CN109402184A - 一种生物酶法合成d-苹果酸的方法 - Google Patents

一种生物酶法合成d-苹果酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物酶法合成D‑苹果酸的方法，属于有机酸制备领域，具体涉及一种用大肠杆菌工程菌全细胞酶法制备D‑苹果酸的方法。本发明利用基因工程手段在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌中共表达了马来酸水合酶的大小亚基，通过生物发酵获得过表达马来酸水合酶的菌体，全细胞生物酶法转化马来酸合成D‑苹果酸，产量为200.17g/L，转化率高达99.97％。本发明构建基因工程菌培养条件简单，发酵周期短，发酵成本低，易于实现菌体高密度发酵，菌体收率高，底物转化率高，有利于生物酶法合成D‑苹果酸的产业化大规模生产。

Description

一种生物酶法合成D-苹果酸的方法
技术领域
本发明属于有机酸制备领域，具体涉及一种用大肠杆菌工程菌全细胞酶法制备D-苹果酸的方法。
背景技术
D-苹果酸，又称羟基丁二酸或羟基琥珀酸，是自然界中存在稀少的一种有机酸，主要应用于手性药物合成、手型添加剂和手型助剂等领域，例如抗生素、抗病毒药物、抗癌药物、D-或L-肉毒碱和维生素(R)-泛酸等合成中的应用，也可作为配体合成药物拆分剂。
目前合成D-苹果酸的方法主要有化学拆分法、生物酶拆分法和生物酶法。其中，化学拆分法合成D-苹果酸的成本高，不利于工业化生产；生物酶拆分法合成D-苹果酸的生产浓度很低，远远达不到工业化要求；生物酶法转化合成D-苹果酸的研究报道最经济的路线是从马来酸转化合成D-苹果酸，1993年日本研究人员Asano Y.等报道了用Arthrobactersp.MCI2612菌以马来酸为原料进行生物转化合成D-苹果酸，产量为87g/L，摩尔转化率为72％；1993年荷兰研究人员Marieet J.van der Werf等利用Pseudomonaspseudoalcaligenes NCIMB9867催化马来酸钠制备D-苹果酸，产物浓度为107g/L，转化率99.4％。2004年何冰芳等(CN 1325634C)报道了一种简单脂肪杆菌(Pimelobactersimplex)DM18，以马来酸盐为底物生物转化合成D-苹果酸盐，产量高达487g/L，转化率达99％。然而应用这些从自然环境中筛选的微生物进行生物酶法合成D-苹果酸时，菌种发酵生物量非常低，最高OD660有4.5，严重制约着D-苹果酸的工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，解决上述背景技术中提出的现有的生物酶法转化制备D-苹果酸的过程中马来酸水合酶活性低，稳定性差，菌种发酵生物量低以及难以实现工业化生产的问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，包括以下步骤：
A.利用大肠杆菌Rosetta(DE3)作为宿主菌，共表达来源于产碱假单胞菌的马来酸水合酶的大小亚基PaHbzI和PaHbzJ，获得共表达马来酸水合酶大小亚基PaHbzI和PaHbzJ的大肠杆菌工程菌pETDuet-PahbzI-PahbzJ/Rosetta(DE3)，即DHIJ工程菌；
B.通过生物发酵DHIJ工程菌获得大量表达马来酸水合酶大小亚基的湿菌体，再利用湿菌体全细胞转化马来酸合成D-苹果酸。
进一步地，所述DHIJ工程菌的构建包括以下步骤：
(1)根据大肠杆菌密码子偏好性优化所述马来酸水合酶的大小亚基PaHbzI和PaHbzJ的基因序列；
(2)在PahbzI基因序列两端添加NcoI和BamHI，在PahbzJ基因序列两端添加NdeI和XhoI后，利用全基因合成技术合成优化后的马来酸水合酶大小亚基PahbzI和PahzJ，构建克隆载体pUC57-PahbzI和pUC57-PahbzJ；
