CN109468279A - 靶向gpc3的免疫效应细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表达有靶向GPC3的嵌合抗原受体和外源性IL12的免疫应答细胞。本发明还提供了包含所述免疫应答细胞的药物组合物以及利用所述免疫应答细胞或药物组合物治疗肿瘤，特别是GPC3阳性肿瘤的方法。本发明的免疫应答细胞不仅在体外对实体瘤细胞有效，在体内对实体瘤细胞也具备优异的杀伤效果。

Description

靶向GPC3的免疫效应细胞及其应用
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种基因修饰的靶向GPC3的免 疫效应细胞。
背景技术
嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞(Chimeric antigen receptor engineered Tlymphocyte，CAR-T)技术是近年来兴起的一项用于肿瘤生物治疗的新策略。嵌 合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)是将识别肿瘤相关抗原的单链抗 体和免疫细胞的活化基序相结合，在体外通过基因工程的手段使T淋巴细胞表 达嵌合抗原受体，赋予了T细胞特异性识别和杀伤肿瘤细胞的能力。目前， CAR-T在血液系统恶性肿瘤的治疗应用中取得了不错的疗效，例如在CD19阳性 的B淋巴细胞性白血病患者取得了巨大的成功。但是CAR-T在实体瘤治疗应用 方面仍然面临非常大的挑战。
白介素12(interleukin-12，IL12)是一种重要的免疫刺激细胞因子，能够促 进辅助性T细胞的增殖，诱导NK细胞和T细胞产生γ干扰素。然而在临床实验中， 发现IL12系统性给药时在多个器官出现严重副作用，例如肝功能异常，高热， 严重血流动力学不稳等，严重者导致了死亡，限制了IL12的应用。
此外，由于肿瘤特别是实体瘤的特殊性，每种肿瘤的微环境也完全不同， 共表达IL12的免疫效应细胞是否增强抗肿瘤的效果，特别是显著增强抗肿瘤的 效果是未知的，并且会造成一定的副作用，例如实验小鼠体重降低。此外，CAR T细胞与其它细胞因子联用也存在副作用大或者体内效果不好等等缺陷。因此， 具体的嵌合抗原受体免疫应答细胞与具体的细胞因子联用会产生什么样的效 果是无法合理预知的。
因此，本领域急需能够具备显著的抗肿瘤效果，但副作用低的免疫应答细 胞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具备显著的抗肿瘤效果，但副作用低的免疫应 答细胞。
在第一方面，本发明提供一种免疫应答细胞，该细胞表达特异结合GPC3 的受体和外源性IL12。
在具体的实施方式中，所述受体和所述IL12可操作地连接。
在具体的实施方式中，所述的免疫应答细胞包括：T细胞、自然杀伤细胞、 细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤T细胞、DNT细胞、和/或调节性T细胞。
在具体的实施方式中，所述的外源性IL12是组成性表达或诱导性表达； 较佳地，用于表达所述的IL12的启动子包括：免疫细胞诱导型启动子；较佳地， 所述的免疫细胞诱导型启动子是NFAT6启动子。
在具体的实施方式中，所述受体具有特异结合GPC3的胞外域、跨膜域、 及胞内信号域。
在具体的实施方式中，所述受体为嵌合抗原受体，其中，所述胞内域含 有细胞刺激信号分子或细胞刺激信号分子与细胞激活共刺激分子的组合；
较佳地，所述细胞刺激信号分子选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcεRIγ、 FcRβ、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、或DAP12的蛋白质的功能性信号 传导结构域；更佳地为CD3ζ；或者
较佳地，所述的细胞激活共刺激分子选自以下的蛋白质的功能性信号传 导结构域：CD27，CD28，CD137，CD134，ICOS，OX40，CD30，CD40，PD-1， 淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，特 异结合CD83的配体，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)， SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD160，CD19，CD4，CD8α，CD8β，IL2Rβ，IL2Rγ， IL7Rα，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6， CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM， CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7， TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244,2B4)，CD84， CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1， CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A,Ly108)，SLAM(SLAMF1,CD150, IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76， PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，和NKG2D，更佳的，为CD27，CD28， CD137，CD134，ICOS。
在具体的实施方式中，所述受体的胞外域含有与SEQ ID NO：25所示的氨 基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，所述受体含有SEQ ID NO:21、22、23、或24所示 的氨基酸序列；或者含有与SEQ ID NO:21、22、23、或24所示的氨基酸序列 具有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，所述受体和所述的外源性IL12由与SEQ ID NO:27、 28、或29具有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的核苷酸序列 编码。
在具体的实施方式中，所述的免疫应答细胞不包含外源的共刺激配体。
在具体的实施方式中，所述受体和/或所述IL12组成性或诱导性表达在免 疫应答细胞的表面。
在具体的实施方式中，所述的免疫应答细胞中包含表达构建物，该表达 构建物包括：所述结合抗原的受体的表达盒；和所述IL12的表达盒。
在具体的实施方式中，所述的受体和/或IL12利用病毒载体表达；较佳地， 所述的病毒载体包括：慢病毒载体，逆转录病毒载体或腺病毒载体。
在具体的实施方式中，所述免疫应答细胞在给予个体后，与不存在所述 外源性IL12的情况相比，所述个体外周血中CAR-T细胞数量提高至少50％。
在具体的实施方式中，所述免疫应答细胞在给予个体约7天后，所述个体 外周血中CAR-T细胞的数量之和大于6,000个/μL；给予所述免疫应答细胞约10 天后，所述个体外周血中CAR-T细胞的数量之和大于6000个/μL。
在优选的实施方式中，本发明的免疫应答细胞对于低剂量，例如剂量低 于1*107细胞/L的非本发明免疫应答细胞(即，不同时表达特异结合GPC3的受 体和外源性IL12的免疫效应细胞)无法控制的肿瘤，或者体积过大的肿瘤(例 如小鼠肿瘤模型中体积大于300mm3的肿瘤，甚至大于600mm3)具备优异的杀 伤作用。
在第二方面，本发明提供一种表达构建物，该表达构建物包括顺序连接的： 受体的表达盒和IL12的表达盒；其中所述结合抗原的受体和IL12如本发明第一 方面所述。
在第三方面，本发明提供本发明第一方面所述的免疫应答细胞在制备用于 治疗有此需要的个体的肿瘤的药物组合物中的用途。
在具体的实施方式中，所述的肿瘤包括：肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、 头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑 色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤、食道癌；优选地，所 述肿瘤是肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌。
在具体的实施方式中，所述的免疫效应细胞使得肿瘤减小至少50％。
在具体的实施方式中，所述的免疫效应细胞使得肿瘤减小至少70％，更优 的，所述的免疫效应细胞使得肿瘤减小至少80％。
在第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述的药物组合物包括：
本发明第一方面所述的免疫应答细胞；以及
药学上可接受的载体或赋形剂。
在第五方面，本发明提供一种试剂盒，其包含：
本发明第一方面所述的免疫应答细胞；以及
指导如何向个体给予所述免疫应答细胞的说明书。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1A为CAR-T细胞制备的质粒结构示意图；图1B显示了FACS检测 GPC3-CAR-T/IL12-GPC3-CAR-T细胞表面CAR的表达情况；
图2显示了CAR细胞-T体外毒性实验结果；
图3A显示了CAR-T与肿瘤细胞共孵共孵育24h时IL-12的分泌情况；图3B显 示了CAR-T与肿瘤细胞共孵共孵育24h时IL-2/TNF-α/IFN-γ的分泌情况；
图4A显示了不同实验组的Huh-7皮下移植瘤的生长情况；图4B显示了不同 实验组的Huh-7皮下移植瘤小鼠的体重变化；
图5显示了第7天和第10天，不同CAR-T在外周血中存活细胞数；
图6显示了CAR-T注射后第10天血清样本中IFN-γ的量；
图7是对肿瘤组织中浸润型T细胞以及Ki67进行免疫组化检测的结果；
图8A和8B显示了实验结束时小鼠皮下瘤的生长情况；
图9是FACS检测mCAR-T/mIL12-GPC3-CAR T细胞表面CAR的表达情况；
图10是mCAR-T体外毒性实验结果图；
图11A显示了UTD、mGPC3-CAR、mGPC3-m28Z-mNFAT6-mIL12与肿瘤 细胞共孵育24h时mIL-12的分泌情况；图11B显示了 UTD/mGPC3-m28Z/mIL12-GPC3-CAR T与肿瘤细胞共孵育24h时细胞因子 mIL-2、mTNF-α、mIFN-γ释放情况；
图12A和图12B显示了E0771-GPC3皮下移植瘤的治疗效果；
图13A显示了尾静脉注射mIL12-GPC3-T 5X106/只组和mIL12-GPC3-T 2X106/只组的实验结果；图13B显示给予mIL12-GPC3-T后，与mGPC3-CAR-T 组和空白对照组小鼠的体重。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现在免疫应答细胞表达特异 结合GPC3的受体和外源性IL12能够具备显著的抗肿瘤效果，但副作用低。在 此基础上完成了本发明。
以下具体说明详尽地展示了本文所公开的实施方案。应当理解，本说明书 并非意欲仅限于此处所公开的具体的实施方案，而是可以发生改变。本领域技 术人员将理解，本说明书中所公开的内容可以有多种改变或变化，而均涵盖于 所公开的范围和原则之内。除非另有说明，每个实施方案均可与任何其他实施 方案任意组合。
本文所公开的某些实施方案包含了数值范围，并且本发明的某些方面可采 用范围的方式描述。除非另有说明，应当理解数值范围或者以范围描述的方式 仅是出于简洁、便利的目的，并不应当认为是对本发明的范围的严格限定。因 此，采用范围方式的描述应当被认为具体地公开了所有可能的子范围以及在该 范围内的所有可能的具体数值点，正如这些子范围和数值点在本文中已经明确 写出。例如，从1至6的范围的描述应当被认为具体公开了从1至3、1至4、1至5、 2至4、2至6、3至6等的子范围，以及在这些范围内的具体的数值点，例如1、2、 3、4、5、6。不论所述数值的宽窄，上述原则均同等适用。当采用范围描述时，该范围包括范围的端点。
术语
本文所用的术语“激活”和“活化”可互换使用，它们以及其语法上的其他形 式可以指细胞从静止状态转变为活性状态的过程。该过程可以包括对抗原、迁 移和/或功能活性状态的表型或遗传变化的响应。例如，术语“激活”可以指T细 胞逐步活化的过程。例如，T细胞可能需要至少两个信号才能完全激活。第一 信号可以在由抗原-MHC复合物接合TCR之后发生，而第二信号可以通过共刺 激分子(参见表1中所列举的共刺激分子)的接合发生。在体外，抗CD3可以模拟 所述第一信号，抗CD28可以模拟所述第二信号。例如，工程化T细胞可以被表 达的CAR激活。本文所用的T细胞激活或T细胞触发可以指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖、细胞因子产生和/或可检测的效应物功能的T细胞的状态。
本文所用的术语“受体”是一类存在于胞膜或胞内的，能与细胞外专一信号 分子结合进而激活细胞内一系列生物化学反应，使细胞对外界刺激产生相应的 效应的特殊蛋白质。与受体结合的生物活性物质统称为配体(ligand)。受体与配 体结合即发生分子构象变化，从而引起细胞反应，如介导细胞间信号转导、细 胞间黏合、胞吞等过程。
本文所用的术语“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的同一性共刺激分 子的抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突状细胞、B细胞等)上的分子，由此提供 信号，与由例如TCR/CD3复合物与加载有肽的MHC分子的结合提供的第一信号 共同介导T细胞应答，包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激配体可以包 括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L、PD-L2、4-1BBL、OX40L、 诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、 CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、 HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共 刺激配体还特别包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，例如但 不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞 功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异 性结合的配体。
本文所用的术语“共刺激分子”是指与共刺激配体特异性结合的T细胞上的 同一性结合配偶体，从而介导T细胞的共刺激应答，例如但不限于增殖。共刺 激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
如本文所用的“共刺激信号”是指与细胞刺激信号分子，例如TCR/CD3结 合，组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指可以由包括但不限于T细胞 的免疫细胞表达的工程化分子。CAR在T细胞中表达并且可以重定向T细胞以诱 导以由人造受体决定的特异性杀死靶细胞。CAR的细胞外结合结构域可以衍生 自鼠、人源化或完全人单克隆抗体。
本文所用的术语“工程化”及其语法上的其他形式可以指核酸的一个或多个 改变，例如生物体基因组内的核酸。术语“工程化”可以指基因的改变、添加和/ 或缺失。工程细胞还可以指具有加入、缺失和/或改变的基因的细胞。
本文所用的术语“细胞”或“工程细胞”及其语法上的其他形式可以指人或非 人动物来源的细胞。工程细胞也可以指表达CAR的细胞。
本文所用的术语“转染”是指将外源核酸引入真核细胞。转染可以通过本领 域已知的各种手段来实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、 聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融 合、逆转录病毒感染和生物弹道技术(biolistics)。
术语“稳定转染”或“稳定地转染”是指将外源核酸、DNA或RNA引入和整合 到转染细胞的基因组中。术语“稳定转染体”(stable transfectant)是指将外来DNA 稳定地整合到基因组DNA中的细胞。
