CN109438220B - 一种从鱼油中纯化epa的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析领域，特别涉及一种从鱼油中纯化EPA的方法。本发明提供的方法具有高的选择性和分离效率，对于EPA和DHA以及其他杂质有很好的分离作用；对鱼油中不饱和脂肪酸和杂质有一定选择性吸附，而且载样量高；使用有机溶剂或有机溶剂/水体系的流动相，溶剂可以回收重复利用，减少工业化成本。

Description

一种从鱼油中纯化EPA的方法

技术领域

本发明涉及分析领域，特别涉及一种从鱼油中纯化EPA的方法。

背景技术

二十碳五烯酸是近年来发现的十分有效的抗血管疾病药物，主要存在于海洋生物中。二十碳五烯酸(EicosaPentaenoic-acid)，简称EPA，属ω-3系多烯脂肪酸，在人及动物体内可转变为具有抗凝血功能的前列腺素I:(PGI。)并能抑制血栓素A:(TXA:)的生成，有抗血管疾病的作用，它的副作用小，是一种很有前途的抗血管疾病药物。EPA被称为“血管清道夫”，具有改善血液循环、软化血管、调整血脂、降低血压和血糖等作用，适合中老年人服用。临床试验已肯定了EPA的药用效果，增加EPA的吸收已经证实对治疗冠状动脉心脏病、高血压和炎症（例如风湿性关节炎）有效。

EPA主要存在于海洋生物中。例如沙丁鱼(Sardinetla)、始鱼(Poeoma-tophorusjaponieus)、鲜鱼(Clupei-dae)、海胆(Eehinoidea)、扇贝(P-eetindae)和海洋小球藻(MarinusC-holrelal)等。目前从海徉生物中分离、纯化EPA的方法很多。越来越多的研究者开始致力于高纯度的EPA的富集分离研究。目前，常用的方法主要有低温结晶法、膜分离法、酶法、超临界流体萃取法、尿素包合法、分子蒸馏法、硝酸银络合法、吸附分离法等。

提取分离方法

高纯度具有极为重要的应用价值，如何提取分离成为其开发应用的关键。目前，实验室与实际生产中采用的分离提取方法主要有溶剂法、分级分离法、超声波法、酶法、超临界流体萃取、尿素包合法、减压蒸馏法、分子蒸馏法、硝酸银络合、吸附分离法、膜分离法、柱色谱法、脂肪酶浓缩法，以及上述种或种以上方法的复合等。

分级分离法

分级分离法又称为低温结晶法，该方法是利用低温条件下不同脂肪酸在有机溶剂中的溶解度不同进行分离纯化。将鱼油或藻油溶解在无水丙酮中，冷却至-25℃以下，混合液下层形成含有饱和脂肪酸和低度不饱和脂肪酸的结晶，上层是含有大量高度不饱和脂肪酸的丙酮溶液，经过滤、真空蒸馏除去丙酮后，即可得到含量较高的制剂。

该方法原理简单、操作简便，有效成分不易氧化、聚合、异构化等，适合于实验室及中小企业使用，但需回收大量有机溶剂，分离效率不高，常与其他方法配合使用。

溶剂法：

该方法是利用不同脂肪酸或脂肪酸盐在溶剂中的溶解度不同来进行分离的，脂肪酸双键数越多越易溶于有机溶剂。将有机溶剂如甲醇、乙醇等与待分离油脂及氢氧化钠按一定比例混合，加热使油脂皂化，后经压滤得到皂液和皂粒。搅拌皂液并加入硫酸调节pH值至1-2，分离上层粗脂肪酸有机溶剂混合液，加热回收有机溶剂，反复水洗粗脂肪至中性，得到EPA和DHA含量较高的制剂。

此法设备简单，操作方便，但有机溶剂会对环境造成污染，EPA和DHA彻底分离较为困难。

超声波法：

该方法是利用超声波的特殊物理性质，超声波在液体介质中传播产生特殊的“空化效应”，不断产生无数内部压力达到上千个大气压的微气穴，并“爆破”产生微观上的强大冲击波作用于样品上，使其中的EPA和DHA被“轰击”逸出。超声波的作用使介质内各点受到的作用一致，样品萃取更加均匀。超声波可降低提取温度、缩短提取时间、减少溶剂用量、较好地保持品质，一定程度上可提高提取率，常与其他方法结合使用，有助于提高提取效率。

