CN109475595A - 癌症治疗联合组合物、方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含促黄体生成激素释放激素(LHRH)或LHRH类似物和姜黄素或姜黄素类似物的组合物和配制物。LHRH或LHRH类似物可以与姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合。本发明的组合物和配制物还可包括抗细胞增殖药物。本发明的组合物和配制物可用于抑制细胞的增殖；治疗过度增生性疾病；以及治疗赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤。

Description

癌症治疗联合组合物、方法和用途
相关申请
本申请要求2016年2月12日提交的美国临时专利申请No.62/294,497的优先权，该申请通过引用整体并入本文，包括所有文本、表格、序列表和附图。
引言
胰腺癌是具有毁灭性的恶性肿瘤，开发具有降低的副作用的有效治疗被证明是具有挑战性的。胰腺癌是最致命的人类恶性肿瘤之一，I期5年生存率低于14％，IV期低于1％。由于大多数病例在晚期被诊断出来，因此胰腺癌的治疗选择非常有限且主要是姑息治疗。尽管已经广泛研究了胰腺癌的分子和遗传基础，但治疗选择仍然有限。尽管在胰腺癌发展背后的遗传和分子事件中有重大发现，但在过去几十年中预后基本保持不变。部分原因是由于没有特异性可检测的生物标志物来帮助识别胰腺癌风险增加的患者以及胰腺癌具有高度异源性的事实，使得靶向治疗更加困难。
目前，吉西他滨(2',2'-二氟2'-脱氧胞苷)是首选药物，并且在生活质量方面提供短期改善，对长期存活几乎没有影响。尝试以吉西他滨和5-氟尿嘧啶(5FU)为基础的组合疗法来增加存活率，但是这些疗法通常伴随着毒性增加。虽然尝试了吉西他滨和5FU组合疗法，总体存活率略有改善，但它们也伴有显著的毒性。因此，只有具有良好表现状态的患者才能从这些疗法中受益。
促性腺激素释放激素(GnRH，也称为促黄体生成激素释放激素或LHRH)和LHRH受体(LHRHR)在生殖和几种恶性肿瘤(例如子宫内膜癌，卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌和黑素瘤)中起重要作用。直到最近，LHRH及其同源受体LHRHR在胰腺癌中的作用很少受到关注。
流行病学和动物研究表明，天然化合物可以帮助预防和治疗癌症。这些化合物中的一些在体外和临床前测试中都显示出显著的抗肿瘤活性。姜黄素(curcumin)是存在于姜黄(Curcumin longa)中的二芳基庚烷，并且据报道其在体外对癌细胞具有有效的抗增殖和促凋亡作用。虽然姜黄素在药理学上是安全的，但它在水中的溶解度低，因此生物利用度差，不能静脉内给药。
发明概述
本文公开的研究显示，与促黄体生成激素释放激素(LHRH)缀合的姜黄素的可溶形式(又名LHRH-姜黄素)单独地以及与吉西他滨的组合对胰腺癌细胞系生长具有显著影响。使用三维(3D)高通量测定平台，相比于单独使用姜黄素或LHRH-姜黄素，可溶形式的与LHRH缀合的姜黄素(LHRH-姜黄素)和抗细胞增殖药物吉西他滨(2',2'-二氟2'-脱氧胞苷)对表达LHRH受体(LHRHR)的胰腺癌细胞更有效。LHRH-姜黄素是与吉西他滨联合治疗的理想候选药物。本发明确立了LHRH-受体靶向的姜黄素和抗细胞增殖药物如吉西他滨是针对表达LHRHR的癌症(例如胰腺癌)的可行疗法，并且该组合提供了降低的药物细胞毒性的有效疗法。
根据本发明，提供了LHRH-姜黄素、LHRH-姜黄素类似物、LHRH类似物-姜黄素和/或LHRH类似物-姜黄素类似物缀合物或融合物和一种或多种抗细胞增殖药物的组合物和配制物。在一实施方案中，组合物和配制物包括LHRH或LHRH类似物；和姜黄素或姜黄素类似物，其中LHRH或LHRH类似物与姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合；以及抗细胞增殖药物。
缀合物或融合物中的LHRH类似物包括但不限于：[D-Ala6]-LHRH；[DLys6]-LHRH；[D-Trp6]-LHRH；[Trp6]-LHRH；[D-Phe6]-LHRH；[D-Leu6]-LHRH；[D-Ser(t-Bu)6]-LHRH；[D-His(Bzl)6]-LHRH；[D-Nal(2)6]-LHRH；[Gln8]-LHRH；[His(3-甲基)2]-LHRH；[des-Gly10,D-Ala6]-LHRH乙酰胺；[–Me-Leu7]-LHRH；[des-Gly10,D-His2,D-Trp6,Pro9]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-His(Bzl)6]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-Phe6]-LHRH乙酰胺；[氮杂-Gly10]-LHRH；；[D-Ala6,N-Me-Leu7]-LHRH；[D-His(苄基)6]-LHRH片段3-9乙酰胺；[D-His(Bzl)6]-LHRH片段1-7；[D-His(Bzl)6]-LHRH片段2-9；[D-His(Bzl)6]-LHRH片段4-9；[DHis(Bzl)6]-LHRH片段5-9；[D-pGlu1,DPhe2,D-Trp3,6]-LHRH；[D-Ser4]-LHRH；[D-Trp6]-LHRH-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2；[des-Gly10,D-Ala6]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,12D-His(Bzl)6]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-His2,D-Trp6,Pro9]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-Phe6]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-Ser4,D-His(Bzl)6,Pro9]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-Ser4,D-Trp6,Pro9]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-Trp6,D-Leu7,Pro9]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-Trp6]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-Tyr5,D-Trp6,Pro9]-LHRH乙酰胺；[des-pGlu1]-LHRH；[His(3-甲基)2]-LHRH；[Hyp9]-LHRH；甲酰基-[D-Trp6]-LHRH片段2-10；LHRH片段1-2；LHRH片段1-4；LHRH片段4-10；LHRH片段7-10二盐酸盐；[D-Trp6]-LHRH片段1-6；那法瑞林(SynarelTM)；德舍瑞林；EHWSYGLRPG序列；亮丙瑞林；醋酸亮丙瑞林(LupronTM)；戈舍瑞林(ZoladexTM)；组氨瑞林(SupprelinTM)；曲普瑞林(TrelstarTM)；布舍瑞林(SuprefactTM)；西曲瑞克(CetrotideTM)；加尼瑞克(AntagonTM)；安替肽(Ala-Phe-Ala-Ser-Lys-Lys-Leu-Lys-Pro-Ala)；阿巴瑞克(PlenaxisTM)；替维瑞克(AntarelixTM)；地加瑞克(FirmagonTM)；Nal-Glu(D-2-Nal-p-Chloro-D-Phe-BETA-(3-吡啶基)-D-Ala-Ser-Arg-D-Glu-Leu-Arg-Pro-D-Ala)；或噁拉戈利(NBI-56418)。
LHRH和LHRH类似物包括盐形式，例如钠盐或乙酸盐。LHRH和LHRH类似物还包括D-氨基酸，其氨基酸可以存在于任何残基上。
缀合物或融合物中的姜黄素结构包括但不限于以下结构：
缀合物或融合物中的姜黄素类似物包括但不限于：四氢姜黄素；6-羟基二苯甲酰基甲烷；咖啡酸；3,4-亚甲二氧基肉桂酸；3,4-二甲氧基肉桂酸；肉桂酸；姜油酮；4-(3,4-亚甲二氧苯基)-2-丁酮；4-(对羟基苯基)-3-丁烯-2-酮；4'-羟基苯戊酮；4-13羟基苄基丙酮；4-羟基二苯甲酮；1,5-双(4-二甲基氨基苯基)-1,4-戊二烯-3-酮；4-羟基苯乙醇；4-羟基苯基丙酮酸；3,4-二羟基氢化肉桂酸；2-羟基肉桂酸；3-羟基肉桂酸；4-羟基肉桂酸或丁子香酚。
缀合物或融合物中的姜黄素类似物结构还包括但不限于以下结构：
在本发明的缀合物或融合物中，LHRH或LHRH类似物可通过键与姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合。键的非限制性实例包括共价键，离子键或疏水键。
在本发明的缀合物或融合物中，LHRH或LHRH类似物可通过线性碳链、肽接头或非肽接头与姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合。线性碳链具有1-25个碳，由C1-25表示。代表性的肽接头可具有约1至25个氨基酸残基的长度。包含所述键或接头的氨基酸包括一个或多个A、S或G氨基酸残基。
本发明的组合物和配制物包括药物组合物和配制物。在一些实施方案中，药物组合物或配制物包括缀合物或融合物与一种或多种抗细胞增殖药物的组合物。
在特定方面，抗细胞增殖药物包含抗癌或抗肿瘤药物。在更具体的方面，抗细胞增殖药物包括烷化剂，抗代谢物，植物提取物，植物生物碱，亚硝基脲，激素，核苷类似物或核苷酸类似物。抗细胞增殖药物的具体非限制性实例包括：吉西他滨，5-氟尿嘧啶，环磷酰胺，硫唑嘌呤，环孢菌素A，强的松龙，美法仑，苯丁酸氮芥，氮芥，白消安，氨甲蝶呤，6-巯基嘌呤，硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，AZT，5-氮杂胞苷(5-AZC)，博来霉素，放线菌素D，光神霉素，丝裂霉素C，卡莫司汀，洛莫司汀，司莫司汀，链脲霉素，羟基脲，顺铂，卡铂，奥沙利铂(oxiplatin)，米托坦，甲基苄肼，达卡巴嗪，泰素(紫杉醇)，长春碱，长春新碱，多柔比星，二溴甘露醇，伊立替康，拓扑替康，依托泊苷，替尼泊苷或培美曲塞。
根据本发明，提供了用于减少或抑制细胞增殖的方法和用途。在一实施方案中，方法或用途包括使表达与LHRH或LHRH类似物结合的受体的细胞与融合或缀合至姜黄素或姜黄素类似物的LHRH或LHRH类似物接触；并使所述细胞与抗细胞增殖药物接触。此类方法和用途包括但不限于，在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内细胞与缀合物或融合物和一种或多种抗细胞增殖药物的组合物或配制物的接触。
根据本发明，还提供了治疗过度增殖性疾病的方法和用途。此类方法和用途包括但不限于，使在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内过度增殖细胞与缀合物或融合物和一种或多种抗细胞增殖药物的组合物或配制物接触。在一实施方案中，方法或用途包括使表达与LHRH或LHRH类似物结合的受体的过度增殖性疾病的细胞与激素(LHRH)或LHRH类似物和姜黄素或姜黄素类似物的融合物或缀合物接触；并且将所述过度增殖性疾病的细胞与抗细胞增殖药物接触。所述细胞可以与所述缀合物或融合物和一种或多种抗细胞增殖药物的组合接触或通过单独给药接触，例如通过时间分开接触。
根据本发明，还提供了治疗表达与LHRH或LHRH类似物结合的受体的赘生物(neoplasia)、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的方法和用途。在一实施方案中，方法或用途包括向受试者(例如哺乳动物，例如人)施用与姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合的LHRH或LHRH类似物；以及向所述受试者施用抗细胞增殖药物。这些方法和用途包括但不限于向受试者(例如哺乳动物，例如人)组合施用或单独施用(例如通过时间间隔施用)缀合物或融合物的配制物和一种或多种抗细胞增殖药物。
在一些实施方案中，在施用所述一种或多种抗细胞增殖药物之前施用所述缀合物或融合物，例如与姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合的LHRH或LHRH类似物。在一些实施方案中，所述缀合物或融合物(例如与姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合的LHRH或LHRH类似物)与所述一种或多种抗细胞增殖药物基本上同时施用。
在一些实施方案中，在施用一种或多种抗细胞增殖药物后施用所述缀合物或融合物，例如与姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合的LHRH或LHRH类似物。
与LHRH或LHRH类似物结合的受体包括LHRH-受体。在一些实施方案中，诸如LHRH受体之类的受体可以存在于细胞表面上。
细胞，过度增殖性疾病和赘生物，肿瘤，癌症和恶性肿瘤可全身，区域，或局部地存在或存在于受试者的特定组织或器官中。在一些实施方案中，细胞，过度增殖性疾病，赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤存在于肺，甲状腺，头部或颈部，鼻咽，咽喉，鼻或鼻窦，脑，脊柱，乳房，肾上腺，脑垂体，甲状腺，淋巴，胃肠，口腔，食道，胃，十二指肠，回肠，空肠，小肠，结肠，直肠，泌尿生殖道，子宫，卵巢，宫颈，子宫内膜，膀胱，睾丸，前列腺，肾，胰腺，肝，骨，骨髓，淋巴，血液，皮肤或肌肉。
在一些实施方案中，过度增殖性疾病，赘生物(neoplasia)，肿瘤，癌症和恶性肿瘤可逐渐恶化，或处于缓解期。在一些实施方案中，细胞，过度增殖性疾病或赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤是转移性的。在一些实施方案中，细胞，过度增殖性疾病或赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤包括实体细胞赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤，或淋巴或造血细胞赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤，例如骨髓瘤，淋巴瘤或白血病。
在一些实施方案中，细胞、过度增殖性疾病或赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤包括癌(carcinoma)，肉瘤，淋巴瘤，白血病，腺瘤，腺癌，黑素瘤，神经胶质瘤，成胶质细胞瘤，脑膜瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，星形细胞瘤，少突胶质细胞瘤，间皮瘤，网状内皮赘生物，网状内皮肿瘤，网状内皮癌症或网状内皮恶性肿瘤。
在一些实施方案中，肉瘤包括淋巴肉瘤，脂肪肉瘤，骨肉瘤，软骨肉瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤或纤维肉瘤。
在一些实施方案中，抗细胞增殖药物包括：吉西他滨，5-氟尿嘧啶，环磷酰胺，硫唑嘌呤，环孢菌素A，强的松龙，美法仑，苯丁酸氮芥，氮芥，白消安，氨甲蝶呤，6-巯基嘌呤，硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，AZT，5-氮杂胞苷(5-AZC)，博来霉素，放线菌素D，光神霉素，丝裂霉素C，卡莫司汀，洛莫司汀，司莫司汀，链脲霉素，羟基脲，顺铂，卡铂，奥沙利铂，米托坦，甲基苄肼，达卡巴嗪，泰素(紫杉醇)，长春碱，长春新碱，多柔比星，二溴甘露醇，伊立替康，拓扑替康，依托泊苷，替尼泊苷或培美曲塞。
在一些实施方案中，方法或用途抑制或减少赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤的复发或进展。
在一些实施方案中，方法或用途导致：部分或完全破坏所述赘生物，肿瘤，癌症或恶性细胞团块(mass)，体积，大小或细胞数量；刺激，诱导或增加赘生物，肿瘤，癌症或恶性细胞坏死，裂解或凋亡；减少赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤体积大小，细胞团块；抑制或预防赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤体积，团块，大小或细胞数量的进展或增加；或延长寿命。
在一些实施方案中，方法或用途减少或降低：与所述赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤相关或由其引起的不良症状或并发症的严重性、持续时间或频率，或疼痛，不适，恶心，虚弱或嗜睡。
在一些实施方案中，方法或用途增加受试者的能量，食欲，改善的活动性或心理健康。
在一些实施方案中，细胞，过度增殖性疾病或赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤存在于哺乳动物中。