如本文所用，术语“核酸分子编码”、“编码DNA序列”和“编码DNA”是指沿 着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或顺序。这些脱氧核糖核苷酸的顺 序决定了沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。因此，核酸序列编码氨基酸序 列。
本文所用的术语“个体”是指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本发明 的个体包括但不限于人类、非人类灵长类动物(例如恒河猴或其他类型的猕猴)、 小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
本文所用的术语“外周血淋巴细胞”(PBL)及其语法上的其他形式可以指在 血液(例如外周血)中循环的淋巴细胞。外周血淋巴细胞可以指不局限于器官的 淋巴细胞。外周血淋巴细胞可以包含T细胞、NK细胞、B细胞或其任何组合。
本文所用的术语“免疫应答细胞”或“免疫反应性细胞”可以指可以引发免疫 应答的细胞，包括但不限于T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、DNT细胞等， 它们各自的前体细胞及其后代。免疫应答细胞还可以指淋巴或骨髓谱系的细 胞。
本文所用的术语“T细胞”及其语法上的其他形式可以指任何来源的T细胞。 例如，T细胞可以是原代T细胞例如自体T细胞等。T细胞也可以是人或非人的。
本文所用的术语“T细胞活化”或“T细胞激活”及其语法上的其他形式可以 指被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖、细胞因子产生和/或可检测的效应物功 能的T细胞的状态。在一些情况下，“完全T细胞活化”可以类似于触发T细胞的 细胞毒性。可以使用本领域已知的各种测定来测量T细胞活化。所述测定可以 是测量细胞因子分泌的ELISA、ELISPOT、用于测量细胞内细胞因子表达的流 式细胞术测定(CD107)、用于测量增殖的流式细胞术测定、和用于确定靶细胞 消除的细胞毒性测定(51Cr释放测定)。所述测定通常使用对照(非工程细胞)与工 程细胞(CAR T)进行比较，以确定与对照相比，工程细胞的相对激活。此外，所述测定可以与未表达靶抗原的靶细胞孵育或接触的工程细胞进行比较。例 如，所述比较可以是与不表达GPC3的靶细胞孵育的GPC3-CART细胞进行的比 较。
当用于指核苷酸序列时，本文所用的术语“序列”及其语法上的其他形式可 以包括DNA或RNA，并且可以是单链或双链。核酸序列可以突变。核酸序列可 以具有任何长度。
本文所用的术语“有效量”是指提供治疗或预防益处的量。
本文所用的术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含与待表 达的核苷酸序列有效连接的表达调控序列。表达载体包含用于表达的足够的顺 式作用元件(cis-acting elements)；用于表达的其它元件可以由宿主细胞或体外表 达系统提供。表达载体包括本领域所有已知的那些，例如粘粒、质粒(例如裸露 或包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病 毒)。
本文所用的术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。逆转录病毒在能够感染 非分裂细胞方面是逆转录病毒中独特的；它们可以将大量的遗传信息递送到宿 主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体最有效的方法之一。HIV、SIV和 FIV都是慢病毒的实例。源自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因 转移的手段。
本文所用的术语“可操作地连接”是指在调控序列和其他核酸序列之间的功 能性连接，如该连接导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列 成功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。
本文使用的术语“启动子”定义为由启动多核苷酸序列的特异性转录所需的 细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列。
本文使用的术语“载体”是包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细 胞内部的组合物。在本领域中已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与 离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主 复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒 和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不 限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
本文使用的术语序列“同一性”通过在比较窗口(例如至少20个位置)上比较 两个经最佳匹配的序列来确定同一性百分比，其中比较窗口中多核苷酸或多肽 序列的部分可以包含添加或缺失(即间隙)，例如对于最佳匹配的两个序列而言 与参考序列(其不包含添加或缺失)相比20％或更少的间隙(例如5至15％、或10 至12％)。通常通过确定在两个序列中发生相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置 的数目来计算百分比，以产生正确匹配的位置的数目，将正确匹配位置的数目 除以参考序列中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100，以产生序列同一 性的百分比。
本文所用的术语“IL12”、“白介素12”及“interleukin-12”可以互换使用，具有 相同意思。本文所用的术语“IL12”是一种具有多种生物学活性的免疫调节因子， 如，术语“IL12”可以是指如SEQ ID NO:26中定义的人IL12或者其活性片段， 也可以是指如SEQ IDNO:27中定义的鼠的IL12或者其活性片段，也可以是其 他种属。
在一些实施方案中，应用于构建所述的特异结合GPC3的受体的元件或所 述的IL12可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物；也可以是人 工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组各元件或IL12。 优选的，本发明可采用重组的各元件或IL12。
在所述各元件或IL12多肽序列的基础上，经过一个或多个氨基酸残基的取 代、缺失或添加而形成的氨基酸序列也包括在本发明中。适当替换氨基酸是本 领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生 物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域 改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。
所述各元件或IL12的多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这 里，所述的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其作为全长多肽的一部分， 仍然能保持全长的多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段 至少保持50％的全长多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持 全长多肽的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
在所述各元件或IL12多肽序列的基础上，经修饰或改良的多肽也可以应用 到本发明中，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或多肽的效 力而加以修饰或改良的多肽。也就是说，任何不影响多肽的生物活性的变化形 式都可用于本发明中。
本文所用的术语“肿瘤”指的是一种以细胞或组织的病理性增生为特征的疾 病，及其随后的迁移或侵袭其他组织或器官。肿瘤生长通常是不受控制的和进 行性的，不诱导或抑制正常细胞增殖。肿瘤可影响多种细胞、组织或器官，包 括但不限于选自膀胱、乳腺、食管、肠、肾、肝、肺、淋巴结、神经组织、卵 巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、子宫器官，或组织或相应 的细胞。本发明所述的肿瘤，可包括，但不限于肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、 头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色 素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤、食道癌。较佳地，所述的 “肿瘤”包括但不限于：肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌。
本文所用的术语“增强免疫应答细胞功能”包括例如增强T细胞功能。以T细 胞为例，增强T细胞功能包括诱导、引起或刺激T细胞使其具有持续的或增强的 生物功能，或更新或重新激活耗竭的(exhausted)或非活性的T细胞。增强T细胞 功能的实例包括：相对于干预前水平，CD8+T细胞分泌的干扰素增加、增殖增 加、抗原反应性(例如病毒或病原体清除率)增加。在一个实施方案中，增强水 平至少为50％，或者60％，70％，80％，90％，100％，120％，150％，200％。 测量这种增强的方式是本领域普通技术人员已知的。
本文所用的术语“外源性”指的是一个核酸分子或多肽，其在细胞内没有内 源性表达，或表达水平不足以实现过表达时具有的功能。因而，“外源性”包括 在细胞内表达的重组核酸分子或多肽，如外源性、异源性和过表达的核酸分子 和多肽。
本文所用的术语“受体”是指一种多肽，或其部分，其在细胞膜上选择性地 结合一个或多个配体。
在一些实施方案中，本发明的结合抗原的受体是嵌合抗原受体。本文所用 的术语“嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)”指一种融合到细胞内 信号转导域的肿瘤抗原结合结构域，能激活T细胞。常见地，CAR的胞外结合 结构域来源于小鼠或人源化或人的单克隆抗体。
嵌合抗原受体通常包含(细)胞外抗原结合区。在一些实施方案中，胞外抗 原结合区可以是完全人的。在其他情况下，胞外抗原结合区域可以被人源化。 在其他情况下，胞外抗原结合区可以是鼠源的，或者所述胞外抗原结合区中的 嵌合体由来自至少两种不同动物的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述 胞外抗原结合区可以是非人的。
可以设计多种抗原结合区域。非限制性实例包括衍生自抗体的单链可变片 段(scFv)、选自文库的片段抗原结合区(Fab)、单结构域片段或与接合其同源受 体的自然配体。在一些实施方案中，胞外抗原结合区域可以包含scFv、Fab或天 然配体，以及它们的任何衍生物。细胞外抗原结合区可以指除完整抗体之外的 分子，其可以包含完整抗体的一部分并且可以与完整抗体所结合的抗原结合。 抗体片段的实例可以包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双功能抗 体、线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
细胞外抗原结合区，例如scFv、Fab或天然配体，可以是确定抗原特异性 的CAR的一部分。细胞外抗原结合区可以结合任何互补靶。细胞外抗原结合区 可以衍生自已知可变区序列的抗体。细胞外抗原结合区可以从获自可获得的小 鼠杂交瘤的抗体序列中得到。或者，可以从肿瘤细胞或原代细胞例如肿瘤浸润 淋巴细胞(TIL)的全外切割测序获得细胞外抗原结合区。
在一些情况下，细胞外抗原结合区的结合特异性可以通过互补决定区或 CDR，如轻链CDR或重链CDR来确定。在许多情况下，结合特异性可以通过轻 链CDR和重链CDR来确定。与其他参考抗原相比，给定的重链CDR和轻链CDR 的组合可以提供给定的结合袋，其可以赋予抗原(例如GPC3)更大的亲和力和/ 或特异性。例如，特异于磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的CDR可以在CAR的细胞外结 合区域中表达，使得靶向GPC3的CAR可以将免疫应答细胞靶向表达GPC3的肿 瘤细胞。
在本文公开的任何实施方案的某些方面，细胞外抗原结合区，例如scFv可 以包含对抗原特异性的轻链CDR。轻链CDR可以是抗原结合单元例如CAR的 scFv轻链的互补决定区。轻链CDR可以包含连续的氨基酸残基序列，或由非互 补决定区(例如框架区)隔开的两个或更多个连续的氨基酸残基序列。在一些情 况下，轻链CDR可以包含两个或更多个轻链CDR，其可以被称为轻链CDR-1， CDR-2等。在一些情况下，轻链CDR可以包含三个轻链CDR，其可分别称为轻 链CDR-1，轻链CDR-2和轻链CDR-3。在一些实例中，存在于普通轻链上的一组CDR可统称为轻链CDR。
在本文公开的任何实施方案的某些方面，细胞外抗原结合区，例如scFv可 以包含对抗原特异的重链CDR。重链CDR可以是抗原结合单元例如scFv的重链 互补决定区。重链CDR可以包含氨基酸残基的连续序列，或由非互补决定区(例 如框架区)隔开的两个或更多个氨基酸残基的连续序列。在一些情况下，重链 CDR可以包含两个或更多个重链CDR，其可以称为重链CDR-1，CDR-2等。在 一些情况下，重链CDR可以包含三个重链CDR，其可分别称为重链CDR-1，重 链CDR-2和重链CDR-3。在一些情况下，存在于共同重链上的一组CDR可统称为重链CDR。
通过使用基因工程，可以以各种方式修饰细胞外抗原结合区。在一些情况 下，可以突变细胞外抗原结合区域，从而可以选择细胞外抗原结合区域以对其 靶标具有更高的亲和力。在一些情况下，细胞外抗原结合区域对其靶标的亲和 力可针对可在正常组织上以低水平表达的靶标进行优化。可以进行此优化， 以尽量减少潜在的毒性。在其他情况下，对靶标的膜结合形式具有更高亲和 力的细胞外抗原结合区域的克隆可以优于其可溶形式的对应物。可以进行这 种修饰，因为也可以检测到不同水平的可溶形式的靶标，并且它们的靶向可引 起不期望的毒性。
在一些情况下，细胞外抗原结合区域包括铰链或间隔区。术语铰链和间隔 区可以互换使用。铰链可以被认为是用于向细胞外抗原结合区提供柔性的CAR 的一部分。在一些情况下，铰链可用于检测细胞的细胞表面上的CAR，特别是 当检测细胞外抗原结合区的抗体不起作用或可用时。例如，衍生自免疫球蛋白 的铰链的长度可能需要优化，这取决于细胞外抗原结合区域靶向靶上的表位的 位置。
在一些情况下，铰链可能不属于免疫球蛋白，而是属于另一种分子，如 CD8α分子的天然铰链。CD8α铰链可以含有已知在CD8辅助受体和MHC分子的 相互作用中起作用的半胱氨酸和脯氨酸残基。所述半胱氨酸和脯氨酸残基可影 响所述CAR的性能。
CAR铰链可以是尺寸可调的。免疫应答细胞和靶细胞之间的免疫突触的这 种形貌还限定了由于细胞表面靶分子上的膜远端表位而不能由CAR进行功能 桥接的距离，即使用短铰链CAR也不能使突触距离达到信号能够传导的近似 值。同样，膜近端CAR靶抗原表位仅在长铰链CAR的背景下观察到信号输出。 可以根据所使用的细胞外抗原结合区域来调节铰链。铰链可以是任何长度的。
跨膜结构域可以将CAR锚定在细胞的质膜上。CD28的天然跨膜部分可用 于CAR。在其他情况下，也可以在CAR中使用CD8α的天然跨膜部分。“CD8” 可以是与NCBI参考号：NP_001759或其具有刺激活性的片段具有至少85、90、 95、96、97、98、99或100％同一性的蛋白质。CD8核酸分子”可以是编码CD8 多肽的多核苷酸，在某些情况下，跨膜区可以是CD28的天然跨膜部分，“CD28” 可以指与NCBI参考号：NP_006130或其具有刺激活性的片段具有至少85、90、 95、96、97、98、99或100％同一性的蛋白质。“CD28核酸分子”可以是编码CD28 多肽的多核苷酸。在一些情况下，跨膜部分可以包含CD8α区域。
