反应都来源于富电子的萘环的环系氧化，因此，如果能有效降低萘环的电子云密度应该可以减缓或者阻碍氧化反应的发生，从而减少代谢产物M3，M4及其中间体M3c的生成。

基于对Lesinurad代谢途径及其临床毒副作用的研究，本发明设计并合成了一系列含有萘环取代基的化合物(式I)，对于其中的两个代表性的化合物(式II和V)成功加以分离，得到了其旋转轴异构体(式III和式IV，式VI和式VII)。发明人考察了这些化合物抑制稳定转染人URAT1基因的MDCK细胞系对标记尿酸的转运能力。我们发现：萘环上的取代基团在细胞抑制活性上是可以接受的，其体外抑制活性IC₅₀较Lesinurad普遍得以提高；这些化合物在大鼠药代动力学实验上也展现出较好的性质，具有开发为药物的可行性；更重要的是，这些化合物在体外代谢产物鉴定实验中被证明能够比参照化合物Lesinurad产生更少的类似代谢产物，这就从毒性机理的角度上说明体内给药时，相比Lesinurad，本发明的这些带有取代基的萘环化合物在保持活性和药效的同时，将有可能产生较小的毒性。

本发明提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐，

其中，

X选自F、Cl、Br和I；

Y和Z分别独立地选自：H、甲基、乙基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基；

或者，Y与Z连接在一起，形成一个3～6元环。

本发明的一些方案中，上述化合物选自式(II)化合物。

本发明提供了左旋或右旋的式(II)化合物或其药学上可接受的盐，其以单一轴手性异构体形式或富含一种轴手性异构体形式存在。

本发明的一些方案中，上述左旋或右旋的式(II)化合物或其药学上可接受的盐，其一种轴手性异构体的含量≥60％，优选≥70％，更优选≥80％，更优选≥90％，最优选≥95％。

本发明还提供了式(III)化合物或其药学上可接受的盐。

本发明的一些方案中，式(III)化合物或其药学上可接受的盐轴手性异构体过量≥90％。

本发明还提供了式(IV)化合物或其药学上可接受的盐。

本发明的一些方案中，式(IV)化合物或其药学上可接受的盐轴手性异构体过量≥90％。

本发明的一些方案中，上述化合物或其药学上可接受的盐，其选自式(V)化合物。

本发明还提供了左旋或右旋的式(V)化合物或其药学上可接受的盐，其以单一轴手性异构体形式或富含一种轴手性异构体形式存在。

本发明的一些方案中，上述左旋或右旋的式(V)化合物或其药学上可接受的盐，其一种轴手性异构体的含量≥60％，优选≥70％，更优选≥80％，更优选≥90％，最优选≥95％。

本发明还提供了式(VI)化合物或其药学上可接受的盐。

本发明的一些方案中，式(VI)化合物或其药学上可接受的盐轴手性异构体过量≥90％。

本发明还提供了式(VII)化合物或其药学上可接受的盐。

本发明的一些方案中，式(VII)化合物或其药学上可接受的盐轴手性异构体过量≥90％。

本发明的一些方案中，上述Y与Z连接在一起，结构单元

选自：

本发明还提供了一种药物组合物，包括作为活性成分的治疗有效量上述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

本发明还提供了一种治疗尿酸水平异常相关病症的方法，包括给予治疗对象有效量上述的化合物或其药学上可接受的盐或上述的组合物。

本发明还提供了上述的化合物或其药学上可接受的盐或上述组合物在制备治疗尿酸水平异常相关病症的药物上的应用。

本发明的一些方案中，上述述病症为高尿酸血症、痛风性关节炎、肾结石、尿路结石或高血压。

术语定义

“左旋或右旋的式(II)化合物”可以是式(II)化合物的单一轴手性异构体，也可以是富含一种轴手性异构体的混合物。

“左旋或右旋的式(V)化合物”可以是式(V)化合物的单一轴手性异构体，也可以是富含一种轴手性异构体的混合物。

“富含一种轴手性异构体”指其中一种轴手性异构体的含量＜100％，且≥60％，优选≥70％，更优选≥80％，更优选≥90％，最优选≥95％。

“轴手性异构体的过量”指两种轴手性异构体相对百分数之间的差值。例如，其中一种轴手性异构体的含量为90％，另一种轴手性异构体的含量为10％，则轴手性异构体过量为80％。

