CN102132772A - 聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法，其特征在于：聚β-羟基丁酸酯强化卤虫幼体时，聚β-羟基丁酸酯浓度为100mg/L，强化时间为24h，聚β-羟基丁酸酯的颗粒大小为10～50μm。本发明使用的β-羟基丁酸酯(PHB)是具有广泛应用前景的可替代抗生素的生物控制剂，目前针对其在水产养殖中应用的研究在国内尚处于起步阶段，国内尚属首次。本发明给出了不同浓度PHB和不同强化培养时间对卤虫成活率和生长的影响，得出以100mg/L PHB浓度强化卤虫幼体24h效果最佳，本发明对PHB在水产育苗中的应用研究具有很好的指导意义。

Description

聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法

技术领域

本发明属于水产养殖领域，尤其是一种聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法。

背景技术

抗生素在一定程度上可以预防和控制水产动物细菌病的流行，但不加选择地滥用抗生素不仅可使细菌产生多重抗药性，而且还会造成水产动物免疫机能下降、体内微生物菌群失调和药物残留等问题。短链脂肪酸具有抑菌、降低动物肠道pH和促进营养物质吸收利用等广泛的生理功能，是一种具有应用前景的生物活性物质和饲料添加剂。聚β-羟基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate，PHB)是短链脂肪酸β-羟基丁酸的聚合体，为一定粒度的脂溶性颗粒(直径0.2～0.5μm)。一些细菌在碳过量和氮缺乏等营养胁迫时，可大量积累PHB作为碳源和能量储备。PHB在动物肠道内可通过酶解和化学水解的方式，降解为β-羟基丁酸单体。PHB的疏水特性可减少挥发性SCFA对水质的破坏作用，适于在水产育苗和养殖中的应用。研究表明，在养殖水体中加入PHB颗粒或者积累PHB的细菌，可完全保护感染发光弧菌(Vibrio campbellii)的卤虫。最近发现饲料中添加PHB具有促进欧洲鲈鱼(Dicentrarchus labrax)生长的作用。目前还没有将PHB应用于水产经济动物育苗的报道。

发明内容

本发明提供了一种聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法，发现以100mg/L PHB浓度强化卤虫幼体24h效果最佳，本发明对PHB在水产育苗中的应用研究具有很好的指导意义。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法，其特征在于：聚β-羟基丁酸酯强化卤虫幼体时，聚β-羟基丁酸酯浓度为100mg/L，强化时间为24h，聚β-羟基丁酸酯的颗粒大小为10～50μm。

而且，所述聚β-羟基丁酸酯采用超声波处理法将PHB颗粒分散成均匀，粒度为10～50μm的悬浮液。

本发明具有如下优点和积极效果是：

1、本发明使用的β-羟基丁酸酯(PHB)具有广泛应用前景的可替代抗生素的生物控制剂，目前针对其在水产养殖中应用的研究在国内尚处于起步阶段，国内尚属首次。本发明给出了不同浓度PHB和不同强化培养时间对卤虫成活率和生长的影响，得出以100mg/L PHB浓度强化卤虫幼体24h效果最佳，本发明对PHB在水产育苗中的应用研究具有很好的指导意义。

2、本发明的方法中采用超声波处理法将PHB颗粒分散成均匀的、平均粒度30μm(10～50μm)的悬浮液，PHB可以被有效包裹于卤虫消化道，较小的颗粒更有利于卤虫摄食，且更容易降解为水溶性β-羟基丁酸单体，从而被卤虫所利用。

附图说明：

图1为本发明PHB浓度标准曲线

图2-1-4为本发明PHB强化48h卤虫和饥饿48h卤虫的相差显微照片(图2-1和图2-2)和经过尼罗蓝A染色后的荧光显微照片(图2-3和图2-4)；

图3为本发明试验1中不同浓度PHB强化培养卤虫的成活率；

图4为本发明试验1中不同浓度PHB强化培养72h的卤虫体长；

图5为本发明试验2中不同浓度PHB强化培养卤虫的成活率；

图6为本发明试验2中不同浓度PHB强化培养72h的卤虫体长；

图7为本发明经过不同时间强化培养的卤虫体内PHB含量(占卤虫干重)。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

卤虫强化是利用其非选择性滤食的特点，将一定大小的颗粒状物质包裹于卤虫消化道内，水产幼苗通过捕食卤虫而间接地将被包裹物摄入体内，既达到输送营养物质的目的，又可避免这些物质直接加入水中所造成的浪费和水质污染。

一种聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法，通过以下实验证明得到卤虫强化的最佳方法。

实验1中PHB浓度分别设定为0，50，100，200，400和800mg/L，探索PHB强化卤虫的最佳浓度范围；在此基础上，实验2中PHB浓度分别设定为50，100，150和200mg/L，试验PHB强化卤虫的最佳浓度。小球藻(5×10⁶cell/mL)投喂作为对照组。每组设置3个平行样。

PHB悬浮母液的配制

称取一定量的PHB粉末于50mL塑料离心管中，加入45mL海水(盐度为30)。将离心管置于超声波处理器中处理5min，使其中的PHB分散均匀，颗粒直径为10～50μm。

卤虫幼体的孵化和PHB强化

试验用卤虫卵来源于我国新疆艾比湖。卤虫卵的孵化条件如下：海水(盐度为30)，pH范围8～9，温度28℃，水表面光强为2000lux，连续充气。孵化24h后，分离并收集无节幼体。将100个初孵卤虫无节幼体转入装有200mL海水的锥形玻璃管中，向其中加入不同剂量PHB悬浮母液，使锥形管中PHB达到试验设计浓度，连续培养72h。强化培养条件同卤虫卵孵化条件。试验期间每天换水100％，pH维持在8.30～8.45，溶解氧DO＞6mg/L。