CAR的胞内信号域可以负责活化CAR已经置于其中的免疫应答细胞的效 应子功能中的至少一种。CAR可以诱导T细胞的效应子功能，例如，所述效应 子功能是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内 信号域”是指转导效应子功能信号并引导细胞进行特异功能的蛋白质部分。虽然 通常可以使用整个细胞内信号传导区域，但是在许多情况下，不必使用信号结 构域的整个链。在一些情况下，使用细胞内信号传导区的截短部分。在一些情 况下，术语细胞内信号域因此意在包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号 传导区的任何截短部分。
在CAR中使用的信号结构域的优选实例可以包括T细胞受体(TCR)的细胞 质序列和协同作用以在靶-受体结合之后启动信号转导的共同受体，以及它们的 任何衍生物或变体序列和这些序列的具有相同功能性的任何合成序列。
在一些情况下，所述细胞内信号域可以含有已知的免疫受体酪氨酸激活基 序(ITAM)的信号基序。含有细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括衍生自 TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、 CD66d的DAP10、或DAP12的蛋白质的功能性信号传导结构域。然而，在优选 的实施方案中，细胞内信号结构域衍生自CD3ζ链。
含有一个或多个ITAM基序的T细胞信号结构域的实例是CD3ζ结构域，也 称为T细胞受体T3ζ链或CD247。该结构域是T细胞受体-CD3复合物的一部分， 并且在将几种细胞内信号转导途径的抗原识别与T细胞的主效应激活相结合方 面起重要作用。如本文所用，CD3ζ主要是指人类CD3ζ及其同种型，如从 Swissprot条目P20963所知的，包括具有基本相同序列的蛋白质。作为嵌合抗原 受体的一部分，再次重申，不需要全T细胞受体T3ζ链，并且其包含T细胞受体 T3ζ链的信号结构域的任何衍生物都是合适的，包括其任何功能等同物。
细胞内信号传导结构域可以选自表1的任何一个结构域。在一些情况下， 可以修饰结构域，使得与参考结构域的同一性可以为约50％至约100％。可以 修饰表1的任何一个结构域，使得修饰形式可以包含约50、60、70、80、90、 95、96、97、98、99或至多约100％的同一性。
CAR的细胞内信号传导区可以进一步包含一个或多个共刺激结构域。细胞 内信号传导区可以包含单个共刺激结构域，例如ζ链(第一代CAR)或其与CD28 或4-1BB(第二代CAR)。在其他实例中，细胞内信号传导区可以包含两个共刺激 结构域，例如CD28/OX40或CD28/4-1BB(第三代)。
与细胞内信号结构域如CD8一起，这些共刺激结构域可以产生激酶途径的 下游激活，从而支持基因转录和功能性细胞反应。CAR的共刺激结构域可以激 活与CD28(磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶)或4-1BB/OX40(TNF-受体相关因子衔 接蛋白)途径以及MAPK和Akt激活相关的近端信号蛋白。
在某些情况下，通过CAR产生的信号可能与辅助或共刺激信号相结合。对 于共刺激信号结构域，嵌合抗原受体样复合物可被设计成包含若干可能的共刺 激信号结构域。如本领域众所周知的，在幼稚T细胞中，T细胞受体的单独接合 不足以诱导T细胞的完全活化为细胞毒性T细胞。完整的生产性T细胞激活需要 第二共刺激信号。已经报道对T细胞活化提供共刺激的几种受体，包括但不限 于CD28、OX40、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BBL、 MyD88和4-1BB。这些共刺激分子使用的信号传导途径均能与主T细胞受体激活 信号协同作用。这些共刺激信号传导区域提供的信号可以与源自一个或多个 ITAM基序(例如CD3zeta信号转导域)的主效应激活信号协同作用，并且可以完 成T细胞激活的要求。
在一些情况下，向嵌合抗原受体样复合物添加共刺激结构域可以增强工程 细胞的功效和耐久性。在另一个实施方案中，T细胞信号结构域和共刺激结构 域彼此融合从而构成信号传导区。
表1.共刺激结构域
本文所用的术语“调节”是指正向或负向改变。调节范例包括1％、2％、10％、25％、50％、75％、或100％变化。
本文所用的术语“治疗”是指在试图改变个人或处理细胞引起的的疾病过程 中的临床干预，既可以进行预防也可以在临床病理过程干预。治疗效果包括但 不限于，防止疾病的发生或复发、减轻症状、减少任何疾病直接或间接的病理 后果、防止转移、减慢疾病的进展速度、改善或缓解病情、缓解或改善预后等。
本文所用的术语“免疫功能低下”是指受试者具有免疫缺陷，其很容易被感 染。引起机会感染的生物体通常情况下不会导致具有健康免疫系统生病，但能 感染免疫系统功能低下或免疫系统受抑制的人。
本文所用的术语“组成性表达”是指在所有的生理条件下的表达。
本文所用的术语“诱导表达”是指在一定条件下的表达，所述的条件例如T 细胞与抗原发生结合的时候。本领域技术人员如何进行常规的“诱导表达”。
免疫应答细胞
在一些实施方案中，本发明提供了一种免疫应答细胞，该细胞表达特异结 合GPC3的受体和外源性IL12。
在一些实施方案中，所述的外源性IL12是组成性表达或诱导性表达；优选 诱导性表达，例如，利用诱导型启动子；优选NFAT6启动子。
在一些实施方案中，所述结合抗原的受体的跨膜区可以选自CD8或CD28 等蛋白的跨膜区。人CD8蛋白是个异二聚体，由αβ或者γδ两条链组成。在一些 实施方案中，跨膜区选自CD8α或者CD28的跨膜区。此外，CD8α铰链区(hinge) 是一个柔性区域，因此，CD8或CD28和跨膜区加上铰链区被用于将结合抗原的 受体CAR的靶点识别结构域scFv和胞内信号区连接起来。
本发明的胞内信号结构域可以选自CD3ζ、FcεRIγ、CD28共刺激信号结构 域、CD137共刺激信号结构域、及其组合。CD3分子由五个亚单位组成，其中 CD3ζ亚单位(又称CD3zeta，简称Z)含有3个ITAM基序，该基序是TCR-CD3复 合体中重要的信号转导区。此外，如前所述，CD28和CD137是共刺激信号分子， 在与各自配体结合后其胞内信号区段产生的共刺激作用引起免疫应答细胞(主 要是T淋巴细胞)的持续增殖，并能够提高免疫应答细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞 因子的水平，提高CAR免疫应答细胞在体内的存活周期和抗肿瘤效果。在一些 实施方案中，所述的细胞内的信号转导域是CD3ζ信号结构域或CD3ζ信号结构域与其它共刺激信号如CD28的组合。
在一些实施方案中，本发明的免疫应答细胞中可以包括表达构建物，该表 达构建物中存在按如下方式顺序连接的元件：抗体、CD28共刺激信号结构域、 CD3ζ，以及与前述元件反向连接的NFAT6、IL12表达单元。较佳地，所述的抗 体与CD28共刺激信号结构域之间通过CD8α跨膜区和CD8α铰链区相连。
在一些实施方案中，活化T细胞核因子NFAT(Nuclear factor of activated Tcells)在T细胞活化过程中细胞因子的转录表达起着重要的作用。基于这样考虑， 本发明人将IL12的编码序列置于NFAT6启动子的调控之下，这样只有当CAR-T 细胞接触抗原引发T细胞活化，IL12才能高水平表达。
NFAT6启动子是利用6个NFAT的结合位子与IL2的最小启动子(minimal promoter)串联在一起组成的启动子(Hooijberg E,Bakker AQ,Ruizendaal JJ, Spits H.NFAT-controlled expression of GFP permits visualization and isolation of antigen-stimulated primary human Tcells.Blood.2000Jul 15；96(2):459-66)，可 用于调节细胞因子如IL12等在T淋巴细胞如TCR-T中的表达(Zhang L,Kerkar SP, Yu Z,Zheng Z,YangS,RestifoNP,Rosenberg SA，Morgan RA.Improving adoptive T cell therapy bytargeting and controlling IL-12expression to the tumor environment.MolTher.2011Apr；19(4):751-9)。
根据本发明的一个方面，本发明也包括编码所述结合抗原的受体的核酸。 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的 多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。
本发明还提供了包含上述编码表达于免疫应答细胞表面的结合抗原的受 体蛋白的核酸的载体。在一个具体实施方案中，本发明使用的载体是一种慢病 毒质粒载体pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE。应理解，其它类型的病毒载体以 及非病毒载体，也是可以应用的。
本发明还包括包含上述载体的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感染 力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。 本领域内已知的其它可用于将外源基因转导入免疫应答细胞的病毒及其对应 的质粒载体也可用于本发明。
本发明的免疫应答细胞，其被转导有能表达结合抗原的受体和外源性IL12 的构建物，或表达载体，或包含该质粒的病毒。本领域常规的核酸转导方法， 包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。
本发明所述的免疫应答细胞还可以表达除了上述结合抗原的受体以外的 另一种结合抗原的受体。
本发明所述的免疫应答细胞还可以表达安全开关；较佳地，所述的安全开 关包括：iCaspase-9，Truancated EGFR或RQR8。
核酸
可以将编码目标结合抗原的受体或CAR的转基因并入细胞中。例如，可将 转基因并入免疫应答细胞，例如T细胞。当插入细胞时，转基因可以是互补 DNA(cDNA)片段，其是信使RNA(mRNA)的拷贝；或者位于其基因组DNA原始 区域的基因本身(含或不含内含子)。
编码转基因序列的核酸如DNA可以随机插入细胞的染色体。随机整合可以 由将核酸(例如DNA)引入细胞的任何方法产生。例如，该方法可以包括但不限 于电穿孔、超声、使用基因枪、脂转染、磷酸钙转染、使用树枝状大分子、显 微注射和使用包括腺病毒、AAV和逆转录病毒载体的病毒载体、和/或II型核酶。
编码转基因的DNA也可以设计成包括报告基因，从而可以通过报告基因的 活化检测转基因或其表达产物的存在。可以使用任何报道基因，例如上述那些。 通过在细胞培养物中选择其中报道基因已经被活化的细胞，可以选择含有转基 因的细胞。
CAR的表达可以通过表达测定法，例如qPCR或通过测量RNA的水平来验 证。表达水平也可以指示拷贝数。例如，如果表达水平非常高，这可以表明CAR 的多于一个拷贝被整合到基因组中。或者，高表达可以指示转基因整合在高转 录区域中，例如高度表达的启动子附近。也可以通过测量蛋白质水平来验证表 达，例如通过Western印迹。
在一些实施方案中，本发明的免疫应答细胞可以包含一种或多种转基因。 所述一种或多种转基因可以表达CAR蛋白，而该CAR蛋白识别并结合抗原上的 至少一个表位或结合抗原上的突变表位。CAR可以是功能性CAR。在一些实施 方案中本发明的免疫应答细胞可以包含一种或多种CAR，或者其可以包含单一 CAR和二次工程化受体。
如上所述，转基因可以以随机或位点特异性方式插入免疫反应性细胞的基 因组中。例如，可以将转基因插入到免疫细胞的基因组中的随机位点。这些转 基因可以是功能性的，例如，在插入到基因组中的任何地方中时是完全功能性 的。例如，转基因可以编码其自身的启动子，或者可以插入其内部启动子控制 的位置。或者，可以将转基因插入基因，例如基因的内含子或基因的外显子、 启动子或非编码区。可以插入转基因使得插入破坏基因，例如内源性免疫检查 点。
在一些情况下，一个以上拷贝的转基因可以插入到基因组内的多个随机位 点。例如，可将多个拷贝插入基因组中的随机位点。与转基因随机插入一次相 比，这可能导致整体表达增加。或者，转基因的拷贝可以插入到基因中，转基 因的另一拷贝可以插入到不同的基因中。可以靶向转基因，使其可以插入到免 疫反应性细胞的基因组中的特定位点。
在一些情况下，包含编码结合抗原的受体序列的多核酸可以采取质粒载体 的形式。质粒载体可以包含启动子。在某些情况下，启动子可以是组成型的。 在一些情况下，启动子是可诱导的。启动子可以是或可以衍生自CMV、U6、 MND或EF1a。在一些情况下，启动子可以与CAR序列相邻。在一些情况下，质 粒载体还包含剪接受体。在一些情况下，剪接受体可以与CAR序列相邻。启动 子序列可以是PKG或MND启动子。MND启动子可以是含有骨髓增生性肉瘤病 毒增强子修饰的MoMuLV LTR的U3区域的合成启动子。
在一些情况下，可以设计编码目标受体的多核酸，以通过非病毒技术递送 至细胞。在某些情况下，多核酸可以是良好的制造规范(GMP)兼容试剂。
编码目标结合抗原的受体或CAR的多核酸的表达可以由一种或多种启动 子控制。启动子可以是普遍存在的，组成型(不受限制的启动子，允许相关基因 的连续转录)，组织特异性启动子或诱导型启动子。可以调节插入邻近或接近启 动子的转基因的表达。例如，转基因可插入到普遍存在的启动子附近或旁边。 一些普遍存在的启动子可以是CAGGS启动子、hCMV启动子、PGK启动子、SV40 启动子或ROSA26启动子。
启动子可以是内源的或外源的。例如，可以将一个或多个转基因插入到内 源或外源ROSA26启动子的邻近或接近处。此外，启动子可以是免疫反应性细 胞的特异性。例如，一个或多个转基因可以插入猪ROSA26启动子的邻近或接 近。
组织特异性启动子或细胞特异性启动子可用于控制表达的位置。例如，可 以将一个或多个转基因插入组织特异性启动子的邻近或接近。组织特异性启动 子可以是FABP启动子、Lck启动子、CamKII启动子、CD19启动子、角蛋白启 动子、白蛋白启动子、aP2启动子、胰岛素启动子、MCK启动子、MyHC启动 子、WAP启动子、或Col2A启动子。
也可以使用诱导型启动子。如果需要，可以通过添加或除去诱导剂来开启 和关闭这些诱导型启动子。预期诱导型启动子可以是但不限于Lac、tac、trc、 trp、araBAD、phoA、recA、proU、cst-1、tetA、cadA、nar、PL、cspA、T7、 VHB、Mx和/或Trex。
免疫细胞诱导型启动子
本文所用的术语“诱导型启动子”是一种受控的启动子，其在所期待的条件 未达成前不表达或者低表达与其可操作地连接的基因，而在所期待的条件达成 的情况下表达或者高水平表达与其可操作地连接的基因。例如，在一些实施方 中，本申请的诱导型启动子在细胞中的正常或高氧含量的条件下不表达或者低 表达与其可操作地连接的基因，而响应于细胞中降低的氧含量，在缺氧条件下 表达或者高表达与其可操作地连接的基因。在一些实施方案中，本文所用的诱 导型启动子包括低氧可诱导的转录因子-1α(Hypoxia-Inducible Transcription factor-1α,HIF-1α)。在在一些实施方案中，本文所用的术语“诱导型启动子”是 指“免疫细胞诱导型启动子”，其在免疫应答细胞接触抗原之前或免疫应答细胞 未被激活之时不表达或者低表达与其可操作地连接的基因，而仅在免疫应答细胞接触抗原或免疫应答细胞被激活时，才会驱动与其操作性连接的基因发生高 水平表达或者在缺氧等条件下表达。在一些实施方案中，所述的“免疫细胞诱导 型启动子”包括NFAT(活化T细胞核因子)型启动子。
本文所用的“NFAT型启动子”是指基于NFAT结合活性进行调控与其可操 作地连接的基因的表达的一类启动子。
NFAT是一个在免疫反应中具有重要作用的转录因子家族的统称。NFAT家 族的一个或多个成员在免疫系统的大多数细胞中表达。NFAT也参与心脏、骨 骼肌和神经系统的发育。
NFAT转录因子家族由五个成员NFATc1，NFATc2，NFATc3，NFATc4和 NFAT5组成。NFATc1至NFATc4受钙信号调节。钙信号对NFAT激活至关重要， 因为钙调蛋白(CaM)激活丝氨酸/苏氨酸磷酸酶钙调神经磷酸酶(CN)。活化的CN 使NFAT蛋白氨基末端的丝氨酸丰富区域(SRR)和SP重复序列快速脱磷酸化，导 致构象变化，暴露核定位信号，导致NFAT输入核中。
基于NFAT在T细胞活化过程中细胞因子的转录表达所起的作用，其可用于 调控本文所述的免疫细胞诱导型启动子，从而在免疫应答细胞接触抗原活化 时，表达或者高水平表达与其可操作地连接的基因。在一些实施方案中，本文 所述的“NFAT型启动子”中可包括多于1个NFAT结合位点。例如，所述“NFAT 型启动子”可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个NFAT结合位点。在一 些实施方案中，所述“NFAT型启动子”可以是多个所述NFAT结合位点与启动子 如IL2最小启动子串联所组成的启动子。在一些实施方案中，本文所述的NFAT 型启动子包括6个NFAT结合位点，记作(NFAT)6。出于便利的目的，所述 (NFAT)6也记作NFAT6。在一些实施方案中，所述NFAT6也表示在所述NFAT 型启动子中的6个重复的NFAT结合位点。
