CN109438462A - 具有抗肿瘤活性的o-对硝基苯甲酰基土甘草a及其制备方法和用途 - Google Patents

具有抗肿瘤活性的o-对硝基苯甲酰基土甘草a及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的O‑对硝基苯甲酰基土甘草A，其结构式为：本发明还提供上述O‑对硝基苯甲酰基土甘草A的制备方法：以土甘草A为原料，吡啶为缚酸剂，乙腈为溶剂回流反应，冷却后蒸除溶剂，无水乙醇中重结晶得到纯品。本发明提供的O‑对硝基苯甲酰基土甘草A经体外抗肿瘤实验表明具有强的抗肿瘤活性。

Description

具有抗肿瘤活性的O-对硝基苯甲酰基土甘草A及其制备方法 和用途
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的 O-对硝基苯甲酰基土甘草A及其制备方法和用途。
背景技术
香豆素(Coumarin)是广泛存在于自然界中的内酯类化合物,其母核为苯并吡喃酮的一类化合物，其衍生物具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗高血压、抗凝血等多种药理作用，是很好的潜在待开发药物。近年来，大量的具有抗癌活性的香豆素类化合物被分离出来，为抗肿瘤药物的研究与开发开辟了新的领域。本课题组近几年对两粤黄檀(Dalbergia benthamiPrain)的化学成分及生物活性进行研究，发现两粤黄檀提取物具有较强的抗氧化活性，并从两粤黄檀中分离出并鉴定出一单体化合物，经核磁、质谱鉴定为土甘草A，其结构式为：
土甘草A为吡喃香豆素类化合物，在植物中的含量高达3.5％。初步药理活性发现土甘草A对DPPH自由基和ABTS自由基均有明显的清除作用，自由基与很多疾病如抗肿瘤的靶点均相关，初步抗肿瘤活性显示土甘草A对NCI-H460、HepG2、SK-OV-3、BEL-7404、 HeLa癌细胞具有一定的抑制活性，初期毒性实验也显示该化合物具有一定的毒性，若能对其进行结构优化，提高活性降低毒性，将提高该类衍生物在临床上应用的可能。本发明拟在土甘草A母核结构的基础上，通过不同程度的酯化获得新型O-酰基土甘草A衍生物，以期筛选出高效、低毒的抗肿瘤药物。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种具有抗肿瘤活性的化合物O-对硝基苯甲酰基土甘草 A。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种具有抗肿瘤活性的O-对硝基苯甲酰基土甘草A，所述O-对硝基苯甲酰基土甘草A的结构式为：
分子式为：C29H23NO9，
相对分子量为：529.49，
理化性质为：黄色絮状固体，m.p.239.5-241.9℃；FAB-MS:m/z:([M+H]+)；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ:8.35(d，J＝5Hz，2H，ArH)；8.22(d，J＝5Hz，2H，ArH)；7.39(d，J＝10Hz，2H，ArH)；6.90(d，J＝10Hz，2H，ArH)；6.72(s，1H，ArH)；6.47(d，J＝10Hz，1H，ArH)； 5.73(d，J＝10Hz，1H，ArH)；3.79(s，3H，-OCH3)；3.55(s，3H，-OCH3)；1.50(s，6H， -CH3)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ:161.66，161.49，159.72，157.79，154.24，153.82， 151.88，151.01，133.88，131.12，131.07，131.05，123.82，122.15，117.20，115.60，113.81， 112.67，103.26，101.45，63.50，55.23，28.24。
本发明还提供上述O-对硝基苯甲酰基土甘草A的制备方法，包括以下步骤：
将土甘草A和对硝基苯甲酰氯进行亲核取代反应得到O-对硝基苯甲酰基土甘草A。
优选的是，土甘草A和对硝基苯甲酰氯进行亲核取代反应的缚酸剂为吡啶，溶剂为乙腈。
上述O-对硝基苯甲酰基土甘草A的合成路线如下：