卤虫成活率和体长的测定

每天换水的同时，分别记录24h，48h和72h各组卤虫的成活率。试验结束时(72h)，每组取10～20只卤虫，在立体解剖镜(Nikon SMZ645)下测定卤虫体长，并计算平均值。数据处理采用CCD图像采集系统和Imganaly计算机图像处理软件(济南维纳仪器有限公司提供)。

强化卤虫体内PHB积累的荧光显微观察

尼罗蓝A是一种碱性嗪类颜料，溶于水和乙醇。经过尼罗蓝A染色的PHB颗粒在荧光显微镜下呈现亮橘黄色光斑，而细胞膜和其它脂类物质由于不能与染料有效结合，仅呈现较暗的红色。本实验参照细菌中PHB颗粒的荧光染色法，经PHB强化培养48h的卤虫经过1％尼罗蓝A染色1h，将卤虫取出固定，在543nm波长的荧光激发下，在显微镜下(Nikon Eclipse Ti)观察强化卤虫体内的PHB积累情况。

强化卤虫体内PHB含量的测定

卤虫体内PHB含量参照细菌中PHB的紫外光谱测定，方法参考陈玲，李礼尧，王武.聚β-羟丁酸酯紫外检测方法的改进[J].无锡轻工大学学报，1997，16(2)：27-31，或KAYNAR P，BEYATLI Y.Determination of poly-β-hydroxybutyrate production by Bacillus spp.isolated from the intestines of various fishes[J].Fish Sci，2009，75(2)：439-443。PHB在浓硫酸溶液中加热可以定量转化为巴豆酸，后者在235nm处有一吸收峰值。该测定方法排除了其它脂类的干扰，与细胞内的总脂含量无关。

绘制PHB标准曲线：精确称取0.0100g PHB溶于适量的氯仿中(Mettler，AL204)，60℃水浴1h后，100℃蒸去氯仿，加入10mL浓硫酸配成PHB母液。分别精确移取10，20，30，40和50μL PHB母液于比色管中，加入10mL浓硫酸，使浓硫酸溶液中PHB含量分别为1，2，3，4和5μg/mL。将比色管置于100℃水浴10min，冷却后，用紫外分光光度计(Pgeneral T6)于235nm下测定吸光值，浓硫酸为空白对照。所得标准曲线如图1所示，回归方程为y＝0.128x+0.019(R²＝0.984)。

卤虫卵孵化24h后，收集卤虫无节幼体。将一定量的卤虫无节幼体迅速转入装有1000mL海水的锥形玻璃管中。卤虫无节幼体密度为300个/mL，以100mg/L PHB浓度进行强化，强化条件同前。分别于6h，12h，21h和24h时取出200mL强化培养液，终止强化。用100目筛绢收集卤虫，并用自来水反复冲洗，以去除卤虫体外附着的PHB颗粒，于-18℃冰箱中冷冻保存。未经PHB强化的卤虫(0h)作为对照。待全部样品收集完成后，将样品于60℃烘箱中干燥3h，得到卤虫干品。

精确称取0.0100g卤虫干品于比色管中，向比色管中加入5mL氯仿，60℃下水浴抽提1h，在100℃下蒸去氯仿。再向比色管中加入5mL氯仿，取30μL PHB氯仿溶液于干净比色管中，蒸干氯仿后，加入5mL浓硫酸，100℃水浴10min，冷却，于235nm下测定吸光值，浓硫酸为空白对照。根据标准曲线，计算出卤虫中PHB的含量：

$\mathrm{PHB}=\frac{5\×b\×5\×{10}^3\×{10}^{-6}}{30\×0.0100g}\×100\%---\left(1\right)$

式中：a为标准曲线中查到的PHB浓度(μg/mL)

数据统计分析

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。所有数据在进行显著性差异检验之前，用Levene’s法检验均匀性，如果均匀性不好，则将数据转化成对数或平方根后再进行分析。Tukey’s multiple range test用来检验显著性差异(P＜0.05)。

结果

图2-1和图2-2表示，在可见光下，未经尼罗蓝A染色，饥饿48h的卤虫幼体肠道透明，而PHB强化48h的卤虫肠道饱满。由图2-3和2-4可以看出，543nm波长绿色荧光激发下，经尼罗蓝A染色，48h饥饿卤虫的肠道呈暗黑色，而PHB强化48h的卤虫肠道显示出亮橘黄色条带，说明卤虫能够对PHB进行有效的生物包裹。

本发明得出强化卤虫的最适PHB浓度和时间分别为100mg/L和24h，10～50μm颗粒的更有利于卤虫摄食，且更容易降解为水溶性β-羟基丁酸单体，从而被卤虫所利用。使其中的PHB分散均匀，颗粒直径为10～50μm。

Claims (2)

1.一种聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法，其特征在于：聚β-羟基丁酸酯强化卤虫幼体时，聚β-羟基丁酸酯浓度为100mg/L，强化时间为24h，聚β-羟基丁酸酯的颗粒大小为10～50μm。

2.根据权利要求1所述的聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法，其特征在于：所述聚β-羟基丁酸酯采用超声波处理法将PHB颗粒分散成均匀，粒度为10～50μm的悬浮液。

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