CN109457002A - 利用多粘芽孢杆菌制备微生物絮凝剂的方法及应用 - Google Patents

利用多粘芽孢杆菌制备微生物絮凝剂的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物絮凝剂，具体为利用多粘芽孢杆菌制备微生物絮凝剂的方法及应用，解决现有微生物絮凝剂生产成本高、絮凝性能不稳定的问题，步骤：将斜面菌株接种到牛肉膏、蛋白胨培养基中培养得到菌株种子液；采用葡萄糖、尿素、KH2PO4、K2HPO4、NaCl、MgSO4发酵培养基发酵；发酵液去沉淀留上清液，加无水乙醇或丙酮，采集沉淀，干燥，得粗品；溶解，利用凝胶Sephacryl S‑200过滤层析法对其进行纯化，收集吸收峰处溶液，得纯品。优点：1、微生物絮凝剂无毒性，无二次污染；2、利用多粘芽孢杆菌制备的微生物絮凝剂絮凝性能良好；3、热稳定性好，适用范围广；4、发酵时间短，投加量低，节约成本；5、纯化过程简单，降低生产成本。

Description

利用多粘芽孢杆菌制备微生物絮凝剂的方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物絮凝剂，具体为利用多粘芽孢杆菌制备微生物絮凝剂的方法及应用。
背景技术
传统的絮凝剂虽然在絮凝性能、经济成本等方面有很多的优势，但很容易造成二次污染且在安全方面有着很大隐患。例如：传统的絮凝剂虽然在絮凝性能、经济成本等方面有很多的优势，铝盐类的絮凝剂广泛使用在农林业中，导致植物出现铝害的现象，严重威胁到植物的正常生长，与此同时这些农作物进入人体，能够影响人体的健康。医学上常出现的病情有铝性脑病、骨病以及贫血等病症，其中老年人的痴呆症状就是脑病的一种；铁盐类的絮凝剂对金属有腐蚀性，铁的浓度过高时会对人体健康产生危害，也会对生态环境产生不好的影响；虽有机高分子絮凝剂已被较为普遍的应用，但丙烯酞胺具有严重的神经毒性和致癌性，所以对它的使用作出了一定的限制。
我国对微生物絮凝剂及其产生菌的开始研究起步相对来说比较落后，发现和研制出的生物絮凝剂的数量和种类也要比国外学者研究出来的少的多。目前，我国在微生物絮凝剂的工业化生产过程中普遍存在絮凝性能不稳定、生产成本过高等问题，所以对于高产量、性能优良的生产絮凝剂菌株的缺乏依然是限制我国微生物絮凝剂产业化进程的主要元素。因此，制备一种生产成本低、絮凝性能稳定，不产生二次污染的微生物絮凝剂是十分有必要的。
发明内容
本发明解决现有微生物絮凝剂生产成本高、絮凝性能不稳定的问题，提供一种利用多粘芽孢杆菌制备微生物絮凝剂的方法。
本发明是通过以下操作步骤实现的：利用多粘芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，包括以下操作步骤：
一、多粘芽孢杆菌菌株的种子培养
将多粘芽孢杆菌斜面菌株接种到液体种子培养基中，30℃、150r/min震荡培养16h，得到菌株种子液，所述液体种子培养基配方组分如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH 7，121℃灭菌20 min；
二、发酵液的制备
采用初始pH值为4.0~9.0的发酵培养基，在25~35℃条件下对步骤一所述的菌株种子液进行发酵12~84h制得发酵液，其中菌株接种量为6~16%，所述发酵培养基配方组分如下：葡萄糖15g，尿素0.64g，KH2PO4 2g，K2HPO4 5g，NaCl 0.1g，MgSO4 0.2g，蒸馏水1000mL；
三、微生物絮凝剂的提纯
将步骤二制得的发酵液在4000r/min下离心60min，弃去菌体沉淀，保留上清液，加入体积比为2:1的无水乙醇或丙酮，搅拌均匀，4℃静置过夜，弃掉上清液采集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤，4000r/min离心20min，沉淀40℃恒温干燥数小时，得到微生物絮凝剂粗品；将粗絮凝剂粗品溶解于70-80℃蒸馏水中配置成10mg/L溶液，利用凝胶Sephacryl S-200过滤层析法对其进行纯化，收集吸收峰处溶液，得到微生物絮凝剂纯品。
所述多粘芽孢杆菌为多粘梭状芽胞杆菌或多粘气芽孢杆菌中的一种。
所述微生物絮凝剂粗品利用凝胶Sephacryl S-200过滤层析法操作步骤如下：
（1）样品的准备
称取适量絮凝剂粗品，并将粗絮凝剂溶于热水，配置成浓度10 mg/L，待其完全溶解后离心去掉不溶性物质，得到絮凝剂粗溶液。
（2）凝胶Sephacryl S -200的预处理
取适量凝胶Sephacryl S-200，先用去离子水清洗、抽滤，抽滤3次后将凝胶SephacrylS-200于烧杯中用去离子水稀释，并用超声波清洗仪对其进行脱气1小时。
（3）装柱
选用柱高为50 cm的层析柱，将层析柱垂直固定，先在柱内装入1/3高度的缓冲液去离子水来排出气体，将已经平衡好的凝胶Sephacryl S-200搅拌均匀，倒入柱内，等其自然的沉降到1/4-1/3高的时候打开底端的出口，然后让溶剂缓慢地排出，继续添加凝胶至沉降到所要求的位置。
（4）上样
每次用上样针吸取1 mL絮凝剂粗品溶液，然后上样。
（5）洗脱和收集
打开起始缓冲液阀门，用去离子水，以每管2 mL/ min的流速洗脱，216 nm、280 nm处检测吸收。手动收集流出液，将出峰时的流出液用试管收集。
（6）凝胶的再生及保存
用过的凝胶经0.5 mol/L的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能。如不立即使用，可加20%的乙醇防腐，于4℃冰箱中保存。使用时，再用碱-酸-碱处理。
（7）取絮凝剂精品进行絮凝活性的测定。
本发明具有以下优点：1、微生物絮凝剂无毒性，无二次污染；2、利用多粘芽孢杆菌制备的微生物絮凝剂絮凝性能良好；3、热稳定性好，适用范围广；4、发酵时间短，投加量低，节约成本；5、纯化过程简单，降低生产成本。