在一些实施方案中，受试者或哺乳动物是人。在一些实施方案中，受试者或哺乳动物是家畜或农场(牲畜)动物。在一些实施方案中，所述家畜是狗或猫。
在一些实施方案中，将与姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合的LHRH或LHRH类似物和/或抗细胞增殖药物局部，区域或全身施用于受试者或哺乳动物，或施用进入细胞，过度增生性疾病或赘生物，肿瘤，癌症或转移瘤。
在一些实施方案中，本文所述的组合物或配制物、方法或用途包括一种或多种额外的抗细胞增殖药物或免疫增强药物，或施用一种或多种额外的抗细胞增殖药物或免疫增强药物。
在一些实施方案中，额外的抗细胞增殖药物包含抗癌药物或抗肿瘤药物。
在一些实施方案中，额外的抗细胞增殖药物包括烷化剂，抗代谢物，植物提取物，植物生物碱，亚硝基脲，激素，核苷或核苷酸类似物。
在一些实施方案中，额外的抗细胞增殖药物包括吉西他滨，5-氟尿嘧啶，环磷酰胺，硫唑嘌呤，环孢菌素A，强的松龙，美法仑，苯丁酸氮芥，氮芥，白消安，氨甲蝶呤，6-巯基嘌呤，硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，AZT，5-氮杂胞苷(5-AZC)，博来霉素，放线菌素D，光神霉素，丝裂霉素C，卡莫司汀，洛莫司汀，司莫司汀，链脲霉素，羟基脲，顺铂，卡铂，奥沙利铂，米托坦，甲基苄肼，达卡巴嗪，泰素(紫杉醇)，长春碱，长春新碱，多柔比星，二溴甘露醇，伊立替康，拓扑替康，依托泊苷，替尼泊苷或培美曲塞。
附图说明
图1A至图1B显示使用Incucyte平台自动测量球状体生长。
图2A显示用LHRH-姜黄素，单独的姜黄素或DMSO对照剂量依赖性(10μM，20μM和30μM)处理后的Panc-1球状体生长。
图2B显示用LHRH-姜黄素，单独的姜黄素或DMSO对照剂量依赖性(10μM，20μM和30μM)处理后的Mia-PaCa-2球状体生长。
图3显示用单独的LHRH(30μM)或LHRH-姜黄素(30μM)处理后的Panc-1球状体生长。DMSO用作对照。
图4显示用吉西他滨(5μM)，LHRH-姜黄素(30μM)或吉西他滨与LHRH-姜黄素组合处理后的Panc-1球状体生长。DMSO用作对照。
图5A显示用吉西他滨和LHRH-姜黄素处理(120h)的MiaPaca-2球状体的定量。
图5B显示用吉西他滨和LHRH-姜黄素处理(120h)的Panc-1球状体的定量。
图5C显示用吉西他滨和LHRH-姜黄素处理(120h)的AsPC-1球状体的定量。
图6A显示用5FU(2.5μM)，LHRH-姜黄素(10μM)或5FU与LHRH-姜黄素组合处理后的Panc-1球状体生长。DMSO用作对照。
图6B显示用5FU(2.5μM)，LHRH-姜黄素(10μM)或5FU与LHRH-姜黄素组合处理后的Mia-Paca-2球状体生长。DMSO用作对照。
图7A显示用单独的LHRH(30μM)，LHRH-姜黄素(30μM)或单独的姜黄素(30μM)处理后的Panc-1球状体(非靶标对照[NT])生长。DMSO用作对照。
图7B显示用单独的LHRH(30μM)，LHRH-姜黄素(30μM)或单独的姜黄素(30μM)处理后的Panc-1球状体(LHRHR敲低[KD](knock-down))生长。DMSO用作对照。
图8A显示45kD蛋白质的检测具有LHRH受体并且该受体的存在非常低。
图8B显示Western印迹分析证明癌细胞中LHRH受体表达的敲低。
图8C显示癌细胞的细胞表面上LHRH受体的极低表达。
图9A显示用吉西他滨和LHRH-姜黄素处理的MiaPaca-2细胞的Cellomics核定量(Cellomics nuclei quantification)。
图9B显示用吉西他滨和LHRH-姜黄素处理的Panc-1细胞的Cellomics核定量。
图9C显示用吉西他滨和LHRH-姜黄素处理的AsPC-1细胞的Cellomics核定量。
图9D显示用吉西他滨和LHRH-姜黄素处理的BxPC-3细胞的Cellomics核定量。
图10A显示用吉西他滨和LHRH-姜黄素处理(24h)的MiaPaca-2细胞中的凋亡标志物。
图10B显示用吉西他滨和LHRH-姜黄素处理(24h)的Panc-1细胞中的凋亡标志物。
图10C显示用吉西他滨和LHRH-姜黄素处理(24h)的AsPC-1细胞中的凋亡标志物。
图10D显示用吉西他滨和LHRH-姜黄素处理(24h)的BxPC-3细胞中的凋亡标志物。
图11A显示用组合处理(24h)处理的MiaPaca-2细胞中的凋亡标志物。
图11B显示用组合处理(24h)处理的Panc-1细胞中的凋亡标志物。
图11C显示用组合处理(24h)处理的AsPC-1细胞中的凋亡标志物。
图11D显示用组合处理(24h)处理的BxPC-3细胞中的凋亡标志物。
图12A显示用组合处理(72h)处理的MiaPaca-2细胞中的凋亡标志物。
图12B显示用组合处理(72h)处理的Panc-1细胞中的凋亡标志物。
图13A显示用姜黄素和LHRH-姜黄素处理(24h)的Panc-1细胞中凋亡抑制剂XIAP的相对mRNA水平。
图13B显示用姜黄素和LHRH-姜黄素处理(24h)的Panc-1细胞中凋亡抑制剂cIAP1的相对mRNA水平。
图13C显示用姜黄素和LHRH-姜黄素处理(24h)的Panc-1细胞中凋亡抑制剂cIAP2的相对mRNA水平。
图14显示胰腺癌细胞和正常细胞中的LHRH受体表达。
图15显示用低剂量吉西他滨和LHRH-姜黄素治疗期间小鼠体重的变化：每周腹膜内注射(IP)单独的载体(对照)，吉西他滨(50mg/kg，每周一次)，LHRH-姜黄素(20mg/kg，每周两次)或吉西他滨和LHRH-姜黄素的组合治疗SCID/bg小鼠。在肿瘤植入后第20天开始监测小鼠6周。用吉西他滨或LHRH-姜黄素或所述两种化合物的组合对小鼠进行治疗性处理不会对体重或身体状况产生负面影响。
图16显示低剂量吉西他滨/LHRH-姜黄素处理对人胰腺癌细胞Mia-Paca-2的体内作用：每周腹膜内注射(IP)单独的载体(对照)，吉西他滨(50mg/kg，每周一次)，LHRH-姜黄素(20mg/kg，每周两次)或吉西他滨和LHRH-姜黄素的组合处理小鼠。在肿瘤植入后第20天开始监测小鼠5周。在第55天，在尸体剖检时移除植入后肿瘤。来自载体处理的、单独的吉西他滨、单独的LHRH-姜黄素和组合处理的代表性图像显示用吉西他滨和LHRH-姜黄素的组合处理的小鼠中肿瘤大小的明显减少。
图17显示低剂量的吉西他滨/LHRH-姜黄素组合处理在体内防止胰腺癌细胞Mia-Paca-2的生长：接受腹膜内注射单独的载体(对照)，吉西他滨(橙色箭头，50mg/kg，每周一次)，LHRH-姜黄素(灰色箭头，20mg/kg，每周两次)或吉西他滨和LHRH-姜黄素的组合的SCID/bg小鼠的肿瘤体积变化。数据表示为肿瘤体积的平均值±SD(n＝8)。
图18A-18B显示低剂量的吉西他滨/LHRH-姜黄素组合处理在体内防止胰腺癌细胞Mia-Paca-2的生长：图18A，尸检时的肿瘤体积。如所示进行处理。数据表示为肿瘤体积的平均值±SD(n＝8)。单独使用吉西他滨，单独使用LHRH-姜黄素或在组合处理组中，尸检时的肿瘤体积显著降低(**，p<0.025)。重要的是，组合处理组显示出最有效的肿瘤生长减少，显著低于单独的吉西他滨或LHRH-姜黄素(*，p<0.05)。图18B，尸检时的肿瘤重量。数据表示为肿瘤重量的平均值±SD(n＝8)。与对照组(**，p<0.025)相比，并且与单独的吉西他滨或单独的LHRH-姜黄素处理相比(*，p<0.05)，组合处理组显示肿瘤生长显著减少。
图19显示用高剂量吉西他滨和LHRH-姜黄素处理期间小鼠体重的变化：每周腹膜内注射(IP)单独的载体(对照)，吉西他滨(100mg/kg，每周一次)，LHRH-姜黄素(40mg/kg，每周两次)或吉西他滨和LHRH-姜黄素的组合处理SCID/bg小鼠。在肿瘤植入后第20天开始监测小鼠5周。用较高剂量的吉西他滨或LHRH-姜黄素或这两种化合物的组合对小鼠进行治疗性处理不会对体重或身体状况产生负面影响。
图20显示高剂量吉西他滨/LHRH-姜黄素处理对人胰腺癌细胞Mia-Paca-2的体内作用：每周腹膜内注射(IP)单独的载体(对照)，吉西他滨(100mg/kg，每周一次)，LHRH-姜黄素(40mg/kg，每周两次)或吉西他滨和LHRH-姜黄素的组合处理小鼠。在肿瘤植入后第20天开始监测小鼠4周。在第48天，在尸体剖检时取出植入后肿瘤。来自载体处理的、单独的吉西他滨、单独的LHRH-姜黄素和组合处理的代表性图像显示用较高剂量的吉西他滨和LHRH-姜黄素组合处理的小鼠中肿瘤大小的明显减少。
图21显示高剂量的吉西他滨/LHRH-姜黄素组合处理在体内防止胰腺癌细胞Mia-Paca-2的生长：接受腹膜内注射单独的载体(对照)，吉西他滨(橙色箭头，100mg/kg，每周一次)，LHRH-姜黄素(灰色箭头，40mg/kg，每周两次)或吉西他滨和LHRH-姜黄素的组合的SCID/bg小鼠的肿瘤体积变化。数据表示为肿瘤体积的平均值±SD(n＝8)。
图22A-22B显示吉西他滨/LHRH-姜黄素组合处理在体内防止胰腺癌细胞Mia-Paca-2的生长：图22A，尸检时的肿瘤体积。如所示进行处理。数据表示为肿瘤体积的平均值±SD(n＝8)。单独使用吉西他滨，单独使用LHRH-姜黄素或在组合处理组中，尸检时的肿瘤体积显著降低(**，p<0.025)。重要的是，组合处理组显示出最有效的肿瘤生长减少，显著低于单独的吉西他滨或单独的LHRH-姜黄素(*，p<0.05；**，p<0.025)。图22B，尸检时的肿瘤重量。数据表示为肿瘤重量的平均值±SD(n＝8)。与对照组(**，p<0.025)相比，并且与单独的吉西他滨或单独的LHRH-姜黄素处理相比(*，p<0.05；**，p<0.025)，组合处理组显示肿瘤生长显著减少。
图23A-23B显示LHRH-姜黄素对比游离姜黄素的色谱特征：高效液相色谱(HPLC)分析显示游离姜黄素的独特峰(distinctive peak)(图23A)和LHRH标记的姜黄素的独特峰(图23B)。
图24显示来自对照处理的小鼠的肿瘤组织的HPLC分析：在从对照处理的小鼠的肿瘤提取的组织中在16.5-17分钟未检测到明显的峰。
图25显示来自LHRH-姜黄素处理的小鼠的肿瘤组织的HPLC分析：对来自用LHRH-姜黄素每周两次(20mg/kg)处理的四只不同小鼠的肿瘤组织进行HPLC分析。所有样品在约16.5分钟处显示峰，表明所述提取物中存在游离姜黄素。靶标之前的宽峰提示可能的代谢物，其在对照处理的样品中不存在。
图26显示使用IncucyteZoom软件定量细胞增殖/生长：使用在68小时时程期间获得的图像产生百分比(％)汇合。每次处理重复8次用于定量。PATC53是从MD Anderson获得的源自患者的胰腺癌细胞。先前对LHRHR受体表达的分析表明，PATC53具有低水平的LHRHR受体并且需要更高剂量的LHRH-姜黄素以检测对细胞死亡和/或细胞增殖的影响。吉西他滨和LHRH-姜黄素的组合比单独使用的任何药物对细胞增殖抑制具有更大的影响。
图27显示了PATC53胰腺癌细胞球状体的生长。单独使用吉西他滨(1μM)，单独使用LHRH-姜黄素(30μM)和将它们组合用于处理由PATC53细胞形成的球状体。仅使用培养基作为对照。在定量之前使球状体生长80小时。使用更高剂量的LHRH-姜黄素以检测对球状体生长的影响。与任何单独使用的药物相比，吉西他滨和LHRH-姜黄素的组合对球状体生长抑制具有更大的影响。
图28A-28B显示用TGFβ和LHRH-姜黄素处理48小时的PATC53胰腺癌细胞中的定量PCR分析。图28A用TGFβ(100ng/ml)和LHRH-姜黄素(20μM和50μM)处理的癌细胞中参与TGFβ通路的基因的mRNA水平的定量PCR分析。如图所示，细胞分别处理24小时和48小时。GAPDH用作参考。通过LHRH-姜黄素处理下调对TGFβ信号通路重要的基因，包括SMAD3，转录因子SNAI1(Snail)和SNAI2(Slug)和TGFβ受体(TGFBRI和TGFBRII)；图28B参与细胞周期停滞(GADD45)和凋亡抑制(XIAP)的基因也受LHRH-姜黄素处理的影响。
图29显示了PATC53细胞的蛋白质印迹分析。如所述处理PATC53细胞并进行蛋白质印迹以在处理后24小时检测凋亡标记物(切割的PARP)和凋亡抑制剂(XIAP和cIAP2)。肌动蛋白用作加载对照。PATC53细胞在处理早期显示出对吉西他滨和较低剂量的姜黄素和LHRH-姜黄素具有抗性。用姜黄素和LHRH-姜黄素在50μM开始检测凋亡标记物。
图30显示PATC53细胞的蛋白质印迹分析。如所示处理PATC53细胞并进行蛋白质印迹以在处理后48小时检测凋亡标记物(切割的PARP)和凋亡抑制剂(XIAP和cIAP2)。肌动蛋白用作加载对照。在30μM LHRH-姜黄素，检测到凋亡抑制剂的适度减少。结果表明，由于LHRHR的低表达，PATC53对较低剂量LHRH-姜黄素处理具有抗性。
图31是单独的LHRH-姜黄素或其与其他试剂组合的离体(ex vivo)研究的示意图。
图32显示LHRH-姜黄素的离体测试。将来自所示异种移植物的组织切片用LHRH-姜黄素处理72小时，并用PrestoBlue(孵育2小时)测量组织切片的生存力。用学生t检验分析处理组和对照组之间组织切片生存力差异的显著性。如果p<0.05且生存力被抑制至少30％，则组织切片被定义为敏感的。*P<0.05。
图33显示LHRH-姜黄素和吉西他滨的组合。来自指示的异种移植物的组织切片用LHRH-姜黄素(0,3,10和30μM)或10μM吉西他滨(GEM)或所述组合处理72小时，并且用PrestoBlue测量组织切片的生存力(孵育2小时)。用学生t检验分析处理组和对照组之间组织切片生存力差异的显著性。如果p<0.05且生存力被抑制至少30％，则组织切片被定义为敏感的。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.005。
图34显示LHRH-姜黄素和吉西他滨的组合。来自指示的异种移植物的组织切片用LHRH-姜黄素(0,3,10和30μM)或10μM吉西他滨(GEM)或所述组合处理72小时，并且用PrestoBlue测量组织切片的生存力(孵育2小时)。用学生t检验分析处理组和对照组之间组织切片生存力差异的显著性。如果p<0.05且生存力被抑制至少30％，则组织切片被定义为敏感的。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.005。
图35是LHRH-R表达水平的示例说明。使用免疫组织化学染色对PDX TMA进行LHRH-R表达染色。在显微镜下分析染色并用强度评分法评分，0：无染色；1：弱染色；2：中度染色；3：强染色。
发明详述
本发明提供了针对肿瘤生长的有效治疗。将促黄体生成激素释放激素(LHRH)与姜黄素缀合(LHRH-姜黄素)增强水溶性(与天然未缀合的姜黄素相比)，将姜黄素靶向表达促黄体生成激素释放激素受体(LHRHR)的细胞，便于静脉内给药，并保持姜黄素的抗癌活性，同时在较低剂量下提高生物利用度。姜黄素似乎不会在正常(非癌)细胞中诱导细胞凋亡。因此，据信LHRH-姜黄素靶向并诱导表达LHRHR的癌细胞(例如人胰腺癌细胞和其他表达LHRH受体的癌细胞)的凋亡。LHRH十肽(及其类似物)可用于靶向细胞表面受体，使抗癌药物特异性递送至表达LHRH受体的癌细胞，其包括但不限于胰腺，前列腺，乳腺，睾丸，子宫，卵巢和黑色素瘤。
这种靶向治疗对于患有表达LHRHR的肿瘤的早期(例如，原发)、进展(例如，区域)或晚期(转移)阶段的患者将是非常有益的，所述肿瘤为例如胰腺，前列腺，乳房，睾丸，子宫和卵巢肿瘤。LHRH-姜黄素或LHRH-姜黄素类似物将与癌细胞上的膜受体结合并被细胞内化，使癌细胞更易于凋亡。因此，本发明提供LHRH-姜黄素和LHRH-姜黄素类似物缀合物组合物，包括与第二种化学治疗剂的组合物，以及提供预防、治疗或减小早期(例如，原发性)、进展性(例如，区域性)或晚期(转移性)阶段的肿瘤、或癌症的进展、转移或复发的方法。
如本文所用，术语“缀合物”或“融合物”及其语法变体，是指包含衍生自、获得自或分离自、或基于两种彼此不同并且通常不会在自然界中共同存在的分子实体或以其为模板的部分或区段的分子或构建体。换言之，例如，所述缀合物或融合物的一部分包括姜黄素或姜黄素类似物或由姜黄素或姜黄素类似物组成，并且所述构建体的第二部分包括LHRH或LHRH类似物或由LHRH或LHRH类似物组成，所述LHRH或LHRH类似物对LHRHR具有结合亲和力，每个所述结构域在结构上不同。作为两个分子实体的“缀合物”的化合物可以具有直接或通过接头彼此共价键合的两个实体(或部分)。缀合物或融合物的具体非限制性实例是：LHRH-姜黄素，LHRH-姜黄素类似物，LHRH类似物-姜黄素和LHRH类似物-姜黄素类似物。
“受体”如LHRH-受体(表示为“LHRHR”)通常存在于细胞之上(例如，膜受体)或之内。受体可以与细胞膜表面结合或穿过细胞膜。例如，蛋白质受体可以具有穿过细胞膜的跨膜结构域，任选地具有细胞质的或细胞外的或两者的部分。因此，受体包括含有细胞外、跨膜或细胞质部分的全长完整天然受体，以及其截短形式或片段(例如，单独的所述受体的细胞外、跨膜或细胞质部分或子序列，或其组合)。
LHRH-姜黄素缀合物是水溶性的和盐溶性的，并且可以通过静脉内注射或其他途径容易地施用。LHRH-姜黄素缀合物的水溶性本身是令人惊讶的，因为先前使姜黄素衍生物具有水溶性的尝试并不是特别成功。在室温下所述缀合物在盐水(PBS)中的溶解度至少高达1.2mg/50μL(＝24g/L)，尽管尚未研究溶解度的上限。
