CN109401984B - 一株PHBd-1菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株PHBd‑1菌株，涉及环境污染物微生物处理技术领域，所述PHBd‑1菌株的拉丁文名称为Penicillium oxalicum，保藏编号为CGMCC No.13570。本发明提供的PHBd‑1菌株对PHB的降解率达到90％以上，而且PHBd‑1菌株为广盐性，菌株在盐度1％、3％和5％，以PHB薄膜为唯一碳源的培养基中，日均PHB降解率最依次为15.33％，5.26％和2.94％。

Description

一株PHBd-1菌株及其应用
技术领域
本发明涉及环境污染物微生物处理技术领域，具体涉及一株PHBd-1菌株及其应用。
背景技术
聚3-羟基丁酸酯(poly-3-hydroxyobutyrate,PHB)是细菌在营养限制条件下积累的胞内产物，以颗粒状态存在于细胞中，具有贮藏能量和降低细胞内渗透压等作用(Quillaguamán et al.,2010)。PHB除了具有热塑性、生物相容性、光学活性和压电性外(Urtley,1987)，还具有生物可降解性，是可替代石化合成塑料的原料物质(Yutaka etal.,2009)。作为PHB单体的3-羟基丁酸，是抗生素、维生素、芳香素和信息素等化学合成必不可少的手性单体(Sudesh et al.,2000)。3-羟基丁酸也是生物体内一种常见的物质，在动物的新陈代谢中起重要作用(Lee,1996)。
PHB分子量一般为3-80×104KDa，微生物在碳源限制条件下，利用胞外降解酶将聚合物降解为3-羟基丁酸单体，该水溶性有机酸可渗透进入细胞膜，在胞内进一步通过三羧酸循环(TCA)，在有氧条件下产生CO2和水，在厌氧条件下还可产生甲烷(Amaer et al.,2008)。从环境中分离得到的PHB降解菌大多为细菌和真菌。细菌主要有产碱菌Alcaligenes，丛毛单胞菌Comamonas，假单胞菌和土壤杆菌Agrobacterium等。真菌包括曲霉Aspergillus，拟青霉菌Paecilomyces和青霉Penicillium等(Lee,1996；Lee et al.,2005)。
草酸青霉广泛存在土壤和活性淤泥等环境中，草酸青霉细胞分泌多种酶类，可用于生物降解石油烃(Opasols andAdewoye,2010)，果胶(蓝丽精等,2011)、木质纤维素(耿丽平等,2014)和含磷农药(赵仁邦等,2012)等，但是现有技术中并未记载草酸青霉还具有何种作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一株PHBd-1菌株，拉丁文名称为Penicillium oxalicum，本发明提供的菌株能够降解聚3-羟基丁酸酯。
本发明提供了一株PHBd-1菌株，拉丁文名称为Penicillium oxalicum，保藏编号为CGMCC No.13570。
本发明还提供了上述技术方案所述的PHBd-1菌株在降解聚3-羟基丁酸酯中的应用。
优选的，所述PHBd-1菌株降解聚3-羟基丁酸酯所需的碳源包括聚3-羟基丁酸酯。
本发明还提供了上述技术方案所述的PHBd-1菌株在生产3-羟基丁酸中的应用。
本发明提供了一株PHBd-1菌株，拉丁文名称为Penicillium oxalicum，保藏编号为CGMCC No.13570，本发明提供的菌株产生解聚酶，进而能够降解聚3-羟基丁酸酯。
本发明实施例的结果显示：PHBd-1菌株对PHB的降解率达到90％以上，而且PHBd-1菌株为广盐性，菌株在盐度1％、3％和5％，以PHB薄膜为唯一碳源的培养基中，日均PHB降解率最依次为15.33％，5.26％和2.94％。
附图说明
图1为本发明PHBd-1菌株形态，其中左图为培养6天的形态，右图为培养9天的形态；
图2为本发明PHBd-1菌株的孢子和菌丝形态，其中左图为孢子形态，右图为菌丝形态；
图3为PHBd-1菌株在PHB琼脂上产生的透明圈；
图4为PHBd-1菌株的ITS序列构建的系统发育树；
图5为PHB降解率和培养液pH变化；
图6为培养液中PHB单体含量；
图7为PHB薄膜降解情况；
图8为PHB薄膜降解情况；
图9为不同盐度下菌株降解PHB薄膜率。
保藏说明
PHBd-1，拉丁文名称为Penicillium oxalicum，于2017年03月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.13570。
具体实施方式
本发明提供了一株PHBd-1菌株，拉丁文名称为Penicillium oxalicum，保藏编号为CGMCC No.13570。
本发明将所述PHBd-1菌株在普通察氏培养基上培养到第6天，菌落直径为50～60mm，初期为淡粉色，成熟后菌落中心为深绿色(见图1)。在盐度3％的察氏培养基上菌落生长相对较慢，为深棕色，培养第9天菌落直径为70～75mm。分生孢子梗发生于基质菌丝，孢梗茎帚状枝双轮生，偶尔三轮生或单轮生，较紧密，分生孢子椭圆形(见图2)。采用点植法在PHB琼脂板上培养PHBd-1单菌落，培养4天，菌落中心浅绿色，边缘微粉色，菌落周围出现明显透明圈(见图3)。由于菌落的生长，只在边缘才能显示出清晰的透明圈。