近年来，也有研究者研究无溶剂超声波提取EPA和DHA的方法，环保高效，但大规模工业化应用有待进一步完善。

酶法

酶法分离提取EPA和DHA较物理和化学方法而言，反应条件更加温和，纯化效率高，节约能源，操作简单易行，并且微生物酶具有底物特异性，可将EPA和DHA分离出来。此外，针对于藻类样品，可用溶剂与酶混合溶液提取，酶可有效地水解微藻细胞壁，提高提取效率。

但是，目前处理鱼油的酶种类少，活力较弱，酶价格较高，其经济适用性有待进一步加强。

超临界流体萃取法：

超临界流体萃取是通过调节温度和压力，使原料各组分在超临界流体中的溶解度发生大幅度变化而达到分离的目的。近年来,超临界流体萃取技术作为一种新的分离技术，已成为国内外研究热点。在超临界状态下，某些物质在高压条件下呈气态，然而其密度却近似于液体，与液体溶剂具有相似的萃取能力，其私度又与气体接近,有利于传质。超临界流体与脂肪酸醋混合，逐步增压后，分子量较大的EPA和DHA在较高压力下被萃取出来，而后减压或提高载气温度，使载气与萃取物分离。相比于传统的萃取方法，超临界流体萃取方法萃取率大大提高。

目前，常选用的超临界流体是二氧化碳，它们的临界温度较低且具有化学惰性，特别适用于热敏物质和易氧化物质的分离，产品品质较好，但对于碳数相同但双键数不同的脂肪酸分离效果较差。同时此方法对设备要求高，采取单一萃取剂时溶解性、选择性可能不够，影响提取能力，而且操作过程耗能较大，目前多用于实验室研究或附加值较高产品的工业化生产。

尿素包合法

该方法将脂肪酸混合物按照不饱和程度的差异进行分离。尿素分子在结晶过程中可与饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸形成稳定的晶体包合物析出，而多不饱和脂肪酸双键较多，碳链弯曲成一定的空间结构，不易被尿素包合，可采用过滤方法得到纯度较高的多不饱和脂肪酸。尿素包合法是目前较为常用的多不饱和脂肪酸分离方法，该法设备简单、操作简便、成本较低、操作温度较低,能较好地保留EPA和DHA的营养及生理活性。

但此法在应用中溶剂消耗量大，同时伴有溶剂回收和环境污染问题，包合后产品脱色脱臭过程困难，分离效果受到结晶温度和尿素用量的影响，为提高产率多采用多次尿素包合法来提取。

分子蒸馏法：

分子蒸馏法利用混合物组分挥发度不同而将其分离,是普遍使用的分离方法。此方法一般在相对于绝对大气压的高真空度条件下进行,此时脂肪酸分子克服相互间引力，挥发度提高，因而蒸馏温度较常压蒸馏低，减少高温对EPA和DHA的破坏。蒸馏时饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸先被蒸出，双键较多的不饱和脂肪酸最后被蒸出。此法操作温度低，有效防止EPA和DHA受热氧化分解，分离效果好，产品品质优。

但此法不能将分子量接近的EPA和DHA分开，需要的高真空设备成本高,耗能也较大。

吸附分离法：

吸附分离法是利用吸附剂选择性吸附分离多不饱和脂肪酸进行分离。部分金属离子能与不饱和脂肪酸的双键形成络合物，将部分金属离子固定在吸附剂上，因脂肪酸饱和度不同其在吸附剂上的分配系数不同而得以分离。不饱和脂肪酸的双键越多，络合作用越强，形成的络合物也越稳定。