(3)构建重组表达载体：用NcoI和BamHI分别双酶切pETDuet-1质粒和步骤(2)得到的pUC57-PahbzI质粒，胶回收获得载体骨架pETDuet-1和PahbzI片段，接着用T4DNAligase连接载体骨架pETDuet-1和PahbzI片段，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃恒温倒置过夜培养，筛选获得阳性重组子，抽提质粒获得pETDuet-PahbzI载体；用NdeI和XhoI分别双酶切pETDuet-PahbzI质粒和步骤(2)得到的pUC57-PahbzJ质粒，胶回收获得载体骨架pETDuet-PahbzI和PahbzJ片段，用T4DNAligase连接载体骨架pETDuet-PahbzI和PahbzJ片段，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃恒温倒置过夜培养，筛选获得阳性重组子，抽提质粒获得pETDuet-PahbzI-PahbzJ质粒；
(4)将上述步骤(3)中所得的pETDuet-PahbzI-PahbzJ质粒转化表达所述大肠杆菌Rosetta(DE3)，涂布氨苄抗性平板，37℃恒温倒置过夜培养，筛选获得阳性重组子，即得DHIJ工程菌，保存甘油管。
马来酸水合酶大亚基(PahbzI)基因序列：
SEQ1(1443bp)
ATGCAGGAAAAACAGACCAAACCGCTGACCCTGTTCGACAAACTGTGGCAGCGTCACCTGGTTGACGTTAACGAAGACGGTGAATCTCTGCTGTACATCGACCGTCACCTGGTTTACGAAGTTACCTCTCCGCAGGCTTTCGAAGGTCTGCGTCTGTCTTCTCGTCGTCCGTGGCGTGCTTCTACCGTTCTGGCTACCGTTGACCACAACGTTCCGACCGTTCCGGAACAGCGTATCTCTGTTGACCACATCGCTGACCCGCTGTCTCGTCTGCAGGTTAAACAGCTGGGTATCAACTGCGAAGAATTCGGTATCACCCAGTTCGGTCTGGGTCAGATCCAGCAGGGTATCATCCACGTTATCGGTCCGGAACTGGGTGCTACCCTGCCGGGTATGACCGTTGTTGCTGGTGACTCTCACACCTCTACCCACGGTGCTTTCGGTGCTCTGGCTTTCGGTGTTGGTACCTCTGGTGTTGAACACGTTCTGGCTACCCAGTGCCTGGTTCTGCGTCCGATGAAACGTATGCTGCTGAAAATCGAAGGTGAACTGCGTCCGGGTGTTGGTCCGAAAGACCTGATCCTGCACATCATCGGTCAGATCGGTACCGCTGGTGCTACCGGTTACGCTATCGAATTCTCTGGTGGTACCATCCGTGGTATGTCTATGGAAGGTCGTATGACCGTTTGCAACATGGCTATCGAAGCTGGTGCTCGTGTTGGTCTGGTTGCTGTTGACGAAAAAACCATCGACTACCTGAAAGGTCGTTCTTACGCTCCGCAGGGTTCTCTGTGGGAAGCTGCTGTTGCTGACTGGAAAACCCTGAAATCTGACGAAGGTGCTGTTTTCGACGAAACCCTGTCTATCGACGCTGGTAACATCCGTCCGCTGGTTACCTGGGGTACCTCTCCGGAAATGGTTGTTTCTGTTGAAGGTTGCGTTCCGGACCCGGCTCAGGAAGTTGACGCTGTTAAACGTGCTGGTATGGCTCAGGCTCTGCTGTACATGGGTCTGGAACCGGGTACCCCGATGGGTGCTATCGGTGTTGACAAAGTTTTCATCGGTTCTTGCACCAACGCTCGTATCGAAGACCTGCGTTCTGCTGCTGCTGTTCTGCGTGGTAAACAGGTTTCTCCGCGTATCCGTCAGGCTCTGGTTGTTCCGGGTTCTGGTAAAGTTAAAGAACAGGCTGAAGCTGAAGGTCTGGACCGTATCTTCATCGACGCTGGTTTCGAATGGCGTGCTCCGGGTTGCTCTATGTGCCTGGGTATGAACGACGACCGTCTGGCTCCGGGTGAACGTTGCGCTTCTACCTCTAACCGTAACTTCGAAGGTCGTCAGGGTCCGGGTGGTCGTTCTCACCTGGTTTCTCCGGCTGTTGCTGCTGCTACCGCTATCGCTGGTCACTTCGCTGCTCCGTCTACCGGTGAAGTTCAGCCATGA
