CN109444026B - 一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法 - Google Patents

一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109444026B
CN109444026B CN201811254775.6A CN201811254775A CN109444026B CN 109444026 B CN109444026 B CN 109444026B CN 201811254775 A CN201811254775 A CN 201811254775A CN 109444026 B CN109444026 B CN 109444026B
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombination
generation
screening
mutant
seeds
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811254775.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109444026A (zh
Inventor
李帆
孙丹
王继华
李绅崇
阮继伟
程英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Flower Research Institute of YAAS
Original Assignee
Flower Research Institute of YAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Flower Research Institute of YAAS filed Critical Flower Research Institute of YAAS
Priority to CN201811254775.6A priority Critical patent/CN109444026B/zh
Publication of CN109444026A publication Critical patent/CN109444026A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109444026B publication Critical patent/CN109444026B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5097—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving plant cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1434—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Abstract

本发明涉及一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法，属于生物技术领域，本发明利用拟南芥花粉荧光标记系统FTLs和流式细胞技术，对EMS诱变处理的拟南芥野生型Col与FTL‑I2ab杂交F1代及其自交F2代植株的重组率进行高通量测量，大规模高效筛选减数分裂重组率提高的植株，获得减数分裂重组抑制突变体。由于本发明突变体的筛选是建立在拟南芥野生型遗传背景基础之上，所有减数分裂交叉形成途径（Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型）均存在，故能高效筛选获得抑制所有交叉形成途径的重组抑制突变体。

Description

一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法。
背景技术
减数分裂是生物细胞中染色体数目减半的一种特殊的细胞分裂方式，在该过程中DNA只复制一次，但细胞连续分裂两次，从而形成染色体数目减半的配子，其中包括减速第一次分裂和减速第二次分裂。在减数第一次分裂过程中，为了确保同源染色体的精确分离和染色体数目的减半，同源染色体间需要形成至少一个物理连接点，称为交叉。交叉通过修复作用产生同源染色体间遗传物质的相互交换，即同源染色体间的重组，进而形成具有遗传多样性的配子。因此，减数分裂同源重组不仅保证了同源染色体之间的物理连接，对同源染色体后期的正确分离起到重要作用，同时还促进了父母亲本之间遗传物质的相互交换，在配子中产生不同等位基因的重新组合形成遗传变异，从而大大提高了后代的遗传多样性。综上所述，减数分裂同源重组对生物进化和物种形成至关重要，也是植物新品种培育和开发的基础生物学过程。特别是在全球气候变化的背景下，人类面临各种挑战，减数分裂同源重组为充分利用植物的遗传多样性进行新品种的培育和创新提供了基础。