除姜黄素和LHRH之外，每种组分的类似物也可用于根据本发明的缀合物中。
姜黄素的类似物描述于各种出版物中。例如，姜黄素的类似物描述于“Curcumin:From ancient medicine to current clinical trials,”Cellular andMolecular LifeSciences 2008；65:1631-1652，以及其中的参考文献160,161,162,169和171。参见Aggarwal等，“Curcumin(diferuloylmethane)down-regulates expression of cellproliferation and antiapoptotic and metastaticgene products throughsuppression of I{kappa}B{alpha}kinase and AKTactivation,”Mol Pharmacol 2006；69(1):195-206；美国专利US7,355,081；和公布的PCT申请WO 2008/045534。
公开姜黄素类似物的其他参考文献包括以下：Nakagawa-Goto等，“Antitumoragents.Syntheses and evaluation of dietary antioxidant-taxoid conjugates asnovel cytotoxic agents,”Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters2007；17:5204-5209；Liu,J.；Jiang,F.,“Design,synthesis,and primary evaluation on curcuminderivative as prodrugs of antitumor,”Zhongguo Yaoshi(Wuhan,China)2005；8:543-545；Rieks等，“Preparation of novel curcumin/tetrahydrocurcumin derivatives foruse in cosmetics,pharmaceuticals andfor nutrition,”WO 2004/03112；Rieks等，“Preparation of curcumin esters for use in cosmetics,pharmaceuticals,and foodadditives,”德国专利申请DE10245988A1；Scaramuzzino，G.,“Preparation of nitrateprodrugs able to release nitric oxide in a controlled and selective way andtheir use for prevention and treatment of inflammatory,ischemic andproliferative diseases,”欧洲专利1336602；和Sethi,S.C.；Rao,B.C.S.,“Colorationof vanaspati,”Indian Journal of Technology 1964；2:208。
据报道，姜黄素分子结构的一部分对于姜黄素的至少一些生理作用(去饱和酶抑制)是必需的。因此，与姜黄素分子的一半缀合的LHRH可以是有效的类似物。参见Kawashima等，“Inhibition of rat liver microsomal desaturases by curcumin and relatedcompounds,”Biosci Biotechnol Biochem 1996；60(1):108-10。
LHRH的类似物(激动剂和拮抗剂)都是本领域已知的，并且可以用于实施本发明。参见，例如，“Cancer chemotherapy based on targeting of cytotoxic peptideconjugates to their receptors on tumors,”European Journal of Endocrinology(1999)141:1-14。LHRH的拮抗剂包括，例如，安替肽，布舍瑞林，亮丙瑞林醋酸盐，[D-Ala6]-LHRH，[D-Lys6]-LHRH，[D-Trp6]-LHRH，[Gln8]-LHRH，[His(3-甲基)2]-LHRH，[des-Gly10,D-Ala6]-LHRH乙酰胺，[des-Gly10,D-His2,D-Trp6,Pro9]-LHRH乙酰胺，[des-Gly10,D-His(Bzl)6]-LHRH乙酰胺，和[des-Gly10,D-Phe6]-LHRH乙酰胺。
LHRH类似物的许多实例的代表描述于以下文献中：S.Sealfon等，“Molecularmechanisms of ligand interaction with the gonadotropin-releasing hormonereceptor,”Endocrine Reviews,vol.18,pp.180-205(1997)是一篇综述论文，其中讨论了GnRH十肽中每种氨基酸的明显作用，并对可能在类似物中进行的替代类型提供了广泛的指导。特别参见第184-191页，以及第190页的图8中所示的示意性总结。综述论文，M.Karten等，“Gonadotropin-releasing hormone analog design.Structure-function studiestoward the development of agonists and antagonists:rationale andperspective,”Endocrine Reviews,vol.7,pp.44-66(1986)描述或给出超过2000个GnRH类似物的引用(第44页，第1段)。另一篇综述是S.Sealfon等，“The gonadotrophin-releasinghormone receptor:structural determinants and regulatory control,”HumanReproduction Update,vol.1,pp.216-230(1995)，其提供了GnRH受体结构和受体表达调节的综述。该综述提到已合成并研究了数千种GnRH类似物(第216页)。
另一篇综述文章是M.Filicori，“Gonadotropin-releasing hormone agonists:aguide to use and selection,”Drugs,vol.48,pp.41-58(1994)，其是讨论许多GnRH激动剂的综述，以及可用于制备激动剂的修饰类型的实例。在所提到的实例中，用乙酰胺残基取代所述天然GnRH序列的第十个氨基酸(甘氨酸)；或用其他更亲脂的D-氨基酸(如D-Phe，D-Leu或D-Trp)替代第六个氨基酸残基(甘氨酸)；或将更复杂的氨基酸掺入在第6位，如D-Ser(t-Bu)，D-His(Bzl)或D-Nal(2)；或在第10位，如氮杂-Gly；或在第7位的N-Me-Leu修饰(见第42和43页)。据说这些修饰导致更疏水的化合物比天然GnRH分子更稳定，因此具有更高的受体亲和力和体外效力。此外，据说更疏水的GnRH激动剂对酶降解更具抗性，并且更强地结合血浆蛋白和身体组织，从而减少肾排泄并增加半衰期。该评价还讨论了各种给药途径和给药系统。
更进一步地，P.Conn等人，“Gonadotropin-releasing hormone and itsanalogues,”New Engl.J.Med.,vol.324,pp.93-103(1991)描述了几种GnRH类似物，包括如第95页表1中所示的，类似物曲普瑞林，亮丙瑞林，布舍瑞林，那法瑞林，德舍瑞林和组氨瑞林；和第95页的其他类似物。
A.Nechushtan等，“Adenocarcinoma cells are targeted by the new GnRH-PE66chimeric toxin through specific gonadotropin-releasing hormone bindingsites,”J.Biol.Chem.,vol.298,pp.11597-11603(1997)公开了一种GnRH类似物，其中色氨酸取代甘氨酸作为第六个氨基酸。G.Emons等，“Growth-inhibitory actions ofanalogues of luteinizing hormone releasing hormone on tumor cells,”Trends inEndocrinology and Metabolism,vol.8,pp.355-362(1997)公开了两种人卵巢癌细胞系和两种人子宫内膜癌细胞系的体外增殖被LHRH激动剂曲普瑞林抑制；并且LHRH拮抗剂西曲瑞克也抑制了卵巢和子宫内膜癌细胞系的体外增殖。报道了LHRH类似物对前列腺癌细胞系的抗增殖作用和LHRH激动剂的长期施用(chronic administration)以可逆方式抑制卵巢或睾丸功能。
M.Kovacs等人，“Recovery of pituitary function after treatment with atargeted cytotoxic analog of luteinizing hormone-releasing hormone,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.94,pp.1420-1425(1997)公开了与载体激动剂[D-Lys6]LHRH缀合的多柔比星衍生物，以可逆地(即暂时地)抑制垂体中的促性腺细胞。还报道了该LHRH类似物-毒素缀合物抑制大鼠前列腺肿瘤的生长。
J.Janovick等人，“Gonadotropin releasing hormone agonist provokeshomologous receptor microaggregation:an early event in seven-transmembranereceptor mediated signaling,”Endocrinology,vol.137,pp.3602-3605(1996)公开了使用激动剂D-Lys6-GnRH-和拮抗剂D-pGlu1-D-Phe2-D-Trp3-D-Lys6-GnRH。
C.Albano等人，“Comparison of different doses of gonadotropin-releasinghormone antagonist Cetrorelix during controlled ovarian hyperstimulation,”Fertility and Sterility,vol.67,pp.917-922(1997)报道了用GnRH拮抗剂西曲瑞克进行的研究，以确定用于防止接受辅助生殖技术的控制性超排卵的患者的过早LH激增的最小有效剂量。
L.Maclellan等，“Superstimulation of ovarian follicular growth withFSH,oocyte recovery,and embryo production from Zebu(Bos indicus)calves:Effects of Treatment with a GnRH Agonist or Antagonist,”Theriogenology,vol.49,pp.1317-29(1998)报道了对小牛施用GnRH激动剂(德舍瑞林)或GnRH拮抗剂(西曲瑞克)的研究。
A.Qayum等人，“The effects of gonadotropin releasing hormone analoguesin prostate cancer are mediated through specific tumour receptors,”Br.J.Cancer,vol.62,pp.96-99(1990)报道了GnRH类似物布舍瑞林在前列腺癌中的应用。
A.Cornea等，“Redistribution of Gq/11αin the pituitary gonadotrope inresponse to a gonadotropin-releasing hormone agonist,”Endocrinology,vol.139,pp.397-402(1998)报道了布舍瑞林(一种代谢稳定的GnRH激动剂)的作用。
除上述之外，还有(i)欧洲专利EP0277829；(ii)Genaro G,Lacerda Neto JC,Rosae Silva AA,“LH response(in vivo and in vitro)to an LHRH agonist administeredto domestic male cats,”Arch Physiol Biochem2003；111(3):254-8；(iii)Horvath JE,Bajo AM,Schally AV,Kovacs M,Herbert F,Groot K,“Effects of long-term treatmentwith the luteinizing hormone-releasing hormone(LHRH)agonist Decapeptyl andthe LHRH antagonist Cetrorelix on the levels of pituitary LHRH receptors andtheir mRNA expression in rats,”Proc Natl Acad Sci USA 2002；99(23):15048-53；(iv)Wu TJ,Mani SK,Glucksman MJ,Roberts JL,“Stimulation of luteinizinghormone-releasing hormone(LHRH)gene expression in GT1-7cells by itsmetabolite,LHRH-(1-5),”Endocrinology2005；146(1):280-6。
以下LHRH类似物可商购获得，例如，购自Aldrich：促黄体生成激素释放激素人乙酸盐；促黄体生成激素释放激素鲑鱼；[D-Ala6,N-Me-Leu7]-LH-RH；[D-Ala6]-LH-RH乙酸盐水合物；[D-His(苄基)6]-LH-RH片段3-9乙酰胺三氟乙酸盐；[D-His(Bzl)6]-LH-RH片段1-7；[D-His(Bzl)6]-LH-RH片段2-9；[D-His(Bzl)6]-LH-RH片段4-9乙酰胺三氟乙酸盐；[D-His(Bzl)6]-LH-RH片段5-9乙酰胺三氟乙酸盐；[D-Lys6]-LH-RH；[D-pGlu1,D-Phe2,D-Trp3.6]-LH-RH；[D-Ser4]-LH-RH；[D-Trp6]-LH-RH；[D-Trp6]-LH-RH-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2；[des-Gly10,D-Ala6]-LH-RH乙酰胺乙酸盐水合物；[des-Gly10,D-His(Bzl)6]-LH-RH乙酰胺；[des-Gly10,D-His2,D-Trp6,Pro9]-LH-RH乙酰胺三氟乙酸盐；[des-Gly10,D-Phe6]-LH-RH乙酰胺；[des-Gly10,D-Ser4,D-His(Bzl)6,Pro9]-LH-RH乙酰胺乙酸盐；[des-Gly10,D-Ser4,D-Trp6,Pro9]-LH-RH乙酰胺三氟乙酸盐；[des-Gly10,D-Trp6,D-Leu7,Pro9]-LH-RH乙酰胺三氟乙酸盐；[des-Gly10,D-Trp6]-LH-RH乙酰胺；[des-Gly10,D-Tyr5,D-Trp6,Pro9]-LH-RH乙酰胺三氟乙酸盐；[des-pGlu1]-LH-RH；[His(3-甲基)2]-LH-RH；[Hyp9]-LH-RH；甲酰基-[D-Trp6]-LH-RH片段2-10；LH-RH片段1-2；LH-RH片段1-4；促黄体生成激素释放激素片段4-10；促黄体生成激素释放激素片段7-10二盐酸盐；布舍瑞林；亮丙瑞林醋酸盐；[D-Trp6]-LHRH片段,1-6；和安替肽(Ala-Phe-Ala-Ser-Lys-Lys-Leu-Lys-Pro-Ala)。
因此，本发明包括修饰和变化，例如替代，添加或缺失。因此，包含肽序列的缀合物或融合物可以掺入任何数量的保守或非保守氨基酸替代，只要这种替代不破坏活性(结合)。因此，例如，修饰的LHRH可以保留至少部分LHRH-受体(LHRHR)结合活性。
“保守替代”是通过生物学上、化学上或结构上类似的残基替代一个氨基酸。生物学上相似是指所述替代与生物活性(例如结合活性)相容。结构上相似是指氨基酸具有相似长度的侧链，例如丙氨酸，甘氨酸和丝氨酸，或具有相似的大小，或保持第一、第二或额外的结构域的结构。化学上相似性是指残基具有相同的电荷或者均是亲水的或疏水的。具体实例包括将一个疏水残基(例如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或蛋氨酸)替代另一个，或将一个极性残基替代另一个，例如精氨酸替代赖氨酸，谷氨酸替代天冬氨酸或谷氨酰胺替代天冬酰胺，丝氨酸替代苏氨酸等。可以使用常规测定来确定修饰或变化是否具有活性，例如结合活性。
