CN109464683A - 一种用于生物发酵的灭菌方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于生物发酵的灭菌方法，包含：备好发酵罐，打入消毒后的培养基液并开搅拌，盖上罐盖，排气阀全开，关闭空气进气，打开除罐底蒸汽之外的管路和阀门，并从其向罐中通入蒸汽，进行实消，当培养基液升温到80℃时，开罐底蒸汽，在100℃开始控制排气阀，升温至120℃时，保压20min，关闭罐底蒸汽供给，使培养基液倒流罐底一阀1.5min，之后继续开罐底蒸汽灭菌并进行保压，直到保压总时间达到30min，保压结束，先关闭罐底一阀，后关蒸汽，完成发酵罐实消，再进行降温，移入种子液。本发明提供的用于生物发酵的灭菌方法，可以理清易染菌环节，使生物发酵不会染菌，包括消后、接后、接前，都能避免再出现染菌。

Description

一种用于生物发酵的灭菌方法
技术领域
本发明涉及一种生物发酵灭菌工艺，具体地，涉及一种用于生物发酵的灭菌方法。
背景技术
现在生物发酵企业大面积容量生产基本生产过程中，灭菌是至关重要的环节。常用的灭菌的方式中包括空消、实消、连消等。空消是指空罐灭菌。实消就是将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。其中，通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后，需要维持一定时间，再冷却到接种温度，也叫间歇灭菌、分批灭菌，属于单罐灭菌。
生物发酵需要不染菌的培养基液，包括种子液、大罐发酵培养液，发酵罐包括小罐、中罐、大罐几种。发酵培养基实消过程的具体操作如下：备好发酵罐后，打入培养基液开搅拌，盖上人孔盖，排气阀全开，关闭空气进气，开直接蒸汽、移种管路蒸汽、取样管蒸汽、PH调节阀蒸汽、补料管路蒸汽，培养基液开始灭菌升温。当罐温升温到90℃开入罐底蒸汽，在100℃开始控制排气阀，全过程保压120℃30分钟。结束时关罐底蒸汽一阀、夹层排水阀，关取样一阀，小排气出气蒸汽要流通取样用，关补料一阀、关移种一阀、PH控制一阀、关直接蒸汽一阀，开空气进入罐里保压，开循环水冷却，罐温到后关水，待移入种子液，消后检查。
移入种子液后需要取样，还有一些罐在培养几个小时染了菌，通过查消后的染菌罐批，主要原因有这几类，还包括消后染菌、接后染菌、接前染菌。消后染菌几个小时或几十个小时出现的染菌说明消毒不彻底、留有死角没有消毒好产生染菌，接后染菌主要是中罐带菌，接前染菌主要是中罐已经染菌。染菌则说明有地方没有消透培养基液，要排除困难污染死角，需要消毒工人要有操作能力，更重要的是有责任心，但是有了这些还是染菌，则要排除污染点。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物发酵灭菌工艺，克服现有技术的不足，通过特殊的实消，实现死角灭菌。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于生物发酵的灭菌方法，其中，所述的方法包含：备好发酵罐后，打入消毒后的培养基液并开搅拌，盖上罐盖，排气阀全开，关闭空气进气，打开除罐底蒸汽之外的管路和阀门，并从其向罐中通入蒸汽，进行实消，当培养基液升温后，开罐底蒸汽，继续升温后控制排气阀，升温至预定温度时，开始保压，一段时间后关闭罐底蒸汽供给，使培养基液倒流罐底一阀，之后继续开罐底蒸汽灭菌并进行保压，直到保压结束，先关闭罐底一阀，后关蒸汽，完成发酵罐实消，再进行降温，移入种子液。发酵罐包括小罐、中罐、大罐，大罐和小罐、中罐操作一样只是大罐多了放罐的管路。