减数分裂同源重组起始于DNA双链断裂，而这些断裂双链的修复过程导致了同源染色体间遗传物质的广泛重组。然而，在双链断裂的修复过程中，同源染色体间的交叉数目(重组率)是被严格限制的。在减数分裂开始初期，双链DNA 会产生大量双链断裂，但不管基因组的大小或者染色体数目的多少，只有极少数的断裂双链被修复成为交叉形成同源重组，其余的大量DSBs通过不同的途径和机制修复形成了非交叉。在模式植物拟南芥中，细胞学分析估算每个细胞减数分裂过程中大约形成200个双链断裂，但只有大约10个断裂的双链被修复成为交叉，其余的断裂双链则被修复成非交叉。
在大多数真核生物的减数分裂重组中,至少存在两种不同的交叉形成途径，根据对交叉干扰是否敏感将其分为I型交叉和II型交叉。其中，I型交叉为干涉敏感型交叉，约占交叉总数的80％-85％，而与Ⅰ型交叉对应的是干涉不敏感的Ⅱ型交叉。此外，值得注意的是，在拟南芥msh4mus81fancd2三突变体中，虽然同时缺乏形成I型和II类型交叉的所有关键基因，但仍有交叉形成，这说明阻断I型和II型交叉形成途径后触发了其他未知的交叉形成途径产生交叉，这表明存在其他交叉形成途径(Ⅲ型)，且与已知的交叉形成途径同时共存或是互斥独存。
在大多数真核生物的减数分裂过程中，双链断裂与交叉形成的比率 (DSBs/COs)存在极大差异，如拟南芥中DSBs/COs比率约为200：10，这表明生物进化过程中存在着遗传机制抑制减数分裂重组的形成。2012年，为了揭示减数分裂重组抑制基因，法国科学家Crismani等利用正向遗传学通过EMS诱变拟南芥zmm突变体种子和大规模突变体筛选，并获得多个重组恢复系，最终鉴定出抑制Ⅱ型交叉形成的多个基因(FANCM、MHF1/2、TOP3α、RECQ4A/B、 FIGL1、RMI1和FLIP，图1)。该研究巧妙利用了zmm突变体短角果的表型(因缺乏Ⅰ型交叉形成的ZMM基因而育性降低)进行果夹表型恢复系的筛选。然而，由于该研究是建立在zmm等突变体的背景上，其只能筛选获得抑制Ⅱ型交叉形成的重组抑制突变体，不能发现Ⅰ型交叉途径的重组抑制突变体，而Ⅰ型交叉途径是绝大多数交叉(80％-85％)形成的重要途径。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，解决现有采用正向遗传学通过EMS诱变拟南芥zmm突变体种子只能筛选获得抑制Ⅱ型交叉形成的重组抑制突变体，不能发现其他类型交叉途径(Ⅰ型和Ⅲ型)的重组抑制突变体的技术难题。本发明提供了一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法，运用花粉荧光标记系统(Fluorescent Tagged Lines,FTLs)和流式细胞技术高通量的测量拟南芥野生型遗传背景的EMS突变体的重组率，进而筛选出减数分裂重组率提高的植株，获得减数分裂重组抑制突变体。
花粉荧光标记系统由一系列T-DNA插入片段编码的荧光标记构成(图1)，并由花粉特异性LAT52启动子激活在花粉中表达红荧光(DsRed)、绿荧光(eYFP) 和蓝荧光(eCFP)。利用花粉荧光标记系统统计不同花粉四分体的荧光组合情况，可以非常容易快速的计算出标记位点间的重组率(图2)。如图2b中所示，标记位点红荧光和绿荧光间发生了一次重组，减数分裂后的花粉四分体会表达出一组分离的红色和绿色标记花粉,通过统计12种不同类型的花粉荧光组合情况可以计算出红绿荧光标记间的重组率。同时，为了满足大规模的突变体筛选，通过流式细胞仪高通量的检测不同植物的花粉荧光标记情况测量重组率。
如图1所示，FTLs系统是由花卉特异启动子LAT52引导的，包含三种不同荧光蛋白的标记系统。该系统建立在拟南芥quartet四分体基础上，即减数分裂过程后花粉四分体不分离。四分体花粉在不同的荧光激发下表达不同的荧光标记，如白光(BF)、红荧光(DsRed)、绿荧光(eYFP)和蓝荧光(eCFP)。
本发明提供一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法，具体包括以下步骤：
1)利用拟南芥花粉荧光标记系统FTLs与拟南芥野生型Col进行杂交，获得杂合荧光标记F1代种子(图3)。F1代种子萌发培养，待F1代植株开花，测量其重组率，获得该遗传背景下的重组率数据作为对照；
2)利用EMS诱变F1代种子获得M1代突变群体，通过M1代自交产生M2代突变群体；
3)重组抑制突变体的筛选：通过检测M1代突变群体的重组率可筛选获得显性重组抑制突变体；M2代突变群体中包含显性和隐形突变体，通过检测其重组率筛选获得显性和隐性重组抑制突变体(图4)。
1.进一步的，F1代种子萌发培养具体包括以下步骤：将F1代干燥种子用氯气消毒4小时，播种于MS固体培养基，放于4℃条件下暗处理48h，之后在12 h光照/12h黑暗的光周期和20℃条件下培养8天，将萌发的幼苗移植土壤中在相同的生长条件下培养，直到花蕾抽苔，将光周期调整为16h光照/8h黑暗长日照以促进和诱导开花。
进一步的，MS固体培养基包括MS盐2.21g/L、蔗糖10g/L、2-吗啉乙磺酸 0.5g/L、肌醇100mg/L和植物琼脂8g/L，pH＝5.6。
进一步的，EMS诱变处理具体包括以下步骤：将干燥的F1代种子装于50ml 离心管中，加入100mM磷酸钾缓冲液置于4℃下浸种12h；用新的100mM磷酸钾缓冲液替换后，放置于通风橱中的EMS诱变密闭处理箱(如