马来酸水合酶小亚基(PahbzJ)基因序列：
SEQ2(642bp)
ATGACCCCGTTCACCCGTCTGCACGCTCTGGTTGTTCCGATCGACCGTTCTAACGTTGACACCGACGCTATCATCCCGAAACAGTTCATGAAATCTATCAAACGTACCGGTTTCGGTGACAACCTGTTCGACGAATGGCGTTACCTGGACCGTGGTGAACCGGGTCAGGAAGTTGCTTCTCGTCCGAAAAACCCGGACTTCCCGCTGAACCAGGCTCGTTACGCTGACGCTAAAATCCTGCTGACCCGTGAAAACTTCGGTTGCGGTTCTTCTCGTGAACACGCTCCGTGGGCTCTGCGTGACTACGGTATCCGTGCTCTGATCGCTTCTTCTTTCGCTGACATCTTCTACGGTAACTGCTTCAAAAACGGTATCCTGCCGATCCGTCTGGACGCTGACACCGTTGAACAGCTGTTCCAGCGTCTGTACGACGAATCTGGTTTCTCTCTGGAAATCGACCTGGCTACCCAGCGTATCTCTTCTCCGGGTGGTTTCCACACCGGTTTCGACATCGACCCGGCTCGTAAACACCGTCTGCTGAACGGTCTGGACGACATCGCTCTGACCCTGCAGCAGGCTCGTAAAATCCGTTCTTACGAAGAACGTCACCGTCTGTCTGAACCGTGGCTGTTCTCTCAGTAA
进一步地，所述DHIJ工程菌的生物发酵包括以下步骤：
(1)无菌条件下，用接种环从DHIJ工程菌甘油管中取一环菌移种至一级种子培养基中，
37℃，240rpm培养至OD600至3.0～4.0，得一级种子菌液；
(2)将一级种子菌液按4％～10％接种量转接二级种子培养基中，37℃，240rpm培养3～5h，得二级种子菌液；
(3)按1％～10％的接种量将培养好的二级种子菌液通过火焰接种转接入发酵罐中，初始发酵参数：温度37℃，转速200rpm，pH7.0，通气量50L/h,罐压0.05MPa；随着发酵时间的延长，菌浓度逐渐增加需通过调节转速和通气量将溶氧控制在20％～40％；当溶氧和pH值同时快速升高时，开始流加补料；OD600达到20～25时，先将温度降至30℃，再添加0.2mM诱导剂，继续发酵8h～12h后放罐，通过低温离心收集菌体并冷藏。
进一步地，上述步骤(1)中的一级种子培养基为LB培养基，生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种，使菌种成倍扩增，达到使用要求，其配方为10g胰蛋白胨；5g酵母提取物；10g氯化钠溶解于1L水中，制备简单，能够允许大肠杆菌在摇瓶中正常培养条件下(250rpm)生长到OD6002-3左右。
进一步地，上述步骤(2)中的二级种子培养基为TB培养基，TB培养基是添加了磷酸盐的复合型培养基。跟LB培养基相比，TB培养基中除了多出20％的胰蛋白胨和380％的酵母提取物以外，还多了0.4％的甘油作为额外的碳源。所有这些元素能够支持大肠杆菌在正常的摇瓶培养条件下生长到OD6005-8。TB培养基通常用于实验室规模的蛋白质表达和质粒提取。TB培养基配方如下：2％胰蛋白胨,2.4％酵母提取物,72mM K2HPO4,17mMKH2PO4,0.4％glycerol。
进一步地，上述步骤(3)中发酵培养基的配方：甘油5份，胰蛋白胨6份，酵母膏12份，一水柠檬酸1.5份，硫酸镁1.5份，磷酸氢二钾16.4份，磷酸二氢钾2.3份；补料配方：酵母粉12份，胰蛋白胨8份，甘油450份，硫酸镁5份。
进一步地，上述步骤(3)中的诱导剂为IPTG，即异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性，当pUC系列的载体DNA(或其他带有lacZ基因载体DNA)以lacZ缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X–gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。