上述的用于生物发酵的灭菌方法，其中，所述的方法中，进行实消，当培养基液升温到80℃时，开罐底蒸汽，在100℃开始控制排气阀，升温至120℃时，保压20min，关闭罐底蒸汽供给，使培养基液倒流罐底一阀1.5min，之后继续开罐底蒸汽灭菌并进行保压，直到保压总时间达到30min，保压结束。
上述的用于生物发酵的灭菌方法，其中，所述的方法中还包含：在罐底一阀和罐底蒸汽通入管路下方的排污管处的排污阀上加装1英寸的截止阀，截止阀内设有四氟垫片；加装截止阀后，排污阀被改装成小排污阀，在实消通入蒸汽灭菌，升温后的保压阶段，保压20～23min时，关闭罐底蒸汽供给，使培养基液倒流罐底一阀10～15s，同时灭菌的培养基液经加装排污管外小排污阀排出，之后继续开罐底蒸汽灭菌并进行保压，直到保压总时间达到30min，保压结束。灭菌的培养基液经加装排污管外小排污阀排出时，排出的培养基液、料看到后就可以关闭小排污阀，再开罐底蒸汽继续灭菌直到结束。排出的培养基液料可以在几秒内对与罐底管与发酵罐连接处进行灭菌。
上述的用于生物发酵的灭菌方法，其中，所述的方法中还包含：在培养基液加入发酵罐前，进行备罐检查和空罐灭菌的步骤；以及在发酵罐培养基液完成实消后，进行移种灭菌的步骤；所述的方法中还包含补料灭菌步骤和消泡剂灭菌步骤。
上述的用于生物发酵的灭菌方法，其中，所述的方法中，备罐检查包含备阀门，更换阀垫片；在备阀门时要查看阀心有无裂缝，如有裂缝则更换同样型号的新阀门；更换阀垫片包含将移种一阀更换四氟垫片，取样一阀更换四氟垫片，罐底一阀更换四氟垫片。小罐、中罐、大罐进罐前备好罐，机修入罐检查要保证搅拌不会脱落、拉杠完好，并更换阀垫片。四氟垫片即聚四氟乙烯垫片，在旋转中完成平行四边形阀头结合更紧密不泄漏，在备阀门要用手电筒看看阀心有无裂缝，如有要报告，确认后给预更换同样的J41F阀门。
上述的用于生物发酵的灭菌方法，其中，所述的方法中，在备罐备好后，确认罐内无人，盖上罐盖试压1kg空气压力，该罐压力已满压1kg空气压力时，开始试漏，确认没有漏点，然后泄压，再连入蒸汽供给，进行空消，空消结束后，开罐盖，打入培养基液。优选地，空消通入的蒸汽温度为120℃，保持4kg蒸汽压力，空消时间为30～60min。
上述的用于生物发酵的灭菌方法，其中，所述的方法中，移种时需要事先消毒移种管路一小时，移种管路用蒸汽通入吹扫管路无培养基液存在。消毒移种管路时，调节尾部排汽阀，确保蒸汽正向流通4kg压力，尾部排汽阀有蒸汽流出去，并检查各罐移种一阀前端不留死角，用手去触摸要有蒸汽到位手感。移种种子罐压为1kg空气排气压，大罐罐压为0.3kg排气压。移种操作时关闭尾阀，再关供给蒸汽。开种子罐一阀移出种子液到大罐、大罐在开移种一阀，全部种子液移入大罐，发酵开始。移种结束先关闭大罐一阀，再关种子罐一阀，交值班人员调整大罐空气流量和罐压，开移种管路尾阀打开蒸汽灭菌消毒管路，种子罐关空气进气，开排气泄压，将移种后种子罐交给值班人员洗罐。