优选的是，将土甘草A溶于乙腈，再加入吡啶和对硝基苯甲酰氯，85℃下加热回流反应，反应结束后，减压蒸除乙腈得残留物，残留物重结晶得到O-对硝基苯甲酰基土甘草A。
优选的是，土甘草A和对硝基苯甲酰氯的摩尔比为1：2。
本发明还提供上述O-对硝基苯甲酰基土甘草A在制备抗肿瘤药物中的应用，O-对硝基苯甲酰基土甘草A可以制成药学上的常见剂型，包括制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
本发明至少包括以下有益效果：以土甘草A为母核结构基础制得的O-对硝基苯甲酰基土甘草A在抗肿瘤方面效果更好、毒性更低，且O-对硝基苯甲酰基土甘草A的制备方法简便易行，产率较高。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明实施例中细胞抑制率统计图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
具有抗肿瘤活性的O-对硝基苯甲酰基土甘草A的制备方法，包括以下步骤：
将190mg土甘草A(0.5mmoL)、0.161μL吡啶于10mL乙腈中，85℃下加热回流，待固体溶解完全后加入对硝基苯甲酰氯(1mmol)反应30min，待反应结束后冷却至室温，减压蒸除溶剂，收集残留固体，冰水洗涤，无水乙醇中重结晶得黄色絮状沉淀，产率75.09％。
产物用核磁共振检测，其核磁共振数据为：1H NMR(500MHz，CDCl3)δ:8.35(d，J＝5Hz，2H，ArH)；8.22(d，J＝5Hz，2H，ArH)；7.39(d，J＝10Hz，2H，ArH)；6.90(d，J＝10Hz， 2H，ArH)；6.72(s，1H，ArH)；6.47(d，J＝10Hz，1H，ArH)；5.73(d，J＝10Hz，1H，ArH)； 3.79(s，3H，-OCH3)；3.55(s，3H，-OCH3)；1.50(s，6H，-CH3)；13C NMR(125MHz， CDCl3)δ:161.66，161.49，159.72，157.79，154.24，153.82，151.88，151.01，133.88，131.12， 131.07，131.05，123.82，122.15，117.20，115.60，113.81，112.67，103.26，101.45，63.50， 55.23，28.24。
<实施例2>体外抗肿瘤活性实验
采用MTS法进行体外抗肿瘤筛选
①接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液，以每孔3000～15000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，细胞提前12～24小时接种培养。
②加入待测化合物溶液：用DMSO分别溶解O-对硝基苯甲酰基土甘草A和土甘草A，设置初始浓度40μM，分别对白细胞HL-60、肺癌A-549、肝癌SMMC-7721、肝癌HepG2、宫颈癌Hela这六种肿瘤细胞进行初筛，每孔终体积为200μl，每种处理均设3个复孔。
③显色：37摄氏度培养48小时后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20μl 和培养液100μl；悬浮细胞HL-60弃100μl培养上清液，每孔加20μl的MTS溶液；悬浮细胞MT-4直接每孔加20μl的MTS溶液；设3个空白复孔(MTS溶液20μl和培养液100μl 的混合液)，继续孵育2～4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。
④比色：选择492nm波长，多功能酶标仪(MULTISKAN FC)读取各孔光吸收值，记录结果，数据处理后以化合物编号为横坐标，细胞抑制率为纵坐标绘制细胞的抑制率图，如图1所示。
从图1可以看出，O-对硝基苯甲酰基土甘草A对癌细胞的抑制率明显高于土甘草A对癌细胞的抑制率。
⑤IC50的计算：采用二倍稀释法对抑制率为50％以上的细胞株进行半数有效浓度计算，见表1。
表1、O-对硝基苯甲酰基土甘草A对不同细胞株的IC50值(μM)