附图说明
图1为凝胶层析洗脱曲线；由图可知，采用凝胶Sephacryl S-200层析对粗絮凝剂纯化，只出现一个色谱峰，说明此絮凝剂成分较纯，可能为多糖或蛋白质；
图2为多粘芽孢杆菌发酵液絮凝率热稳定性曲线图；由图可知，本发明中多粘芽孢杆菌发酵液的絮凝率具有良好的热稳定性，对所处理的水环境温度没有特定要求，适用范围广；
图3为发酵液絮凝性能与培养基初始pH值关系图；由图可知发酵液絮凝性能随培养基初始pH值升高而升高，pH值为7时最大，而后随pH值升高而絮凝性能降低；
图4发酵液絮凝性能与培养温度关系图；由图可知，培养温度为30℃时絮凝性能最佳，温度升高或降低均会导致絮凝性能下降；
图5为发酵液絮凝性能与发酵液中菌株接种量关系图；由图可知，发酵液絮凝性能随菌株接种量升高而升高，当菌株接种量为10%时絮凝效果最高，而后随接种量升高出现下降趋势；
图6发酵液絮凝性能与发酵时间关系图；由图可知，发酵液絮凝性能随发酵时间延长而上升，在72h时出现絮凝率最大值，而后呈下降趋势。
具体实施方式
以下提供多组实施例以确定多粘芽孢杆菌发酵的优化条件：
实施例一：研究培养基初始pH值对发酵液絮凝性能的影响：
分别以10%的菌株接种量将种子液接种至初始pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的发酵培养基中，控制温度为30℃、摇床速度为150r/min振荡培养72h，测定发酵液的絮凝率，将上述实验重复三次，以确定最佳的培养基初始pH值。
结果表明，初始pH值为7.0时，发酵液絮凝率最高，如附图3所示。
其中，絮凝率的测定方法：将高岭土悬浊液模拟实际废水作为絮凝的对象：在100mL小烧杯中加入5 mLCaCl2溶液、2 mL发酵液及93 mL 4g/L的高岭土悬液。先快搅拌1 min，再慢搅拌2 min，放置15 min之后取上清液(90mL处)，用722s型分光光度计测定其在550nm处的吸光度。同时以发酵培养基代替发酵液作为对照，应用浊度的减少量来表示絮凝率的大小，絮凝率（用RF表示）的计算公式为：
RF/%=(A-B)/A×100%
式中，A为对照试验中的上层清液在550 nm处的吸光度值；
B为添加微生物絮凝剂样品后上清液在550 nm处的吸光度值。
实施例二：研究培养温度对发酵液絮凝性能的影响：
分别以10%的菌株接种量将种子液接至pH为7.0的50 mL发酵培养液中，分别置于温度25℃、30℃、35℃的条件下，控制摇床速度为150 r/min培养72 h，测定发酵液絮凝率大小，重复三次，确定最适温度。
结果表明，发酵温度为30℃时发酵液絮凝率最高，如附图4所示。
实施例三：研究菌株接种量对发酵液絮凝性能的影响：
分别将6%、8%、10%、12%、14%、16%的菌株接种量接入到50 mL发酵培养基中，其余条件同上，测定各组的絮凝率，重复三次后确定最佳的接种量。
结果表明，接种量为10%时发酵液絮凝率最高，如附图5所示。
实施例四：研究发酵时间对发酵液絮凝性能的影响：
以10%接种量将种子液接至pH为7.0的发酵培养液中，在30℃、150 r/min条件下振荡培养，每12h取样一次，测其絮凝活性，重复三次，确定最佳培养时间。
结果表明，发酵时间为72h时发酵液絮凝率最高，如附图6所示。
实施例五：研究提纯所用试剂对制得絮凝剂絮凝性能的影响：
在步骤三：微生物絮凝剂的提纯时，分别采用两倍体积的无水乙醇或两倍体积的丙酮溶液对离心后的上清液进行沉淀，40℃冰箱静置过夜，离心干燥，测得：采用无水乙醇沉淀时，絮凝剂产率为1.7g/L，絮凝率为89.7%；采用丙酮溶液沉淀时，絮凝剂产率为0.78g/L，絮凝率为87.5%。
结果表明，无论是絮凝剂得率还是絮凝率，无水乙醇都比丙酮好，因此选用无水乙醇作为有机溶剂沉淀剂更佳。
实施例六：研究本发明制得的微生物絮凝剂的热稳定性和絮凝特性：
取50 mL经72 h摇床培养后的多粘芽孢杆菌发酵液，将其分别置于10℃、30℃、50℃、70℃、90℃、100℃水浴中加热30 min，分别取2 mL加入到93 mL 4g/L的高岭土悬浊液中，加入5 mL 1% CaC12，调pH值为7，先快搅拌1 min，再慢搅拌2 min，放置15 min以后取上清液然后进行絮凝率测定，根据絮凝率的大小考察其热稳定性，如附图2所示。
结果表明，该絮凝剂在10℃-100℃温度范围内的絮凝率均处于86%-92%之间，热稳定性非常好，对所处理的水环境温度没有特定要求，适用范围广。
实施例七：研究本发明制得的微生物絮凝剂的最佳絮凝条件：
分别采用不同絮凝剂投加量、絮凝体系pH值、无机阳离子、助凝剂添加量、静沉时间测定微生物絮凝剂粗品对高岭土悬浊液的絮凝率，结果表明最佳絮凝条件为：絮凝剂用量2mL/100mL（10mg/L）、絮凝体系pH 8.0、助凝剂1%的CaCl2用量3mL/100mL、静沉时间15min。
实施例八：研究本发明制得的微生物絮凝剂在处理生活污水和洗车废水中的应用：
取两只烧杯，分别加入100mL水温20℃，pH 6.5，浊度为34NTU的洗车废水水样和100 mL水温20℃，pH 6.9，浊度为93 NTU的生活污水水样，分别向两只烧杯中加入5mL、l%的CaC12溶液，然后投入2mL浓度为10 mg/L的微生物絮凝剂粗品，调节pH到7，先快速搅拌1 min，接着慢速搅拌2 min，静置沉降15 min测定废水的浊度。
结果表明，生活污水浊度降至17.5，去除率达到81.2%；洗车废水浊度降至5.6，去除率达到83.5%，由此证明本发明制得的生物絮凝剂在处理生活污水和洗车废水方面有良好的应用效果。
在多组实施例中发现，用微生物絮凝剂粗品配置成溶液时，只有浓度为10mg/L的溶液提纯后才具有絮凝效果，其他浓度的絮凝效果显著下降甚至无絮凝效果。