上述的用于生物发酵的灭菌方法，其中，所述的补料灭菌步骤，包含补料罐灭菌和管路灭菌；补料罐灭菌采用与发酵罐实消灭菌同样的操作，向补料罐中通入蒸汽进行实消，升温至120～125℃时，保压20～23min，关闭蒸汽供给，使料液倒流罐底一阀1.5min，之后继续开蒸汽灭菌并进行保压，直到保压总时间达到28～30min，保压结束，完成实消，再进行降温。优选地，123℃在20～23min关上一阀，时间到后，继续供给蒸汽灭菌补料液，保压28min，这样染菌批次将大辐下降，最后染菌率为零。
上述的用于生物发酵的灭菌方法，其中，所述的补料灭菌步骤，其管路灭菌与移种管路灭菌过程相同。补料是给各大罐补料的，补料是利用分配站执行补料，可以放补料罐单独消毒灭菌，补料通过移种管路补料，补料时和移种一样消毒管路进行灭菌，这种补料和移种一样操作。PH调节和补料操作一样，也不会造成染菌。
上述的用于生物发酵的灭菌方法，其中，所述的消泡剂灭菌步骤是在消泡剂罐打入消泡剂后，从出料一阀供给蒸汽通入，升温至80℃时，开罐底蒸汽，100℃开始控制排气阀收排气，升压到1.5kg蒸汽压力后，保压45min，关闭罐底蒸汽，倒流消泡剂到罐底一阀2min，时间到后继续供给罐底蒸汽消毒灭菌，保压总时间为一个小时，灭菌结束。关罐底蒸汽、关出料一阀蒸汽，开空气保压，关闭一阀与二阀中间蒸汽，将消泡剂液送到分配站。大罐有起泡，需要加一些消泡剂，做用消泡用。
本发明提供的用于生物发酵的灭菌方法具有以下优点：
该方法抓住了生物发酵中易染菌、难灭菌的关键点，发现了可能污染的地方。采用该方法，在120℃、保压20分钟时，关闭罐底蒸汽阀供给蒸汽，让120℃的培养基液无菌液倒流罐底一阀灭菌1.5分钟，时间到后开蒸汽阀继续供给蒸汽，也就是通过120℃在20分钟倒流高温料液完全侵入灭菌罐底一阀，这样实消这个污染死角，能够彻底解决蒸汽灭菌通过连接处关键点的蒸汽停留时间短、灭菌效果不充分的缺点。而且120℃料温已经完全液化，通入蒸汽不存在蒸汽撞击。实消都采用这一抗染菌的操作，可以理清易染菌环节，使生物发酵不会染菌，包括消后、接后、接前，都能避免再出现染菌。
附图说明
图1为本发明的发酵罐的罐底罐底一阀以及管路示意图。
其中，1、发酵罐；2、罐底一阀；3、排污阀。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式作进一步地说明。
本发明提供的用于生物发酵的灭菌方法，该方法包含：备好发酵罐1后，打入消毒后的培养基液并开搅拌，盖上罐盖，排气阀全开，关闭空气进气，打开除罐底蒸汽之外的管路和阀门，并从其向罐中通入蒸汽，进行实消，当培养基液升温后，开罐底蒸汽，继续升温后控制排气阀，升温至预定温度时，开始保压，一段时间后关闭罐底蒸汽供给，使培养基液倒流罐底一阀2，之后继续开罐底蒸汽灭菌并进行保压，直到保压结束，先关闭罐底一阀2，后关蒸汽，完成发酵罐1实消，再进行降温，移入种子液。发酵罐1的罐底罐底一阀2以及管路如图1所示。
优选地，进行实消，当培养基液升温到80℃时，开罐底蒸汽，在100℃开始控制排气阀，升温至120℃时，保压20min，关闭罐底蒸汽供给，使培养基液倒流罐底一阀1.5min，之后继续开罐底蒸汽灭菌并进行保压，直到保压总时间达到30min，保压结束。
该方法中还包含：在罐底一阀2和罐底蒸汽通入管路下方的排污管处的排污阀3上加装截止阀，截止阀内设有四氟垫片；加装截止阀后，在实消通入蒸汽灭菌，升温后的保压阶段，保压20～23min时，关闭罐底蒸汽供给，使培养基液倒流罐底一阀10～15s，之后继续开罐底蒸汽灭菌并进行保压，直到保压总时间达到30min，保压结束。