术语“氨基酸序列”，“蛋白质”，“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，是指通过酰胺键或等同物共价连接的两个或更多个氨基酸或“残基”。氨基酸序列可以通过非天然和非酰胺化学键连接，包括例如通过戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双官能马来酰亚胺或N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)形成的那些。非酰胺键包括，例如，酮亚甲基，氨基亚甲基，烯烃，醚，硫醚等(参见，例如，Spatola in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins,Vol.7,pp 267-357(1983),“Peptide and BackboneModifications,”Marcel Decker,NY)。
缀合物和融合物包括L-氨基酸序列，D-氨基酸序列和具有L-氨基酸和D-氨基酸的混合物的氨基酸序列。第一和第二结构域的氨基酸序列可以是线性或环状结构，与不同的部分(例如，第三，第四，第五，第六，第七等结构域)缀合，形成分子内或分子间二硫键，并且还与相同或不同氨基酸序列或其他分子形成高阶多聚体(higher order multimer)或寡聚体。
缀合物和融合物的示例性长度包括约5至10、10至15、15至20、20至25、25至50、50至100或更多个氨基酸残基。在特定实施方案中，缀合物或融合物具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸残基。
术语“同一性”和“同源性”及其语法变体意指两个或更多个参考实体是相同的。因此，在两个氨基酸序列相同的情况下，它们具有相同的氨基酸序列。“同一性的区，区域或结构域”是指两个或更多个参考实体的一部分是相同的。因此，当两个氨基酸序列在一个或多个序列区域上相同或同源时，它们在这些区域中具有同一性。
可以使用本领域已知的计算机程序和数学算法确定两个序列之间的同一性程度。这种计算序列同一性(同源性)百分比的算法通常解释了比较区域上的序列缺口和错配。例如，BLAST(例如，BLAST 2.0)搜索算法(参见，例如，Altschul等，J.Mol.Biol.215:403(1990)，可通过NCBI公开获得)具有如下示例性搜索参数：错配-2；缺口开放(gap open)5；缺口延伸(gap extension)2。对于多肽序列比较，BLASTP算法通常与评分矩阵组合使用，例如PAM100，PAM 250，BLOSUM 62或BLOSUM 50。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)和SSEARCH序列比较程序也是用于定量同一性的程度(Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)；Pearson，Methods Mol Biol.132:185(2000)；和Smith等，J.Mol.Biol.147:195(1981))。还开发了使用基于Delaunay的拓扑作图定量蛋白质结构相似性的程序(Bostick等，Biochem Biophys Res Commun.304:320(2003))。
可以通过共价键或非共价键形成单个残基和缀合物/融合物。共价键的非限制性实例是酰胺键，非天然和非酰胺化学键，其包括例如戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，双官能马来酰亚胺，N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)或N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)。除酰胺键之外的连接基团包括例如酮亚甲基(例如针对-C(＝O)-NH-的C(＝O)-CH2-)，氨基亚甲基(CH2-NH)，亚乙基，烯烃(CH＝CH)，醚(CH2-O)，硫醚(CH2-S)，四唑(CN4-)，噻唑，逆酰胺(retroamide)，硫代酰胺，或酯(参见，例如，Spatola(1983)在Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins,Vol.7,pp 267-357,“Peptideand Backbone Modifications,”Marcel Decker,NY)。
两个或更多个分子实体可以通过位于所述分子实体之间的间插区域(例如铰链、间隔区或接头)直接连接或分隔。在一实施方案中，两个或更多个分子实体通过氨基酸、肽或非肽铰链、间隔区或接头连接。肽铰链、间隔区或接头序列可以是任何长度，但通常为约1-5、5-10、10-15、10-20、20-25或25-30个氨基酸残基。在特定实施方案中，位于第一和第二结构域之间的肽铰链、间隔区或接头是1至25个L-或D-氨基酸残基，或1至6个L-或D-氨基酸残基。包含在位于两个或更多个分子实体之间的序列中的特定氨基酸残基包括一个或多个或C、A、S或G氨基酸残基。位于两个或更多个分子实体之间的肽的具体非限制性实例包括在以下之内的或如下所示的序列：GSGGS，ASAAS或CCCCCC。
在另一实施方案中，两个或更多个分子实体通过碳链连接，所述碳链可以表示为C1、C2、C3、C4、C4、C5、C6等，其中下标表示所述碳链中的碳原子数。多碳链包括羧酸(例如二羧酸)，例如戊二酸，琥珀酸和己二酸。
氨基酸和肽的衍生物可位于所述两个或更多个分子实体之间。氨基酸衍生物的具体非限制性实例是赖氨酸衍生物，或6个碳接头，例如α-氨基-己酸。
缀合物和融合物可含有非天然结构组分的任何组合，其通常来自三个结构基团：a)除天然酰胺键(“肽键”)连接基团之外的残基连接基团；b)代替天然氨基酸残基的非天然残基；或c)诱导二级结构模拟的残基，即诱导或稳定二级结构。缀合物和融合物包括环状结构，例如在所述分子的氨基和羧基末端之间的末端-末端酰胺键或分子内或分子间二硫键。缀合物和融合物可以在体外或体内被修饰，例如，翻译后修饰以包括例如糖或碳水化合物残基，磷酸基团，脂肪酸，脂质等。
可以使用本领域已知的方法产生和分离氨基酸序列、蛋白质、多肽、肽和肽模拟物。肽可以使用本领域已知的化学方法全部或部分合成(参见，例如，Caruthers(1980).Nucleic Acids Res.Symp.Ser.215；Horn(1980)；和Banga,A.K.,Therapeutic Peptides and Proteins,Formulation,Processing and Delivery Systems(1995)TechnomicPublishing Co.,Lancaster,PA)。肽合成可以使用各种固相技术进行(参见，例如，RobergeScience 269:202(1995)；Merrifield,Methods Enzymol.289:3(1997))，并且可以实现自动合成，例如，使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)按照制造商的说明进行操作。肽和肽模拟物也可以使用组合方法合成。合成的残基和掺入多肽的模拟物可以使用本领域已知的各种程序和方法合成(参见，例如，Organic Syntheses Collective Volumes,Gilman,etal.(Eds)John Wiley&Sons,Inc.,NY)。修饰的肽可以通过化学修饰方法产生(参见，例如，Belousov,Nucleic Acids Res.25:3440(1997)；Frenkel,Free Radic.Biol.Med.19:373(1995)；和Blommers,Biochemistry 33:7886(1994)。
缀合物和融合物包括分离和纯化的形式。当用作本发明组合物的改性剂时，术语“分离的”是指该组合物通过人工制备或基本上完全或至少部分地从天然存在的体内环境分离。通常，分离的组合物基本上不含一种或多种通常天然结合一种或多种蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜的物质。术语“分离的”不排除所述组合物的替代物理形式，例如多聚体/寡聚体，变体，修饰或衍生形式，或由人工产生的宿主细胞中表达的形式。术语“分离的”也不排除其中存在组合的形式(例如，药物配制物以及缀合物和融合物彼此或与其他组合物的组合)，其中任何一种都是由人工制备的。
“分离的”组合物也可以在不含与其通常天然结合的一些、大量、大部分或全部物质时被“纯化”。因此，也基本上纯的分离的缀合物或融合物不包括存在于数百万其他序列中的多肽或多核苷酸，例如蛋白质文库的蛋白质或基因组或cDNA文库中的核酸。“纯化的”组合物可以与一种或多种其他分子组合。
根据本发明，在组合的组合物中提供了缀合物或融合混合物。在一实施方案中，混合物包括一种或多种缀合物或融合物和抗细胞增殖、抗肿瘤、抗癌或抗肿瘤治疗剂或药剂。代表性的非限制性组合包括吉西他滨，例如LHRH-姜黄素和吉西他滨。在另一实施方案中，混合物包括药学上可接受的载体或赋形剂。组合的其他非限制性实例包括一种或多种缀合物或融合物与一种或多种抗细胞增殖剂、抗肿瘤剂、抗癌剂或抗肿瘤治疗剂或药剂，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的缀合物和融合物可用于靶向细胞以进行裂解，细胞死亡或凋亡。可以选择性地靶向这些细胞。例如，表达受体的细胞可以通过缀合物/融合物被靶向，从而与不可检测地表达或表达较少所述受体的细胞相比，优先被杀死。
根据本发明，提供了减少或抑制细胞增殖的方法，以及减少或抑制细胞增殖的方法。在一实施方案中，方法包括使细胞与足以减少或抑制细胞增殖的量的缀合物或融合物接触。在另一实施方案中，方法包括使细胞与足以减少或抑制细胞增殖的量的缀合物或融合物接触。
还提供了减少或抑制过度增殖细胞的增殖的方法，以及减少或抑制过度增殖细胞的增殖的方法。在一实施方案中，方法包括使过度增殖细胞或过度增殖细胞与足以减少或抑制增殖的量的缀合物或融合物接触。
进一步提供了减少或抑制非转移性或转移性赘生物，癌症，肿瘤和恶性肿瘤细胞增殖的方法。在一实施方案中，方法包括使赘生物，癌症，肿瘤或恶性肿瘤细胞与足以减少或抑制细胞增殖的量的缀合物或融合物接触。
另外提供了选择性地减少或抑制表达受体(例如LHRHR)的细胞(例如过度增殖细胞)增殖的方法。在一实施方案中，方法包括使细胞与足以减少或抑制细胞(例如，过度增殖细胞)增殖的量的缀合物或融合物接触，其中所述缀合物或融合物与由所述细胞表达的所述受体(例如LHRHR)结合。
术语“接触”是指两个或更多个实体之间(例如，缀合物或融合物与细胞之间)的直接或间接结合或相互作用。如本文所用的接触包括在溶液中，在固相中，体外，离体，在细胞中和体内。体内接触可称为施用或给药。
靶细胞包括表达结合LHRH和/或LHRH类似物的受体的细胞。实例包括促黄体生成激素释放激素受体。
本发明的缀合物和融合物以及方法也适用于治疗不希望的或异常的细胞增殖和过度增殖性疾病。因此，根据本发明，提供了治疗不希望的或异常的细胞增殖和过度增殖性疾病的方法。在一实施方案中，方法包括向(需要治疗)受试者施用足以治疗不希望的或异常细胞增殖或过度增殖性疾病的量的缀合物或融合物。
术语“过度增殖性疾病”是指任何不期望的或异常的细胞存活(例如，未经历程序性细胞死亡或凋亡)，生长或增殖。此类疾病包括良性增生，非转移性和转移性赘生物，癌症，肿瘤和恶性肿瘤。不希望的或异常的细胞增殖和过度增殖性疾病可以影响受试者中的任何细胞，组织，器官。不希望的或异常的细胞增殖和过度增殖性疾病可以局部、区域或全身存在于受试者中。过度增生性疾病可由多种组织和器官引起，包括但不限于乳腺，肺(例如，小细胞或非小细胞)，甲状腺，头部和颈部，脑，鼻咽，咽喉，鼻或鼻窦，淋巴，肾上腺，脑垂体，甲状腺，淋巴，胃肠道(口腔，食道，胃，十二指肠，回肠，空肠(小肠)，结肠，直肠)，生殖泌尿道(子宫，卵巢，阴道宫颈，子宫内膜，输卵管，膀胱，睾丸，阴茎，前列腺)，肾脏，胰腺，肝脏，骨骼，骨髓，淋巴，血液，肌肉，皮肤和干细胞，其可能会或可能不会转移到其他次级部位，区域或位置。
本发明的缀合物和融合物以及方法也适用于任何细胞、器官或组织来源的转移性或非转移性肿瘤，癌症，恶性肿瘤或赘生物。此类疾病实际上可影响任何细胞或组织类型，例如癌(carcinoma)，肉瘤，黑素瘤，神经和网状内皮细胞或造血细胞肿瘤病症(例如，骨髓瘤，淋巴瘤或白血病)。
术语“赘生物”和“肿瘤”是指细胞或细胞群，其生长、增殖或存活大于正常对应细胞的生长、增殖或存活，例如细胞增殖或分化障碍。肿瘤是一种形成明显块状或生长的赘生物。“癌症”或“恶性肿瘤”是指可侵入相邻空间、组织或器官的赘生物或肿瘤。“转移”是指已经从其主要部位传播或扩散到受试者内的一个或多个次级部位，位置或区域的赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤，其中所述部位，位置或区域不同于原发性肿瘤或癌症。
赘生物，肿瘤，癌症和恶性肿瘤细胞(转移性或非转移性)包括休眠或残留的赘生物，肿瘤，癌症和恶性肿瘤细胞。此类细胞通常由不分裂(G0-G1停滞)的残余肿瘤细胞组成。这些细胞可以作为最小残留疾病存在于原发部位或已传播的赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤细胞。这些休眠的赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤细胞保持无症状，但一旦这些细胞增殖就会出现严重的症状和死亡。本发明的共轭物和融合物和方法可用于减少或抑制休眠的赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤细胞的增殖，其反过来可抑制或减少肿瘤或癌症复发，或肿瘤或癌症转移或进展。
根据本发明，提供了治疗患有转移性或非转移性肿瘤，癌症，恶性肿瘤或赘生物的受试者的方法。在一实施方案中，方法包括向(需要治疗)受试者施用足以治疗(例如，减少或抑制增殖)转移性或非转移性肿瘤，癌症，恶性肿瘤或赘生物的量的缀合物或融合物。
转移性或非转移性肿瘤，癌症，恶性肿瘤或赘生物可处于任何阶段，例如早期或晚期，例如I，II，III，IV或V期肿瘤。转移性或非转移性肿瘤，癌症，恶性肿瘤或赘生物可能已经过预先治疗或稳定(未进展)或缓解。
就转移性肿瘤而言，本发明的缀合物，融合物和方法可用于减少或抑制原发性肿瘤或癌症向其他部位的转移，或在远离原发性肿瘤或癌症的其他部位形成或建立转移性肿瘤或癌症，从而抑制或减少肿瘤或癌症复发或肿瘤或癌症进展。因此，本发明的缀合物，融合方法尤其包括1)减少或抑制潜在或确实发生转移的肿瘤或癌细胞的生长，增殖，迁移或侵袭性(例如，播散性肿瘤细胞，DTC)；2)减少或抑制由原发性肿瘤或癌症引起的转移性肿瘤的形成或建立到与原发性肿瘤或癌症不同的一个或多个其他部位，位置或区域；3)减少或抑制在已形成或已建立转移性肿瘤后在与原发性肿瘤或癌症不同的一个或多个其他部位、位置或区域处转移瘤的生长或增殖；以及4)减少或抑制在已形成或建立转移瘤后其他转移瘤的形成或建立。
转移性或非转移性肿瘤，癌症，恶性肿瘤或赘生物的细胞可以在“实体”细胞团中聚集或分散或扩散。“实体”肿瘤是指通常聚集在一起并形成肿块的癌症，赘生物或转移瘤。具体的非限制性实例包括内脏肿瘤，例如黑素瘤，乳腺癌，胰腺癌，子宫癌和卵巢癌，睾丸癌(包括精原细胞瘤)，胃癌或结肠癌，肝癌，肾上腺癌，肾癌和膀胱癌，肺癌，头颈癌和脑肿瘤/癌症。
涉及上皮或内分泌组织恶性肿瘤的癌(carcinoma)包括呼吸系统癌，胃肠系统癌，泌尿生殖系统癌，睾丸癌，乳腺癌，前列腺癌，内分泌系统癌和黑素瘤。示例性癌包括由子宫，子宫颈，肺，前列腺，乳房，头颈部，结肠，胰腺，睾丸，肾上腺，肾，食道，胃，肝和卵巢形成的癌。该术语还包括癌肉瘤，例如，其包括由癌组织和肉瘤组织组成的恶性肿瘤。腺癌包括腺体组织的癌，或其中肿瘤形成腺体样结构。
肉瘤是指间充质细胞来源的恶性肿瘤。示例性肉瘤包括例如淋巴肉瘤，脂肪肉瘤，骨肉瘤，软骨肉瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤和纤维肉瘤。
神经赘生物(neoplasia)包括神经胶质瘤，胶质母细胞瘤，脑膜瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤。
“液体肿瘤”是指在自然界中分散或弥散的赘生物，因为它们通常不形成实体肿块。具体实例包括网状内皮细胞或造血系统的赘生物，例如淋巴瘤，骨髓瘤和白血病。白血病的非限制性实例包括急性和慢性淋巴细胞，髓系细胞(myeolblastic)和多发性骨髓瘤。通常，这些疾病起因于分化不良的急性白血病，例如成红细胞白血病和急性巨核细胞白血病。特定的骨髓疾病包括但不限于急性早幼粒细胞白血病(APML)，急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)。淋巴系统恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)，其包括B系ALL和T系ALL，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，幼淋巴细胞白血病(PLL)，毛细胞白血病(HLL)和华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)(WM)。特异性恶性淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤和变异体，外周T细胞淋巴瘤，成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)，霍奇金病和Reed-Sternberg疾病。