Figure RE-GDA0001871694590000041
AtmosBag glove bag)内，加入二甲基亚砜和EMS使最终浓度分别为5％和75mM；将种子在室温下处理8h，期间上下轻微摇动离心管；将处理之后的种子依次用100mM 硫代硫酸钠和蒸馏水分别浸洗10次，每次2-3min；最后将处理的M1代种子转移到滤纸上干燥，完成后放置于种子袋中保存备用(需尽快种植M1代，否则可能因为EMS的残留导致种子的萌发率降低)。
拟南芥基因组大小为125Mb，为了获得基因组序列中任一碱基对均被突变的概率(95％的可信区间)，至少需要125,000粒EMS诱变的M1代种子才能获得饱和诱变。而受限于F1代杂交种子的生产能力，为了获得任一基因中至少有一个突变体的概率，则只需要25000粒EMS诱变的M1代种子(拟南芥约有25498 个基因)。根据理想诱变后幼苗隐性性状标准(50％的种子萌发率、幼苗出现白化和毛状表型)，采用75mM EMS
Figure RE-GDA0001871694590000051
处理拟南芥F1代干燥种子(千粒重为0.023g)8小时为最佳处理。
M1代种子的萌发率约为50％左右，将萌发后的幼苗分别种植并标号。在 M1代突变群体中，可通过检测重组率鉴定出显性重组抑制突变体。待M1代植株自交结实后，分别收集每株种子(M2代)并标号。在M2代突变群体中，花粉荧光标记和重组抑制突变基因的分离比遵循1/4(显性重组抑制突变体)和1/8 (隐性重组抑制突变体)。因此，进一步的，通过M1代自交产生M2代突变群体，分别独立收集由每个M1代产生的M2代株系种子，每个株系的M2代种子至少需种植8株植株进行筛选。
进一步的，重组抑制突变体的筛选包括杂合荧光标记表型的初筛和重组率的检测。
进一步的，杂合荧光标记表型的初筛是指利用荧光显微镜对植物的荧光标记进行检测，筛选出杂合表型的荧光标记，具体包括以下步骤：在多孔板中加入200μL花粉缓冲液(50mM的Na3PO4溶液和0.5％Triton-x溶液，ph值为7.0)，每个孔分别放入至少5朵待检测植株当天开放的花朵，轻轻震荡多孔板使花粉从花朵中分离，用干净的镊子取出花朵，在荧光显微镜下静止多孔板稍许，并对每个孔进行荧光标记检测(自动拍照)，筛选出杂合荧光标记表型的植株。
进一步的，重组率的检测是指利用流式细胞仪检测杂合荧光标记植株的重组率，具体包括以下步骤：在2mL离心管中加入300μL(50mM的Na3PO4溶液和0.5％Triton-x溶液，ph值为7.0)，放入至少15朵待检测植株当天开放的花朵，大力震荡离心管5分钟使花粉从花朵中分离，用干净的镊子取出花朵，花粉悬浊液用孔径为100μM的尼龙网过滤，流式细胞仪检测四种花粉荧光标记组合情况(如：无荧光标记花粉数、红绿荧光标记花粉数、红荧光标记花粉数和绿荧光标记花粉数)，计算检测植株染色体荧光标记区间的重组率(
Figure RE-GDA0001871694590000061
Figure RE-GDA0001871694590000062
其中“G”是绿荧光标记花粉数，“R”为红荧光标记花粉数，“GR”为红绿荧光标记花粉数，“NF”为无荧光标记花粉数，单位为cM)，筛选获得重组率提高的重组抑制突变体。
进一步的，以F1代植株的重组率为对照，在M1或M2代突变群体中筛选获得重组率提高的重组抑制突变体，将突变体与拟南芥野生型Col回交，若回交群体BC1代均表现为重组率增加，判定该突变体为显性重组抑制突变体，如实施例1中的drs突变体；若回交群体BC1代重组率与野生型Col无差异，而在自交F2代群体中出现1/4的植株重组率提高，判定该突变体为隐性重组抑制突变体，如实施例2中的rrs突变体。
本发明的有益效果：
与现有技术相比，本发明利用拟南芥花粉荧光标记系统和流式细胞技术，对拟南芥野生型Col与FTL-I2ab杂交F1代EMS处理的突变群体M1代及其自交M2代植株的重组率进行高通量测量，大规模高效筛选减数分裂重组率提高的植株，获得减数分裂重组抑制突变体。本发明突变体的筛选是建立在拟南芥野生型遗传背景基础上，所有减数分裂交叉形成途径(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型)均存在，因此能筛选获得抑制所有交叉形成途径的重组抑制突变体。
附图说明
图1是拟南芥花粉荧光标记系统FTLs示意图；
图2是花粉荧光标记系统的四分体荧光组合模式示意图；
图3是拟南芥花粉荧光标记系FTL-I2b与拟南芥野生型Col杂交示意图；
图4是减数分裂重组抑制突变体筛选示意图；
图5是实施例1中拟南芥野生型Col与显性重组抑制突变体drs植株表型和花粉荧光标记图；
图6是实施例2中拟南芥野生型Col与隐性重组抑制突变体rrs植株表型和花粉荧光标记图。
图1中，图示标尺为50μm。
图2中，三种颜色标记的椭圆代表对应的荧光标记蛋白，并定义出两个标记区间I1和I2。数字1-4表示四条染色单体。图中a-l对应经过减数分裂后形成的12种四分体花粉荧光标记分离组合情况。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例中所用的拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)植物材料为拟南芥荧光标记系FTL-I2b和拟南芥野生型哥伦比亚(Col)，由美国北卡罗莱纳大学Gregory P.Copenhaver教授提供。