该方法中还包含：在培养基液加入发酵罐1前，进行备罐检查和空罐灭菌的步骤；以及在发酵罐1培养基液完成实消后，进行移种灭菌的步骤；该方法中还包含补料灭菌步骤和消泡剂灭菌步骤。
备罐检查包含备阀门，更换阀垫片；在备阀门时要查看阀心有无裂缝，如有裂缝则更换同样型号的新阀门；更换阀垫片包含将移种一阀更换四氟垫片，取样一阀更换四氟垫片，罐底一阀2更换四氟垫片。
在备罐备好后，确认罐内无人，盖上罐盖试压1kg空气压力，该罐压力已满压1kg空气压力时，开始试漏，确认没有漏点，然后泄压，再连入蒸汽供给，进行空消，空消结束后，开罐盖，打入培养基液。
移种时需要事先消毒移种管路一小时，移种管路用蒸汽通入吹扫管路无培养基液存在。
补料灭菌步骤包含补料罐灭菌和管路灭菌；补料罐灭菌采用与发酵罐1实消灭菌同样的操作，向补料罐中通入蒸汽进行实消，升温至120～125℃时，保压20～23min，关闭蒸汽供给，使料液倒流罐底一阀1.5min，之后继续开蒸汽灭菌并进行保压，直到保压总时间达到28～30min，保压结束，完成实消，再进行降温。补料灭菌步骤中的管路灭菌与移种管路灭菌过程相同。
消泡剂灭菌步骤是在消泡剂罐打入消泡剂后，从出料一阀供给蒸汽通入，升温至80℃时，开罐底蒸汽，100℃开始控制排气阀收排气，升压到1.5kg蒸汽压力后，保压45min，关闭罐底蒸汽，倒流消泡剂到罐底一阀2min，时间到后继续供给罐底蒸汽消毒灭菌，保压总时间为一个小时，灭菌结束。
下面结合实施例对本发明提供的用于生物发酵的灭菌方法做更进一步描述。
实施例1
一种用于生物发酵的灭菌方法，该方法包含：
备好发酵罐1后，打入消毒后的培养基液并开搅拌，盖上罐盖，排气阀全开，关闭空气进气，打开除罐底蒸汽之外的管路和阀门，并从其向罐中通入蒸汽，进行实消，当培养基液升温到80℃时，开罐底蒸汽，在100℃开始控制排气阀，升温至120℃时，保压20min，关闭罐底蒸汽供给，使培养基液倒流罐底一阀1.5min，之后继续开罐底蒸汽灭菌并进行保压，直到保压总时间达到30min，保压结束，先关闭罐底一阀2，后关蒸汽，完成发酵罐1实消，再进行降温，移入种子液。发酵罐1包括小罐、中罐、大罐，大罐和小罐、中罐操作一样只是大罐多了放罐的管路。
更优选地，在罐底一阀2和罐底蒸汽通入管路下方的排污管处的排污阀3上加装1英寸的截止阀，截止阀内设有四氟垫片；加装截止阀后，排污阀3被改装成小排污阀，在实消通入蒸汽灭菌，升温后的保压阶段，保压20～23min时，关闭罐底蒸汽供给，使培养基液倒流罐底一阀10～15s，同时灭菌的培养基液经加装排污管外小排污阀排出，之后继续开罐底蒸汽灭菌并进行保压，直到保压总时间达到30min，保压结束。灭菌的培养基液经加装排污管外小排污阀排出时，排出的培养基液、料看到后就可以关闭小排污阀，再开罐底蒸汽继续灭菌直到结束。排出的培养基液料可以在几秒内对与罐底管与发酵罐1连接处进行灭菌。
该方法中还包含：在培养基液加入发酵罐1前，进行备罐检查和空罐灭菌的步骤；以及在发酵罐1培养基液完成实消后，进行移种灭菌的步骤；该方法中还包含补料灭菌步骤和消泡剂灭菌步骤。
备罐检查包含备阀门，更换阀垫片；在备阀门时要查看阀心有无裂缝，如有裂缝则更换同样型号的新阀门；更换阀垫片包含将移种一阀更换四氟垫片，取样一阀更换四氟垫片，罐底一阀2更换四氟垫片。小罐、中罐、大罐进罐前备好罐，机修入罐检查要保证搅拌不会脱落、拉杠完好，并更换阀垫片。四氟垫片即聚四氟乙烯垫片，在旋转中完成平行四边形阀头结合更紧密不泄漏，在备阀门要用手电筒看看阀心有无裂缝，如有要报告，确认后给预更换同样的J41F阀门。