式(III)和(IV)化合物分别是式(II)化合物的两种绝对构型，

分别是

的两种绝对构型。

式(VI)和(VII)化合物分别是式(V)化合物的两种绝对构型，

分别是

的两种绝对构型。

(+)表示右旋，(-)表示左旋，(±)表示外消旋。

本发明所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐(参见Berge et al.,"PharmaceuticalSalts",Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19(1977))。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。

优选地，以常规方式使盐与碱或酸接触，再分离母体化合物，由此再生化合物的中性形式。化合物的母体形式与其各种盐的形式的不同之处在于某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度不同。

本文所用的“药学上可接受的盐”属于本发明化合物的衍生物，其中，通过与酸成盐或与碱成盐的方式修饰所述母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于：碱基比如胺的无机酸或有机酸盐、酸根比如羧酸的碱金属或有机盐等等。药学上可接受的盐包括常规的无毒性的盐或母体化合物的季铵盐，例如无毒的无机酸或有机酸所形成的盐。常规的无毒性的盐包括但不限于那些衍生自无机酸和有机酸的盐，所述的无机酸或有机酸选自2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、碳酸氢根、碳酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、葡庚糖、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸盐、羟萘、羟乙磺酸、乳酸、乳糖、十二烷基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、多聚半乳糖醛、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、单宁、酒石酸和对甲苯磺酸。

本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。一般地，优选醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水介质。

本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚(³H)，碘-125(¹²⁵I)或C-14(¹⁴C)。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。

术语“药学上可接受的载体”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂或载体介质代表性的载体包括水、油、蔬菜和矿物质、膏基、洗剂基质、软膏基质等。这些基质包括悬浮剂、增粘剂、透皮促进剂等。它们的制剂为化妆品领域或局部药物领域的技术人员所周知。关于载体的其他信息，可以参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins(2005)，该文献的内容通过引用的方式并入本文。

针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。

术语“活性成分”是指一种化学实体，它可以有效地治疗目标紊乱、疾病或病症。

本发明的进步本发明报道的一系列化合物，特别是旋转轴异构体式(III)化合物((-)-WX001)，式(IV)化合物((+)-WX002)，式(VI)化合物((-)-WX004)，式(VII)化合物((+)-WX005)，与参照消旋体化合物(±)-Lesinurad相比，在抑制稳定转染URAT1基因的MDCK细胞系对标记尿酸的转运实验中均展现了显著提高了的体外活性，其中异构体(-)-WX001相对于另一异构体(+)-WX002展现了超过3倍的体外抑制活性，充分显示了单一异构体在体外抑制活性上的优势。同时，在相同剂量，相同方式给药时，与(+)-WX002和(±)-Lesinurad相比，(-)-WX001在大鼠PK中展现了更低的体内清除率和更高的血浆暴露量，总体药代动力学表现更优。更为突出的是，(-)-WX001和(+)-WX002，与(±)-Lesinurad相比，在同一条件体外肝细胞代谢稳定性试验中，均展现了极好的体外稳定性，没有被检测到代谢产物。我们可以预见萘环上含有取代基，特别是吸电基的单一异构体化合物，比如(-)-WX001，(+)-WX002，(-)-WX004和(+)-WX005在临床给药上将有可能显著降低发生临床毒副作用的可能性，并保持或提高临床中的体内药效。

具体实施方式

下面通过实施例和测试例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。

实施例1和实施例2：化合物(-)-WX001(式(III))和(+)-WX002(式(IV))

合成路线:

步骤1:化合物2的合成

将化合物1(500.00mg,2.73mmol,1.00eq)和N-氯代丁二酰亚胺(364.34mg,2.73mmol,1.00eq)加入到醋酸(5.00mL)中，20℃搅拌反应16小时。反应完成后，反应液直接浓缩除去醋酸，加硅胶1.0g拌样并经自动过柱机(乙酸乙酯/石油醚＝0-10％)纯化得到棕色固体化合物2(383.00mg,1.76mmol,收率：64.47％)，¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.41-8.35(m,1H),7.85-7.80(m,1H),7.57-7.52(m,2H),7.19(d,J＝0.8Hz,1H),4.43(s,2H),2.26-2.17(m,1H),1.07-0.97(m,2H),0.74-0.67(m,2H)。

步骤2:化合物3的合成

将化合物2(360.00mg,1.65mmol,1.00eq)，三乙胺(502.02mg,4.96mmol,687.70uL,3.00eq)溶于二氯甲烷(5.00mL)中，降温到0℃后滴加硫光气(228.17mg,1.98mmol,152.12uL,1.20eq)，反应液在0℃反应0.5小时。用稀盐酸(1mol/L，20mL)将反应淬灭，再用二氯甲烷(10mL×3)萃取。有机相合并后用饱和食盐水(30mL)洗涤，再用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩得到黑色液体粗品化合物3(520.00mg,粗品)，粗品直接用于下一步反应。

步骤3:化合4的合成

将粗品化合物3(520.00mg,2.00mmol,1.00eq)，水合肼(100.12mg,2.00mmol,97.20uL,1.00eq)和N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(285.98mg,2.40mmol,317.76uL,1.20eq)加入到N,N-二甲基甲酰胺(5.00mL)中，所得混合物在20℃搅拌反应16小时。将反应液浓缩除去N,N-二甲基甲酰胺，剩余混合物用乙酸乙酯(20mL)溶解，加硅胶(2g)拌样并经自动过柱机(乙酸乙酯/石油醚＝0-35％)纯化得到白色固体化合物4(813.00mg,粗品)。¹HNMR(400MHz,Methanol-d₄)δ:8.58(d,J＝8.0Hz,1H),8.37(s,1H),7.73-7.67(m,1H),7.67-7.62(m,1H),7.48-7.45(m,1H),7.38-7.34(m,1H),2.59-2.49(m,1H),1.25-1.18(m,2H),0.96-0.84(m,2H)。

步骤4:化合5的合成

化合物4(813.00mg,2.69mmol,1.00eq)，2-溴乙酸乙酯(539.86mg,3.23mmol,357.53uL,1.20eq)和碳酸铯(1.76g,5.39mmol,2.00eq)加入到N,N-二甲基甲酰胺(5.00mL)中，所得反应液在20℃搅拌反应16小时。反应完成后用油泵浓缩得到黄色油状物与白色固体的混合物，向混合物中加入乙腈(20mL)并搅拌2分钟，过滤，滤饼用乙腈(20mL)淋洗，滤液合并浓缩得到棕黄色油状粗品化合物5(1.10g,粗品)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.49(d,J＝8.4Hz,1H),8.24(s,1H),7.68-7.63(m,1H),7.62-7.59(m,1H),7.39-7.37(m,1H),7.22(d,J＝8.0Hz,1H),4.19-4.17(m,2H),4.16-4.15(m,2H),2.46-2.39(m,1H),1.22-13.18(m,2H),1.06(t,J＝7.2Hz,3H),0.90-0.85(m,2H)；

MS m/z:388.0[M+H]⁺。

步骤5:化合物6的合成

将粗品化合物5(1.10g,粗品)，N-溴代丁二酰亚胺(505.46mg,2.84mmol,1.00eq)加入到乙腈(10.00mL)中，所得反应液在18℃搅拌反应2小时。反应完成后将反应液直接浓缩拌样，并经自动过柱机(乙酸乙酯/石油醚＝0-25％)纯化得到棕色油状粗品。粗品经制备HPLC分离得到白色固体化合物6(201.1mg,430.82umol)。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:8.64(d,J＝8.0Hz,1H),7.79-7.74(m,1H),7.74-7.69(m,1H),7.52(d,J＝0.8Hz,1H),7.27-7.22(m，1H),4.17-4.09(m,2H),4.08-3.96(m,2H),2.63-2.52(m,1H),1.28-1.23(m,5H),0.97-0.90(m,2H)。