本发明对所述PHBd-1菌株用真菌通用引物ITS1/ITS4对PHBd-1菌株进行PCR扩增，获得目的片段长度为600～800bp。经与NCBI数据进行BLAST比对和同源性分析，所述PHBd-1菌株与草酸青霉菌Penicillium oxalicum相似度接近100％(见图4)。结合形态特征鉴定，将所述PHBd-1菌株确定为草酸青霉菌。
本发明还提供了上述技术方案所述的PHBd-1菌株在降解聚3-羟基丁酸酯中的应用。
在本发明中，所述PHBd-1菌株降解聚3-羟基丁酸酯所需的碳源优选包括聚3-羟基丁酸酯。
本发明还提供了上述技术方案所述的PHBd-1菌株在生产3-羟基丁酸中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的一株PHBd-1菌株及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
PHBd-1菌株降解PHB特性分析：
1)孢子悬浮液制备
PHBd-1菌株于察氏培养基(斜面)28℃下培养72h。向培养基斜面加入无菌生理盐水，震荡将孢子洗下，转移至50mL离心管中，重复2～3次。在离心管中加入小玻璃球，充分震荡，用灭菌脱脂棉过滤掉菌丝，并用无菌生理盐水冲洗滤渣2～3次，定容滤液到500mL，得孢子悬浮液。用血球计数板在显微镜下测定孢子数目，测得孢子数为2.0×104CFU/mL。
2)菌株培养
孢子悬浮液以5％比例分别接种到若干个PHB-broth 100mL(250mL三角瓶)中培养(28℃，150rpm和pH 7.2)。分别在第12h、24h、36h、48h、96h、144h、192h和240h各取出3个三角瓶，于4℃、12000×g离心50min，除去菌丝。上清用15μm定性滤纸抽滤，进一步除去菌丝后，置于4℃冰箱保存。
3)PHB降解的测定
PHB降解率采用差减法测定。根据菌丝生长情况，对培养液做不同处理。几乎不存在菌丝：用定性滤纸过滤沉淀，蒸馏水洗涤3次，烘干称重。存在少量菌丝：离心后，将沉淀置于80％丙酮水溶液中浸泡2h后，于-20℃冷冻。解冻后去除浮在培养液表面的菌丝，重复3次。用定性滤纸过滤剩余PHB，蒸馏水洗涤3次，烘干称重。PHB几乎全部被降解：用定性滤纸过滤沉淀，蒸馏水洗涤3次，烘干称重。
4)3-羟基丁酸含量测定
3-羟基丁酸标准品(百灵威科技有限公司，纯度95％)用5mmol/L稀硫酸制作标准曲线，3-羟基丁酸含量分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL。滤液用2N H2SO4调到pH值为2。色谱条件参考乳酸的检测方法：Welch Xtimate Sugar-H色谱柱，以5mmol/L稀硫酸为流动相，柱温40℃，流速0.6mL/min，采用示差折光检测器进行检测(马瑞等，2012)。
1～5％盐度PHB薄膜降解情况：
(1)将浓度为104CFU/mL孢子悬浮液接种1mL到放置3片PHB薄膜(直径1cm，厚度约1mm)的PHB培养基中(pH 7.2、28℃和150rpm)，实验组盐度分别是1％和3％各10瓶，每天从各实验组中取出2瓶中PHB薄膜，洗涤，干燥，测PHB降解率并测培养基的pH。
(2)降解速率补充实验：将浓度为106CFU/mL孢子悬浮液接种1mL到放置3片PHB薄膜(直径1cm，厚度约1mm)的PHB培养基中(pH 7.2、28℃和150rpm)，实验组盐度分别是1％、3％和5％各六瓶，每天从各实验组中取出2瓶中PHB薄膜，洗涤，干燥，测PHB降解率。
结果：
1)PHB降解率和单体产率
将孢子悬浮液以5％比例分别接种到若干个PHB-broth 100mL(250mL三角瓶)中培养(28℃，150rpm)。培养过程中PHB降解率迅速增加，4天后接近100％(见图5)。培养前2天PHB单体含量较低，但此时PHB降解较快(图6)，推测此时菌株大量利用PHB单体进行生长繁殖。培养2天后，菌株开始大量合成与积累PHB解聚酶，单体降解速率加快，含量升高。
2)PHB薄膜实验
由图7看出，PHBd-1能在海水中降解PHB，但相比盐度10％的解聚率较低，可能与高盐度抑制细胞生长有关。由图8分析得到，菌株降解PHB薄膜会使培养变酸。然而在海水中pH变化不明显，是因为海水有一定缓冲能力。
由图9补充实验看出菌株接种量106细胞数在盐度1％、3％和5％，以PHB薄膜为唯一碳源的培养基中，日均PHB降解率最依次为15.33％，5.26％和2.94％。PHB薄膜更符合现实现降解的情况。
由以上实施例可以得出，PHBd-1菌株在4天后对PHB的降解率达到90％以上。而且PHBd-1菌株为广盐性，菌株在盐度1％、3％和5％，以PHB薄膜为唯一碳源的培养基中，日均PHB降解率最依次为15.33％，5.26％和2.94％，在高盐条件下降解效率有所降低。推测该酶的合成类型为滞后合成型，待菌株利用部分降解产物生长后再大量分解PHB胞外解聚酶。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）PHBd-1菌株，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.13570。
2.权利要求1所述的PHBd-1菌株在降解聚3-羟基丁酸酯中的应用。
3.权利要求1所述的PHBd-1菌株在生产3-羟基丁酸中的应用。
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