此外，尽管不是表达必需的，但转基因序列还可以包括转录或翻译调控序 列，例如启动子、增强子、绝缘体、内部核糖体进入位点、编码2A肽和/或多 腺苷酸化信号的序列。
在一些情况下，可以使用逆转录病毒载体(γ-逆转录病毒或慢病毒载体)将 转基因导入免疫反应性细胞。例如，编码CAR的转基因或结合抗原的任何受体 或其变体或片段可被克隆到逆转录病毒载体中，并且可以由其内源性启动子、 逆转录病毒长末端重复序列、或对靶细胞类型特异性的启动子驱动。也可以使 用非病毒载体。非病毒载体递送系统可以包括DNA质粒、裸核酸和与递送载体 如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例 如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技 术将所选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。衍生自逆转录病毒如 慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳 定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体与衍生自逆转录病毒如鼠类白血病 病毒的载体相比具有附加优点，因为它们可以转导非增殖细胞。它们还具有低 免疫原性的附加优点。腺病毒载体的优点是它们不融合到靶细胞的基因组中， 从而绕过负面的整合相关事件。
可以用编码所述结合抗原的受体的转基因转染细胞。转基因浓度可以为约100皮克至约50微克。在一些情况下，可以改变引入细胞的核酸(例如，ssDNA、 dsDNA或RNA)的量以优化转染效率和/或细胞活力。例如，可以向每个细胞样 品中加入1微克dsDNA用于电穿孔。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活 力所需的核酸(例如，双链DNA)的量根据细胞类型而不同。在一些情况下，用 于每个样品的核酸(例如，dsDNA)的量可以直接对应于转染效率和/或细胞活 力。例如，一系列转染浓度。由载体编码的转基因可以整合到细胞基因组中。 在一些情况下，由载体编码的转基因前向整合。在其他情况下，由载体编码的 转基因的反向整合。
在一些情况下，免疫反应性细胞可以是由CD45RO(-)、CCR7(+)、 CD45RA(+)、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和/或IL-7Rα+组成的干记忆 TSCM细胞，所述干记忆细胞还可以表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3和/或LFA-1， 并且显示出与所述干记忆细胞不同的许多功能属性。或者，免疫反应性细胞还 可以是包含L-选择素和CCR7的中枢记忆体TCM细胞，其中中枢记忆细胞可以 分泌例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。免疫反应性细胞还可以是包含L-选择蛋 白或CCR7的效应记忆TEM细胞，并产生例如效应细胞因子如IFNγ和IL-4。
通常通过全身给药(例如静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内输注)或局部 应用，通过给予个体患者体内递送载体，如下所述。或者，载体可以离体递 送到细胞，例如从个体患者(例如，淋巴细胞、T细胞、骨髓抽吸物、组织活检) 移出的细胞，然后通常在选择并入了该载体的细胞后将细胞再植入患者体内。 在选择之前或之后，可以扩增细胞。
用于表达结合抗原的受体的合适的免疫反应性细胞可以是对于有需要的 个体是自体的或非自体的细胞。
可以从个体获得合适的免疫应答细胞的来源。在某些情况下，可以获得T 细胞。所述T细胞可以从许多来源获得，包括PBMC、骨髓、淋巴结组织、脐带 血、胸腺组织和来自感染部位、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤的组织。在某 些情况下，可以使用任何数量的本领域技术人员已知的技术，例如FicollTM分 离，从自所述个体收集的血液获得T细胞。在一个实施方案中，通过单采血获 得来自个体的循环血液的细胞。单采制品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单 核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方 案中，可以洗涤通过单采采集收集的细胞以除去血浆级分并将细胞置于合适的 缓冲液或培养基中用于随后的加工步骤。
或者，可以从健康供体，来自诊断患有癌症的患者或诊断为感染的患者衍 生细胞。在一些实施方案中，细胞可以是具有不同表型特征的混合细胞群体的 一部分。还可以根据前述方法从转化的T细胞获得细胞系。还可以从细胞治疗 库获得细胞。可以通过本文所述的任何方法获得对免疫抑制治疗有抗性的修饰 细胞。还可以在修饰前选择合适的细胞群。修饰后也可以选择工程细胞群。工 程细胞可用于自体移植。或者，细胞可用于同种异体移植。在一些情况下，将 细胞施用于样品用于鉴定癌症相关靶序列的同一患者。在其他情况下，将细胞 施用于不同于其样本用于鉴定癌症相关靶序列的患者的患者。
在一些情况下，合适的原代细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、外周血淋 巴细胞(PBL)和其它血液细胞亚群，例如但不限于T细胞、天然杀伤细胞、单核 细胞、天然杀伤剂T细胞、单核细胞前体细胞、造血干细胞或非多能干细胞。 在一些情况下，细胞可以是任何免疫细胞，包括任何T细胞如肿瘤浸润细胞 (TIL)，如CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或任何其他类型的T细胞。 T细胞还可以包括记忆T细胞、记忆干T细胞或效应T细胞。也可以从大量群体中 选择T细胞，例如从全血中选择T细胞。T细胞也可以从大量群体中扩增。T细胞 也可能倾向于特定种群和表型。例如，T细胞可以倾斜于表型包含CD45RO(-)、 CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。合适 的细胞可以选自以下列表中的一种或多种标志物：CD45RO(-)、CCR7(+)、 CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。合适的细胞还包 括干细胞，例如，例如胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、造血干细胞、神经元 干细胞和间充质干细胞。合适的细胞可以包含任何数量的原代细胞，例如人细 胞、非人细胞和/或小鼠细胞。合适的细胞可以是祖细胞。合适的细胞可以衍生 自要治疗的受试者(例如，患者)。
患者中需要的治疗有效的细胞的量可以根据细胞的存活力和细胞被遗传 修饰的效率而变化(例如，转基因被整合到一个或多个细胞中的效率，或者由转 基因编码的蛋白质的表达水平)。在一些情况下，遗传修饰后细胞存活力的产物 (例如，倍增)和转基因整合的效率可以对应于可用于给予受试者的细胞的治疗 量。在一些情况下，遗传修饰后细胞存活力的增加可能对应于给予治疗对患者 有效的必需细胞量的减少。在一些情况下，转基因整合到一个或多个细胞中的 效率的增加可以对应于给予在患者中治疗有效的必需的细胞数量的减少。在一 些情况下，确定所需的治疗有效的细胞的量可以包括确定与细胞随时间变化相 关的功能。在一些情况下，确定需要治疗有效的细胞的量可以包括确定与根据 时间相关变量将转基因整合到一个或多个细胞中的效率变化相对应的功能(例 如，细胞培养时间、电穿孔时间、细胞刺激时间)。在一些情况下，治疗有效的 细胞可以是细胞群，其包含在细胞表面上约30％至约100％的结合抗原的受体 的表达。在一些情况下，通过流式细胞术测量，治疗有效的细胞可以在细胞表 面上表达所述结合抗原的受体约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或超过约99.9％。
在一些情况下，当所述结合抗原的受体存在于细胞的质膜上时，并且当通 过结合靶标而被活化时，可以导致具有对于其细胞表面表达所述结合抗原的受 体能够结合的靶标的细胞的毒性。例如，在某些情况下，当细胞存在于细胞的 质膜中时，细胞可以是细胞毒性细胞(例如，NK细胞或细胞毒性T淋巴细胞)， 本文所述的结合抗原的受体，并且当其通过结合其靶标而被激活时可以增加细 胞毒性细胞对靶细胞的细胞毒性活性。例如，在一些情况下，本文所述的结合 抗原的受体，当通过其靶标的结合而被激活时，与对不存在结合靶的细胞的细 胞毒性相比，可以使细胞毒性增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、 至少10倍或更多10倍。
药物组合物
本发明的免疫应答细胞可以应用于制备药物组合物。所述的药物组合物除 了包括有效量的免疫应答细胞，还可包含药学上可接受的载体。术语“药学上可 接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利 的、过敏的或其它不良反应。
可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是抗氧化剂； 防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年 龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。 给药方式例如可以采用肠胃外给药(如注射)或其它治疗方式。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.) 或胸骨内注射或输注技术。
给予个体的包含免疫反应性细胞群体的制剂包含有效治疗和/或预防特定 适应症或疾病的多个免疫反应性细胞。因此，可以向个体施用免疫反应性细胞 的治疗有效群体。通常，施用包含约1×104至约1×1010个免疫反应性细胞的制剂。 在大多数情况下，制剂将包含约1×105至约1×109个免疫反应性细胞、约5×105至约5×108个免疫反应性细胞、或约1×106至约1×107个免疫反应性细胞。然而， 根据癌症的位置、来源、身份、程度和严重程度、待治疗的个体的年龄和身体 状况等，对个体施用的CAR免疫反应性细胞的数量将在宽的范围之间变化。医 生将最终确定要使用的适当剂量。
在一些实施方案中，使用嵌合抗原受体来刺激免疫细胞介导的免疫应答。 例如，T细胞介导的免疫应答是涉及T细胞活化的免疫应答。活化的抗原特异 性细胞毒性T细胞能够在表面上显示外源抗原表位的靶细胞中诱导细胞凋亡， 例如显示肿瘤抗原的癌细胞。在另一个实施方案中，使用嵌合抗原受体在哺乳 动物中提供抗肿瘤免疫。由于T细胞介导的免疫应答，受试者将产生抗肿瘤免 疫。
在某些情况下，治疗患有癌症的受试者的方法可以涉及向需要治疗的受试 者施用一种或多种本发明所述的免疫应答细胞。所述免疫应答细胞可结合肿瘤 靶分子并诱导癌细胞死亡。如前文所述，本发明还提供治疗个体中的病原体感 染的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的本发明的免疫应答细胞。
本发明的免疫反应性细胞的给药频率将根据包括所治疗疾病的因素、特定 免疫反应性细胞的元件和给药方式。如本文所述，由于本申请的免疫应答细胞 具有改善的活力，从而可以不仅以与类似的但不表达外源性IL12的免疫应答细 胞更低的治疗有效的量给药，并且可以以更低的频率给药，以获得至少类似、 并且优选更加显著的疗效。
与抗肿瘤药物联合
在一些实施方案中，本发明的免疫应答细胞可以与另一治疗剂联合给药。 在一些实施方案中，所述另一治疗剂是化疗药。可以与本发明的免疫应答细胞 联合应用的化疗药物包括但不限于有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)，包括长春 新碱、长春花碱、长春地辛和诺维宾(TM)(长春瑞滨，5'-去氢硫化氢)；拓扑异 构酶I抑制剂，例如喜树碱化合物，包括CamptosarTM(伊立替康HCL)、 HycamtinTM(托泊替康HCL)和衍生自喜树碱及其类似物的其它化合物；鬼臼毒 素衍生物，例如依托泊苷、替尼泊苷和米多昔佐兹；烷基化剂顺铂、环磷酰胺、 氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、布列喹嗪、尿 嘧啶芥末、氯洛芬和达卡巴嗪；抗代谢物，包括阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶 呤、巯嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼；抗生素，包括但不限于多柔比星、博来霉 素、更生霉素、柔红霉素、霉素霉素、丝裂霉素、肉瘤霉素C和道诺霉素；以 及其它化疗药物，包括但不限于抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮胞苷、阿姆沙康、 美法仑、异环磷酰胺和米托蒽醌。
在一些实施方案中，可以与本发明的免疫应答细胞联合应用的化疗药物包 括但不限于抗血管生成剂，包括抗VEGF抗体(包括人源化和嵌合抗体、抗VEGF 适体和反义寡核苷酸)以及其他血管发生抑制剂，例如血管抑素、内皮抑制素、 干扰素、视黄酸和金属蛋白酶-1和-2的组织抑制剂。
试剂盒
本发明还提供了包含本发明免疫应答细胞的试剂盒。所述试剂盒可用于治 疗或预防癌症、病原体感染、免疫病症或同种异体移植。在一个实施方案中， 试剂盒可以包括含有有效量的包含一种或多种单位剂型的免疫应答细胞的治 疗或预防组合物。
在一些实施方案中，试剂盒包含可含有治疗或预防性组合物的无菌容器。
在一些情况下，试剂盒可以包括约1×104个细胞至约1×106个细胞。在一些 情况下，试剂盒可以包括至少约1×105个细胞，至少约1×106个细胞，至少约1×107个细胞，至少约4×107个细胞，至少约5×107个细胞，至少约6×107个细胞，至少 约6×107个细胞，8×107个细胞，至少约9×107个细胞，至少约1×108个细胞，至 少约2×108个细胞，至少约3×108个细胞，至少约4×108个细胞，至少约5×108个 细胞，至少约6×108个细胞，至少约6×108细胞，至少约8×108个细胞，至少约9×108细胞，至少约1×109个细胞，至少约2×109个细胞，至少约3×109个细胞，至少约 4×109个细胞，至少约5×109个细胞，至少约6×109个细胞，至少约8×109个细胞， 至少约9×109个细胞，至少约1×1010个细胞，至少约2×1010个细胞，至少约3×1010个细胞，至少约4×1010个细胞，至少约5×1010个细胞，至少约6×1010个细胞，至 少约9×1010个细胞，至少约9×1010个细胞，至少约1×1011个细胞，至少约2×1011个细胞，至少约3×1011个细胞，至少约4×1011个细胞，至少约5×1011个细胞，至 少约8×1011个细胞，至少约9×1011个细胞，或至少约1×1012个细胞。例如，可以 在试剂盒中包括大约5×1010个细胞。
在一些情况下，试剂盒可以包括同种异体细胞。在一些情况下，试剂盒 可以包括可以包含基因组修饰的细胞。在一些情况下，试剂盒可以包含“现成 的”细胞。在一些情况下，试剂盒可以包括可以扩展用于临床使用的细胞。在 某些情况下，试剂盒可能包含用于研究目的的内容物。
自体淋巴细胞输注可用于治疗。可以从需要治疗的患者收集自体外周血单 核细胞(PBMC)，并且可以使用本文所述和本领域已知的方法活化和扩增T细 胞，然后注入患者体内。在其他情况下，同种异体细胞可用于治疗患者。
本文公开的方法可以包括移植。移植可以指细胞产品的过继性移植。移 植可以是自体移植、同种异体移植、异种移植或任何其他移植。例如，移植 可以是异种移植。移植也可以是同种异体移植。
实施例1.GPC3-CAR-T细胞/IL12-GPC3-CAR T细胞的制备
1、质粒构建
本实施例所采用的嵌合抗原受体为二代的嵌合抗原受体，采用的靶向 GPC3的受体的胞外域的scFv的核苷酸编码序列如SEQ ID NO：1所示，，还具 有CD28的跨膜域、CD28的胞内域、及CD3ζ。参照图1A所示，分别构建 GPC3-CAR-T细胞和IL12-GPC3-CAR T细胞的质粒，具体如下：