此法分离效果好，产品纯度高，但是有时产品易被某些洗脱剂污染，且分离量少，只适合于实验室研究，不适用于工业化量产。

脂肪酶浓缩法：

此法可将含有多种脂肪酸的甘油三酯进行选择性水解,含有EPA和DHA的甘油三酯被脂肪酶水解的速度比不含二者的甘油三酯水解速度慢,由此可富集多价不饱和脂肪酸甘油三酯,但是不能将EPA和DHA分离开来。

采用单一的方法不能将EPA和DHA进行有效分离，需将多种方法结合使用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种从鱼油中纯化EPA的方法。本发明采用高效液相色谱分离法结合膜浓缩，能一步得到纯度96%以上的EPA，收率达90%以上，能够高效、低成本的工业化生产高纯度的EAP/DHA产品。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种从鱼油中纯化EPA的方法，包括如下步骤：

步骤1：取鱼油与洗脱溶剂混合，制得上样溶液；

步骤2：取所述上样溶液于经所述洗脱溶剂平衡后的色谱柱EPA-C18上样；

步骤3：取所述洗脱溶剂洗脱，高效液相色谱检测收集EPA组分，膜浓缩，收集浓缩液，干燥。

在本发明的一些具体实施方案中，所述层析柱EPA-C18的填料为在硅胶基质上键合十八烷基硅烷和聚苯乙烯；其中，十八烷基硅烷和聚苯乙烯的质量比为2:1。

在本发明的一些具体实施方案中，所述填料为EPA-C18，源自苏州赛分科技有限公司，产品编号：101180-2410。

在本发明的一些具体实施方案中，所述鱼油中EPA含量为20%~80%（m/m）。在本发明的另一些具体实施方案中，所述鱼油中EPA含量为70%（m/m）。

在本发明的一些具体实施方案中，所述上样溶液的浓度1%~20%（m/V）

在本发明的一些具体实施方案中，所述洗脱溶剂为甲醇的水溶液，所述甲醇的水溶液浓度为50%~90%（V/V）。在本发明的另一些具体实施方案中，所述洗脱溶剂为甲醇的水溶液，所述甲醇的水溶液浓度为82%（V/V）。

在本发明的一些具体实施方案中，所述上样的流速为10ml/min~400ml/min，所述洗脱的流速为200ml/min。在本发明的另一些具体实施方案中，所述上样的流速为400ml/min，所述洗脱的流速为10ml/min~400ml/min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述膜浓缩采用纳滤膜，所述纳滤膜的截留分子量150~300；所述纳滤膜的膜面积0.1m²~10m²；所述纳滤膜的膜通量0.1~50L/(m²·h)；温控0~50℃。在本发明的另一些具体实施方案中，所述纳滤膜的截留分子量150~300；所述纳滤膜的膜面积2.54m²；所述纳滤膜的膜通量20L/(m²·h)；温控0~50℃。其中，截留分子量通常指的是相对分子质量，单位为1。

在本发明的一些具体实施方案中，所述收集EPA组分为收集保留时间为40~75min的组分。

在本发明的一些具体实施方案中，所述色谱柱EPA-C18的规格为100mm×250mm，所述填料的质量为1.18kg。

在本发明的一些具体实施方案中，所述鱼油的载量占所述填料质量的3.5%。

在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤3之后还包括回收透过液的步骤。回收后的透过液可以作为下一批纯化的洗脱溶剂使用。

在填料层析步骤后会产生大量有机溶剂和水混合物，采用纳滤膜浓缩能快速回收这些试剂并循环作为洗脱溶剂使用。本发明采用膜浓缩技术回收甲醇水，每批次产生的甲醇水溶液可直接通过膜浓缩回收，回收效率不低于层析过程溶剂产生速度，从而保持每批次纯化过程产生的溶剂通过膜浓缩回收后直接作为下一批纯化的洗脱溶剂使用。纳滤膜浓缩过程中的参数为：纳滤膜截留分子量150~300；膜面积2.54m²；膜通量20L/(m²·h)；温控0~50℃；本发明膜浓缩过程，甲醇水回收率高达99%，且膜浓缩过程中目标物EPA损失率＜2%，保证了此浓缩技术的可行性。