具有抗细胞增殖活性或作用的任何组合物，治疗，治疗计划(protocol)，疗法或给药方案可以与缀合物/融合物组合或在本发明的方法中组合使用。因此，本发明的缀合物，融合物和方法包括抗细胞增殖，抗肿瘤，抗癌，抗赘生物和抗转移瘤治疗，治疗计划和疗法，其包括任何其他组合物、治疗、治疗计划或治疗方案，所述任何其他组合物、治疗、治疗计划或治疗方案体外或体内抑制，减少，阻碍，减缓，减少或预防过度增殖性疾病，例如肿瘤，癌症，恶性肿瘤或赘生物生长，进展，转移，增殖或存活，或恶化。抗细胞增殖(例如肿瘤)疗法的具体非限制性实例包括化学疗法，免疫疗法，放射疗法(电离或化学疗法)，局部热疗(高热疗法)，手术切除和疫苗接种。缀合物或融合物可以在施用抗细胞增殖、抗赘生物、抗肿瘤、抗癌、抗转移瘤或免疫增强治疗或疗法之前，基本上同时或之后施用。缀合物或融合物可以作为与抗细胞增殖、抗赘生物、抗肿瘤、抗癌、抗转移瘤或免疫增强治疗或疗法、转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物的组合组合物施用。
抗细胞增殖，抗赘生物，抗肿瘤，抗癌和抗转移瘤组合物，疗法，治疗计划或治疗包括预防，破坏，中断，抑制或延迟细胞周期进展或细胞增殖的那些；刺激或增强细胞凋亡或细胞死亡，抑制核酸或蛋白质合成或代谢，抑制细胞分裂，或降低、减少或抑制细胞存活，或生产或利用必需的细胞存活因子，生长因子或信号通路(细胞外或细胞内)。具有抗细胞增殖，抗赘生物，抗肿瘤，抗癌和抗转移瘤活性的化学试剂类别的非限制性实例包括烷化剂，抗代谢物，植物提取物，植物生物碱，亚硝基脲，激素，核苷和核苷酸类似物。
本发明的缀合物，融合物和方法，例如治疗方法，可以为受试者提供可检测的或可测量的治疗益处或改善。治疗益处或改善是对受试者的任何可测量或可检测的、客观的或主观的、短暂的、暂时的或长期的益处，或对在受试者的组织、器官、细胞或细胞群中病症，障碍或疾病，不良症状，后果或根本病因的任何程度的改善。治疗益处和改善包括但不限于减少或降低与障碍、疾病或病症相关的或者与所述障碍、疾病或病症的根本病因或后果相关的一种或多种症状或并发症的发生、频率、严重性、进展或持续时间。因此，本发明的缀合物，融合物和方法包括为受试者提供治疗益处或改善。
在本发明的方法中，其中治疗益处或改善是期望的结果，缀合物/融合物可以以足够或有效的量施用于有此需要的受试者。“足够量”或“有效量”是指这样的数量，其通常与一种或多种其他组合物(治疗剂，例如化学治疗剂或免疫刺激性药物)、治疗、治疗计划或治疗方案药剂组合，以单剂量或多剂量提供，预期提供任何持续时间(长期或短期)的可检测反应，任何可测量或可检测程度的受试者的期望结果或益处，或持续任何持续时间(例如，数小时，数日，数月，数年或治愈)。通常预期用于治疗(例如，提供治疗益处或改善)的剂量或“足够量”或“有效量”在可测量的程度上有效减轻障碍、疾病或病症，或所述障碍、疾病或病症的一种、多种或所有不良症状、后果，尽管减少或抑制所述障碍、疾病或病症或症状的进展或恶化被认为是令人满意的结果。
术语“减轻”意指受试者病症中的可检测的客观或主观改善。可检测的改善包括主观或客观地减少由障碍、疾病或病症引起或与之相关的症状的发生、频率、严重程度、进展或持续时间，根本病因或所述障碍、疾病或病症的后果的改善，或所述障碍、疾病或病症的逆转。
因此，治疗可以导致抑制、减少或预防障碍、疾病或病症，或相关的症状或后果，或根本病因；抑制、减少或预防障碍、疾病、病症、症状或后果或根本病因的进展或恶化；或所述障碍、疾病或症状中的一种或多种其他症状的进一步恶化或发生。因此，成功的治疗结果导致“治疗效果”或“益处”或抑制、减少或预防受试者的病症、障碍、疾病或症状的发生，频率，严重性，进展，或一种或多种症状的持续时间或根本病因或后果。因此认为影响所述病症、障碍、疾病或症状的一种或多种根本病因的治疗方法是有益的。稳定或抑制障碍或病症的进展或恶化也是成功的治疗结果。
治疗益处或改善不需要完全消除与所述病症、障碍或疾病相关的任何一种、大多数或所有症状、并发症、后果或根本病因。因此，当在短或长时间(数小时，数天，数周，数月等)内受试者的病症逐渐改善，或者部分减少所述障碍或疾病的一种或多种相关的不良症状或并发症或后果或根本病因的发生、频率、严重程度、进展或持续时间，或抑制或逆转所述障碍或疾病的一种或多种相关的不良症状或并发症或后果或根本病因，部分减少所述障碍或疾病的一种或多种生理、生化或细胞表现或特征的恶化或进展(例如，稳定所述病症、障碍或疾病的一种或多种症状或并发症)时，可以获得满意的终点。
在特定实施方案中，治疗方法导致转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物细胞团块，体积，大小或细胞数量的部分或完全破坏；导致刺激、诱导或增加转移性或非转移性肿瘤，癌症，恶性肿瘤或赘生物细胞坏死，裂解或凋亡；导致减少转移性或非转移性肿瘤，癌症，恶性肿瘤或赘生物体积，大小，细胞团块；导致抑制或预防转移性或非转移性肿瘤，癌症，恶性肿瘤或赘生物体积，团块，大小或细胞数量的进展或增加；导致抑制或减少过度增殖细胞(例如，转移瘤)向受试者的其他(次级)部位，区域，组织或器官的扩散或传播，或抑制或减少在受试者的其他(次级)部位、区域、组织或器官建立过度增殖细胞(例如，转移瘤)；或导致延长受试者的寿命。在额外的具体实施方案中，治疗方法导致减少或降低与转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物相关或由其引起的不良症状或并发症的严重性、持续时间或频率。
足够量或有效量可以但不必在单次给药中提供，并且可以但不必与另一种组合物(例如化学治疗剂或药剂)、治疗、治疗计划或治疗方案组合给药。例如，根据受试者的需要，所治疗的所述障碍、疾病或病症的状态或治疗的副作用所指示的，该量可以按比例增加。此外，如果以单剂量或多剂量给予而没有第二种组合物(例如，化学治疗剂)、治疗、治疗计划或治疗方案，则足够量或有效量不必足够或有效，因为可以包括高于和超过这样的剂量的额外的剂量、量或持续时间，或者其他组合物(例如，化学治疗剂)、治疗、治疗计划或治疗方案，以便被认为在给定受试者中是有效的或足够的。认为足够的量还包括导致减少使用另一种治疗、治疗方案或治疗计划的量。
足够量或有效量不需要在经处理、预防或治疗的每个受试者中有效，也不需要在给定组或群体中的大多数治疗受试者中有效。通常对于处理或治疗方法，一些受试者对给定的处理、治疗方案或治疗计划表现出更大或更小的反应。足够量或有效量是指特定受试者，而不是群体或一般群体的充分性或有效性。这样的量将部分取决于所治疗的病症，例如不希望的或异常的细胞增殖或过度增殖性疾病(例如，转移性或非转移性肿瘤，癌症，恶性肿瘤或赘生物)的类型或阶段，所需的治疗效果，以及个体受试者(例如，受试者内的生物利用度，性别，年龄等)。
对不希望的或异常的细胞增殖(例如过度增殖性病症(例如，转移性或非转移性肿瘤，癌症，恶性肿瘤或赘生物))的治疗益处或改善的特定非限制性实例，包括细胞大小、团块或体积的减少，抑制细胞大小、团块或体积的增加，减缓或抑制恶化或进展，刺激细胞坏死、裂解或凋亡，减少或抑制赘生物或肿瘤恶性肿瘤或转移瘤，降低死亡率和延长受试者的寿命。因此，抑制或延迟细胞大小、团块、体积或转移(稳定)的增加可以延长寿命(降低死亡率)，即使仅仅几天、几周或几个月，即使完全消融转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物尚未发生。与可以减少或降低的过度增殖性疾病(例如，转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物)相关的不良症状和并发症包括例如疼痛，恶心，不适，食欲不振，嗜睡和虚弱。因此，不期望的或异常细胞增殖(例如过度增殖性疾病(例如，转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物))症状的发生、频率、严重程度、进展或持续时间的减少，例如主观感觉的改善(例如，增加的能量，食欲，减少的恶心，改善的活动性或心理健康等)是治疗益处或改善的所有实例。
例如，如果给药导致治疗不希望的或异常的细胞增殖(例如过度增殖性疾病(例如，转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物))需要较少的化学治疗药物、放射疗法或免疫疗法，则认为足够或有效量的缀合物或融合物具有治疗效果。
术语“受试者”是指动物，通常是哺乳动物，例如人，非人灵长类动物(猿，长臂猿，黑猩猩，猩猩，猕猴)，家畜(狗和猫)，农场动物(马，牛，山羊，绵羊，猪)和实验动物(小鼠，大鼠，兔，豚鼠)。受试者包括动物疾病模型，例如，不希望的或异常的细胞增殖的动物模型，例如过度增殖性疾病(例如，转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物)，用于分析体内的缀合物和融合物。
适于治疗的受试者包括具有转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物细胞或具有其风险的受试者，那些正在接受或正在经历或经历过抗细胞的受试者。
增殖(例如，转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物)疗法，包括肿瘤处于缓解期的受试者。“有风险”受试者通常具有与不希望的或异常的细胞增殖、增生(例如，肿瘤)的发展相关的风险因子。
具有风险或候选受试者的具体实例包括具有表达可结合缀合物或融合物的受体、配体、抗原或抗体的细胞的那些受试者，特别是其中靶向坏死、裂解、杀死或破坏的细胞与非靶细胞相比表达更多数量或量的受体、配体、抗原或抗体。这些细胞可以选择性地或优先地靶向坏死、裂解或杀死。
处于风险中的受试者还包括那些候选者和经历过手术切除，化学疗法，免疫疗法，电离或化学放射疗法，局部或区域热(高热)疗法或疫苗接种的那些受试者。因此，本发明适用于治疗具有转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物或与转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物相关的并发症风险的受试者，例如，归因于在一段稳定或缓解期后转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物再现或再生。
风险因素包括性别，生活方式(饮食，吸烟)，职业(医疗和临床人员，农业和畜牧工人)，环境因素(致癌物暴露)，家族史(自身免疫性疾病，糖尿病等)，遗传倾向等。例如，患有黑色素瘤风险的受试者包括过量的阳光照射(紫外线照射)，白皙的皮肤，大量的痣(发育不良的痣)，患者的表型，家族史或既往黑素瘤的病史。因此，可以通过生活方式，职业，环境因素，家族史和肿瘤相关基因的遗传筛选，基因缺失或基因突变来鉴定具有患癌症风险的受试者。例如，有患乳腺癌风险的受试者缺乏Brca1。具有患结肠癌风险的受试者具有早期或高频息肉形成，或缺失或突变的肿瘤抑制基因，例如腺瘤性结肠息肉病(APC)。
受试者还包括那些被排除在其他治疗之外的受试者。例如，一些受试者可能不是手术切除、化学疗法、免疫疗法、电离或化学放疗、局部或区域热(高热)疗法或疫苗接种的良好候选者。因此，根据本发明的用于治疗的候选受试者包括那些不是手术切除、化疗、免疫疗法、电离或化学放射疗法、局部或区域热(高热)疗法或疫苗接种的候选受试者。
缀合物和融合物可以配制成单位剂量或单位剂型。在一具体实施方案中，融合物与抗细胞增殖药物(例如吉西他滨)组合，所述融合物的量可有效地治疗患有不希望的或异常的细胞增殖或过度增殖性疾病的受试者。在额外的具体实施方案中，缀合物或融合物与抗细胞增殖药物(例如吉西他滨)组合，所述缀合物或融合物的量可有效地治疗患有转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物的受试者。缀合物和融合物(例如，LHRH-姜黄素，LHRH-姜黄素类似物，LHRH类似物-姜黄素和LHRH类似物-姜黄素类似物)和/或抗细胞增殖药物(例如吉西他滨)的示例性单位剂量范围为约25-250、250-500、500-1000、1000-2500或2500-5000、5000-25,000、5000-50,000ng；约25-250、250-500、500-1000、1000-2500或2500-5000、5000-25,000、5000-50,000μg。
可以在体外、离体(ex vivo)或体内接触或提供本发明的组合物和方法。可施用组合物以提供单剂量或多剂量的预期效果，例如，以有效或足量的量提供。缀合物/融合物和/或抗细胞增殖药物(例如，吉西他滨)的示例性剂量范围为在同一天、连续几天、或隔日(alternating days)或间歇地约25-250、250-500、500-1000、1000-2500或2500-5000、5000-25,000、5000-50,000pg/kg；约50-500、500-5000、5000-25,000或25,000-50,000ng/kg；和约25-250、250-500、500-1000、1000-2500或2500-5000、5000-25,000、5000-50,000μg/kg。单剂量或多剂量可以在同一天，连续几天，隔日或间歇给药。
可以通过任何途径经由全身、区域或局部施用来施用组合物并且可以实施方法。例如，缀合物或融合物可全身给药，区域给药或局部给药，静脉内给药，口服给药(例如摄入或吸入)，肌肉内，腹膜内，皮内，皮下，腔内，颅内，透皮(局部)，肠胃外，例如透粘膜给药或直肠给药。经粘膜或直肠。包括药物配制物的本发明组合物和方法可以通过(微)包封的递送系统给药或包装到植入物中用于给药。
本发明进一步提供缀合物或融合物和方法，其中缀合物或融合物包含在药物组合物中。药物组合物是指“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”载体，稀释剂或赋形剂。如本文所用，术语“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”，当涉及载体，稀释剂或赋形剂时，包括溶剂(水性或非水性)，去垢剂(detergent)，溶液，乳液，分散介质，包衣，等渗和吸收促进或延迟剂，其与药物给药以及所述配制物的其它组分相容。这些配制物可以包含在片剂(包衣或未包衣)，胶囊(硬或软)，微珠，乳液，粉末，颗粒，晶体，悬浮液，糖浆或酏剂(elixir)中。
可以配制药物组合物以与特定的给药途径相容。用于肠胃外，皮内或皮下施用的组合物可包括无菌稀释剂，例如水、盐溶液、固定油(fixedoil)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。所述配制物可以含有一种或多种防腐剂，以防止微生物的生长(例如，抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐和调节渗透压的药剂，如氯化钠或右旋糖)。
用于注射的药物组合物包括无菌(例如含水的)溶液(水溶性的)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水，抑菌水，Cremophor EL TM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和聚乙二醇)及其合适的混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂之类的涂层，或通过使用表面活性剂，可以保持流动性。抗细菌剂和抗真菌剂包括例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸和硫柳汞。包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶可以延长可注射组合物的吸收。
可以将根据本发明的缀合物或融合物配制成药学上可接受的盐。盐包括但不限于与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸，草酸或酒石酸)形成的酸加成盐。盐还包括由无机碱和有机碱形成的那些，所述无机碱为例如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙或氢氧化铁，所述有机碱为例如异丙胺，三甲胺，组氨酸，普鲁卡因等。
额外的药物配制物和递送系统是本领域已知的并且适用于本发明的方法(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA；The Merck Index(1996)12th ed.,Merck Publishing Group,Whitehouse,NJ；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms,Technonic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,Pa.,(1993)；和Poznansky,等,Drug Delivery Systems,R.L.Juliano,ed.,Oxford,N.Y.(1980),pp.253-315)。