GPC3-CAR-T序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO：2)、靶向GPC3的scFv(SEQ ID NO：1)、CD8的hinge区(SEQ ID NO：3)、CD28跨膜区(SEQ ID NO：6)和 胞内信号传导结构域(SEQ IDNO：4)以及CD3的胞内段CD3ζ(SEQ ID NO：5) 组成。
IL12-GPC3-CAR的质粒是在GPC3-CAR-T质粒的基础上插入了 NFAT6-IL12序列，构建了表达GPC3的二代嵌合抗原受体以及IL12的慢病毒质 粒。NFAT6-IL12序列是由6*NFATbinding motif(SEQ ID NO：7)、IL2minimal promoter(SEQ ID NO：8)、IL12信号肽和IL12p40(SEQ ID NO：10)、 (G4S)3Linker(SEQ ID NO：9)、IL12p35(SEQ ID NO：11)、PA2(SEQ ID NO： 20)组成。
2、慢病毒包装、病毒浓缩及滴度测定
a.慢病毒包装
1)以5×106的密度接种培养至第6～10代的293T细胞于培养皿中，37℃，5％ CO2培养过夜，培养基为含10％胎牛血清(Gibico)的DMEM；
2)分别将目的基因质粒GPC3-CAR-T和IL12-GPC3-CAR T 5.4μg与包装质 粒pRsv-REV 6.2μg、RRE-PMDLg 6.2μg、Vsvg 2.4μg溶入800μL空白DMEM 培养液，混匀，得质粒混合液；
3)将60μg PEI(1μg/μl)溶解于800μl的无血清DMEM培养液中，室温孵育 5min，得PEI混合液；
4)将质粒混合液加入PEI混合液中混匀，室温下孵育20min，形成转染复 合物；
5)将转染复合物1.6ml滴加入含11ml DMEM培养基的10cm培养皿中， 4-5h小时后，用10％FBS的DMEM培基给转染的293T细胞换液，37℃孵育72h， 收集病毒液上清。
b.慢病毒浓缩
1)5XPEG8000NaCl配制：称取NaCl 8.766g、PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121℃湿热灭菌30min，保存在4℃；
2)使用0.45μm滤头过滤病毒上清液，每30ml过滤后的病毒初始液，加入 5X PEG-8000NaCl母液7.5ml；每20～30min混合一次，共进行3-5次；4℃放 置过夜，离心后吸弃上清，静置并去除残余液体；加入适量的慢病毒溶解液溶 解慢病毒沉淀；集中后的病毒悬液-80℃储存。
流式细胞仪检测所得的慢病毒滴度，以阳性率为5～20％的细胞数为宜，计 算滴度(U/mL)＝细胞数目×阳性率/病毒体积，浓缩后的病毒滴度分别为：
GPC3-CAR-T：2.4×108U/ml
IL12-GPC3-CAR T：1×108U/ml
3、GPC3-CAR-T细胞、IL12-GPC3-CAR T细胞的制备
1)采用抗CD3和CD28抗体的磁珠(Invitrogen)进行T淋巴细胞活化；
2)感染前一天，RetroNectin包被24孔板：每孔加入380μl 5μg/ml的 RetroNectin溶液(PBS)，4℃孵育过夜；
3)弃去24孔板中的RetroNectin溶液(PBS)，1ml PBS洗两次；将活化后的T 细胞接种于包被了retronectin的24孔板内，每孔细胞数目5×105，培养液体积 500μl；按照MOI＝15在PBMC细胞中加入浓缩后的慢病毒，32℃，1800rpm， 离心40min后，转移至细胞培养箱中；
4)扩增培养：感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同 时在淋巴细胞培养液中补加终浓度500U/mL的重组人IL-2。
采用本领域常规的操作流式检测GPC3-CAR-T细胞/IL12-GPC3-CAR T阳 性率(纯度)测定(测定方法为本领域常规的方法，如Kowolik et al.,2006所公开 的方法)，结果如图1B所示，UTD是未转染CAR的T细胞，GPC3-CAR是转染了 pRRLSIN.cPPT.EF-1α-9F2-28Z的T细胞，IL12-GPC3-CAR是转染了 pRRLSIN.cPPT.EF-1α-9F2-28Z-NFAT6-IL12的T细胞，结果显示 9F2-28Z/9F2-28Z-NFAT6-IL12表面均有较高水平的CAR表达。
实施例2、靶向GPC3CAR-T/IL12-GPC3-CAR T细胞的细胞毒性测定
采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)检测细胞毒 性，具体参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
1)靶细胞：选择Huh-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1细胞为靶细胞，其中， Huh-7细胞、PLC/PRF/5细胞为GPC3阳性，SK-HEP-1细胞为GPC3阴性；
2)效应细胞：按效靶比3:1、1:1或1:3加UTD、GPC3-CAR-T及 IL12-GPC3-CAR T细胞；
实验结果如图2所示，相比UTD组，GPC3-CAR-T/IL12-GPC3-CAR T在体 外毒性实验中均显示了较强的细胞毒作用，且两者之间没有明显差别。对于 GPC3阴性的肝癌细胞，GPC3-CAR-T/IL12-GPC3-CAR T没有增强的杀伤作用。
实施例3、GPC3-CAR-T/IL12-GPC3-CAR T细胞因子分泌情况
将UTD/GPC3-CAR-T/IL12-GPC3-CAR T与肝癌细胞系Huh-7、PLC/PRF/5、 SK-HEP-1细胞1:1共孵24h后收上清，ELISA检测上清中细胞因子分泌水平。
其中检测TNF-α、IL12的样品不需稀释，检测IL2、IFN-γ的样品分别稀释 20倍和25倍。ELISA试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。结果如图 3A和3B所示。图3A显示了在与GPC3+的肿瘤细胞Huh-7、PLC/PRF/5共孵时 IL12-GPC3-CAR T有较高水平IL12的分泌，在与GPC3-的肿瘤细胞SK-HEP-1共 孵时几乎检测不到IL12，说明该CAR-T细胞只有在识别GPC3的情况下，才会分 泌IL12。图3B为检测UTD/GPC3-CAR-T/IL12-GPC3-CAR T与肿瘤细胞共孵育 24h时细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ释放情况，显示了IL12-GPC3-CAR T明显分泌更多的IFN-γ。
实施例4、GPC3-CAR-T/IL12-GPC3-CAR T对内源性中高GPC3表达的 Huh-7皮下移植瘤的治疗效果
1、NOD/SCID小鼠接种Huh-7皮下移植瘤
通过皮下接种Huh-7细胞，2×106/只，约10天后瘤体积达到300mm3；通过 随机分组方式，每组6只小鼠；
2、制备并扩增UTD/GPC3-CAR-T/IL12-GPC3-CAR T细胞；
3、对Huh-7移植瘤进行UTD/GPC3-CAR-T/IL12-GPC3-CAR T细胞过继免疫 治疗
1)皮下移植瘤在10天进行腹腔环磷酰胺注射(100mg/kg)；
2)D10天，测量NOD/SCID小鼠移植瘤体积并进行随机分组。皮下移植瘤 小鼠共分为3组，包括：UTD组、GPC3-CAR-T组、IL12-GPC3-CAR T组，每组 小鼠6只；
3)D12天，对分组后的NOD/SCID小鼠细胞过继免疫治疗。通过尾静脉注 射，给予低剂量的CAR-T，给药剂量为1x107细胞/只小鼠；
4)每隔3-4天测量Huh-7皮下移植瘤体积的大小，记录每组小鼠瘤体积的变 化，并绘制瘤体积随时间的生长曲线。结果如图4A和图4B所示。
图4A显示了Huh-7皮下移植瘤的生长情况，在给予CAR-T细胞2天后， IL12-GPC3-CAR T即显示出显著的肿瘤抑制和杀伤作用，而GPC3-CAR-T组， 肿瘤从第14天开始，一直呈现增大趋势，与空白对照组差别不大。说明对于 GPC3-CAR不能控制的肿瘤，IL12-GPC3-CART仍显示出优异的杀伤活性。
图4B显示给予IL12-GPC3-CAR T后，与GPC3-CAR-T组和空白对照组小鼠 的体重无明显差别，说明虽然IL12-GPC3-CAR T显示出显著的抗肿瘤效果，但 没有引起治疗相关体重下降副作用。并且，对实验组的小鼠观察，发现给予 IL12-GPC3-CAR T后的小鼠也没有出现明显的毒副作用。
在CAR-T注射后第7天和第10天分别尾静脉取血，流式检测CAR-T细胞的 存活情况，结果如图5所示，显示了第7天时GPC3-CAR-T组的CAR-T细胞存活 数已低于6000个/μL，IL12-GPC3-CAR T组则达到近8000个/μL，在第10天时 GPC3-CAR-T组的CAR-T细胞显著降低，已低于2000个/μL，IL12-GPC3-CAR T 仍保持较高的细胞存活，与第7天时IL12-GPC3-CAR T的数据相比，差别不大， IL12-GPC3-CAR T组与GPC3-CAR-T组相比，外周血中CAR-T细胞数量高至少 75％(计算方法：IL12-GPC3-CAR T组-GPC3-CAR-T组/IL12-GPC3-CAR T组)，说明IL12-GPC3-CAR T在体内的细胞存活远远优于不含有IL12的CAR-T产品。
在Day10取小鼠外周血，对血清样本进行ELISA检测IFN-γ，检测方法同实 施例3，结果如图6所示，显示了IL12-GPC3-CAR T组小鼠血液中的IFN-γ远远高 于GPC3-CAR-T组。
实验结束时取其皮下瘤，对肿瘤组织中浸润型T细胞以及Ki67进行免疫组 化检测，结果如图7所示，IL12-GPC3-CAR T组CAR-T浸润明显多于 GPC3-CAR-T组，IL12-GPC3-CAR T组的核增殖Marker Ki67明显少于其他两组， Ki67的减少说明肿瘤内增殖的细胞减少，即说明IL12-GPC3-CAR T可以有效清 除GPC3+的肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的增殖。
实验结束时安乐死小鼠并称重其皮下瘤，结果如图8A和图8B所示， IL12-GPC3-CAR T组在实验结束时无论是肿瘤体积还是肿瘤重量都明显低于二 代CAR-T组，具有显著的统计学差异。
实施例5、小鼠CAR-T(mGPC3-CAR)及m-IL12-GPC3-CAR T(小鼠 CAR-IL12)细胞的制备
为了进一步验证IL12在免疫健全小鼠中调动固有免疫的作用，制备了鼠源 的CAR-T。
1、质粒构建
将鼠CD8α信号肽(SEQ ID NO：12)、抗GPC3单抗抗体(SEQ ID NO：1)、 鼠CD8α胶链区及跨膜区(SEQ ID NO：13)、鼠CD28胞内域(SEQ ID NO：14)、 鼠CD3ζ胞内域(SEQ ID NO：15)的基因序列依次连接，通过体外基因合成的方 法获得GPC3-CAR-T基因片段，并用MluⅠ和SalⅠ双酶切位点置换逆转录病毒 载体MSCV-IRES-GFP中的IRES-GFP片段，获得重组载体MSCV-GPC3-CAR-T。 Mouse CAR-IL12(m-IL12-GPC3-CAR T)是在MSCV-GPC3-CAR-T质粒的基础上 插入了mNFAT6-mIL12序列，构建了表达GPC3的二代嵌合抗原受体以及mIL12 的质粒，MSCV-IL12-GPC3-CAR T。mNFAT6-mIL12序列是由6*mNFAT binding motif(SEQ ID NO：16)、mIL2minimal promoter(SEQ ID NO：17)、mIL12信号 肽和mIL12p40(SEQ ID NO：18)、(SG4)3Linker(SEQ ID NO：9)、mIL12p35(SEQ ID NO：19)、PA2(SEQ ID NO：20)组成。
2、逆转录病毒包装
1)以5×106的密度接种培养至第6～10代的293T细胞于10cm培养皿中， 37℃，5％CO2培养过夜，培养基为含10％胎牛血清(Gibico)的DMEM；
2)分别将9μg MSCV-GPC3-CAR-T或 MSCV-GPC3-CAR-T-mNFAT6-mIL12与9μg包装质粒pCL-Eco溶入800μL无血 清DMEM培养液，混匀，得到质粒混合液；将54μg PEI(1μg/μl)溶解于800μl 的无血清DMEM培养液中，混匀，室温孵育5min，得到PEI混合液；
3)将质粒混合液加入PEI混合液中混匀，室温下孵育20min，形成转染复 合物；
4)将转染复合物1.6ml滴加入含11ml DMEM培养基的10cm培养皿中， 4-5h小时后，用10％FBS的DMEM培基给转染的293T细胞换液，37℃孵育72h， 收集病毒液上清，得到携带mGPC3-CAR-T/mGPC3-CAR-T-mNFAT6-mIL12的 逆转录病毒。
4、小鼠CAR-T淋巴细胞的制备
取健康Balb/c小鼠，采用Cell isolation kit(STEMCELL Technologies)，按照说明书所述，分离得到小鼠脾脏T淋巴细胞。
将纯化的小鼠CD3+T淋巴细胞按1:1加入Dynabeads Mouse T-activator CD3/CD28(PBS清洗一次)，放培养箱培养，培养基为RPMI 1640完全培养基， 进行活化。
将活化24h的小鼠脾脏T淋巴细胞接种于retronectin包被的48孔板中，每孔 细胞数目1×106，加入1ml mGPC3-CAR-T/mGPC3-CAR-T-mNFAT6-mIL12的逆 转录病毒，补充培养基至2mL，2000g，32℃，离心90min后，转移至细胞培养 箱继续培养；第二天更换新鲜培养基，调整细胞密度为5×105/mL，每2-3天进行 传代。
mCAR-T细胞嵌合抗原受体表达测定：
取1×106的mCAR-T/mIL12-GPC3-CAR T细胞，二等分于2ml离心管内，4 度，400g，离心5min，弃上清，PBS洗两次。对照组细胞加入50μl PE-SA(1:200 稀释)抗体冰上孵育45min，PBS(2％NBS)洗两次；重悬后作为对照；检测组细 胞加入50μl 1:50稀释的biotin-Goat anti human IgG，F(ab’)2抗体，冰上孵育45 min；PBS(2％NBS)洗两次；加入50μl PE-SA(1:200稀释)抗体冰上孵育45min。
加入2ml PBS(2％NBS)重悬细胞，4℃，400g，离心5分钟弃上清；重复两 次，加入500μl PBS(2％NBS)，FACS检测，结果如图9所示，结果显示 m9F2-m28Z/m9F2-m28Z-mNFAT6-mIL12表面均有较高水平的CAR表达，UTD 是未转染CAR的mT细胞。
实施例6、靶向GPC3mCAR-T/mIL12-GPC3-CAR T细胞的细胞毒性测定
采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)，具体参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
1)靶细胞：分别接种50μL 2×105/mL的E0771-Parental、 E0771-Parental-GPC3、E0771-Recurrent(将E0771接种于小鼠成瘤后，对瘤组织 进行分离得到的细胞系)、E0771-Recurrent-GPC3细胞于96well板；
2)效应细胞：按效靶比3:1、1:1或1:3加UTD,mGPC3-m28Z及 mGPC3-m28Z-mNFAT6-mIL12细胞；
实验结果如图10所示，相比UTD组，mGPC3-CAR和mGPC3-m28Z-mNFAT6-mIL12(mIL12-GPC3-CAR T)在体外毒性实验中均显示 了较强的细胞毒作用，且两者之间没有明显差别。对于GPC3阴性的肿瘤细胞， mGPC3-CAR和mIL12-GPC3-CAR T没有增强的杀伤作用。
实施例7、mCAR-T/mIL12-GPC3-CAR T细胞因子分泌情况
将UTD/mGPC3-CAR/mIL12-GPC3-CAR T与E0771-Parental、 E0771-Parental-GPC3、E0771-Recurrent、E0771-Recurrent-GPC3细胞1:1共孵24h 后收上清后ELISA检测上清中细胞因子分泌水平。其中检测mTNF-α、mIL12、 mIL2的样品不需稀释，检测mIFN-γ的样品稀释50倍。ELISA试剂盒采用双抗体 夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗小鼠IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-12单克 隆抗体分别预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本 和生物素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的mIL-2、mTNF-α、mIFN-γ、mIL-12分别与固相抗体和检测抗体结合。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根 过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-HRP)。洗涤后TMB显色。颜色反应 的深浅与样本中上述细胞因子的浓度成正比。加入终止液终止反应，在450nm 波长(参考波长570-630nm)测定吸光度值。
