CN109401856A - 一种用于核酸测序仪清洗的试剂和方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于核酸测序仪清洗的试剂和方法。本申请用于核酸测序仪清洗的试剂由强碱、蒸馏水、非极性溶剂和吐温组成，强碱为氢氧化钠或氢氧化钾，非极性溶剂为乙醇、甲醇或乙醚，吐温为吐温20或吐温21。本申请的试剂，特别针对核酸测序仪中存在的污染源设计其组分，结合本申请的清洗方法，能够有效的对核酸测序仪进行清洗，提高了清洗效率和质量，解决了核酸测序仪长周期使用过程中的液路系统污染无法通过现有清洗手段解决或清洗不到位等问题；为延长核酸测序仪使用寿命，保障测序质量奠定了基础。
Description
技术领域
本申请涉及核酸测序仪养护领域，特别是涉及一种用于核酸测序仪清洗的 试剂和方法。
背景技术
核酸测序仪在使用过程中经常需要对其各管路进行清洗，以保障测序仪能 够正常运行或保障测序质量。目前，根据测序仪厂商的建议，通常都是采用蒸 馏水或添加少量防腐剂的蒸馏水进行清洗。这种清洗方法对于新购买的测序仪 而言，具有较好的清洗效果。但是，对于使用周期长的旧的测序仪来说，蒸馏 水或添加少量防腐剂的蒸馏水，由于对测序仪所使用的试剂没有针对性，因此， 清洗效果不好，对测序仪使用、测序质量造成影响。
因此，有必要研发一种新的专用于核酸测序仪的清洗试剂，以保障清洗效 果和测序质量。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的用于核酸测序仪清洗的试剂，以及基于该试 剂的清洗方法。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请一方面公开了一种用于核酸测序仪清洗的试剂，由强碱、蒸馏水、 非极性溶剂和吐温组成，其中，强碱为氢氧化钠或氢氧化钾，非极性溶剂为乙 醇、甲醇或乙醚，吐温为吐温20或吐温21。
需要说明的是，本申请的试剂特别针对核酸测序仪长期使用的污染残留而 设计，能够针对性的对dNTPs、SBS polymerase、Tris、NaCl、EDTA、Tween 20、 sodium acsorbate、5×SSC等试剂残留进行清洗，提高洗涤效率和质量，为测序 仪的高品质测序提供了保障。其中，各组分的具体用量可以根据不同的核酸测 序仪或测序平台的具体污染类型进行适当调整，在此不做具体限定。
还需要说明的是，本申请的试剂中，吐温20为司盘和环氧乙烷的缩合物， 由于其分子中有较多的亲水性基团一聚氧乙烯基，故亲水性强，为一种非离子 型去污剂；本申请中，吐温20和吐温21可以替换使用，本申请的一种优选方 案中采用吐温20。本申请的试剂中，强碱能有效去除蛋白和核酸；同时，还能 灭活大多数的病毒、细菌、酵母、真菌以及内毒素；作为清洗试剂，强碱能皂 化脂肪并且溶解沉淀的蛋白；此外，核酸物质顽固地结合在阴离子交换介质上， 而强碱可有效清除来自弱阴离子交换介质；本申请可使用的强碱包括氢氧化钾 和氢氧化钠，但从成本考虑，氢氧化钾较氢氧化钠价格高，因此，优选采用氢 氧化钠。本申请的试剂中，非极性溶剂根据相似相溶原理，能够溶解并清洗非 极性分子，蒸馏水是极性溶剂，用于溶解并清洗极性分子；优选的，非极性溶 剂可以采用乙醇、甲醇或乙醚，但从燃点和试剂毒性的角度看来，乙醚燃点低 且有毒，甲醇也存在毒性，因此本申请优选采用乙醇。
因此，优选的，本申请的试剂中强碱为氢氧化钠，氢氧化钠的用量为终浓 度0.015-0.064g/mL，非极性溶剂为乙醇，乙醇的用量为总体积占比的 2.38％-6.16％，吐温为吐温20，吐温20的用量为总重量的0.000746％-0.000794％。
需要说明的是，以上浓度范围是本申请的一种实现方式中，经验证对所试 验的核酸测序仪有效的清洗浓度，可以理解，对于不同型号或者偏好的核酸测 序仪，可以参考以上浓度范围适当调整。
更优选的，氢氧化钠的终浓度为0.031g/mL，乙醇的用量为总体积占比的 4.61％，吐温20的用量为总重量的0.000769％。
本申请的另一面公开了一种用于核酸测序仪清洗的方法，包括先采用本申 请的试剂对核酸测序仪的管路进行清洗，最后再采用去离子水对所有管路进行 清洗。
优选的，包括以下步骤，
(1)采用本申请的试剂对所有管路进行至少1次清洗；
(2)采用去离子水对所有管路进行5次清洗。
优选的，步骤(1)和步骤(2)中清洗的条件为，吸液速250μL/min排液 速2500μL/min洗液用量为250μL。
优选的，在步骤(2)之前，本申请的方法还包括，采用本申请的试剂对荧 光试剂液路进行6次清洗。
优选的，对荧光试剂液路进行清洗的条件为，吸液速250μL/min排液速 2500μL/min洗液用量为250μL。
优选的，在步骤(2)之前，本申请的方法还包括，采用本申请的试剂对酶 蛋白试剂液路进行5次清洗。
优选的，对酶蛋白试剂液路进行清洗的条件为，吸液速250μL/min排液速 2500μL/min洗液用量为250μL。