在备罐备好后，确认罐内无人，盖上罐盖试压1kg空气压力，该罐压力已满压1kg空气压力时，开始试漏，确认没有漏点，然后泄压，再连入蒸汽供给，进行空消，空消结束后，开罐盖，打入培养基液。优选地，空消通入的蒸汽温度为120℃，保持4kg蒸汽压力，空消时间为30～60min。
移种时需要事先消毒移种管路一小时，移种管路用蒸汽通入吹扫管路无培养基液存在。消毒移种管路时，调节尾部排汽阀，确保蒸汽正向流通4kg压力，尾部排汽阀有蒸汽流出去，并检查各罐移种一阀前端不留死角，用手去触摸要有蒸汽到位手感。移种种子罐压为1kg空气排气压，大罐罐压为0.3kg排气压。移种操作时关闭尾阀，再关供给蒸汽。开种子罐一阀移出种子液到大罐、大罐在开移种一阀，全部种子液移入大罐，发酵开始。移种结束先关闭大罐一阀，再关种子罐一阀，交值班人员调整大罐空气流量和罐压，开移种管路尾阀打开蒸汽灭菌消毒管路，种子罐关空气进气，开排气泄压，将移种后种子罐交给值班人员洗罐。
补料灭菌步骤包含补料罐灭菌和管路灭菌；补料罐灭菌采用与发酵罐1实消灭菌同样的操作，向补料罐中通入蒸汽进行实消，升温至120～125℃时，保压20～23min，关闭蒸汽供给，使料液倒流罐底一阀1.5min，之后继续开蒸汽灭菌并进行保压，直到保压总时间达到28～30min，保压结束，完成实消，再进行降温。优选地，123℃在20～23min关上一阀，时间到后，继续供给蒸汽灭菌补料液，保压28min，这样染菌批次将大辐下降，最后染菌率为零。
补料灭菌步骤中的管路灭菌与移种管路灭菌过程相同。补料是给各大罐补料的，补料是利用分配站执行补料，可以放补料罐单独消毒灭菌，补料通过移种管路补料，补料时和移种一样消毒管路进行灭菌，这种补料和移种一样操作。PH调节和补料操作一样，也不会造成染菌。
消泡剂灭菌步骤是在消泡剂罐打入消泡剂后，从出料一阀供给蒸汽通入，升温至80℃时，开罐底蒸汽，100℃开始控制排气阀收排气，升压到1.5kg蒸汽压力后，保压45min，关闭罐底蒸汽，倒流消泡剂到罐底一阀2min，时间到后继续供给罐底蒸汽消毒灭菌，保压总时间为一个小时，灭菌结束。关罐底蒸汽、关出料一阀蒸汽，开空气保压，关闭一阀与二阀中间蒸汽，将消泡剂液送到分配站。大罐有起泡，需要加一些消泡剂，做用消泡用。
本发明提供的用于生物发酵的灭菌方法，其中发酵培养基液在120℃保压20分钟时，关闭罐底蒸汽，培养基液倒流到底部管道，关闭罐底部蒸汽，培养基液倒流1.5分钟。以及经过进一步改进，在罐底一阀和罐底蒸汽管路下方的排污管处加装1英寸截止阀，灭菌的培养基液经加装排污管外小排污阀排出，排出的培养基液、料看到后就可以关闭小排污阀，再开罐底蒸汽继续灭菌直到结束。排出的培养基液料可以在几秒内对与罐底管与发酵罐连接处进行灭菌，该处有可能带来染菌，现在发酵染菌了查找不到来源和原因，一般都是来自于此。发酵罐消毒工作人员要求清除罐内不容易清除点及消透培养基能接触的设备，这就是罐底的连接处。排出高温无菌培养基液秒排，可以将关键控制点与罐底连接处彻底灭菌，这样实消后的培养基液就不会染菌。排出的料液要及时清除现场保持干净，不应产生二次污染环境。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种用于生物发酵的灭菌方法，其特征在于，所述的方法包含：