结果如图11A和11B所示，图11A为检测UTD、mGPC3-CAR、 mGPC3-m28Z-mNFAT6-mIL12与肿瘤细胞共孵育24h时mIL-12的分泌情况，显 示了在与GPC3+的肿瘤细胞共孵时mGPC3-m28Z-mNFAT6-mIL12 (mIL12-GPC3-CAR T)有较高水平IL12的分泌，说明小鼠IL12的分泌也是可诱导 的。图11B为检测UTD/mGPC3-m28Z/mIL12-GPC3-CAR T与肿瘤细胞共孵育24h 时细胞因子mIL-2、mTNF-α、mIFN-γ释放情况，mIL12-GPC3-CAR T明显分泌 更多的IFN-γ。
实施例8、mGPC3-CAR-T/mIL12-GPC3-T对E0771-GPC3皮下移植瘤的治 疗效果
1、C57BL/6小鼠接种E0771-GPC3皮下移植瘤
通过皮下接种E0771-GPC3细胞，1×106/只，约10天后瘤体积达到300mm3； 通过随机分组方式，每组6只小鼠；
2、制备并扩增mUTD/mGPC3-CAR-T/mIL12-GPC3-T细胞；
3、对E0771-GPC3移植瘤进行mUTD/mGPC3-CAR-T/mIL12-GPC3-CAR-T 细胞过继免疫治疗
1)D10天，测量E0771-GPC3小鼠移植瘤体积并进行随机分组。皮下移植瘤 小鼠共分为5组，包括：UTD组、mGPC3-CAR-T 5×106组、mGPC3-CAR-T 2×106组、mIL12-GPC3-T 5×106组、mIL12-GPC3-T 2×106组，每组小鼠6只；
2)每隔3-4天测量E0771-GPC3皮下移植瘤体积的大小，记录每组小鼠瘤体 积的变化，并绘制瘤体积随时间的生长曲线。结果如图12A和图12B所示。
图12A显示了尾静脉注射mIL12-GPC3-T 5×106/只组和mIL12-GPC3-T 2×106/只组在实验结束时抑瘤效果相似，都有较好地抑瘤作用，抑瘤率均达90％ 以上，也说明了在IL12的协助下，在面对大肿瘤负荷时输注小剂量CAR-T仍可 达到理想效果，而反观mGPC3-CAR-T 5×106/只组体积虽然小于mUTD组，但无 统计学差异，考虑是由于注射CAR-T时瘤体积较大(300mm3)所致。
图12B显示给予mIL12-GPC3-T后，与mGPC3-CAR-T组和空白对照组小鼠 的体重无明显差别，说明虽然IL12-GPC3-T显示出显著的抗肿瘤效果，但没有 引起治疗相关体重下降副作用。
实验结束时安乐死小鼠并称重其皮下瘤，结果如图13A和图13B所示， mIL12-GPC3-T组在实验结束时无论是肿瘤体积还是肿瘤重量都明显低于二代 CAR-T组，具有显著的统计学差异。
本发明涉及的序列总结于下表
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 科济生物医药（上海）有限公司
上海市肿瘤研究所
<120> 靶向GPC3的免疫效应细胞及其应用
<130> P2018-1679
<150> CN2017108059914
<151> 2017-09-08
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcagc gactacgaga tgcactgggt gcggcaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatgggcgcc atccaccccg gcagcggcga caccgcctac 180
aaccagcggt tcaagggccg ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggttctac 300
agctacgcct actggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcgccggtgg aggcggttca 360
ggcggaggtg gttctggcgg tggcggatcg gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc 420
ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc atcagctgcc ggagcagcca gagcctggtg 480
cacagcaacg gcaacaccta cctgcagtgg tacctgcaga agcccggcca gagcccccag 540
ctgctgatct acaaggtgag caaccggttc agcggcgtgc ccgaccggtt cagcggcagc 600
ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc agccgggtgg aggccgagga cgtgggcgtg 660
tactactgca gccagagcat ctacgtgccc tacaccttcg gccagggcac caagctggag 720
atcaaacgt 729
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 3
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 4
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggccaaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 5
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339
<210> 6
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 7
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt caattgtcct cgacggagga aaaactgttt 120
catacagaag gcgtggagga aaaactgttt catacagaag gcgtggagga aaaactgttt 180
catacagaag gcgt 194
<210> 8
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acattttgac acccccataa tatttttcca gaattaacag tataaattgc atctcttgtt 60
caagagttcc ctatcactct ctttaatcac tactcacagt aacctcaact cctg 114
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggttct ggcggtggcg gatcg 45
<210> 10
<211> 984
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagt 984
<210> 11
<211> 594
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agaaacctcc ccgtggccac tccagaccca ggaatgttcc catgccttca ccactcccaa 60
aacctgctga gggccgtcag caacatgctc cagaaggcca gacaaactct agaattttac 120
ccttgcactt ctgaagagat tgatcatgaa gatatcacaa aagataaaac cagcacagtg 180
gaggcctgtt taccattgga attaaccaag aatgagagtt gcctaaattc cagagagacc 240
tctttcataa ctaatgggag ttgcctggcc tccagaaaga cctcttttat gatggccctg 300
tgccttagta gtatttatga agacttgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaat 360
gcaaagcttc tgatggatcc taagaggcag atctttctag atcaaaacat gctggcagtt 420
attgatgagc tgatgcaggc cctgaatttc aacagtgaga ctgtgccaca aaaatcctcc 480
cttgaagaac cggattttta taaaactaaa atcaagctct gcatacttct tcatgctttc 540
agaattcggg cagtgactat tgatagagtg atgagctatc tgaatgcttc ctaa 594
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atggcctcac cgttgacccg ctttctgtcg ctgaacctgc tgctgctggg tgagtcgatt 60
atcctgggga gtggagaagc t 81
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actactacca agccagtgct gcgaactccc tcacctgtgc accctaccgg gacatctcag 60
ccccagagac cagaagattg tcggccccgt ggctcagtga aggggaccgg attggacttc 120
gcctgtgata tttacatctg ggcacccttg gccggaatct gcgtggccct tctgctgtcc 180
ttgatcatca ctctcatctg ctaccacagg agccga 216
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<212> DNA
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aatagtagaa ggaacagact ccttcaaagt gactacatga acatgactcc ccggaggcct 60
gggctcactc gaaagcctta ccagccctac gcccctgcca gagactttgc agcgtaccgc 120
ccc 123
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcaggagtg cagagactgc tgccaacctg caggacccca accagctcta caatgagctc 60
aatctagggc gaagagagga atatgacgtc ttggagaaga agcgggctcg ggatccagag 120
atgggaggca aacagcagag gaggaggaac ccccaggaag gcgtatacaa tgcactgcag 180
aaagacaaga tggcagaagc ctacagtgag atcggcacaa aaggcgagag gcggagaggc 240
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agcactgcca ccaaggacac ctatgatgcc 300
ctgcatatgc agaccctggc c 321
<210> 16
<211> 192
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagaggaaaa tttgtttcat acagaaggcg ttaagaggaa aatttgtttc atacagaagg 60
cgttaagagg aaaatttgtt tcatacagaa ggcgttaaga ggaaaatttg tttcatacag 120
aaggcgttaa gaggaaaatt tgtttcatac agaaggcgtt aagaggaaaa tttgtttcat 180
acagaaggcg tt 192
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<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aacatcgtga cacccccata ttatttttcc agcattaaca gtataaattg cctcccatgc 60
tgaagagctg cctatcaccc ttgctaatca ctcctcacag tgacctcaag tcct 114
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg ttttgctggt gtctccactc 60
atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag aggtggactg gactcccgat 120
gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg aagaagatga catcacctgg 180
acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga ccctgaccat cactgtcaaa 240
gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag gcgagactct gagccactca 300
catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca ctgaaatttt aaaaaatttc 360
aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact ccggacggtt cacgtgctca 420
tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca agagcagtag cagttcccct 480
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atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg agtaccctga ctcctggagc 780
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atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt tcctcgtaga gaagacatct 900
accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag ctcaggatcg ctattacaat 960
tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc gatcc 1005
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<400> 19
agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60
accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120
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atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480
gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540
gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcc 579
<210> 20
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga g 51
<210> 21
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