需要说明的是，对荧光试剂液路或酶蛋白试剂液路的清洗可以在荧光试剂 液体或酶蛋白试剂液体污染严重时选择使用，或者对于使用时间比较长的核酸 测序仪使用，即直接对核酸测序仪依序进行步骤(1)、荧光试剂液路清洗、酶 蛋白试剂液路清洗和步骤(2)。其中，步骤(1)对所有管路进行1次清洗，主 要是为了排除管路中残留的液体，避免后续造成交叉污染；而荧光试剂液路或 酶蛋白试剂液路的清洗，主要是因为荧光试剂和酶蛋白试剂比较难清洗，因此， 对两者的管路要单独进行多次清洗；最后采用去离子水清洗所有管路是为了去 除本申请试剂中的氢氧化钠、乙醇等试剂，保障核酸测序仪的清洗质量。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的试剂，特别针对核酸测序仪中存在的污染源设计其组分，结合本 申请的清洗方法，能够有效的对核酸测序仪进行清洗，提高了清洗效率和质量， 解决了核酸测序仪长周期使用过程中的液路系统污染无法通过现有清洗手段解 决或清洗不到位等问题；为延长核酸测序仪使用寿命，保障测序质量奠定了基 础。
具体实施方式
本申请在经过大量的试验和研究的过程中发现，现有的核酸测序仪清洗效 果差，特别是对长期使用的旧测序仪清洗效果不好，其关键因素在于蒸馏水或 者添加少量防腐剂的蒸馏水对于污染源的溶解效果差，不能有效的去除各管路 中的污染成份，因此，无法达到良好的清洗效果。
基于以上认识，本申请的发明人特别对核酸测序仪各管路中的污染成份进 行了测量和分析，确定其主要试剂残留成分为：dNTPs、SBS polymerase、Tris、 NaCl、EDTA、Tween 20、sodium acsorbate、5×SSC等试剂。对此，本申请特 别研制了能够有效溶解以上残留成分的试剂，用于对核酸测序仪管路进行清洗， 以提高清洗效果。
在本申请的试剂的基础上，本申请进一步提出了核酸测序仪的清洗方法， 特别针对各管路中特别难清除的部分管路，例如荧光试剂液路、酶蛋白试剂液 路，进行了特殊处理，以保障清洗质量。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请 进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例的核酸测序仪清洗试剂，由氢氧化钠、蒸馏水、乙醇和吐温组成，本 例具体按照以下配方配制了三个试剂：
配方一：20g氢氧化钠、300mL蒸馏水、10mL浓度为75％的乙醇、5mL 0.05％Tween20；其中，氢氧化钠的浓度约为0.064g/mL、乙醇的量约为总体积占比的 2.4％、吐温20的量约为总重量的0.000794％；
配方二：10g氢氧化钠、300mL蒸馏水、20mL浓度为75％的乙醇、5mL 0.05％ Tween；其中，氢氧化钠的浓度约为0.031g/mL、乙醇的量约为总体积占比的 4.61％、吐温20的量约为总重量的0.000769％；
配方三：5g氢氧化钠、300mL蒸馏水、30mL浓度为75％的乙醇、5mL 0.05％ Tween。其中，氢氧化钠的浓度约为0.015g/mL、乙醇的量约为总体积占比的6.7％、 吐温20的量约为总重量的0.000746％；
本例的核酸测序仪清洗的管路包括：盐离子试剂液路、荧光试剂液路、酶 蛋白试剂液路。采用以上三个试剂按照以下方法，分别对核酸测序仪进行清洗， 同时，采用去离子水作为对照进行同样的清洗：
(1)采用试剂对所有管路进行1次清洗；
(11)采用试剂对荧光试剂液路进行6次清洗；
(12)采用试剂对酶蛋白试剂液路进行5次清洗；
(2)采用去离子水对所有管路进行5次清洗。
以上步骤中试剂都是指本例的三个试剂或者作为对照的去离子水。
以上清洗步骤中，清洗的条件为，吸液速250μL/min排液速2500μL/min洗 液用量为250μL。
本例分别测试了核酸测序仪清洗前后的吸光度、电导率。其中，清洗前的 吸光率，具体测试的是测试核酸测序仪清洗前，纯水泵入管路后回收测定的吸 光度；清洗后的吸光度，具体测试的是核酸测序仪清洗后，纯水泵入管路后回 收测定的吸光度。另外，本例还测试了去离子水的吸光度，核酸测序仪收集的 废液的吸光度，作为参考。本例分别测试了488nm和647nm下的吸光度。电导 率的测试类同，在此不累述；同样的，也测试了去离子水的电导率，核酸测序 仪收集的废液的电导率，作为参考。本例吸光度测试采用赛默飞世尔的Qubit 测试仪，电导率测试采用上海雷磁的DDSJ-308A检测仪。
此外，采用同样的测序文库，分别对三个试剂和去离子水对照清洗后的核 酸测序仪进行上机测序。本例采用的测序文库为WHTRDRPEP00002813 FC： FCCAFBMANXX，测序平台为Hiseq 2500。统计分析测序结果的Q30值和PF 值。
Q30值和PF值的结果如表1所示，吸光度测试结果如表2所示，电导率测 试结果如表3所示。
表1同一文库上机的Q30、FP％结果
| 试验组 | Q30 | FP％ |
| 去离子水组 | 70.6 | 83.9％ |
| 配方一 | 83.1 | 89.3％ |
| 配方二 | 84.2 | 91.8％ |
| 配方三 | 81.8 | 90.2％ |
表2吸光度对比