实施例1
1)获得杂合荧光标记的F1代
拟南芥花粉荧光标记系FTL-I2b与拟南芥野生型Col杂交，获得杂合荧光标记F1代种子，将种子在阴凉通风处风干储存备用。将F1代干燥种子用氯气消毒4小时，播种于MS固体培养基(MS盐2.21g/L、蔗糖10g/L、2-吗啉乙磺酸 0.5g/L、肌醇100mg/L和植物琼脂8g/L，pH＝5.6)，放于4℃条件下暗处理48h，之后在12h光照/12h黑暗的光周期和20℃条件下培养8天，将萌发的幼苗移植土壤中在相同的生长条件下培养，直到花蕾抽苔，将光周期调整为16h光照 /8h黑暗长日照以促进和诱导开花。测量F1代植株的重组率，并以此为该遗传背景下重组率的对照。
2)EMS诱变
将50000粒干燥的F1代种子装于50ml离心管中，加入40ml 100mM磷酸钾缓冲液，置于4℃下浸种12h；加入40ml 100mM磷酸钾缓冲液置换，放置于通风橱中EMS诱变密闭处理箱(
Figure RE-GDA0001871694590000083
AtmosBag glove bag)内，加入2.1ml 二甲基亚砜和325.2μL EMS
Figure RE-GDA0001871694590000084
在室温下处理8h，期间上下轻微摇动离心管；将处理之后的种子依次用100mM硫代硫酸钠和蒸馏水分别浸洗10次，每次2-3min；最后将处理的种子(M1代)转移到滤纸上干燥，并将M1代种子播种于MS固体培养基进行萌发培养。
3)M1代突变群体筛选
M1代种子按照步骤1中的培养条件萌发，幼苗按照步骤1中的生长条件分别单独种植并标号。待M1代植株开花，用流式细胞仪检测植株的重组率，具体的操作流程为：在2mL离心管中加入500μL花粉缓冲液(50mM的Na3PO4溶液和0.5％Triton-x溶液，ph值为7.0)，放入至少15朵待检测植株当天开放的花朵，大力震荡离心管5分钟使花粉从花朵中分离，用干净的镊子取出花朵，花粉悬浊液用孔径为100μM的尼龙网过滤，流式细胞仪检测四种花粉荧光标记组合情况(如：无荧光标记花粉数、红绿荧光标记花粉数、红荧光标记花粉数和绿荧光标记花粉数)，计算检测植株染色体荧光标记区间的重组率(
Figure RE-GDA0001871694590000081
Figure RE-GDA0001871694590000082
其中“G”是绿荧光标记花粉数，“R”为红荧光标记花粉数，“GR”为红绿荧光标记花粉数，“NF”为无荧光标记花粉数，单位为cM)，筛选获得重组率提高的显性重组抑制突变体。
4)显性重组抑制突变体
从M1代突变群体中，可鉴定出重组率提高的显性重组抑制突变体，下面以筛选获得的显性重组抑制突变体为例进行说明。在M1代突变群体中筛选获得了重组率提高4倍的重组抑制突变体，将其与拟南芥野生型Col回交，回交后代 BC1群体均表现为重组率提高，表明该突变体为显性重组抑制突变体，命名为 drs(dominant recombinationsuppressor)。重组抑制突变体drs植株与拟南芥野生型Col在生长发育上没有差异，但其重组率(21.56cM)比Col重组率(5.02cM) 提高4倍(图5)。
实施例2
实施例2中步骤1)、2)与实施例1相同。
3)M2代突变群体筛选
M1代种子按照步骤1中的培养条件萌发，幼苗按照步骤1中的生长条件分别单独种植并标号。待M1代植株自交结实后，分别收集每株种子(M2代)并标号。从每个标号的M2代种子中随机选取50粒种子按照步骤1中的培养条件萌发，随机选取12株萌发幼苗按照步骤1中的生长条件分别种植并标号。待 M2代植株开花，用荧光显微镜检测花粉荧光标记情况，筛选出杂合表型的荧光标记的植株检测重组率，具体的操作流程为：在多孔板中加入200μL花粉缓冲液(50mM的Na3PO4溶液和0.5％Triton-x溶液，ph值为7.0)，每个孔分别放入待检测植株当天开放的花朵(至少5朵)，轻轻震荡多孔板使花粉从花朵中分离，用干净的镊子取出花朵，在荧光显微镜下静止多孔板稍许，并对每个孔进行荧光标记检测(自动拍照)，筛选出杂合荧光标记表型的植株。待筛选出的杂合荧光标记植株继续生长3-4天后，取至少15朵待检测植株当天开放的花朵放入装有300μL花粉缓冲液的2mL离心管中，大力震荡离心管5分钟使花粉从花朵中分离，用干净的镊子取出花朵，花粉悬浊液用孔径为100μM的尼龙网过滤，流式细胞仪检测四种花粉荧光标记组合情况(如：无荧光标记花粉数、红绿荧光标记花粉数、红荧光标记花粉数和绿荧光标记花粉数)，计算检测植株染色体荧光标记区间的重组率(
Figure RE-GDA0001871694590000101
其中“G”是绿荧光标记花粉数，“R”为红荧光标记花粉数，“GR”为红绿荧光标记花粉数，“NF”为无荧光标记花粉数，单位为cM)，筛选获得重组率提高的显性或者隐形重组抑制突变体。
4)隐性重组抑制突变体