进一步地，所述全细胞生物酶法转化马来酸合成D-苹果酸的具体的步骤如下：用4mol/LNaOH溶液将转化体系pH调至7.5，32℃，200rpm转化16h，即可获得D-苹果酸。
进一步地，所述转化体系包括1.5mol/L马来酸，75g/L碳酸钙，3g/L Tris碱，0.25g/L CTAB，4％湿菌体。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.本发明采用工业上常用菌种大肠杆菌Rosetta(DE3)作为宿主菌，共表达来源于产碱假单胞菌的马来酸水合酶(PaHbzIJ)的大小亚基(PaHbzI和PaHbzJ)，所构建工程菌DHIJ稳定性好，易于培养，发酵周期短(18-20小时)，比已知用于酶法合成D-苹果酸的菌种发酵时间短接近10小时；发酵生物量高(120-140g/L，OD600为60-70)，比目前报道的用于酶法合成D-苹果酸的菌种发酵生物量最高OD616为4.5高太多，大大节约了发酵成本。
2.本发明采用“一锅法”进行生物酶法合成D-苹果酸的工艺简单，易于操作，转化周期短(16小时内)，比目前报道的转化时间短10小时，节约大量人力和电力；D-苹果酸产量高(200.17g/L)，转化率高(99.97％)。
附图说明
图1是利用生物酶法合成D-苹果酸的催化反应示意图；
图2是pETDuet-PahbzI-PahbzJ载体图谱；
图3是重组蛋白PaHbzIJ的SDS-PAGE检测图；
其中：M为蛋白分子标量；
泳道1为DHIJ工程菌未诱导上清样品；
泳道2为DHIJ工程菌未诱导沉淀样品；
泳道3、5和7为DHIJ工程菌诱导后上清样品；
泳道4、6和8为DHIJ工程菌诱导后沉淀样品。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图1～图3，对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中所涉及的基因(PaHbzIJ)、马来酸、D-苹果酸、氨苄青霉素钠、Tris碱、CTAB：购自上海生工；限制性内切酶、T4DNA连接酶：购自宝生物(Takara)；pETDuet-1载体：购自优宝生物；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒：购自OMEGA；克隆感受态细胞DH5α、表达感受态细胞Rosetta(DE3)：购自全式金。
实施例1
DHIJ工程菌的构建：
(1)根据大肠杆菌密码子偏好性优化所述马来酸水合酶的大小亚基PaHbzI和PaHbzJ的基因序列；
(2)在PahbzI基因序列两端添加NcoI和BamHI，在PahbzJ基因序列两端添加NdeI和
XhoI后，利用全基因合成技术合成优化后的马来酸水合酶大小亚基PahbzI和PahzJ，构建克隆载体pUC57-PahbzI和pUC57-PahbzJ；
(3)构建重组表达载体：用NcoI和BamHI分别双酶切pETDuet-1质粒和步骤(2)得到的pUC57-PahbzI质粒，胶回收获得载体骨架pETDuet-1和PahbzI片段，接着用T4DNAligase连接载体骨架pETDuet-1和PahbzI片段，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃恒温倒置过夜培养，筛选获得阳性重组子，抽提质粒获得pETDuet-PahbzI质粒；用NdeI和XhoI分别双酶切pETDuet-PahbzI质粒和步骤(2)得到的pUC57-PahbzJ质粒，胶回收获得载体骨架pETDuet-PahbzI和PahbzJ片段，用T4DNAligase连接载体骨架pETDuet-PahbzI和PahbzJ片段，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃恒温倒置过夜培养，筛选获得阳性重组子，抽提质粒获得pETDuet-PahbzI-PahbzJ质粒；
(4)将上述步骤(3)中所得的pETDuet-PahbzI-PahbzJ质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，涂布氨苄抗性平板，37℃恒温倒置过夜培养，筛选获得阳性重组子，即得DHIJ工程菌，保存甘油管。
实施例2
DHIJ工程菌的发酵：