表2中，去离子水组是指去离子水清洗前后的吸光度值，阳性对照是指废 液的吸光度值，纯水是直接采用纯水测量的吸光度值。
表3电导率对比
表3中，去离子水组是指去离子水清洗前后的电导率值，阳性对照是指废 液的电导率值，纯水是直接采用纯水测量的电导率值。
表1至表3的结果显示，本例三种方案配方的试剂清洗完成后，较之前的 去离子水清洗数据都有较高改善。其中上机数据配方二效果最好，Q30及PF都 有较大提高。
Q30是测序的一种质量值。Q30数学上来讲是指，错误识别的概率是0.1％， 即错误率0.1％，或者正确率是99.9％。测序评价中，为了评估下机reads测序的 准确度，会评估Q30，及所有碱基质量值大于Q30所占的比例，这个数值越高 反映测序质量越好。
PF即passfilter，是指符合标准的簇的百分比，与测序最终通量相关联。这 个数值越高反映测序质量越好，得到的数据量越多。
测试结果显示，吸光度降低及电导率降低方面三种配方都较之前有很大改 善，结合上机测序质量，配方二可作为推荐值，即优选的配方为：氢氧化钠的 浓度0.031g/mL、乙醇的量为总体积占比4.61％，吐温20的量为总重量 0.000769％。
其中，吸光度降低，这部分作为主要参考指标，原因在于，测序仪废液污 染中有很大一部分是FFN/LFN荧光染料。通过检测使用洗剂前后的荧光染料对 应的吸光度，可以反映出荧光染料的清除度，反映洗涤的洁净度。
电导率降低，水溶液的电导率直接和溶解固体量浓度成正比，而且固体量 越高，浓度越高，电导率越大。测序仪试剂中有很多盐离子，对离子清洗率可 以通过电导率来反映。从而反映洗涤的洁净度。
可见，采用本例的试剂，与直接采用去离子水进行核酸测序仪清洗相比， 本例的试剂具有更好的清洗效果，文库测序试验也证实了本例的试剂清洗后的 测序结果更好。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能 认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (10)
1.一种用于核酸测序仪清洗的试剂，其特征在于：由强碱、蒸馏水、非极性溶剂和吐温组成，所述强碱为氢氧化钠或氢氧化钾，所述非极性溶剂为乙醇、甲醇或乙醚，所述吐温为吐温20或吐温21。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述强碱为氢氧化钠，所述氢氧化钠的用量为终浓度0.015-0.064g/mL，所述非极性溶剂为乙醇，所述乙醇的用量为总体积占比的2.38％-6.16％，所述吐温为吐温20，所述吐温20的用量为总重量的0.000746％-0.000794％。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述氢氧化钠的终浓度为0.031g/mL，所述乙醇的用量为总体积占比的4.61％，所述吐温20的用量为总重量的0.000769％。
4.一种用于核酸测序仪清洗的方法，其特征在于：包括先采用权利要求1-3任一项所述的试剂对核酸测序仪的管路进行清洗，最后再采用去离子水对所有管路进行清洗。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)采用权利要求1-3任一项所述的试剂对所有管路进行至少1次清洗；
(2)采用去离子水对所有管路进行5-8次清洗。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)和步骤(2)中清洗的条件为，吸液速250-300μL/min、排液速2000-2500μL/min、洗液用量为250-300μL。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：在步骤(2)之前，还包括，采用权利要求1-3任一项所述的试剂对荧光试剂液路进行6-8次清洗。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：对荧光试剂液路进行清洗的条件为，吸液速250-300μL/min、排液速2000-2500μL/min、洗液用量为250-300μL。
9.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：在步骤(2)之前，还包括，采用权利要求1-3任一项所述的试剂对酶蛋白试剂液路进行5-7次清洗。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：对酶蛋白试剂液路进行清洗的条件为，吸液速250-300μL/min、排液速2000-2500μL/min、洗液用量为250-300μL。
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2017
- 2017-08-16 CN CN201710703173.3A patent/CN109401856A/zh active Pending
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