本发明提供了试剂盒，其包括本发明的被包装在合适的包装材料中的缀合物和融合物，其组合组合物和药物配制物。试剂盒任选地包括标签或包装插页，其包括其中组分的体外、体内或离体使用的组分或说明书的描述。示例性说明书包括用于减少或抑制细胞增殖，减少或抑制不期望或异常细胞(例如过度增殖细胞)增殖，减少或抑制转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物细胞的增殖，治疗具有过度增殖性疾病的受试者，治疗患有转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生物的受试者的说明书。
试剂盒可含有这些组分的集合，例如缀合物或融合物和抗细胞增殖药物(例如吉西他滨)，或两种或更多种缀合物和融合物单独或与另一种治疗上有用的组合物(例如，抗细胞增殖药物)组合。
术语“包装材料”是指容纳试剂盒组分的物理结构。包装材料可以无菌地保持所述组分，并且可以由通常用于这种目的的材料(例如纸，瓦楞纤维，玻璃，塑料，箔，安瓿，小瓶，管等)制成。
本发明的试剂盒可包括标签或插入物。标签或插入物包括“印刷品”，例如纸或纸板，或分开或固定到组分，试剂盒或包装材料(例如盒子)，或附着到含有试剂盒组分的安瓿，管或小瓶。标签或插入物还可以包括计算机可读介质，例如盘(例如，软盘，硬盘，ZIP盘)，诸如CD或DVD-ROM/RAM之类的光盘，DVD，MP3，磁带，或诸如RAM和ROM之类的电子存储介质或诸如磁/光存储介质，FLASH介质或存储器型卡之类的这些的混合。
标签或插入物可包括其中一种或多种组分的识别信息，剂量，活性成分的临床药理学，包括作用机制，药代动力学和药效学。标签或插入物可包括识别制造商信息，批号，制造商地址和日期的信息。
标签或插入物可包括关于试剂盒组分可适用的病症，障碍，疾病或症状的信息。标签或插入物可包括用于临床医生或受试者在方法，治疗方案或治疗给药方案中使用一种或多种试剂盒组分的说明书。说明书可包括剂量，频率或持续时间，以及用于实施本文所述的任何方法，治疗计划或治疗方案的说明书。示例性说明书包括用于治疗不期望的或异常的细胞增殖，过度增殖的细胞和障碍(例如，转移性或非转移性肿瘤，癌症，恶性肿瘤或赘生物)的说明书。因此，本发明的试剂盒可另外包括用于实施本文所述的任何本发明方法的标签或说明书，包括治疗方法。
标签或插入物可包括关于组分可提供的任何益处的信息，例如预防或治疗益处。标签或插入物可包括关于潜在不良副作用的信息，例如对受试者或临床医生关于不适合使用特定组合物的情况的警告。当受试者已经，将要或正在服用一种或多种可能与所述组合物不相容的其他药物，或者受试者已经，将要或正在经历另一种与所述组合物不相容并且因而说明书可包括这种不相容的信息的治疗计划或治疗方案时，也可能发生不良副作用。
发明试剂盒可另外包括其他组分。试剂盒的每个组分可以封装在单独的容器中，并且所有各种容器可以在单个包装内。发明试剂盒可以设计用于无菌、稳定和/或冷藏。试剂盒中的细胞可以保持在适当的储存条件下直至使用。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但本文描述了合适的方法和材料。
本文引用的所有申请，出版物，专利和其他参考文献，GenBank引文和ATCC引文均通过引用方式而整体并入。如果发生冲突，将以本说明书为准，包括定义。
如本文所用，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一缀合物”或“一融合物”或“一个抗细胞增殖药物”包括多种这样的缀合物，融合物或抗细胞增殖药物等。
如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则所有数值或数值范围包括这些范围内的整数和范围内的数值的分数或整数。因此，例如，参考范围为90-100％，包括91％，92％，93％，94％，95％，95％，97％等，以及91.1％，91.2％，91.3％，91.4％，91.5％等，92.1％，92.2％，92.3％，92.4％，92.5％等，诸如此类。
本文一般使用肯定语言来公开本发明以描述许多实施方案。本发明还具体包括其中全部或部分排除特定主题(例如物质或材料，方法步骤和条件，给药计划，程序，测定或分析)的实施方案。因此，尽管本发明通常不以本发明不包括的内容表达，但本文仍然公开了未明确包括在本发明中的方面。
已经描述了本发明的许多实施例方案。然而，应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，以下实施例旨在说明但不限制权利要求中描述的发明的范围。
实施例
以下实施例描述了显示LHRH-姜黄素缀合物是组合疗法的有吸引力的候选物的数据。三维(3D)高通量测定平台(IncuCyte ZOOM-EssenBioScience)显示在与表达LHRHR的胰腺癌细胞系中LHRH-姜黄素在与姜黄素相同的浓度下更有效。与单独施用的任一化合物相比，LHRH-姜黄素与吉西他滨一起显示出在减缓3D胰腺癌细胞球状体生长方面显著更有效。
由于较低的毒性和较高的肿瘤生长抑制作用，LHRH-姜黄素缀合物作为组合疗法是有吸引力的。数据还显示LHRH-姜黄素缀合物与LHRH受体相互作用，尽管看起来很少的受体在细胞表面。数据进一步显示LHRH-姜黄素缀合物可以被切割并且两个部分可以独立地起作用。
实施例1
该实施例包括显示LHRH-姜黄素缀合物比单独的姜黄素对Panc-1细胞球状体生长更有效的数据。
已经开发了一种治疗计划，该治疗计划能够在96孔板中的基质胶(Matrigel)中生长相同大小的单个癌细胞球状体。在预测癌症药物在人类患者中的功效方面，3D培养方法通常优于2D方法。
Panc-1和Mia-Paca-2细胞在10％FBS DMEM中生长。胰蛋白酶消化后收集细胞，并重悬于含有10％FBS的无酚红DMEM中。用CellTracker Red(Life Techmologies)标记细胞5分钟。标记后，用PBS洗涤细胞，并以1,000个细胞/孔转移到在含有10％FBS和5％Matrigel的100μl无酚红色培养基中的96孔Corning 7007ULA圆底板中。在建立球状体后(24小时后)，应用以下处理(每组8个球状体):(1)LHRH-姜黄素缀合物(10μM，20μM和30μM)；(2)姜黄素(10μM，20μM和30μM)和(3)DMSO对照。球状体在IncuCyte ZOOM(Essen Bioscience)中在37℃和5％CO2下生长。在处理后120小时每4小时获取图像，并设计软件分析以识别孔中的红色物体。使用IncuCyte软件分析确定的“孔中的平均红色物体面积”，将数据表示为处理结束时球状体尺寸的倍数增加。在三个独立实验中证实了再现性。球状体以均匀的速率生长(图1)。
用LHRH-姜黄素缀合物的处理以剂量依赖性方式显著降低由Panc-1细胞形成的球状体的大小。此外，在3D培养中生长的Panc-1胰腺癌细胞系中，LHRH-姜黄素缀合物比姜黄素更有效。结果显示在图2A中。有趣的是，LHRH-姜黄素缀合物在Panc-1细胞上比Mia-PaCa-2细胞更有效，表明LHRH-受体(LHRHR)表达是LHRH-姜黄素缀合物处理功效的决定因素。结果显示在图2B中。
实施例2
该实施例包括显示LHRH处理对Panc-1细胞球状体生长具有抑制作用的数据。
为了证实LHRH-姜黄素缀合物的作用与结合至细胞表面LHRH受体相关，用游离LHRH处理Panc-1球形体并测量球状体生长。游离LHRH对球状体生长具有抑制作用，与细胞表面存在LHRHR一致。此外，LHRH-姜黄素缀合物的效果优于LHRH。结果显示在图3中。在三个独立实验中证实了再现性。这些观察结果与LHRH-姜黄素缀合物通过与所述受体结合优先影响表达LHRH受体的细胞的机制一致。
实施例3
该实施例包括显示LHRH-姜黄素缀合物和吉西他滨的组合对Panc-1球状体生长更有效的数据。
如所述，在96孔圆底板中形成Panc-1球状体。在建立球状体后，应用以下处理(每组8个球状体):(1)吉西他滨(5μM)；(2)LHRH-姜黄素缀合物(30μM)；(3)吉西他滨加LHRH-姜黄素缀合物；(4)DMSO对照。
分析显示LHRH-姜黄素缀合物加吉西他滨处理的球状体显著小于用LHRH-姜黄素缀合物或单独施用吉西他滨处理的球状体。结果显示在图4中。在三个独立实验中证实了再现性。
这些结果表明，当与吉西他滨组合时，LHRH-姜黄素缀合物强烈抑制Panc-1球状体生长，并且可以在表达LHRH受体的其他癌细胞中的联合治疗中使用。
实施例4
该实施例包括显示低剂量的LHRH-姜黄素缀合物和吉西他滨的组合对Panc-1，Mia-Paca-2和AsPC-1球状体生长更有效的数据。
如所述，在96孔圆底板中形成Panc-1，Mia-Paca-2和AsPC-1球状体。在建立球状体后，应用以下处理(每组8个球状体)：遵循在单独使用吉西他滨的剂量依赖性(0.5μM，1.0μM和5.0μM)处理以及与LHRH-姜黄素(10μM和20μM)组合。仅使用培养基作为对照。在定量之前使球状体生长5天。吉西他滨和LHRH-姜黄素均在水中稀释。球状体的处理如下：
1.Mock
2.吉西他滨0.5uM
3.吉西他滨1uM
4.吉西他滨5uM
5.LHRH-姜黄素10.0uM
6.LHRH-姜黄素20.0μM
7.吉西他滨(0.5)+LHRH-c(10)
8.吉西他滨(1)+LHRH-c(10)
9.吉西他滨(5)+LHRH-c(10)
10.吉西他滨(0.5)+LHRH-c(20)
11.吉西他滨(1)+LHRH-c(20)
12.吉西他滨(5)+LHRH-c(20)
使用“孔中的平均红色物体区域”模块的IncucyteZOOM软件分析显示，用吉西他滨和LHRH-姜黄素的处理以剂量依赖方式减少由MiaPaca-2，Panc-1和AsPC-1细胞形成的球状体的大小。LHRH-姜黄素缀合物加吉西他滨处理的球状体显著小于用LHRH-姜黄素缀合物或单独施用吉西他滨处理的球状体。结果显示在图5A(Mia-Paca-2)，图5B(Panc-1)和图5C(AsPC-1)中。
这些结果表明，该LHRH-姜黄素缀合物在低剂量与吉西他滨组合时强烈抑制Panc-1，Mia-Paca-2和AsPC-1球状体生长，并且在降低球状体尺寸方面比单独施用的任一化合物显著更有效。这种LHRH-姜黄素缀合物/吉西他滨联合疗法可用于表达LHRH受体的其他癌细胞，以减少化疗的副作用，同时提供良好的肿瘤生长抑制。
实施例5
该实施例包括显示LHRH-姜黄素缀合物和5FU组合对Panc-1和Mia-Paca-2球状体生长更有效的数据。
如所述，在96孔圆底板中形成Panc-1和Mia-Paca2球状体。在建立球状体后，应用以下处理(每组8个球状体):(1)5FU(2.5μM)；(2)LHRH-姜黄素缀合物(10μM)；(3)5FU加LHRH-姜黄素缀合物；(4)DMSO对照。
分析显示LHRH-姜黄素缀合物加5FU处理的球状体显著小于用单独施用的任一化合物处理的球状体。结果显示在图6A(Panc-1)和图6B(Mia-Paca-2)中。
这些结果表明，该LHRH-姜黄素缀合物在与5FU组合时强烈抑制Panc-1和Mia-Paca-2球状体生长，并暗示，可在表达LHRH受体的癌细胞的治疗中使用。
实施例6
该实施例包括显示LHRH受体是LHRH和LHRH-姜黄素缀合物对Panc-1细胞球状体生长的抑制作用所需的数据。
为验证LHRH和LHRH-姜黄素缀合物的作用是由于与细胞表面LHRH受体结合，用LHRH、LHRH-姜黄素缀合物和单独的姜黄素处理非靶标对照(NT))Panc-1球形体和LHRHR敲低(KD)Panc-1球形体并测量球状体生长(图7)。数据显示游离LHRH对NT Panc-1球状体生长具有抑制作用，这与细胞表面存在LHRHR一致。而且，如前所示，LHRH-姜黄素缀合物的效果优于LHRH或单独的姜黄素(图7A)。然而，在LHRHR KDPanc-1球形体中，LHRH的抑制作用被消除。甚至，虽然LHRH-姜黄素缀合物仍对由LHRHR KD细胞形成的球状体生长具有作用，但是其效果不如单独施用姜黄素，表明LHRH-姜黄素缀合物的作用至少部分是由于与在细胞表面上的受体结合(图7B)。
这些观察结果与LHRH-姜黄素缀合物通过结合LHRH受体优先影响癌细胞的机制一致。
实施例7
该实施例包括显示LHRH受体具有45kD分子量且仅有一小部分似乎在细胞表面上的数据。
已经预测LHRHR的分子量为35kD至超过70kD，这一结论在很大程度上基于非特异性的抗体。图8B是胰腺肿瘤细胞裂解物的蛋白质印迹，证明GenScript抗体识别66kD的强条带，而Abcam抗体识别约45kD的主条带。从细胞中清洗血清消除了66kD条带，这表明GenScript抗体最有可能识别血清白蛋白。
图8B证明在用编码针对LHRHR的shRNA的慢病毒感染的细胞中，使用一些病毒克隆减少45kD条带，强烈暗示AbCam抗体识别的45kD条带是真正的受体。据我们所知，这是首个验证实验，证实LHRHR抗体的特异性，以及45kD蛋白代表该受体。
关于LHRHR的细胞表面表达的实际水平存在不同意见。一些组声称大部分受体存在于那里，而其他组表示细胞表面曾存在少于5％，其余组与内质网相关。为了确定细胞表面LHRHR，将生物素附着于细胞表面，回收生物素化的蛋白质并通过蛋白质印迹分析比较细胞表面的LHRHR水平对比总LHRHR表达。对照是致癌受体c-Met，其主要存在于细胞表面。
图8C证明在五种肿瘤细胞系中未发现表达LHRHR的可检测表面。这与使用流式细胞术分析和共聚焦显微镜观察的其他观察结果一致，所述其他观察结果是在细胞表面上表达的LHRHR很少。这是重要的信息，因为它表明可能会发现可以增加LHRHR表面表达并增加靶向药物功效的药物分子伴侣(pharmacological chaperone)。
实施例8
该实施例包括实施例9-14中使用的各种材料和方法的简要描述。
细胞增殖分析：胰蛋白酶消化后收集胰腺细胞，并在处理前接种于96孔板中24小时。如图例(Figure legend)中所述进行处理。在多聚甲醛固定和DAPI染色后，使用ThermoFisher Cellomics VTI软件的“对象计数”模块定量细胞数。图表表示在相同处理条件下8个孔的平均值和标准偏差。
蛋白质印迹分析：胰蛋白酶消化后收集胰腺细胞，并在处理前在12孔板中接种24小时。如图例中所述进行处理。处理后，将全细胞裂解物收集在Laemmli缓冲液中并通过蛋白质印迹分析。使用以下的一抗：XIAP，c-IAP2，切割的PARP，Caspase-3(均来自CellSignaling)，肌动蛋白(Santa Cruz)和LHRHR(Abcam)。
定量PCR分析：使用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix形式的ThermoFisher通过定量实时PCR测定XIAP，c-IAP1和c-IAP2的mRNA水平。使用来自BioRad的CFX系统在以下条件下进行热循环：95℃10分钟，和40个循环(95℃15秒和55℃60秒)。任何给定基因的mRNA表达以与DMSO处理的细胞相比较进行表示。GAPDH用作参考的管家基因。
实施例9
该实施例包括显示吉西他滨与LHRH-姜黄素的组合在抑制细胞增殖和/或诱导细胞死亡方面更有效的数据。
单独使用吉西他滨和LHRH-姜黄素以及和组合使用吉西他滨和LHRH-姜黄素处理后使用ThermoFisher Cellomics VTI成像系统和软件，在DAPI染色和细胞增殖/生长定量后进行细胞核计数。在核的DAPI染色后测定细胞数。如图1所述处理细胞。
每个处理重复8次用于定量。结果如图9A(MiaPaca-2细胞)，图9B(Panc-1细胞)，图9C(AsPC-1细胞)和图9D(BxPC-3细胞)所示。核的定量支持用IncucyteZOOM获得的结果，并进一步证实癌细胞以剂量依赖性方式对所述处理敏感，并且吉西他滨与LHRH-姜黄素的组合在抑制细胞增殖和/或诱导细胞死亡方面更有效。
实施例10
该实施例包括在处理后24小时分析凋亡标志物(切割的PARP)和凋亡抑制剂(XIAP和cIAP2)。
蛋白质印迹分析。肌动蛋白，GAPDH和丽春红染色(Ponceaustaining)用作上样对照。吉西他滨在水中稀释。将姜黄素和LHRH-姜黄素在DMSO中稀释。细胞处理如下：
1.吉西他滨1uM
2.吉西他滨5uM
3.吉西他滨10uM
4.吉西他滨20uM
5.DMSO
6.姜黄素10uM
7.姜黄素20uM
8.姜黄素50uM
9.姜黄素100uM
10.LHRH-姜黄素10uM
11.LHRH-姜黄素20uM
12.LHRH-姜黄素50uM
13.LHRH-姜黄素100uM
结果如图10A(MiaPaca-2细胞)，图10B(Panc-1细胞)，图10C(AsPC-1细胞)和图10D(BxPC-3细胞)所示。包括MiaPaca-2，Panc-1，AsPC-1和BxPC-3的所有胰腺细胞系对姜黄素和LHRH-姜黄素处理敏感并且启动细胞凋亡，如处理后24小时裂解的PARP的存在所指示。较高剂量的姜黄素和LHRH-姜黄素，分别为50μM和100μM，在处理后24小时更有效地引发细胞死亡。
Panc-1和MiaPaca-2胰腺细胞系对吉西他滨处理更具抗性，因为即使最高剂量的吉西他滨(20μM)在处理后24小时也未能诱导细胞凋亡。如蛋白质印迹分析所示，在用吉西他滨处理后24小时，在Panc-1和MiaPaca-2细胞中未检测到切割的PARP。用较高剂量的吉西他滨处理的AsPC-1和BxPC-3中检测到低水平的切割的PARP。在处理后24小时，所有胰腺细胞系中单独使用高剂量姜黄素和LHRH-姜黄素(50uM和100uM)可下调XIAP和c-IAP2凋亡蛋白抑制剂，进一步证实所用的所有胰腺癌细胞系对姜黄素和LHRH-姜黄素两者均敏感。单独使用吉西他滨不会影响处理后24小时的XIAP和c-IAP2水平。
实施例11