Claims (3)

1.一种利用多粘芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：
一、多粘芽孢杆菌菌株的种子培养
将多粘芽孢杆菌斜面菌株接种到液体种子培养基中，30℃、150r/min震荡培养16h，得到菌株种子液，所述液体种子培养基配方组分如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH 7，121℃灭菌20 min；
二、发酵液的制备
采用初始pH值为4.0~9.0的发酵培养基，在25~35℃条件下对步骤一所述的菌株种子液进行发酵12~84h制得发酵液，其中菌株接种量为6~16%，所述发酵培养基配方组分如下：葡萄糖15g，尿素0.64g，KH2PO4 2g，K2HPO4 5g，NaCl 0.1g，MgSO4 0.2g，蒸馏水1000mL；
三、微生物絮凝剂的提纯
将步骤二制得的发酵液在4000r/min下离心60min，弃去菌体沉淀，保留上清液，加入体积比为2:1的无水乙醇或丙酮，搅拌均匀，4℃静置过夜，弃掉上清液采集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤，4000r/min离心20min，沉淀40℃恒温干燥数小时，得到微生物絮凝剂粗品；将粗絮凝剂粗品溶解于70-80℃蒸馏水中配置成10mg/L溶液，利用凝胶Sephacryl S-200过滤层析法对其进行纯化，收集吸收峰处溶液，得到微生物絮凝剂纯品。
2.根据权利要求1所述的利用多粘芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于：步骤一所述多粘芽孢杆菌为多粘梭状芽胞杆菌或多粘气芽孢杆菌中的一种。
3.根据权利要求1或2方法制备的生物絮凝剂在处理生活污水和洗车废水中的应用。
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