从M2代突变群体中，可鉴定出重组率提高的显性和隐性重组抑制突变体，下面以筛选获得的隐性重组抑制突变体为例进行说明。在M2代突变群体中筛选获得了重组率提高3倍的重组抑制突变体，将其与拟南芥野生型Col回交，回交后代BC1群体的重组率与野生型相比没有差异，而其自交F2代的重组率出现 3：1的单基因分离比，表明该突变体为隐性重组抑制突变体，命名为rrs(recessive recombination suppressor)。重组抑制突变体rrs植株与拟南芥野生型Col在生长发育上没有差异，但其重组率(16.26cM)比Col重组率(5.06cM)提高3倍以上(图6)。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
1）利用拟南芥花粉荧光标记系统FTLs与拟南芥野生型Col进行杂交，获得杂合荧光标记F1代种子；F1代种子萌发培养，待F1代植株开花，测量其重组率，获得该遗传背景下的重组率数据作为对照；
2）利用EMS诱变F1代种子获得M1代突变群体，通过M1代自交产生M2代突变群体；
3）重组抑制突变体的筛选：通过检测M1代突变群体的重组率可筛选获得显性重组抑制突变体；M2代突变群体中包含显性和隐形突变体，通过检测其重组率筛选获得显性和隐性重组抑制突变体；筛选具体步骤如下：以F1代植株的重组率为对照，在M1或M2代突变群体中筛选获得重组率提高的重组抑制突变体，将突变体与拟南芥野生型Col回交，若回交群体BC1代均表现为重组率增加，判定该突变体为显性重组抑制突变体；若回交群体BC1代重组率与野生型Col无差异，而在自交F2代群体中出现1/4的植株重组率提高，判定该突变体为隐性重组抑制突变体。
2.根据权利要求1所述的一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法，其特征在于：F1代种子萌发培养具体包括以下步骤：将F1代干燥种子用氯气消毒4小时，播种于MS固体培养基，放于4℃条件下暗处理48h，之后在12 h光照/12 h黑暗的光周期和20℃条件下培养8天，将萌发的幼苗移植土壤中在相同的生长条件下培养，直到花蕾抽苔，将光周期调整为16h光照/8 h黑暗长日照以促进和诱导开花。
3.根据权利要求2所述的一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法，其特征在于：MS固体培养基包括MS盐2.21g/L、蔗糖10g/L、2-吗啉乙磺酸0.5g/L、肌醇100mg/L和植物琼脂8g/L，pH=5.6。
4.根据权利要求1所述的一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法，其特征在于：EMS诱变处理具体包括以下步骤：将干燥的F1代种子装于50ml离心管中，加入100mM磷酸钾缓冲液置于4℃下浸种12h；用新的100mM磷酸钾缓冲液替换后，放置于通风橱中的EMS诱变密闭处理箱内，加入二甲基亚砜和EMS使最终浓度分别为5%和75mM；将种子在室温下处理8h，期间上下轻微摇动离心管；将处理之后的种子依次用100mM硫代硫酸钠和蒸馏水分别浸洗10次，每次2-3min；最后将处理的M1代种子转移到滤纸上干燥，完成后放置于种子袋中保存备用。
5.根据权利要求1所述的一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法，其特征在于：通过M1代自交产生M2代突变群体，分别独立收集由每个M1代产生的M2代株系种子，每个株系的M2代种子至少需种植8株植株进行筛选。
6.根据权利要求1所述的一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法，其特征在于：重组抑制突变体的筛选包括杂合荧光标记表型的初筛和重组率的检测。
7.根据权利要求6所述的一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法，其特征在于：杂合荧光标记表型的初筛是指利用荧光显微镜对植物的荧光标记进行检测，筛选出杂合表型的荧光标记，具体包括以下步骤：在多孔板中加入200μL花粉缓冲液，每个孔分别放入至少5朵待检测植株当天开放的花朵，轻轻震荡多孔板使花粉从花朵中分离，用干净的镊子取出花朵，在荧光显微镜下静止多孔板稍许，并对每个孔进行荧光标记检测，筛选出杂合荧光标记表型的植株。
8.根据权利要求6或7任一项所述的一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法，其特征在于：重组率的检测是指利用流式细胞仪检测杂合荧光标记植株的重组率，具体包括以下步骤：在2mL离心管中加入300μL花粉缓冲液，放入至少15朵待检测植株当天开放的花朵，大力震荡离心管5分钟使花粉从花朵中分离，用干净的镊子取出花朵，花粉悬浊液用孔径为100μM的尼龙网过滤，流式细胞仪检测四种花粉荧光标记组合情况，计算检测植株染色体荧光标记区间的重组率，筛选获得重组率提高的重组抑制突变体。