该实施例包括在处理后24小时分析凋亡标志物(切割的PARP)和凋亡抑制剂(XIAP和cIAP2)。
蛋白质印迹分析。肌动蛋白，GAPDH和丽春红染色用作上样对照。吉西他滨在水中稀释。将姜黄素和LHRH-姜黄素在DMSO中稀释。细胞处理如下：
1.吉西他滨5uM
2.LHRH-姜黄素20uM
3.LHRH-姜黄素50uM
4.姜黄素20uM
5.姜黄素50uM
6.吉西他滨(5)+姜黄素(20)
7.吉西他滨(5)+姜黄素(50)
8.吉西他滨(5)+LHRH-姜黄素(20)
9.吉西他滨(5)+LHRH-姜黄素(50)
10.DMSO
结果如图11A(MiaPaca-2细胞)，图11B(Panc-1细胞)，图11C(AsPC-1细胞)和图11D(BxPC-3细胞)所示。在处理后24小时，即使在所有胰腺细胞系中存在吉西他滨(5uM)，高剂量的姜黄素和LHRH-姜黄素(50μM)也会使XIAP和c-IAP2凋亡蛋白抑制剂下调。虽然所有细胞系在姜黄素和LHRH姜黄素存在下下调XIAP和c-IAP2，但是4个胰腺细胞系中如由切割的PARP所揭示的在24小时开始凋亡是不同的，这表明可能需要不同的药物剂量来诱导细胞凋亡。
实施例12
该实施例包括在处理后72小时分析凋亡标志物(切割的PARP，切割的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3))和凋亡抑制剂(XIAP和cIAP2)。
蛋白质印迹分析。肌动蛋白用作上样对照。吉西他滨和LHRH-姜黄素均在水中稀释。细胞处理如下：
1.空白(Mock)
2.吉西他滨1uM
3.吉西他滨5uM
4.吉西他滨10uM
5.LHRH-姜黄素10.0uM
6.LHRH-姜黄素20.0μM
7.吉西他滨(1)+LHRH-c(10)
8.吉西他滨(5)+LHRH-c(10)
9.吉西他滨(10)+LHRH-c(10)
10.吉西他滨(1)+LHRH-c(20)
11.吉西他滨(5)+LHRH-c(20)
12.吉西他滨(10)+LHRH-c(20)
结果如图12A(MiaPaca-2细胞)和图12B(Panc-1细胞)所示。在MiaPaca-2和Panc-1细胞中处理72小时后，在吉西他滨(5μM和10μM)存在下，低剂量的LHRH-姜黄素(10μM和20μM)下调XIAP和c-IAP2凋亡蛋白抑制剂。当用低剂量的吉西他滨联合低剂量的LHRH-姜黄素处理细胞时，检测到由更高水平的切割的PARP和裂解的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3说明的在72h时增加的细胞凋亡。该数据表明，较低剂量的联合处理可以有效地诱导长期结果，并可能减少副作用。
实施例13
该实施例显示了用姜黄素，LHRH-姜黄素和DMSO对照处理的Panc-1细胞中凋亡抑制剂XIAP，cIAP1和cIAP2的mRNA水平的定量PCR分析。
如所显示的，将细胞处理24小时。GAPDH用作参考。结果如图12A(XIAP相对mRNA水平)，图12B(cIAP1相对mRNA水平)，图12C(cIAP2相对mRNA水平)所示。
定量PCR分析显示，在处理后24小时，Panc-1胰腺细胞系中高剂量的姜黄素和LHRH-姜黄素(50uM)下调XIAP，cIAP1和c-IAP2凋亡抑制剂的mRNA水平。QPCR分析支持蛋白质印迹分析(图10和图11)并且表明姜黄素和LHRH-姜黄素在RNA和蛋白质水平下调XIAP，cIAP1和c-IAP2细胞凋亡抑制剂。
实施例14
该实施例包括显示HPNE正常胰腺细胞系和癌症胰腺细胞系(MiaPaca-2，Pnac-1，AsPC-1和BxPC-3)中LHRHR蛋白表达的数据。
结果如图14所示。LHRH-受体(LHRHR)在正常胰腺细胞系和癌细胞系中以不同水平表达。MiaPaca-2和Panc-1癌细胞系以最高水平表达LHRHR。
实施例15
该实施例列出了用于实施例16和图15-30中开发的数据的一些材料和方法。
动物
将雄性SCID/bg小鼠(5周龄；Taconic Biosciences，NY)饲养在标准小鼠Plexiglas笼中，在恒温恒湿12h光照和黑暗循环的室内。实验方案由LSUHSC Shreveport的Institutional Animal Care and Use Committee审查和批准。
皮下植入Mia-PaCa-2细胞
在胰蛋白酶消化后从细胞培养物中收获Mia-PaCa-2细胞。将细胞在无血清培养基中洗涤一次并重悬于HBSS中。仅使用具有>90％活力的单细胞的悬浮液进行注射。在小鼠右后侧用26Ga注射器皮下注射在50％基质胶(Matrigel/)/HBSS中的5×106MIA-PaCa细胞(ATCC，VA)。
实验计划方案
在在肿瘤细胞植入后第21天，将携带100-200mm3肿瘤的小鼠随机分成下列处理组(n＝8)：载体对照；吉西他滨处理(50mg/kg或100mg/kg)；LHRH-姜黄素处理(20mg/kg或40mg/kg)；吉西他滨/LHRH姜黄素处理。在100μL PBS中进行处理，并且通过每周一次腹膜内注射吉西他滨，并且每周两次腹膜内注射LHRH-姜黄素，持续四周。载体处理组接受等量的PBS。每周一次用卡尺测量肿瘤体积，并且每周测量一次小鼠的体重。通过下式计算肿瘤体积：V(mm3)＝(长度×宽度*2)/2，其中宽度是以毫米计的最短测量值。在低剂量处理的最后一次治疗(随机化后第35天和肿瘤细胞植入第55天)后10天或高剂量治疗的最后一次治疗(随机化后第28天和从肿瘤细胞植入第48天)后2天对小鼠进行尸检。解剖肿瘤，称重并拍照。
HPLC肿瘤提取方法
称量肿瘤组织样品，然后使用在液氮中冷却3-5分钟的Bessman TissuePulverizer粉碎。然后将得到的粉末置于玻璃均化室中，在PBS中混合至20％溶液，并粉碎以产生最终的匀浆。将200ml等分试样的匀浆物分配到Axygen 2mL透明微量管(部件号：MCT-200-C-S)中。每个样品用1mL10％甲醇/90％乙酸乙酯萃取，涡旋，并在冷室离心机中以14,000rpm旋转30分钟。然后取出上部有机相层并置于单独的微量离心管中。重复该过程，并使用Savant SpeedVac浓缩合并的肿瘤提取物。将样品在100μL的1mM抗坏血酸性MeOH(pH4.6)中重建，在超声浴中混合2分钟，并在柱上注射75μL。使用在环境温度下操作的具有Thermo ODS Hypersil 5μm250mm×4.6mm分析柱(部件号：30105-252130)的反相HPLC(Agilent 1100系列)来定量肿瘤中的姜黄素。流动相为0.1％TFA(流动相A(Mobile A))和具有0.08％TFA的乙腈(流动相B(Mobile B))。使用以下梯度洗脱提取的肿瘤样品：从90％流动相A/10％流动相B开始在0-15分钟增加至35％流动相A/65％流动相B，最后在25分钟内达到31.4％A/68.6％B。使用在100％流动相B中注射入100μL异丙醇20分钟，清除柱中的残留姜黄素。所有分析均以0.5mL/min的流速和Ex 420nm和Em 524nm的荧光检测进行，姜黄素在约16.5分钟被洗脱。
细胞增殖分析
胰蛋白酶消化后收集胰腺癌细胞，并在处理前接种于96孔板中24小时。如图例(Figure legend)中所述进行处理。处理后，使用IncucyteZOOM软件的“相对象饱和度(Phase Object Confluence)”模块分析细胞增殖。
蛋白质印迹分析
胰蛋白酶消化后收集胰腺癌细胞，并在处理前将其接种在12孔板中24小时。如图例中所述进行处理。处理后，将全细胞裂解物收集在Laemmli缓冲液中并通过蛋白质印迹分析。使用以下一抗(primary antibodies)：切割的PARP，c-IAP2，XIAP，切割的Parp-1(均来自Cell Signaling)，肌动蛋白(Santa Cruz)。
定量PCR分析
使用Roche Universal Library Probe方案通过定量实时PCR测定Smad3，SNAI1，SNAI2，TGFBRI，TGFBRII，GADD45和XIAP的mRNA水平。使用来自Roche的LightCycler96系统在以下条件下进行热循环：95℃10分钟，以及40个循环(95℃15秒和55℃60秒)。任何给定基因的mRNA表达以与对照处理的细胞相比较进行表示。GAPDH用作参考的管家基因。
实施例16
该实施例描述了组合施用的低剂量和高剂量吉西他滨和LHRH-姜黄素的体内研究结果，其强烈抑制肿瘤生长。
简而言之，腹膜内注射组合低剂量和高剂量的吉西他滨和LHRH-姜黄素强烈抑制了SCID小鼠中Mia-PaCa-2癌细胞异种移植物的生长。与载体处理的对照小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量相比，单独的吉西他滨，单独的LHRH-姜黄素和药物组合处理的小鼠的肿瘤的平均体积和平均体重显著(p＝0.025)降低。重要的是，用药物组合处理的肿瘤的平均体积和平均体重显著小于用单一药物处理的小鼠的平均体积和平均体重。
虽然低剂量的吉西他滨和LHRH-姜黄素不能完全阻止肿瘤生长，但两种药物的组合对肿瘤大小的影响显著强于任何单独的处理。较高剂量的药物对肿瘤生长显示出更深远的影响。与对照小鼠相比，用高剂量吉西他滨和LHRH-姜黄素组合处理的小鼠显示肿瘤大小减少3/4-4/5。
单独或组合的药物处理不影响小鼠的健康，并且未检测到小鼠体重或外观的显著变化。这意味着使用较低或较高剂量的吉西他滨和LHRH-姜黄素可以有效地减少肿瘤生长而不会在该小鼠模型中显著诱导副作用。
为了特异性地检测肿瘤中姜黄素的存在，对来自对照处理和LHRH-姜黄素处理的小鼠的肿瘤组织进行HPLC分析。在[DLys6]-LHRH-姜黄素的合成过程中，在所述缀合物的两种组分之间引入酯键。该键通过细胞内的细胞酯酶水解，使游离的姜黄素在细胞水平起作用。
本文的HPLC分析清楚地显示了肿瘤组织中积累的姜黄素以及可能的代谢物的存在。来自对照处理的小鼠的肿瘤组织中不存在游离的姜黄素及其代谢物。肿瘤组织中的游离姜黄素的检测意味着药物被有效地递送到肿瘤部位并起到抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞死亡的作用。
总之，本文的体内结果显示LHRH-姜黄素的优异效力和生物利用度，使得该化合物成为单一和药物组合癌症治疗的极好候选者。
还检测了LHRH-姜黄素对患者来源的胰腺癌细胞系PATC53的作用。先前对PATC53细胞的分析显示该特定细胞系显示低水平的LHRHR。本文的数据与先前的数据一致，并显示PATC53细胞需要更高水平的LHRH-姜黄素以检测对细胞增殖和/或细胞死亡的影响。用高剂量的LHRH-姜黄素处理也抑制参与TGFβ途径诱导的基因的表达。
该数据意味着即使当LHRHR以较低水平表达时，用较高剂量LHRH-姜黄素处理仍然抑制由TGFβ途径诱导的细胞生长和转移。
实施例17
该实施例是对在胰腺癌患者来源的异种移植物(PDX)模型中验证LHRH-姜黄素单独或作为组合剂的抗肿瘤活性的进一步研究的描述。
生长PDXs肿瘤：
动物实验方案由德克萨斯大学MD Anderson Cancer Center(Houston,Texas)institutional review board根据National Institutes of Health出版的Guidelinesfor the Care and Use of Laboratory Animals进行审查和批准。如先前的出版物(KimMP等，Nat Protoc 2009；4(11):1670-80)所述，PDX在裸鼠中从冷冻保存的PDX早期传代中生长。简而言之，回收储存在CryoStor TM CS10存储介质中的肿瘤样品并切成约2mm3片段，浸泡在基质胶(Matrigel)中，并植入Balb/c裸鼠(5只小鼠/PDX)的皮下空间。当肿瘤达到1.5cm直径时收获肿瘤用于产生用于药物测试的组织切片，一式四份。
活组织敏感性试验(LTSA)：
用组织切片机从1个肿瘤移植物产生约100个组织切片，并用先前建立的方法(Roife D，等，Clin Cancer Res 2016)排列在96孔板中。孵育2小时后，将组织切片用LHRH-姜黄素(0μM,3μM,10μM和30μM)，10μM吉西他滨或其组合处理。将具有0.1％DMSO的相同体积的培养基加入对照孔中。72小时后，用PrestoBlue法测量组织活力。通过用抑制剂处理的组织切片的生存力的标准化来对抗对照(DMSO处理的)切片的生存力来计算生存力抑制。用t-检验进一步分析生存力的抑制。如果p<0.05且平均组织切片生存力的至少30％被抑制，则所述组织被定义为对处理敏感。
统计分析：
用t检验分析所述处理和对照之间的显著差异。所有统计分析均使用GraphPad8.0进行。
PDAC PDX的亚组(subset)对LHRH-姜黄素和所述组合处理敏感。为该研究植入了一组25个PDX。使用LTSA测定法(所述方法)，测试总共16个PDAC PDX对单独的LHRH-姜黄素和其与吉西他滨的组合的应答。基于灵敏度标准(30％生存力抑制和P值小于0.05)，16个(50％)PDX中的8个对LHRH-姜黄素单一药剂处理敏感(图32-34和表1)。此外，与吉西他滨(10μM)的组合进一步增强了LTAR-姜黄素在PTAX141,148,112,176,173,102和153中的抗肿瘤活性。在测试的14个PDX中，10个PDX对所述组合处理敏感(图33和34，以及表2)。结果表明单个LHRH-姜黄素在PDAC PDX的亚组中具有活性，并且吉西他滨和LHRH-姜黄素的组合进一步增强了LHRH-姜黄素的抗肿瘤活性。
数据显示约50％的PDX对LHRH-姜黄素单一药剂处理敏感。因此，吉西他滨和LHRH-姜黄素的组合增强了LHRH-姜黄素在PDX亚组中的抗肿瘤活性。
表1.PDX对LHRH-姜黄素单一药剂处理的响应的总结。#P：处理(30μM LHRH-姜黄素)对比非处理对照
表2.PDX对LHRH-姜黄素和吉西他滨的组合的响应的总结。
*P：组合处理(10μM GEM和30μM LHRH-姜黄素)对比非处理对照。
实施例18
这是用于确定LHRH受体表达的研究的描述。数据显示LHRH受体(LHRH-R)的表达与对LHRH-姜黄素的响应相关。
组织微阵列(TMA)中的LHRH受体分析：
在临床组织病理学核心实验室中用已建立的方法测量LHRH-受体表达。LHRH-R的染色在显微镜下定量，使用得分0表示不表达，1表示低表达，2表示中度表达，3表示高表达。
统计分析
使用Pearson相关性来分析LHRH-R的表达与PDX对LHRH-姜黄素或其组合的敏感性之间的相关性。所有统计分析均使用GraphPad 8.0进行。
在一组排列在两个组织微阵列中的88个PDX肿瘤中分析LHRH-R的表达。在显微镜下检查LHRH-R的染色并评分(图35)。对12个测试的PDX中的LHRH-R的表达进行评分。另外4个PDX肿瘤不在TMA组中。LHRH-R的表达水平和PDX敏感性总结在表3中。相关分析发现LHRH-R表达与PDX肿瘤对LHRH-姜黄素单一药剂处理的敏感性密切相关。
使用离体活肿瘤药物敏感性测定与PDX模型组合，分析来自16个不同患者的16个PDAC PDX肿瘤。结果显示，约50％的测试的PDX对单一药剂LHRH-姜黄素处理(30μM)敏感，且当与吉西他滨组合使用时，在PDX肿瘤亚组中的抗肿瘤活性进一步增强，显示约70％PDX对所述组合处理敏感。
因为PDX模型已被证明是评估治疗剂功效的最可靠模型，所以这些结果表明单独或与其他药剂组合的LHRH-姜黄素是用于胰腺癌治疗的有希望的策略。结果还显示LHRH受体的表达与对LHRH-姜黄素的响应相关，表明LHRH受体水平可以是用于这些给药方案的未来临床试验中患者选择的预测标记。
表3.PDX和LHRH-R表达的响应的总结，以及所述响应和LHRH-R表达水平之间的相关性。UN为未知。

Claims (57)

1.一种组合物或配制物，其包括：
a)促黄体生成激素释放激素(LHRH)或LHRH类似物；和
b)姜黄素或姜黄素类似物，
其中所述LHRH或LHRH类似物与所述姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合；和
c)抗细胞增殖药物。