130 135 140
Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
145 150 155 160
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220
Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
290 295 300
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
305 310 315 320
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
325 330 335
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
340 345 350
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
355 360 365
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
370 375 380
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
385 390 395 400
Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
405 410 415
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
420 425 430
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
435 440 445
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
450 455 460
Ala Leu Pro Pro Arg
465
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<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
130 135 140
Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
145 150 155 160
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220
Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
290 295 300
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
305 310 315 320
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
325 330 335
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
340 345 350
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
355 360 365
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
370 375 380
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
385 390 395 400
Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
405 410 415
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
420 425 430
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
435 440 445
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
450 455 460
Pro Pro Arg
465
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<211> 511
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
130 135 140
Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
145 150 155 160
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220
Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
290 295 300
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
305 310 315 320
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
325 330 335
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
340 345 350
Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
355 360 365
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
370 375 380
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln
435 440 445
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
450 455 460
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
465 470 475 480
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
485 490 495
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
130 135 140
Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
145 150 155 160
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220
Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
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Ile Lys Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
245 250 255
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
260 265 270
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
275 280 285
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
290 295 300
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
305 310 315 320
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
325 330 335
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
340 345 350
Leu Pro Pro Arg
355
<210> 25
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
130 135 140
Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
145 150 155 160
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220
Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg
<210> 26
<211> 540
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
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Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
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290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
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Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
325 330 335
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp
340 345 350
Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala
355 360 365
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370 375 380
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Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser
405 410 415
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Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile
435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
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1 5 10 15
Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln
50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp
100 105 110
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115 120 125
Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln
130 135 140
Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro
145 150 155 160
Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys
165 170 175
Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln
180 185 190
Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu
195 200 205
Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser
210 215 220
Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln
225 230 235 240
Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro
245 250 255
Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val
260 265 270
Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys
275 280 285
Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln
290 295 300
Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val
340 345 350
Ile Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu
355 360 365
Leu Lys Thr Thr Asp Asp Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys
370 375 380
His Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg
385 390 395 400
Asp Gln Thr Ser Thr Leu Lys Thr Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys
405 410 415
Asn Glu Ser Cys Leu Ala Thr Arg Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly
420 425 430
Ser Cys Leu Pro Pro Gln Lys Thr Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu
435 440 445
Gly Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala
450 455 460
Ile Asn Ala Ala Leu Gln Asn His Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp
465 470 475 480
Lys Gly Met Leu Val Ala Ile Asp Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His
485 490 495
Asn Gly Glu Thr Leu Arg Gln Lys Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro
500 505 510
Tyr Arg Val Lys Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr
515 520 525
Arg Val Val Thr Ile Asn Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala
530 535 540
<210> 28
<211> 4415
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgatggctcc ggtgcccgtc agtgggcaga gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt 60
ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga 120
aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag 180
tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacaggtgtc 240
gtgacgcgga tccaggccta agcttacgcg tcctagcgct accggtcgcc accatggcct 300