CN201811254775.6A 2018-10-26 2018-10-26 一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法 Active CN109444026B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811254775.6A CN109444026B (zh) 2018-10-26 2018-10-26 一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811254775.6A CN109444026B (zh) 2018-10-26 2018-10-26 一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109444026A CN109444026A (zh) 2019-03-08
CN109444026B true CN109444026B (zh) 2020-11-27

Family

ID=65548683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811254775.6A Active CN109444026B (zh) 2018-10-26 2018-10-26 一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109444026B (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7279334B2 (en) * 2003-07-18 2007-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Methods for inducing targeted stimulation of meiotic recombination and kits for performing said methods
CN101861390A (zh) * 2007-06-13 2010-10-13 先正达参股股份有限公司 用于欧洲油菜的新杂交系统
CN101904297A (zh) * 2010-07-27 2010-12-08 上海交通大学 基于水稻的osms4突变体的制种、繁种及两系杂交育种方法
CN104450696A (zh) * 2015-01-05 2015-03-25 北京林业大学 一种双重组位点的双向启动植物表达载体系统
CN104928303A (zh) * 2015-05-11 2015-09-23 复旦大学 拟南芥pol2a基因在减数分裂重组中的功能及其应用
CN106661589A (zh) * 2014-06-02 2017-05-10 国家农艺研究所 在植物中产生二倍体配子的tdm基因中的显性突变
CN108220333A (zh) * 2018-03-28 2018-06-29 中国农业科学院作物科学研究所 一种高效植物受体孤雌生殖单倍体筛选方法
CN108342408A (zh) * 2018-02-14 2018-07-31 天津大学 一种精确控制基因重排的基因元件及其重组质粒和应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7279334B2 (en) * 2003-07-18 2007-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Methods for inducing targeted stimulation of meiotic recombination and kits for performing said methods
CN101861390A (zh) * 2007-06-13 2010-10-13 先正达参股股份有限公司 用于欧洲油菜的新杂交系统
CN101904297A (zh) * 2010-07-27 2010-12-08 上海交通大学 基于水稻的osms4突变体的制种、繁种及两系杂交育种方法
CN106661589A (zh) * 2014-06-02 2017-05-10 国家农艺研究所 在植物中产生二倍体配子的tdm基因中的显性突变
CN104450696A (zh) * 2015-01-05 2015-03-25 北京林业大学 一种双重组位点的双向启动植物表达载体系统
CN104928303A (zh) * 2015-05-11 2015-09-23 复旦大学 拟南芥pol2a基因在减数分裂重组中的功能及其应用
CN108342408A (zh) * 2018-02-14 2018-07-31 天津大学 一种精确控制基因重排的基因元件及其重组质粒和应用
CN108220333A (zh) * 2018-03-28 2018-06-29 中国农业科学院作物科学研究所 一种高效植物受体孤雌生殖单倍体筛选方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dynamics of male meiotic recombination frequency during plant development using Fluorescent Tagged Lines in Arabidopsis thaliana;Li Fan et al;《 SCIENTIFIC REPORTS》;20170213;2134 *