从表1的结果可以看出，本发明的O-对硝基苯甲酰基土甘草A经体外抗肿瘤实验表明，该化合物对白血病HL-60、肝癌SMMC-7721及宫颈癌Hela具有强的抗肿瘤活性。本发明为研究开发新的抗肿瘤药物提供了新的思路。
<实施例3>化学毒性实验
①实验动物
野生型AB系雄性斑马鱼，由南方医科大学斑马鱼实验中心提供，养鱼系统为北京爱生公司净水系统，系统温度在28.5-29.5℃，盐浓度为0.03％-0.04％，pH 7.2-7.6，昼夜光照控制14h光照(8:30am-10：30pro)，10h黑夜。
斑马鱼培养液参照Zebrafish Book标准配制(0.137moL/L NaCl，5.4mmoL/L KCl，0.25mmoL/L Na2HPO4，0.44mmoL/L KH2PO4，1.3mmoL/L CaCl2，1.0mmoL/L MgSO4， 4.2mmoL/LNaHCO3)。
②药液的配置
选取土甘草A用二甲亚砜(DMSO)助溶，分别配成浓度为2.0mg/mL、1.5mg/mL、 1mg/mL的药液，避光置于-20℃冰箱保存。
选取O-对硝基苯甲酰基土甘草A用二甲亚砜(DMSO)助溶，分别配成浓度为2.0 mg/mL、1.5mg/mL、1mg/mL的药液，避光置于-20℃冰箱保存。
③胚胎的处理方法
在正置显微镜下挑选正常发育6h(6hpf)的斑马鱼胚胎，随机移入6孔板的样孔中，每孔20枚。根据预实验，取各浓度药液100μL及斑马鱼培养液加入各样孔中，使每孔所含DMSO终浓度为2％，并设纯孵化液组(对照组)及含2％DMSO的孵化液组。药物暴露72h。
④数据处理
采用概率单位法分析斑马鱼胚胎在不同药物浓度，药物暴露72h后，各系列代表药物的死亡率及致畸率；用SPSS 13.0卡方检验对各组间死亡率和畸形率进行比较。
⑤结果分析
一般斑马鱼胚胎的观察的指标有：Ⅰ类指标(致死性指标)：卵凝结，无心跳，不孵化；Ⅱ类指标(揭示受试药物特定的作用方式的非致死性指标)：无血液循环，发育畸形、孵化延迟。在对各浓度DMSO对斑马鱼影响实验中发现，1％、2％DMSO对斑马鱼胚胎影响不大。但当浓度达到3％以上时，胚胎发育出膜受到极大影响，脊柱弯曲严重，5％DMSO 在48hpf时全部胚胎无出膜，甚至有腐烂趋势。鉴于目标产物水溶性较差，1％DMSO仍出现沉淀，因此本实验采用2％DMSO溶解目标产物。选取72hpf各系列代表药物斑马鱼胚胎(72hpf)畸形率和死亡率进行统计，其结果见表2。
表2、斑马鱼胚胎(72hpf)畸形率和死亡率统计表
从表2可以看出，胚胎的死亡率和畸形率随着各化合物浓度的增加而增大，呈现出量效关系。对照组及DMSO组胚胎发育正常，按时出膜。其中土甘草A普遍表现出了较强的毒性，化合物2.0mg.L-1组中，对斑马鱼的死亡率和畸形率总和达到100％，死亡率达到了45％，表现出很强的胚胎毒性。O-对硝基苯甲酰基土甘草A的毒性较土甘草A减弱，化合物2.0mg.L-1、1.5mg.L-1、1mg.L-1组中，斑马鱼胚胎的死亡率与畸形率总和均小于 100％，且死亡率和畸形率均较土甘草A组中的低。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.具有抗肿瘤活性的O-对硝基苯甲酰基土甘草A，其特征在于，所述O-对硝基苯甲酰基土甘草A的结构式为：
2.如权利要求1所述的O-对硝基苯甲酰基土甘草A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将土甘草A和对硝基苯甲酰氯进行亲核取代反应得到O-对硝基苯甲酰基土甘草A。
3.如权利要求2所述的O-对硝基苯甲酰基土甘草A的制备方法，其特征在于，土甘草A和对硝基苯甲酰氯进行亲核取代反应的缚酸剂为吡啶，溶剂为乙腈。
4.如权利要求2所述的O-对硝基苯甲酰基土甘草A的制备方法，其特征在于，将土甘草A溶于乙腈，再加入吡啶和对硝基苯甲酰氯，85℃下加热回流反应，反应结束后，减压蒸除乙腈得残留物，残留物重结晶得到O-对硝基苯甲酰基土甘草A。
5.如权利要求2所述的O-对硝基苯甲酰基土甘草A的制备方法，其特征在于，土甘草A和对硝基苯甲酰氯的摩尔比为1：2。
6.如权利要求1所述的O-对硝基苯甲酰基土甘草A在制备抗肿瘤药物中的应用。
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