MS m/z:468.0[M+H+2]⁺。

步骤6:化合物6A&6B的合成

化合物6(201.1mg,430.82umol,1.00eq)经超临界流体色谱SFC(手性柱:Chiralpak AD(250mm×30mm,5um)；流动相:超临界CO₂/乙醇(0.1％氨水)＝30％for30min；流速:60mL/min；检测波长:220nm)分离得到无色透明油状化合物6A(50.30mg,107.76umol)和无色透明油状化合物6B(52.60mg,112.69umol)。

化合物6A：SFC(手性柱:Chiralpak AD-3(100mm×4.6mm,3um)；流动相:乙醇(0.05％DEA)/超临界CO₂＝5～40％，4.5min；40％，2.5min；5％，1min；；流速:2.8mL/min；检测波长:220nm；柱温:40℃)R_t＝3.513min。轴手性异构体过量99.69％。

化合物6B：SFC(手性柱:Chiralpak AD-3(100mm×4.6mm,3um)；流动相:乙醇(0.05％DEA)/超临界CO₂＝5～40％，4.5min；40％，2.5min；5％，1min；流速:2.8mL/min；检测波长:220nm；柱温:40℃)R_t＝3.911min。轴手性异构体过量99.87％。

步骤7:化合物(-)-WX001和(+)-WX002的合成

将化合物6A(50.00mg,107.12umol,1.00eq)和一水合氢氧化锂(22.47mg,535.60umol,5.00eq)加入到乙醇(2.00mL)/水(2.00mL)中，所得反应液在20℃搅拌反应16小时。将反应液浓缩除去乙醇，剩余水相用稀盐酸(2mol/L)调到pH＝2，有白色固体析出，过滤，滤饼用水(5mL)淋洗，然后滤饼用乙醇(1mL)溶解，加水(20mL)冻干得到(-)-WX001(36.30mg,82.74umol,收率：77.24％)。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:8.52(d,J＝8.4Hz,1H),7.67-7.55(m,2H),7.39(s,1H),7.13(d,J＝8.0Hz,1H),4.56(s,1H),3.95-3.79(m,2H),2.53-2.39(m,1H),1.18-1.10(m,2H),0.85-0.76(m,2H)；

MS m/z:439.9[M+H+2]⁺；

SFC(手性柱:Chiralpak AS-3(150mm×4.6mm,3um)；流动相:甲醇(0.05％DEA)/超临界CO₂＝5～40％，5min；40％，2.5min；5％，2.5min；流速:2.5mL/min；检测波长:220nm；柱温:35℃)R_t＝3.548min。轴手性异构体过量100％。[α]²⁵ _D＝-0.350(c＝5.0mg/mL甲醇溶液)。

将化合物6B(52.00mg,111.40umol,1.00eq)和一水合氢氧化锂(23.37mg,557.00umol,5.00eq)加入到乙醇(2.00mL)/水(2.00mL)中，所得反应液在20℃搅拌反应16小时。将反应液浓缩除去乙醇，剩余水相用稀盐酸(2mol/L)调到pH＝2，有白色固体析出，过滤，滤饼用水(5mL)淋洗，然后滤饼用乙醇(1mL)溶解，加水(20mL)冻干得到(+)-WX002(36.80mg,83.88umol,收率：75.29％)。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:8.64(d,J＝8.4Hz,1H),7.81-7.67(m,2H),7.51(s,1H),7.26(d,J＝8.0Hz,1H),4.14-3.93(m,2H),2.63-2.53(m,1H),1.30-1.23(m,2H),0.97-0.90(m,2H)；

MS m/z:439.9[M+H+2]⁺；

SFC(手性柱:Chiralpak AS-3(150mm×4.6mm,3um)；流动相:甲醇(0.05％DEA)/超临界CO₂＝5～40％，5min；40％，2.5min；5％，2.5min；流速:2.5mL/min；检测波长:220nm；柱温:35℃)，R_t＝3.774min。轴手性异构体过量99.22％。[α]²⁵ _D＝+1.191(c＝4.6mg/mL甲醇溶液)。