本发明提供的方法利用与饱和脂肪酸、低不饱和脂肪酸的极性不同，在两相间逆流分配系数的不同进行分离。使用的层析体具有耐久性，层析柱可反复利用，分离效果好，产品纯度高。结合膜浓缩技术，使得溶剂可以回收重复利用，大大减小了企业的生产成本。该方法原理简单、操作简便，有效成分不易氧化、聚合、异构化等，分离效率高，回收率高。可以满足企业的各种生产需求。

本发明利用大颗粒C18分离深海鱼油EPA，相比于普通的DAC设备，压力更低，纯化工艺要求更简易。使用的纯化填料性能稳定，载量高，回收率超过90%，而且使用寿命长久，容易清洗再生。所用的溶剂为甲醇和水，配合膜浓缩技术，可以循环使用，大大降低企业生产成本。

本发明提供的方法具有高的选择性和分离效率，对于EPA和DHA以及其他杂质有很好的分离作用；对鱼油中不饱和脂肪酸和杂质有一定选择性吸附，而且载样量高；使用有机溶剂或有机溶剂/水体系的流动相，溶剂可以回收重复利用，减少工业化成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明提供的从鱼油中纯化EPA及溶剂回收流程；

图2示鱼油粗品纯化的HPLC谱图；

图3示洗脱过程中HPLC谱图；

图4示鱼油粗品纯化后的HPLC谱图。

具体实施方式

本发明公开了一种从鱼油中纯化EPA的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

1、仪器和材料

纯度70%以上的EPA鱼油粗品

（1）高效液相色谱仪（紫外检测器）

（2）分析色谱柱C18-5um（4.6mm*250mm）一根

（3）分析天平（百分之一）一台

（4）分析天平（万分之一）一台

（5）移液枪1ml和200ul各一把（配枪头）

（6）磁力搅拌器一台

（7）涡旋混合器

（8）量筒（500ml、100ml）各一个

（9）接收样品瓶（桶）2L的15个，25L的两个

（10）一次性滴管和5ml离心管各一包

（11）500ml烧杯两个

（12）保鲜膜

（13）记号笔及标签纸等

2、试剂

（1）甲醇（工业级及以上）25L两桶

（2）纯化水25L一桶

3、实验步骤

（1）样品称取：在分析天平上称取鱼油粗品40g；

（2）溶剂配制：配制82%的甲醇400ml，甲醇量取328ml，纯化水量取72ml，两者混在一起，并搅拌均匀，配制两份,待用；

（3）样品溶解：将上（2）配好的溶剂一份加到（1）40g鱼油粗品中，用保鲜膜封口，加入搅拌子，在磁力搅拌器上保持搅拌状态，使其充分溶解；

（4）色谱柱平衡：在LC6000仪器上，A通道为纯化水，B通道为甲醇，在接通EPA制备柱的条件下，以400ml/min的流速冲洗，以82%B(328ml/min)、18%A（72ml/min）平衡柱子。平衡15min；

（5）样品上样：（4）完成后停止所有泵，将A管道插入配好溶剂（2）的另一份中，以400ml/min的速度冲洗A管道，0.5min后停泵，将A管道换到配好的鱼油粗品中，以400ml/min的速度上样1min后停泵，换到前面（2）剩下的溶剂中以400ml/min冲洗0.5min后停泵；