备好发酵罐后，打入消毒后的培养基液并开搅拌，盖上罐盖，排气阀全开，关闭空气进气，打开除罐底蒸汽之外的管路和阀门，并从其向罐中通入蒸汽，进行实消，当培养基液升温后，开罐底蒸汽，继续升温后控制排气阀，升温至预定温度时，开始保压，一段时间后关闭罐底蒸汽供给，使培养基液倒流罐底一阀，之后继续开罐底蒸汽灭菌并进行保压，直到保压结束，先关闭罐底一阀，后关蒸汽，完成发酵罐实消，再进行降温，移入种子液。
2.如权利要求1所述的用于生物发酵的灭菌方法，其特征在于，所述的方法中，进行实消，当培养基液升温到80℃时，开罐底蒸汽，在100℃开始控制排气阀，升温至120℃时，保压20min，关闭罐底蒸汽供给，使培养基液倒流罐底一阀1.5min，之后继续开罐底蒸汽灭菌并进行保压，直到保压总时间达到30min，保压结束。
3.如权利要求2所述的用于生物发酵的灭菌方法，其特征在于，所述的方法中还包含：在罐底一阀和罐底蒸汽通入管路下方的排污管处的排污阀上加装截止阀，所述的截止阀内设有四氟垫片；加装截止阀后，在实消通入蒸汽灭菌，升温后的保压阶段，保压20～23min时，关闭罐底蒸汽供给，使培养基液倒流罐底一阀10～15s，之后继续开罐底蒸汽灭菌并进行保压，直到保压总时间达到30min，保压结束。
4.如权利要求2所述的用于生物发酵的灭菌方法，其特征在于，所述的方法中还包含：在培养基液加入发酵罐前，进行备罐检查和空罐灭菌的步骤；以及在发酵罐培养基液完成实消后，进行移种灭菌的步骤；所述的方法中还包含补料灭菌步骤和消泡剂灭菌步骤。
5.如权利要求4所述的用于生物发酵的灭菌方法，其特征在于，所述的方法中，备罐检查包含备阀门，更换阀垫片；在备阀门时要查看阀心有无裂缝，如有裂缝则更换同样型号的新阀门；更换阀垫片包含将移种一阀更换四氟垫片，取样一阀更换四氟垫片，罐底一阀更换四氟垫片。
6.如权利要求4所述的用于生物发酵的灭菌方法，其特征在于，所述的方法中，在备罐备好后，确认罐内无人，盖上罐盖试压1kg空气压力，该罐压力已满压1kg空气压力时，开始试漏，确认没有漏点，然后泄压，再连入蒸汽供给，进行空消，空消结束后，开罐盖，打入培养基液。
7.如权利要求4所述的用于生物发酵的灭菌方法，其特征在于，所述的方法中，移种时需要事先消毒移种管路一小时，移种管路用蒸汽通入吹扫管路无培养基液存在。
8.如权利要求4所述的用于生物发酵的灭菌方法，其特征在于，所述的补料灭菌步骤，包含补料罐灭菌和管路灭菌；补料罐灭菌采用与发酵罐实消灭菌同样的操作，向补料罐中通入蒸汽进行实消，升温至120～125℃时，保压20～23min，关闭蒸汽供给，使料液倒流罐底一阀1.5min，之后继续开蒸汽灭菌并进行保压，直到保压总时间达到28～30min，保压结束，完成实消，再进行降温。
9.如权利要求8所述的用于生物发酵的灭菌方法，其特征在于，所述的补料灭菌步骤，其管路灭菌与移种管路灭菌过程相同。
10.如权利要求4所述的用于生物发酵的灭菌方法，其特征在于，所述的消泡剂灭菌步骤是在消泡剂罐打入消泡剂后，从出料一阀供给蒸汽通入，升温至80℃时，开罐底蒸汽，100℃开始控制排气阀收排气，升压到1.5kg蒸汽压力后，保压45min，关闭罐底蒸汽，倒流消泡剂到罐底一阀2min，时间到后继续供给罐底蒸汽消毒灭菌，保压总时间为一个小时，灭菌结束。
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