实施例3：化合物(±)-WX003(式(II))

合成路线:

步骤1:化合物(±)-WX003的合成

将化合物6(56.30mg,120.61umol,1.00eq)和一水合氢氧化锂(25.30mg,603.07umol,5.00eq)加入到乙醇(2.00mL)/水(2.00mL)中，所得混合物在20℃反应16小时。反应完成后将反应液浓缩除去乙醇，加水到2mL，然后用稀盐酸(2mol/L)将反应液调到pH＝3，有白色固体析出，过滤，滤饼用水(10mL)淋洗，滤饼用甲醇(1mL)溶解，再向甲醇溶液中加水(20mL)，混合溶液呈白色，无固体析出，冻干得到白色粉末化合物(±)-WX003(50.30mg,114.65umol,收率：91.43％)。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:8.64(d,J＝8.4Hz,1H),7.80-7.67(m,2H),7.52(s,1H),7.26(br d,J＝8.4Hz,1H),4.13-3.95(m,2H),2.63-2.53(m,1H),1.30-1.23(m,2H),0.98-0.90(m,2H)；

MS m/z:439.6[M+H]⁺。

实施例4和实施例5：化合物(-)-WX004(式(VI))和(+)-WX005(式(VII))

合成路线:

步骤1：化合物7的合成

将化合物4(1.00g,3.31mmol,1.00eq)，碳酸钾(914.95mg,6.62mmol,2.00eq)和2-溴代异丁酸甲酯(719.05mg,3.97mmol,513.61uL,1.20eq)加入到N,N-二甲基甲酰胺(10.00mL)中，在28℃反应16小时。反应完成后，反应液浓缩除去N,N-二甲基甲酰胺得到棕色油状液体混合物，混合物用乙酸乙酯(20mL)浸泡搅拌10分钟。过滤，滤液浓缩得到粗品化合物7(1.52g,粗品)，粗品直接用于下一步反应。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.50(d,J＝8.8Hz,1H),8.28(s,1H),7.68-7.63(m,1H),7.62-7.55(m,1H),7.38(s,1H),7.18(d,J＝8.4Hz,1H),3.64(s,3H),2.49-2.38(m,1H),1.68(s,3H),1.61(s,3H),1.24-1.19(m,2H),0.95-0.85(m,2H)；

MS m/z：402.1[M+H]⁺。

步骤2：化合物8的合成

将粗品化合物7(1.52g,1.00eq)和N-溴代丁二酰亚胺(1.01g,5.67mmol,1.50eq)加入到乙腈(15.00mL)中，在28℃搅拌反应20小时。反应完成后，向反应液中加入硅胶(3.0g)直接浓缩拌样，经过快速柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝0～45％)纯化得到黄色油状液体化合物8(0.85g,1.77mmol,两步收率53.44％).

步骤3：化合物8A和8B的合成

化合物8(0.85g,1.77mmol,1.00eq)经超临界流体色谱SFC(手性柱:Chiralpak AD(250mm×30mm,5um)；流动相:超临界CO₂/甲醇(0.1％氨水)＝25％；流速:50mL/min；检测波长:220nm)分离得到淡黄色油状液体化合物8A(350.00mg,727.94umol)和淡黄色油状液体化合物8B(350.00mg,727.94umol)。

化合物8A：SFC(手性柱:Chiralpak AD-3(150mm×4.6mm,3um)；流动相:甲醇(0.05％DEA)/超临界CO₂＝5～40％，5.5min；40％，3min；5％，1.5min；；流速:2.5mL/min；检测波长:220nm；柱温:40℃)R_t＝4.972min。轴手性异构体过量99.72％。

化合物8B：SFC(手性柱:Chiralpak AD-3(150mm×4.6mm,3um)；流动相:甲醇(0.05％DEA)/超临界CO₂＝5～40％，5.5min；40％，3min；5％，1.5min；；流速:2.5mL/min；检测波长:220nm；柱温:40℃)；R_t＝5.242min。轴手性异构体过量99.05％。

步骤4：化合物(-)-WX004和化合物(+)-WX005的合成

将化合物8A(330.00mg,686.34umol,1.00eq)和一水合氢氧化锂(143.99mg,3.43mmol,5.00eq)加入到甲醇(15.00mL)/水(15.00mL)中，在30°0反应2.5小时。反应完成后，反应液与小试批次合并，反应液在35℃旋蒸浓缩除去甲醇。剩余反应液用稀盐酸(2mol/L)调到pH＝2，有大量白色固体析出，白色固体马上聚成团。过滤，滤饼用水(10mL)淋洗。滤饼用乙腈(1mL)溶解，再加水(15mL)混合后冻干得到白色固体化合物(-)-WX004(328.30mg,703.33umol)。

¹H NMR(400MHz,MeOD-d₄)δ:8.60(d,J＝8.0Hz,1H),7.76-7.64(m,2H),7.47(s,1H),7.16(d,J＝8.0Hz,1H),2.58-2.50(m,1H),1.63(d,J＝5.2Hz,6H),1.27-1.21(m,2H),0.95-0.88(m,2H)；

MS m/z:465.7[M+H]⁺，467.7[M+H+2]⁺；

SFC(手性柱:Chiralpak AD-3(150mm×4.6mm,3um)；流动相:乙醇(0.05％DEA)/超临界CO₂＝5～40％，5.5min；40％，3min；5％，1.5min；流速:2.5mL/min；检测波长:220nm；柱温:40℃)；R_t＝4.892min。轴手性异构体过量97.64％。[α]²⁵ _D＝-5.766(c＝5.52mg/mL甲醇溶液)。

将化合物8B(350.00mg,727.94umol,1.00eq)和一水合氢氧化锂(152.72mg,3.64mmol,5.00eq)加入到甲醇(16.00mL)/水(16.00mL)中，在30℃反应2小时。反应液在35℃旋蒸浓缩除去甲醇，剩余反应液用稀盐酸(2mol/L)调到pH＝2，有大量白色固体析出，白色固体马上聚成团。过滤，滤饼用水(10mL)淋洗。滤饼用乙腈(1mL)溶解，再加水(15mL)混合后冻干得到白色固体化合物(+)-WX005(324.60mg,695.40umol,收率：95.53％)。

¹H NMR(400MHz,MeOD-d₄)δ:8.61(d,J＝8.0Hz,1H),7.77-7.63(m,2H),7.48(s,1H),7.17(d,J＝8.0Hz,1H),2.60-2.49(m,1H),1.71-1.54(m,6H),1.27-1.19(m,2H),0.96-0.85(m,2H)；

MS m/z:466.0[M+H]⁺,468.0[M+H+2]⁺；

SFC(手性柱:Chiralpak AD-3(150mm×4.6mm,3um)；流动相:乙醇(0.05％DEA)/超临界CO₂＝5～40％，5.5min；40％，3min；5％，1.5min；流速:2.5mL/min；检测波长:220nm；柱温:40℃)；R_t＝5.301min。轴手性异构体过量91.82％。[α]²⁵ _D＝+7.630(c＝5.38mg/mL甲醇溶液)。

测试例1：体外评价

1.实验目的：

采用稳定转染URAT-1(尿酸转运蛋白)基因的MDCK细胞系测定化合物抑制尿酸重吸收的IC₅₀值。

2.背景介绍：

痛风是由血液尿酸水平异常升高引起的进行性疾病。URAT-1基因编码存在于肾小管中的尿酸转运蛋白。小分子化合物可以通过抑制该蛋白功能促进尿酸排泄，从而起到防止痛风发作的作用。

3.实验材料:

URAT-1(MDCK)细胞系：稳定转染URAT-1基因的MDCK细胞。

细胞培养液：MEM培养液,加10％胎牛血清(FBS)、1％丙酮酸钠和250ug/ml G418。

HBSS缓冲液。

0.1M NaOH溶液。

¹⁴C标记-尿酸溶液。

CO₂培养箱。

液闪计数仪Tri-Carb

4.实验步骤和方法：

4.1细胞接种:

1)吸掉细胞培养的培养上清，用10mL PBS洗细胞。

2)加入预热过的胰酶到洗过的细胞培养瓶中，旋转培养瓶使胰酶均匀覆盖培养瓶底部。室温消化。

3)每个T150培养瓶用10－15mL培养液悬浮细胞，吸取0.1mL用台盼蓝溶液稀释2倍计数细胞。

4)用培养液稀释细胞到2.5×10⁵/mL,将稀释好的细胞加入24孔板(800μL/孔,2×10⁵细胞/孔)。置于37℃,5％CO₂培养箱培养过夜。

4.2细胞准备：

1)细胞接种于24孔板16-18小时后，弃去上清。每孔加入600μl的HBSS缓冲液，清洗两遍。

2)吸掉HBSS缓冲液后，再向每孔加入180μl的HBSS缓冲液。

4.3化合物溶液制备、稀释和加样:

1)将化合物粉剂溶解于100％DMSO。然后对化合物以3倍稀释6个点，或10倍稀释2个点，最高起始浓度为50mM。

2)将步骤1)的5ulDMSO溶液转入120μl HBSS缓冲液，稀释25倍。

3)将步骤2)的10μl稀释液加入24孔细胞板，置于37℃,5％CO₂培养箱孵育15分钟。DMSO终浓度为0.2％。细胞对照孔：不加化合物，只含0.2％

DMSO。

4.4检测：

将¹⁴C标记-尿酸溶液稀释加入细胞板，终浓度为50μM。置于37度,5％CO₂培养箱孵育10分钟。弃去上清后，用HBSS缓冲液清洗细胞两遍。向细胞加入0.1M NaOH溶液进行裂解。将细胞裂解液收集于液闪管，加入液闪液后，使用液闪计数仪Tri-Carb读取信号值。

4.5数据处理和分析：

根据发光数据分析化合物对URAT-1抑制效果，计算抑制百分比数据。采用GraphPad Prism软件对抑制百分比(inh﹪)数据进行非线性拟合分析得到

IC₅₀值。实验结果见下表-3：

表-3各实施例对URAT-1抑制效果IC₅₀测试结果

实施例	化合物	IC<sub>50</sub>
			1	(-)-WX001	8.0uM
2	(+)-WX002	>20uM
			3	(±)-WX003	10.36uM
4	(-)-WX004	1.1uM
			5	(+)-WX005	1.4uM
Ref	(±)-Lesinurad	23.97uM

结论：本发明化合物与参考化合物(±)-Lesinurad相比较，具有更好的URAT-1抑制活性。

测试例2：体外评价

1.实验目的

该实验的目的是用LC-UV-MSⁿ(n＝1-2)检测手段来证实一系列化合物在人肝细胞中孵育120分钟后的代谢产物。数据采集后采用MetaboLynx^TM软件对MS和MS²数据进行分析。

2.实验方案

2.1肝细胞孵育体系

2.2样品处理与分析

样品孵育2h后，采用含0.1％甲酸的乙腈进行沉淀蛋白，离心，取出上清在氮气下吹干，复溶后进样分析。

3.实验结果

3.1化合物(-)-WX001的代谢产物鉴定结果见表-4

表-4

代谢产物	保留时间(分)	紫外面积百分含量	代谢途径
				(-)-WX001	9.71	100％	NA

3.2化合物(+)-WX002的代谢产物鉴定结果见表-5

表-5

代谢产物	保留时间(分)	紫外面积百分含量	代谢途径
				(+)-WX002	9.71	100％	NA

3.3化合物(±)-Lesinurad的代谢产物鉴定结果见表-6

表-6

4.实验结论

实验数据表明，在相同的人肝细胞代谢条件下，化合物(±)-Lesinurad产生了4.40％的代谢产物M1，而化合物(-)-WX001和(+)-WX002则检测不到任何代谢产物的生成。相比(±)-Lesinurad，(-)-WX001和(+)-WX002体现了更好的体外肝细胞稳定性。