（6）样品洗脱：在（5）完成后将A泵换到纯化水中，同时开启制备工作站的在线信号记录，在400ml/min的条件下以82%B(328ml/min)冲洗柱子；

（7）样品收集：在见到目标峰出现时开始收集样品，4min/tube，一直接收到目标峰和后面杂质有分离迹象为止。详细见样品制备图；

（8）杂质冲洗：主峰收集完，为了节省时间，后面换成100%甲醇冲洗，直到杂质冲洗完全，停泵；

（9）收集样品分析：收集样品在C18-5um上分析。

术语：

EPA：二十碳五烯酸；

DHA：二十二碳六烯酸，俗称脑黄金；

DAC：动态轴向压缩；

C18：十八烷基键合硅胶填料。

本发明提供的一种从鱼油中纯化EPA的方法中所用原料、辅料及试剂均可由市场购得。

其中，填料来自于苏州赛分科技有限公司自主研发的填料，主要为硅胶基质，通过独特的技术键合了十八烷基硅烷以及聚苯乙烯，二者添加质量比为2:1。

本发明所用鱼油原料采购自舟山海力生集团，具体成分如下：

表1 本发明实施例所用的鱼油原料的主要成分数据

批次	EPA含量（%）	DHA含量（%）
			1	70%	11%
2	20%	9%
			3	80%	5%

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 鱼油粗品纯化前分析

鱼油粗品纯度为 70 %。

色谱柱:Sepax GP-C18 ( 5um, 4.6 x 250 mm )

流动相:

A：水

B：乙腈

流速: 1ml/min 进样量: 5ul柱温: RT

样品:1mg/ml（82%甲醇溶解）压力: 78bar

仪器:Agilent 1260

检测波长: UV @ 214nm

按照如下梯度进行洗脱：

表2

Timemin)	A%	B%
			0	5	95
20	0	100

粗品分析图如图2所示。

实施例2 鱼油粗品纯化

鱼油粗品纯度为 20 %。

色谱柱:EPA-C18 ( 1000 x 250 mm )

流动相:

A：水

B：甲醇

流速: 400ml/min 进样量: 400ml 柱温: RT

样品:100mg/ml压力: 1.2M Pa

仪器:Sepax制备色谱仪

检测波长: UV @ 214nm

梯度：82%B

具体方法如下：

（1）样品称取：在分析天平上称取鱼油粗品40g；

（2）溶剂配制：配制82%的甲醇400ml，甲醇量取328ml，纯化水量取72ml，两者混在一起，并搅拌均匀，配制两份，待用；

（3）样品溶解：将上（2）配好的溶剂一份加到（1）40g鱼油粗品中，用保鲜膜封口，加入搅拌子，在磁力搅拌器上保持搅拌状态，使其充分溶解；

（4）色谱柱平衡：在LC6000仪器上，A通道为纯化水，B通道为甲醇，在接通EPA制备柱的条件下，以400ml/min的流速冲洗，以82%B(328ml/min)、18%A（72ml/min）平衡柱子。平衡15min；

（5）样品上样：（4）完成后停止所有泵，将A管道插入配好溶剂（2）的另一份中，以400ml/min的速度冲洗A管道，0.5min后停泵，将A管道换到配好的鱼油粗品中，以400ml/min的速度上样1min后停泵，换到前面（2）剩下的溶剂中以400ml/min冲洗0.5min后停泵；

（6）样品洗脱：在（5）完成后将A泵换到纯化水中，同时开启制备工作站的在线信号记录，在400ml/min的条件下以82%B(328ml/min)冲洗柱子；

（7）样品收集：在见到目标峰出现时开始收集样品，4min/tube，一直接收到目标峰和后面杂质有分离迹象为止。如图3所示，收集保留时间为40~75min的组分。

（8）杂质冲洗：主峰收集完，为了节省时间，后面换成100%甲醇冲洗，直到杂质冲洗完全，停泵；

（9）收集样品分析：收集样品在C18-5um上分析。结果见图4。

实施例3

取鱼油粗品40g，其中EPA含量70%（m/m），加入82%甲醇（V/V）400ml，搅拌使充分溶解；上经过82%甲醇平衡后的层析柱EPA-C18（100mm×250mm，含填料质量约1.18kg），上样流速200ml/min，上样后用82%甲醇洗脱，洗脱流速400ml/min，共洗脱100min，HPLC检测收集EPA组分溶液，膜浓缩，所用纳滤膜面积2.54m²，截留分子量150~300，膜通量20L/(m²·h)，温控0~50℃，浓缩后的组分溶液经过干燥，即得EPA产品26.2g，HPLC检测纯度为97.3%，回收率91.1%。