taccagtgac cgccttgctc ctgccgctgg ccttgctgct ccacgccgcc aggccggagg 360
tgcagctggt gcagagcggc gccgaggtga agaagcccgg cgccagcgtg aaggtgagct 420
gcaaggccag cggctacacc ttcagcgact acgagatgca ctgggtgcgg caggcccccg 480
gccagggcct ggagtggatg ggcgccatcc accccggcag cggcgacacc gcctacaacc 540
agcggttcaa gggccgggtg accatcaccg ccgacaagag caccagcacc gcctacatgg 600
agctgagcag cctgcggagc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgcccgg ttctacagct 660
acgcctactg gggccagggc accctggtga ccgtgagcgc cggtggaggc ggttcaggcg 720
gaggtggttc tggcggtggc ggatcggaca tcgtgatgac ccagaccccc ctgagcctgc 780
ccgtgacccc cggcgagccc gccagcatca gctgccggag cagccagagc ctggtgcaca 840
gcaacggcaa cacctacctg cagtggtacc tgcagaagcc cggccagagc ccccagctgc 900
tgatctacaa ggtgagcaac cggttcagcg gcgtgcccga ccggttcagc ggcagcggca 960
gcggcaccga cttcaccctg aagatcagcc gggtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact 1020
actgcagcca gagcatctac gtgccctaca ccttcggcca gggcaccaag ctggagatca 1080
aacgtaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc 1140
ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg 1200
ggctggactt cgcctgtgat ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct 1260
atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc 1320
tcctgcacag tgactacatg aacatgactc cccgccgccc cgggccaacc cgcaagcatt 1380
accagcccta tgccccacca cgcgacttcg cagcctatcg ctccagagtg aagttcagca 1440
ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc 1500
taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg 1560
ggggaaagcc gcagagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag 1620
ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg 1680
ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc 1740
acatgcaggc cctgccccct cgctaggtcg acaatcaacc tctggattac aaaatttgtg 1800
aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt 1860
taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata 1920
aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg 1980
tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc 2040
tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct 2100
gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt 2160
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ctcagatagc ccatcaccct gttgatggtc acgacgcggg tgctgaaggc gtgaagcagg 1740
atgcagagct tcattttcac tctgtaaggg tctgcttctc ccacaggagg tttctggcgc 1800
agagtctcgc cattatgatt cagagactgc atcagctcat cgatggccac cagcatgccc 1860
ttgtctagaa tgatctgctg atggttgtga ttctgaagtg ctgcgttgat ggcctggaac 1920
tctgtctggt acatcttcaa gtcctcatag atgctaccaa ggcacagggt catcatcaaa 1980
gacgtcttct gtgggggcag gcagctccct cttgttgtgg aagaagtctc tctagtagcc 2040
aggcaactct cgttcttgtg tagttccagt ggtaaacagg tcttcaatgt gctggtttgg 2100
tcccgtgtga tgtcttcatg atcgatgtct tcagcagtgc aggaataatg tttcagtttt 2160
tctctggccg tcttcaccat gtcatctgtg gtcttcagca ggtttcggga ctggctaaga 2220
cacctggcag gtccagagac tggaatgacc ctagatccgc cgccacccga cccaccaccg 2280
cccgagccac cgccaccgga tcggaccctg cagggaacac atgcccactt gctgcatgag 2340
gaattgtaat agcgatcctg agcttgcacg cagacattcc cgcctttgca ttggacttcg 2400
gtagatgtct tctctacgag gaacgcacct ttctggttac acccctcctc tgtctccttc 2460
atcttttctt tcttgcgctg gattcgaaca aagaacttga gggagaagta ggaatgggga 2520
gtgctccagg agtcagggta ctcccagctg acctccacct gtgagttctt caaaggcttc 2580
atctgcaagt tcttgggcgg gtctggtttg atgatgtccc tgatgaagaa gctggtgctg 2640
tagttctcat atttattctg ctgccgtgct tccaacgcca gttcaatggg cagggtctcc 2700
tcggcagttg ggcaggtgac atcctcctgg caggacactg aatacttctc atagtccctt 2760
tggtccagtg tgaccttctc tgcagacaga gacgccattc cacatgtcac tgcccgagag 2820
tcaggggaac tgctactgct cttgatgttg aacttcaagt ccatgtttct ttgcaccagc 2880
catgagcacg tgaaccgtcc ggagtaattt ggtgcttcac acttcaggaa agtcttgttt 2940
ttgaaatttt ttaaaatttc agtggaccaa attccatttt ccttcttgtg gagcagcaga 3000
tgtgagtggc tcagagtctc gcctcctttg tggcaggtgt actggccagc atctagaaac 3060
tctttgacag tgatggtcag ggtctttcca gagcctatga ctccatgtct ctggtctgag 3120
gtccaggtga tgtcatcttc ttcaggcgtg tcacaggtga ggttcactgt ttctccaggg 3180
gcatcgggag tccagtccac ctctacaaca taaacgtctt tctccagctc ccacatggcc 3240
atgagtggag acaccagcaa aacgatggca aaccaggaga tggttagctt ctgaggacac 3300
atggtggcga ccggtagcgc taggacgcgt aggacttgag gtcactgtga ggagtgatta 3360
gcaagggtga taggcagctc ttcagcatgg gaggcaattt atactgttaa tgctggaaaa 3420
ataatatggg ggtgtcacga tgttcccggg acaattgaac gccttctgta tgaaacaaat 3480
tttcctctta acgccttctg tatgaaacaa attttcctct taacgccttc tgtatgaaac 3540
aaattttcct cttaacgcct tctgtatgaa acaaattttc ctcttaacgc cttctgtatg 3600
aaacaaattt tcctcttaac gccttctgta tgaaacaaat tttcctctt 3649

Claims (22)

1.一种免疫应答细胞，其特征在于，该细胞表达特异结合GPC3的受体和外源性IL12。
2.如权利要求1所述的免疫应答细胞，其特征在于，所述受体和所述IL12可操作地连接。
3.如权利要求1所述的免疫应答细胞，其特征在于，所述的免疫应答细胞包括：T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤T细胞、DNT细胞、和/或调节性T细胞。
4.如权利要求1所述的免疫应答细胞，其特征在于，所述的外源性IL12是组成性表达或诱导性表达；
较佳地，用于表达所述的IL12的启动子包括：免疫细胞诱导型启动子；较佳地，所述的免疫细胞诱导型启动子是NFAT6启动子。
5.如前述权利要求之一所述的免疫应答细胞，其特征在于，所述受体具有特异结合GPC3的胞外域、跨膜域、及胞内信号域。
6.如权利要求5所述的免疫应答细胞，其特征在于，所述受体为嵌合抗原受体，其中，所述胞内域含有细胞刺激信号分子或细胞刺激信号分子与细胞激活共刺激分子的组合；
较佳地，所述细胞刺激信号分子选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcεRIγ、FcRβ、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、或DAP12的蛋白质的功能性信号传导结构域；更佳地为CD3ζ；或者
较佳地，所述的细胞激活共刺激分子选自以下的蛋白质的功能性信号传导结构域：CD27，CD28，CD137，CD134，ICOS，OX40，CD30，CD40，PD-1，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，特异结合CD83的配体，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD160，CD19，CD4，CD8α，CD8β，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Rα，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244,2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A,Ly108)，SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，和NKG2D，更佳的，为CD27，CD28，CD137，CD134，ICOS。
7.如权利要求5或6所述的免疫应答细胞，其特征在于，所述受体的胞外域含有与SEQID NO：25所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
8.如前述权利要求之一所述的免疫应答细胞，其特征在于，所述受体含有SEQ ID NO:21、22、23、或24所示的氨基酸序列；或者含有与SEQ ID NO:21、22、23、或24所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的氨基酸序列。
9.如权利要求8所述的免疫应答细胞，其特征在于，所述受体和所述的外源性IL12由与SEQ ID NO:28、29、30、31、32、33、34或35具有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的核苷酸序列编码；
优选的，与SEQ ID NO:28、29、30、或31具有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的核苷酸序列编码；
更优选的，由SEQ ID NO:28、29、30、或31所示的核苷酸序列编码。
10.如前述权利要求之一所述的免疫应答细胞，其特征在于，所述的免疫应答细胞不包含外源的共刺激配体。
11.如前述权利要求之一所述的免疫应答细胞，其特征在于，所述受体和/或所述IL12组成性或诱导性表达在免疫应答细胞的表面。
12.如前述权利要求之一所述的免疫应答细胞，其特征在于，所述的免疫应答细胞中包含表达构建物，该表达构建物包括：所述结合抗原的受体的表达盒；和所述IL12的表达盒。
13.如前述权利要求之一所述的免疫应答细胞，其特征在于，所述的受体和/或IL12利用病毒载体表达；较佳地，所述的病毒载体包括：慢病毒载体，逆转录病毒载体或腺病毒载体。
14.如权利要求1至13之一所述的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞在给予个体后，与不存在所述外源性IL12的情况相比，所述个体外周血中CAR-T细胞数量提高至少50％。
15.如权利要求1至13之一所述的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞在给予个体约7天后，所述个体外周血中CAR-T细胞的数量之和大于6,000个/μL；给予所述免疫应答细胞约10天后，所述个体外周血中CAR-T细胞的数量之和大于6000个/μL。
16.一种表达构建物，其特征在于，该表达构建物包括顺序连接的：受体的表达盒和IL12的表达盒；其中所述结合抗原的受体和IL12如前述权利要求之一所定义。
17.权利要求1-13之一所述的免疫应答细胞在制备用于治疗有此需要的个体的肿瘤的药物组合物中的用途。
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括：肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤、食道癌；优选地，所述肿瘤是肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌。
19.如权利要求17或18所述的用途，其中所述的免疫效应细胞使得肿瘤减小至少50％。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述的免疫效应细胞使得肿瘤减小至少70％，更优的，所述的免疫效应细胞使得肿瘤减小至少80％。
21.药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：
权利要求1-13之一所述的免疫应答细胞；以及
药学上可接受的载体或赋形剂。
22.一种试剂盒，其包含：
如权利要求1-13之一所述的免疫应答细胞；以及
指导如何向个体给予所述免疫应答细胞的说明书。
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