测试例3：体内评价

1.实验目的

以SD大鼠为受试动物，应用LC/MS/MS法测定大鼠IV(静注)，PO(灌胃)给予(-)-WX001和(+)-WX002后，不同时刻测定血浆中(-)-WX001和(+)-WX002的药物浓度，研究本发明的化合物在大鼠体内的药代动力学行为，评价其药动学特征。

2.实验方案

2.1试验药品

(-)-WX001和(+)-WX002

2.2试验动物

健康成年雄性SD大鼠12只，分成4组(每个化合物各有IV,PO组)，每组3只，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2012-0002。

2.3药物配制

称取适量样品，加入一定量的DMSO超声溶解，再加入20％羟丙基-β-环糊精溶液，制成受试化合物浓度为1mg/mL的5％DMSO/95％20％HPCD澄清溶液用于IV和PO给药。

2.4给药

SD大鼠12只，分成4组，每组3只，雄性，禁食一夜后分别IV，PO给药。

IV剂量为2mg/kg，给药体积为2mL/kg；PO剂量为10mg/kg，给药体积为10mL/kg。

3.实验操作

IV组于给药后0.083,0.25,0.5,1,2,4,6,8,24小时采血约200μL，置于K2-EDTA的抗凝管中，3000rpm离心15分钟，分离血浆，于-80℃保存。PO组于给药后0.25,0.5,1,2,4,6,8,24小时采血，其他操作同IV组。血浆样品经沉淀蛋白预处理后采用LC/MS/MS法测定血药浓度。分析方法的线性范围为4.00-6000nM。

4.药代动力学参数

实验结果表明：(-)-WX001和(+)-WX002以及(±)-Lesinurad在SD-大鼠体内展现了不同的药代动力学表现。在相同剂量，相同方式给药时，相比(+)-WX002，(-)-WX001展现了更低的体内清除率和更高的血浆暴露量，总体药代动力学表现更优。相比(±)-Lesinurad，(-)-WX001也展现了更低的体内清除率和更高的血浆暴露量，总体药代动力学表现也更优。同时，在体内未观察到两个轴手性异构体的相互转化，在循环体系内保持为稳定的单一轴手性异构体。实验结果见下表-7：

表-7各实施例在大鼠体内的药代动力学参数

Claims (21)

1.式(Ⅱ)化合物或其药学上可接受的盐，

2.左旋或右旋的式(Ⅱ)化合物或其药学上可接受的盐，其以单一轴手性异构体形式或富含一种轴手性异构体形式存在，

3.根据权利要求2所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，一种轴手性异构体的含量≥60％。

4.根据权利要求3所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，一种轴手性异构体的含量≥70％。

5.根据权利要求4所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，一种轴手性异构体的含量≥80％。

6.根据权利要求5所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，一种轴手性异构体的含量≥90％。

7.根据权利要求6所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，一种轴手性异构体的含量≥95％。

8.式(Ⅲ)化合物或其药学上可接受的盐，

9.式(Ⅳ)化合物或其药学上可接受的盐，

10.式(Ⅴ)化合物或其药学上可接受的盐，

11.左旋或右旋的式(Ⅴ)化合物或其药学上可接受的盐，其以单一轴手性异构体形式或富含一种轴手性异构体形式存在，

12.根据权利要求11所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，一种轴手性异构体的含量≥60％。

13.根据权利要求12所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，一种轴手性异构体的含量≥70％。

14.根据权利要求13所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，一种轴手性异构体的含量≥80％。

15.根据权利要求14所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，一种轴手性异构体的含量≥90％。

16.根据权利要求15所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，一种轴手性异构体的含量≥95％。

17.式(Ⅵ)化合物或其药学上可接受的盐，

18.式(Ⅶ)化合物或其药学上可接受的盐，

19.一种药物组合物，包括作为活性成分的治疗有效量的根据权利要求1～18任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

20.根据权利要求1～18任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或根据权利要求19所述的组合物在制备治疗尿酸水平异常相关病症的药物上的应用。

21.根据权利要求20所述应用，其中所述病症为高尿酸血症、痛风性关节炎、肾结石、尿路结石或高血压。