实施例4

使用EPA-C18填料，填装一根4.6mm×250mm规格的色谱柱，填料用量约2.4g；样品采用鱼油粗品84mg（载量约3.5%），鱼油粗品纯度为 80 %。用适量82%甲醇溶解配成约100mg/ml的溶液，上样，洗脱，重复试验2500次，每50次用企业标准对该色谱柱进行测试，同时收集EPA组分进行HPLC分析。

寿命试验结果显示，该色谱柱在使用1500次以后，柱效有缓慢下降趋势，这个阶段收集的EPA组分纯度＞96%和收率＞90%，尚可达到标准；但在使用2050次左右，柱效下降明显，且EPA组分纯度不足95%，且收率小于65%，影响下一步结晶效果，故填料使用寿命定为2000次。

对比例1

取鱼油粗品40g，其中EPA含量70%（m/m），加入82%甲醇（V/V）400ml，搅拌使充分溶解；上经过82%甲醇平衡后的层析柱HP-C18（100mm×250mm，含填料质量约1.13kg），上样流速200ml/min，上样后用82%甲醇洗脱，洗脱流速400ml/min，共洗脱100min，HPLC检测收集EPA组分溶液，膜浓缩，所用纳滤膜面积2.54m²，膜通量20L/(m²·h)，温控0~50℃，浓缩后的组分溶液经过干燥，即得EPA产品22.8g，纯度96.8%，回收率仅为78.7%。

对比例2

取鱼油粗品40g，其中EPA含量70%（m/m），加入82%甲醇（V/V）400ml，搅拌使充分溶解；上经过82%甲醇平衡后的层析柱GP-C18（100mm×250mm，含填料质量约1.22kg），上样流速200ml/min，上样后用82%甲醇洗脱，洗脱流速400ml/min，共洗脱100min，HPLC检测收集EPA组分溶液，膜浓缩，所用纳滤膜面积2.54m²，膜通量20L/(m²·h)，温控0~50℃，浓缩后的组分溶液经过干燥，即得EPA产品24.1，纯度97.0%，回收率为83.5%。

对比例3

取鱼油粗品40g，其中EPA含量70%（m/m），加入82%甲醇（V/V）400ml，搅拌使充分溶解；上经过82%甲醇平衡后的层析柱BR-C18（100mm×250mm，含填料质量约1.22kg），上样流速200ml/min，上样后用82%甲醇洗脱，洗脱流速400ml/min，共洗脱100min，HPLC检测收集EPA组分溶液，膜浓缩，所用纳滤膜面积2.54m²，膜通量20L/(m²·h)，温控0~50℃，浓缩后的组分溶液经过干燥，即得EPA产品23.8g，纯度为96.2%，回收率为81.9%。

对比例4

一次纯化

将EPA-EE和DHA-EE总含量为29％的鱼油粗品，配制成180mg/mL的待分离 制备液，使用CXTH-LC6000制备系统和CXTH-DAC100色谱柱进行纯化，柱床高 度300mm，使用C18作为固定相；流动相：甲醇/乙腈/水70:20:10(v/v/v)；进样 500mL制备液；进样流速：300mL/min，运行流速：480mL/min；检测波长：210nm， 并根据紫外检测信号EPA-EE及DHA-EE进行分段收集。

二次纯化

二次纯化的条件为：流动相：甲醇/水90:10(v/v)；进样流速及运行流速同前。

将4批一纯工序中收集到纯度接近的EPA-EE、DHA-EE组分合并，加水稀释， 使其浓度变为2.5mg/L，进入色谱柱，进行二次纯化精制分段收集，得到不同纯度级 别的EPA-EE和DHA-EE。此处不同的纯度级别可以依据产品的目标级别而确定。

浓缩

收集不同级别的二次纯化制得的EPA-EE及DHA-EE，并分别加水进行稀释，水 的加入量为溶液体积的10％，使其浓度为1.5mg/L，后分别使用溶剂50％的乙醇水溶 液和乙醇进行洗脱(后文简称为脱水浓缩)，再将收集液添加茶多酚进行旋蒸浓缩，旋 蒸温度为55℃。