本实施例在实施例1的基础上，进一步地，进行以下步骤：
(1)无菌条件下，用接种环从DHIJ工程菌甘油管中取一环菌移种至一级种子培养基中，37℃，240rpm培养至OD600至3.0～4.0，得一级种子菌液；
(2)将一级种子菌液按4％～10％接种量转接二级种子培养基中，37℃，240rpm培养3～5h，得二级种子菌液；
(3)按1％～10％的接种量将培养好的二级种子菌液通过火焰接种转接入发酵罐中，初始发酵参数：温度37℃，转速200rpm，pH7.0，通气量50L/h,罐压0.05MPa；随着发酵时间的延长，菌浓度逐渐增加需通过调节转速和通气量将溶氧控制在20％～40％；当溶氧和pH值同时快速升高时，开始流加补料；OD600达到20～25时，先将温度降至30℃，再添加0.2mM诱导剂，继续发酵8h～12h后放罐，通过低温离心收集菌体并冷藏。
实施例3
本实施例在实施例2的基础上，进一步地，对发酵工程菌DHIJ获得湿菌体进行生物酶法转化合成D-苹果酸，转化体系含有0.5mol/L马来酸(58g/L)，25g/L碳酸钙，3g/L Tris碱，0.25g/L CTAB，4％湿菌体，用4mol/L NaOH溶液调节pH为7.5。32℃，200rpm转化2.5小时，获得67g/L D-苹果酸，底物转化率达99.93％(以转化体系中存在的底物含量计)。
实施例4
本实施例在实施例2的基础上，进一步地，对发酵工程菌DHIJ获得湿菌体进行生物酶法转化合成D-苹果酸，转化体系含有1mol/L马来酸(116g/L)，50g/L碳酸钙，3g/L Tris碱，0.25g/L CTAB，4％湿菌体，用4mol/L NaOH溶液调节pH为7.5。32℃，200rpm转化6小时，获得133.96g/L D-苹果酸，底物转化率达99.9％(以转化体系中存在的底物含量计)，转化结束时转化体系中析出部分D-苹果酸钙盐，取样检测A240确定底物残留量为上清样品和沉淀样品(加入等体积1mol/L HCl溶解后离心除去菌体)的和。
实施例5
本实施例在实施例1的基础上，进一步地，对发酵工程菌DHIJ获得湿菌体进行生物酶法转化合成D-苹果酸，转化体系含有1.5mol/L马来酸(174.1g/L)，75g/L碳酸钙，3g/LTris碱，0.25g/L CTAB，4％湿菌体，用4mol/L NaOH溶液调节pH为7.5，温度为32℃，200rpm转化16小时，获得200.17g/L D-苹果酸，底物转化率达99.97％(以转化体系中存在的底物含量计)，转化结束时转化体系中析出部分D-苹果酸钙盐，取样检测A240确定底物残留量为上清样品和沉淀样品(加入等体积1mol/L HCl溶解后离心除去菌体)的和。
马来酸含量测定方法：配制马来酸标准品0，0.05，0.1，0.5，1，2.5，5，7.5，10，15，20g/L梯度浓度，稀释400倍，测定A240值分别为0，0.005，0.007，0.016，0.034，0.092，0.180，0.266，0.354，0.519，0.680；以A240值为橫坐标，浓度为纵坐标绘制曲线，标曲y＝29.204x-0.1114(R2＝0.9995)；取样测定A240时，稀释倍数同为400倍。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.利用大肠杆菌Rosetta(DE3)作为宿主菌，共表达来源于产碱假单胞菌的马来酸水合酶的大小亚基PaHbzI和PaHbzJ，获得共表达马来酸水合酶大小亚基PaHbzI和PaHbzJ的大肠杆菌工程菌pETDuet-PahbzI-PahbzJ/Rosetta(DE3)，即DHIJ工程菌；
B.通过生物发酵DHIJ工程菌获得大量表达马来酸水合酶大小亚基的湿菌体，再利用湿菌体全细胞转化马来酸合成D-苹果酸。
2.根据权利要求1所述的一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，其特征在于，步骤A中所述DHIJ工程菌的构建包括以下步骤：
(1)根据大肠杆菌密码子偏好性优化所述马来酸水合酶的大小亚基PaHbzI和PaHbzJ的基因序列；
(2)在PahbzI基因序列两端添加NcoI和BamHI，在PahbzJ基因序列两端添加NdeI和XhoI后，利用全基因合成技术合成优化后的马来酸水合酶大小亚基PahbzI和PahzJ，构建克隆载体pUC57-PahbzI和pUC57-PahbzJ；