2.如权利要求1所述的组合物或配制物，其中所述LHRH类似物包含：[D-Ala6]-LHRH；[DLys6]-LHRH；[D-Trp6]-LHRH；[Trp6]-LHRH；[D-Phe6]-LHRH；[D-Leu6]-LHRH；[D-Ser(t-Bu)6]-LHRH；[D-His(Bzl)6]-LHRH；[D-Nal(2)6]-LHRH；[Gln8]-LHRH；[His(3-甲基)2]-LHRH；[des-Gly10,D-Ala6]-LHRH乙酰胺；[–Me-Leu7]-LHRH；[des-Gly10,D-His2,D-Trp6,Pro9]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-His(Bzl)6]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-Phe6]-LHRH乙酰胺；[氮杂-Gly10]-LHRH；；[D-Ala6,N-Me-Leu7]-LHRH；[D-His(苄基)6]-LHRH片段3-9乙酰胺；[D-His(Bzl)6]-LHRH片段1-7；[D-His(Bzl)6]-LHRH片段2-9；[D-His(Bzl)6]-LHRH片段4-9；[DHis(Bzl)6]-LHRH片段5-9；[D-pGlu1,DPhe2,D-Trp3,6]-LHRH；[D-Ser4]-LHRH；[D-Trp6]-LHRH-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2；[des-Gly10,D-Ala6]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,12D-His(Bzl)6]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-His2,D-Trp6,Pro9]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-Phe6]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-Ser4,D-His(Bzl)6,Pro9]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-Ser4,D-Trp6,Pro9]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-Trp6,D-Leu7,Pro9]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-Trp6]-LHRH乙酰胺；[des-Gly10,D-Tyr5,D-Trp6,Pro9]-LHRH乙酰胺；[des-pGlu1]-LHRH；[His(3-甲基)2]-LHRH；[Hyp9]-LHRH；甲酰基-[D-Trp6]-LHRH片段2-10；LHRH片段1-2；LHRH片段1-4；LHRH片段4-10；LHRH片段7-10二盐酸盐；[D-Trp6]-LHRH片段1-6；那法瑞林(SynarelTM)；德舍瑞林；EHWSYGLRPG序列；亮丙瑞林；醋酸亮丙瑞林(LupronTM)；戈舍瑞林(ZoladexTM)；组氨瑞林(SupprelinTM)；曲普瑞林(TrelstarTM)；布舍瑞林(SuprefactTM)；西曲瑞克(CetrotideTM)；加尼瑞克(AntagonTM)；安替肽(Ala-Phe-Ala-Ser-Lys-Lys-Leu-Lys-Pro-Ala)；阿巴瑞克(PlenaxisTM)；替维瑞克(AntarelixTM)；地加瑞克(FirmagonTM)；Nal-Glu(D-2-Nal-p-Chloro-D-Phe-BETA-(3-吡啶基)-D-Ala-Ser-Arg-D-Glu-Leu-Arg-Pro-D-Ala)；或噁拉戈利(NBI-56418)。
3.如权利要求1所述的组合物或配制物，其中所述LHRH或LHRH类似物包括钠盐或乙酸盐。
4.如权利要求1所述的组合物或配制物，其中所述LHRH或LHRH类似物在任何残基处具有D-氨基酸。
5.如权利要求1所述的组合物或配制物，其中所述姜黄素包含：
6.如权利要求1所述的组合物或配制物，其中所述姜黄素类似物包含：四氢姜黄素、6-羟基二苯甲酰基甲烷、咖啡酸、3,4-亚甲二氧基肉桂酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、肉桂酸、姜油酮、4-(3,4-亚甲二氧苯基)-2-丁酮、4-(对羟基苯基)-3-丁烯-2-酮、4'-羟基苯戊酮、4-13羟基苄基丙酮、4-羟基二苯甲酮、1,5-双(4-二甲基氨基苯基)-1,4-戊二烯-3-酮、4-羟基苯乙醇、4-羟基苯基丙酮酸、3,4-二羟基氢化肉桂酸、2-羟基肉桂酸、3-羟基肉桂酸、4-羟基肉桂酸或丁子香酚。
7.如权利要求1所述的组合物或配制物，其中所述姜黄素类似物包含：
8.如权利要求1所述的组合物或配制物，其中所述LHRH或LHRH类似物通过共价键与所述姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合。
9.如权利要求1所述的组合物或配制物，其中所述LHRH或LHRH类似物通过肽或非肽接头与所述姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合。
10.如权利要求8所述的组合物或配制物，其中所述肽接头的长度为1-25个氨基酸残基。
11.如权利要求1所述的组合物或配制物，其中所述LHRH或LHRH类似物通过包含一个或多个A、S或G氨基酸残基的肽接头与所述姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合。
12.如权利要求1所述的组合物或配制物，其中所述LHRH或LHRH类似物通过肽接头与所述姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合，所述肽接头包含GSGGS(SEQ.ID NO.)或ASAAS(SEQ.ID NO.)或由其组成。
13.如权利要求1所述的组合物或配制物，其中所述LHRH或LHRH类似物通过线性碳链与所述姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合。
14.药物组合物，其包含如权利要求1所述的组合物或配制物。
15.如权利要求1所述的组合物或配制物，其中所述抗细胞增殖药物包括抗癌或抗肿瘤药物。
16.如权利要求1所述的组合物或配制物，其中所述抗细胞增殖药物包括烷化剂、抗代谢物、植物提取物、植物生物碱、亚硝基脲、激素、核苷类似物或核苷酸类似物。
17.如权利要求1所述的组合物或配制物，其中所述抗细胞增殖药物包括吉西他滨、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢菌素A、强的松龙、美法仑、苯丁酸氮芥、氮芥、白消安、氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、AZT、5-氮杂胞苷(5-AZC)、博来霉素、放线菌素D、光神霉素、丝裂霉素C、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素、羟基脲、顺铂、卡铂、奥沙利铂、米托坦、甲基苄肼、达卡巴嗪、泰素(紫杉醇)、长春碱、长春新碱、多柔比星、二溴甘露醇、伊立替康、拓扑替康、依托泊苷、替尼泊苷或培美曲塞。
18.一种减少或抑制细胞增殖的方法，其包括：
a)使表达与LHRH或LHRH类似物结合的受体的细胞与融合或缀合姜黄素或姜黄素类似物的LHRH或LHRH类似物接触；和
b)使所述细胞与抗细胞增殖药物接触。
19.一种减少或抑制细胞增殖的方法，其包括使表达与LHRH或LHRH类似物结合的受体的细胞与如权利要求1-17中任一项所述的组合物或配制物接触。
20.如权利要求1-16中任一项所述的组合物或配制物在减少或抑制细胞增殖的方法中的用途。
21.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述细胞在受试者中。
22.一种治疗过度增殖性疾病的方法，其包括：
a)使表达与LHRH或LHRH类似物结合的受体的过度增殖性疾病的细胞与融合或缀合姜黄素或姜黄素类似物的激素(LHRH)或LHRH类似物接触；和
b)使所述过度增殖性疾病的细胞与抗细胞增殖药物接触。
23.一种治疗过度增殖性疾病的方法，其包括使表达与LHRH或LHRH类似物结合的受体的过度增殖性疾病的细胞与如权利要求1-17中任一项所述的组合物或配制物接触。
24.如权利要求1-17中任一项所述的组合物或配制物在治疗过度增殖性疾病的方法中的用途。
25.一种治疗表达与LHRH或LHRH类似物结合的受体的赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的方法，其包括：
a)给受试者施用与姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合的LHRH或LHRH类似物；和
b)给所述受试者施用抗细胞增殖药物。
26.一种治疗表达与LHRH或LHRH类似物结合的受体的赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的方法，其包括将如权利要求1-17中任一项所述的组合物或配制物施用于所述赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤。
27.如权利要求1-17中任一项所述的组合物或配制物在治疗赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的方法中的用途。
28.如权利要求18、22或25中任一项所述的方法或用途，其中与姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合的LHRH或LHRH类似物在施用所述抗细胞增殖药物之前、基本上同时或之后施用。
29.如权利要求18-27中任一项所述的方法或用途，其中结合所述LHRH或LHRH类似物的受体是LHRH-受体。
30.如权利要求18-27中任一项所述的方法或用途，其中结合所述LHRH或LHRH类似物的受体存在于所述细胞表面上。
31.如权利要求18-27中任一项所述的方法或用途，其中结合所述LHRH或LHRH类似物的受体是细胞内的。
32.如权利要求18-24或28中任一项所述的方法或用途，其中所述细胞或过度增殖性疾病存在于肺、甲状腺、头部或颈部、鼻咽部、咽喉、鼻或鼻窦、脑、脊柱、乳腺、肾上腺、脑垂体、甲状腺、淋巴、胃肠、口腔、食道、胃、十二指肠、回肠、空肠、小肠、结肠、直肠、生殖泌尿道、子宫、卵巢、子宫颈、子宫内膜、膀胱、睾丸、前列腺、肾、胰腺、肝脏、骨骼、骨髓、淋巴、血液、皮肤或肌肉。
33.如权利要求25-28中任一项所述的方法或用途，其中所述赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包括肺、甲状腺、头部或颈部、鼻咽部、咽喉、鼻或鼻窦、脑、脊柱、乳房、肾上腺、脑垂体、甲状腺、淋巴、胃肠、口腔、食道、胃、十二指肠、回肠、空肠、小肠、结肠、直肠、生殖泌尿道、子宫、卵巢、子宫颈、子宫内膜、膀胱、睾丸、前列腺、肾、胰腺、肝脏、骨骼、骨髓、淋巴、血液、皮肤或肌肉的赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤。
34.如权利要求25-28中任一项所述的方法或用途，其中所述赘生物、肿瘤、癌症或转移瘤包括I、II、III、IV或V期赘生物、肿瘤、癌症或转移瘤。
35.如权利要求25-28中任一项所述的方法或用途，其中所述赘生物、肿瘤、癌症或转移瘤逐渐恶化或处于缓解期。
36.如权利要求18-28中任一项所述的方法或用途，其中所述细胞、过度增殖性疾病或赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤是转移性的。
37.如权利要求18-28中任一项所述的方法或用途，其中所述细胞、过度增殖性疾病或赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包括实体细胞赘生物、实体细胞肿瘤、实体细胞癌症或实体细胞恶性肿瘤。
38.如权利要求18-28中任一项所述的方法或用途，其中所述细胞、过度增殖性疾病或赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包括淋巴或造血细胞赘生物、淋巴或造血细胞肿瘤、淋巴或造血细胞癌症或淋巴或造血细胞恶性肿瘤。
39.如权利要求38所述的方法或用途，其中所述造血细胞赘生物、造血细胞肿瘤、造血细胞癌症或造血细胞恶性肿瘤包括骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。
40.如权利要求18-28中任一项所述的方法或用途，其中所述细胞、过度增殖性疾病或赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包括癌，肉瘤，淋巴瘤，白血病，腺瘤，腺癌，黑素瘤，神经胶质瘤，胶质母细胞瘤，脑膜瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，星形细胞瘤，少突胶质细胞瘤，间皮瘤，网状内皮赘生物、网状内皮肿瘤、网状内皮癌症或网状内皮恶性肿瘤。
41.如权利要求40所述的方法或用途，其中所述肉瘤包括淋巴肉瘤，脂肪肉瘤，骨肉瘤，软骨肉瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤或纤维肉瘤。
42.如权利要求18-28中任一项所述的方法或用途，其中所述抗细胞增殖药物包括吉西他滨，5-氟尿嘧啶，环磷酰胺，硫唑嘌呤，环孢菌素A，强的松龙，美法仑，苯丁酸氮芥，氮芥，白消安，氨甲蝶呤，6-巯基嘌呤，硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，AZT，5-氮杂胞苷(5-AZC)，博来霉素，放线菌素D，光神霉素，丝裂霉素C，卡莫司汀，洛莫司汀，司莫司汀，链脲霉素，羟基脲，顺铂，卡铂，奥沙利铂，米托坦，甲基苄肼，达卡巴嗪，泰素(紫杉醇)，长春碱，长春新碱，多柔比星，二溴甘露醇，伊立替康，拓扑替康，依托泊苷，替尼泊苷或培美曲塞。
43.如权利要求18-28中任一项所述的方法或用途，其中所述抗细胞增殖药物以约25-250、250-500、500-1000、1000-2500或2500-5000、5000-25,000、5000-50,000pg/kg、约50-500、500-5000、5000-25,000或25,000-50,000ng/kg、约25-250、250-500、500-1000、1000-2500或2500-5000、5000-25,000、5000-50,000μg/kg的剂量施用于所述受试者。
44.如权利要求18-28中任一项所述的方法或用途，其中与姜黄素或姜黄素类似物融合或缀合的LHRH或LHRH类似物以约25-250、250-500、500-1000、1000-2500或2500-5000、5000-25,000、5000-50,000pg/kg、约50-500、500-5000、5000-25,000或25,000-50,000ng/kg、约25-250、250-500、500-1000、1000-2500或2500-5000、5000-25,000、5000-50,000μg/kg的剂量施用于所述受试者。
45.如权利要求18-28中任一项所述的方法或用途，其中所述方法或用途抑制或减少所述赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的复发或进展。
46.如权利要求18-28中任一项所述的方法或用途，其中所述方法或用途导致：部分或完全破坏所述赘生物、肿瘤、癌症或恶性细胞团块，体积，大小或细胞数量；刺激，诱导或增加赘生物、肿瘤、癌症或恶性细胞坏死，裂解或凋亡；减少赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤体积大小，细胞团块；抑制或预防赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤体积，团块，大小或细胞数量的进展或增加；或延长寿命。
47.如权利要求18-28中任一项所述的方法或用途，其中所述方法或用途减少或降低：与所述赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤相关的或由其引起的不良症状或并发症的严重性、持续时间或频率，或疼痛，不适，恶心，虚弱或嗜睡。
48.如权利要求18-28中任一项所述的方法或用途，其中所述方法或用途增加受试者的能量，食欲，改善的活动性或心理健康。
49.如权利要求18-28中任一项所述的方法或用途，其中所述细胞，过度增殖性疾病或赘生物，肿瘤，癌症或恶性肿瘤存在于哺乳动物中。
50.如权利要求21或48所述的方法或用途，其中所述受试者或哺乳动物是人。
51.如权利要求21或48所述的方法或用途，其中所述受试者或哺乳动物是家畜或农场(牲畜)动物。
52.如权利要求51所述的方法或用途，其中家畜是狗或猫。
53.如权利要求18-28中任一项所述的方法或用途，其中与姜黄素或姜黄素类似物或所述抗细胞增殖药物融合或缀合的LHRH或LHRH类似物局部、区域或全身施用于所述受试者或哺乳动物，或施用进入所述细胞、过度增殖性疾病或赘生物、肿瘤、癌症或转移瘤。
54.如权利要求1所述的组合物或配制物，其包含一种或多种额外的抗细胞增殖药物或免疫增强药物。
55.如权利要求54所述的组合物或配制物，其中所述一种或多种额外的抗细胞增殖药物包括抗癌药物或抗肿瘤药物。
56.如权利要求54所述的组合物或配制物，其中所述一种或多种额外的抗细胞增殖药物包括烷化剂，抗代谢物，植物提取物，植物生物碱，亚硝基脲，激素，核苷或核苷酸类似物。
57.如权利要求54所述的组合物或配制物，其中所述一种或多种额外的抗细胞增殖药物包括吉西他滨，5-氟尿嘧啶，环磷酰胺，硫唑嘌呤，环孢菌素A，强的松龙，美法仑，苯丁酸氮芥，氮芥，白消安，氨甲蝶呤，6-巯基嘌呤，硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，AZT，5-氮杂胞苷(5-AZC)，博来霉素，放线菌素D，光神霉素，丝裂霉素C，卡莫司汀，洛莫司汀，司莫司汀，链脲霉素，羟基脲，顺铂，卡铂，奥沙利铂，米托坦，甲基苄肼，达卡巴嗪，泰素(紫杉醇)，长春碱，长春新碱，多柔比星，二溴甘露醇，伊立替康，拓扑替康，依托泊苷，替尼泊苷或培美曲塞。
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