最终得到三种不同级别的EPA-EE和DHA-EE，级别1：98％～99％，级别2： 93％～97％，级别3：86％～90％。其中EPA-EE的回收率为82％，三种级别所占比例 为55％:40％:5％；DHA-EE的回收率为80％，三种级别所占比例为50％:42％:8％。

使用普通C18作为固定相，鱼油粗品经过二次上柱纯化得到EPA产品，大部分纯度93%-99%之间，回收率80%。

该工艺需经两步纯化，耗费时间及试剂，同时纯化得到的EPA组分溶液，采用旋转蒸发仪进行减压浓缩，长时间的减压浓缩很容易导致被氧化，同时减压浓缩在工业上应用有机溶剂损失率较高（达到10%）。

相较之下，本发明采用纳滤膜回收技术，纯化后的EPA组分溶液经过纳滤膜回收，98%以上的甲醇水溶液可被回收并循环作为下一批流动相使用，只有很少的组分溶液需要用到减压回收（有机溶剂损失率不到2%）。此纳滤膜浓缩结合纯化层析技术使用，可大大降低设备成本和溶剂成本，同时可以大幅度降低EPA的受热时间（减压浓缩体积少），保证了EPA在层析过程和纯化过程的稳定性，更加适用于工业化生产。

实施例5

取鱼油粗品40g，其中EPA含量20%（m/m），加入82%甲醇（V/V）400ml，搅拌使充分溶解；上经过82%甲醇平衡后的层析柱EPA-C18（100mm×250mm，含填料质量约1.18kg），上样流速200ml/min，上样后用82%甲醇洗脱，洗脱流速400ml/min，共洗脱100min，HPLC检测收集EPA组分溶液，膜浓缩，所用纳滤膜面积2.54m²，膜通量20L/(m²·h)，温控0~50℃，浓缩后的组分溶液经过干燥，即得EPA产品7.1g，HPLC检测纯度为97.0%，回收率85.8%。

试验结果表明，采用对比例4的鱼油原料作为本发明的纯化原料，所取得的结果好于对比例4。本发明只需一步纯化，并运用了纳滤膜浓缩技术，在节省了时间和试剂成本的同时，也保证了EPA组分溶液在浓缩过程中的稳定性。

使用对比例4的原料，分别采用对比例4和本发明的工艺，进行对比试验，结果如下：

表3对比试验结果

注：^*示与对比例相比具有显著差异（P＜0.05）；^#示与对比例相比具有极显著差异（P＜0.05）。

EPA产品作为药品或保健品原料使用，其纯度要求＞97%，对比例4的产品纯度小于95%，于市场使用价值不大。本发明提供的方法纯度、回收率高于对比例4，浓缩过程溶剂损失量显著（P＜0.05）降低，且浓缩温度为常温，工艺简单且生产成本显著降低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种从鱼油中纯化EPA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：取鱼油与洗脱溶剂混合，制得上样溶液；所述鱼油中EPA含量为20%~80% m/m；

步骤2：取所述上样溶液于经所述洗脱溶剂平衡后的色谱柱EPA-C18上样，所述EPA-C18的填料为在硅胶基质上键合十八烷基硅烷和聚苯乙烯；其中，十八烷基硅烷和聚苯乙烯的质量比为2:1；

步骤3：取所述洗脱溶剂洗脱，高效液相色谱检测收集EPA组分，膜浓缩，收集浓缩液，干燥；所述膜浓缩采用纳滤膜，所述纳滤膜的截留分子量150~300；所述纳滤膜的膜面积0.1m²~10m²；所述纳滤膜的膜通量0.1~50L/(m²·h)；温控0~50℃。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上样溶液的浓度1%~20% m/V。

3.如权利要求1至2任一项所述的方法，其特征在于，所述洗脱溶剂为甲醇的水溶液，所述甲醇的水溶液浓度为50%~90% V/V。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上样的流速为10ml/min~400ml/min，所述洗脱的流速为10ml/min~400ml/min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述收集EPA组分为收集保留时间为40~75min的组分。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3之后还包括回收透过液的步骤。

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