(3)构建重组表达载体：用NcoI和BamHI分别双酶切pETDuet-1质粒和步骤(2)得到的pUC57-PahbzI质粒，胶回收获得载体骨架pETDuet-1和PahbzI片段，接着用T4 DNA ligase连接载体骨架pETDuet-1和PahbzI片段，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃恒温倒置过夜培养，筛选获得阳性重组子，抽提质粒获得pETDuet-PahbzI质粒；用NdeI和XhoI分别双酶切pETDuet-PahbzI质粒和步骤(2)得到的pUC57-PahbzJ质粒，胶回收获得载体骨架pETDuet-PahbzI和PahbzJ片段，用T4 DNA ligase连接载体骨架pETDuet-PahbzI和PahbzJ片段，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃恒温倒置过夜培养，筛选获得阳性重组子，抽提质粒获得pETDuet-PahbzI-PahbzJ质粒；
(4)将上述步骤(3)中所得的pETDuet-PahbzI-PahbzJ质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，涂布氨苄抗性平板，37℃恒温倒置过夜培养，筛选获得阳性重组子，即得DHIJ工程菌，保存甘油管。
3.根据权利要求1所述的一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，其特征在于，所述DHIJ工程菌的生物发酵包括以下步骤：
(1)无菌条件下，用接种环从DHIJ工程菌甘油管中取一环菌移种至一级种子培养基中，37℃，240rpm培养至OD600至3.0～4.0，得一级种子菌液；
(2)将一级种子菌液按4％～10％接种量转接二级种子培养基中，37℃，240rpm培养3～5h，得二级种子菌液；
(3)按1％～10％的接种量将培养好的二级种子菌液通过火焰接种转接入发酵罐中，初始发酵参数：温度37℃，转速200rpm，pH7.0，通气量50L/h,罐压0.05MPa；随着发酵时间的延长，菌浓度逐渐增加需通过调节转速和通气量将溶氧控制在20％～40％；当溶氧和pH值同时快速升高时，开始流加补料；OD600达到20～25时，先将温度降至30℃，再添加0.2mM诱导剂，继续发酵8h～12h后放罐，通过低温离心收集菌体并冷藏。
4.根据权利要求3所述的一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的一级种子培养基为LB培养基。
5.根据权利要求3所述的一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的二级种子培养基为TB培养基。
6.根据权利要求3所述的一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，其特征在于，所述步骤(3)中发酵培养基的配方：甘油5份，胰蛋白胨6份，酵母膏12份，一水柠檬酸1.5份，硫酸镁1.5份，磷酸氢二钾16.4份，磷酸二氢钾2.3份；补料配方：酵母粉12份，胰蛋白胨8份，甘油450份，硫酸镁5份。
7.根据权利要求3所述的一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的诱导剂为IPTG。
8.根据权利要求1所述的一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，其特征在于，所述全细胞生物酶法转化马来酸合成D-苹果酸的具体的步骤如下：用4mol/L NaOH溶液将转化体系pH调至7.5，32℃，200rpm转化16h，即可获得D-苹果酸。
9.根据权利要求8所述的一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，其特征在于，所述转化体系包括1.5mol/L马来酸，75g/L碳酸钙，3g/L Tris碱，0.25g/L CTAB，4％湿菌体。
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