High-throughput analysis of meiotic crossover;Yelina NE et al;《Nat Protoc》;20131210;2119-2134 *
拟南芥DNA复制因子RFC1在减数分裂重组中的功能研究;程志号;《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20150315;A006-126 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109444026A (zh) 2019-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pandey Mutations of self-incompatibility alleles in Trifolium pratense and T. repens
CN109997683B (zh) 一种基于单倍体诱导系的水稻双单倍体育种方法
US20230332173A1 (en) Intelligent genetic breeding and seed production system for crop cross breeding and hybrid seed production, and application thereof
Amorim et al. Banana breeding at Embrapa cassava and fruits
Koornneef Classical mutagenesis in higher plants
JP7386150B2 (ja) 自家和合性ブラシカ・オレラセア植物およびその育成方法
US20200196546A1 (en) Breeding method and application of new downy mildew-resistant interspecific hybrid cucumis sativus variety
Hooghvorst et al. In situ parthenogenetic doubled haploid production in melon “Piel de Sapo” for breeding purposes
CN107435066A (zh) 水稻柱头外露率主效qtl及其定位方法和应用
Germana et al. Citrus biotechnology
CN113993373A (zh) 生长性被改良的细胞质雄性不育芜菁植物
CN109444026B (zh) 一种高效筛选减数分裂重组抑制突变体的方法
CN116491415A (zh) 优化温度提高cenh3介导的母本单倍体诱导效率的方法
Roumet et al. Estimation of hybrid seed production and efficient pollen flow using insect pollination of male sterile soybeans in caged plots
CN115053803A (zh) 一种具备强化颜色标记与高频单倍体诱导率的诱导系选育方法及其应用
CN105331689B (zh) 小麦-长穗偃麦草抗白粉病易位系选育方法及其分子标记
CN111172309B (zh) 与矮杆基因紧密连锁的分子标记及其应用
Tripodi Methods of development of biparental mapping populations in horticultural crops
Guan et al. Feature of blast resistant near-isogenic lines using an elite maintainer line II-32B by marker-assisted selection
Chen et al. Identification and evaluation of tobacco cytoplasmic male sterile line Nta (gla) S K326 generated from asymmetric protoplast fusion of Nicotiana glauca and N. tabacum followed by backcrossing with N. tabacum K326
CN108243942B (zh) 辣椒cms三系杂交砧木的选育方法
Wisman et al. Isolation of a new paramutagenic allele of the sulfurea locus in the tomato cultivar Moneymaker following in vitro culture
Brar et al. Application of biotechnology in hybrid rice
Zarei et al. Biodiversity, germplasm resources and breeding methods
CN107347248B (zh) 不依赖于春化处理的洋桔梗植物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant