CN109381492A - 一种同时构建隐球菌肺炎及脑膜炎实验模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物医学及实验技术领域，涉及构建实验模型的方法，具体涉及一种构建隐球菌肺炎及脑膜炎实验模型的方法，尤其涉及一种同时构建肺隐球菌肺炎和脑膜炎实验动物模型的方法。本发明采用耳窥镜优化确定隐球菌菌液干预方式，进而同时构建实验小鼠肺炎和脑膜炎模型；结果表明，本发明的方法构建的实验小鼠脑膜炎模型能更好地模拟临床上隐球菌自然感染过程，通过呼吸道感染隐球菌，继而隐球菌全身播散引起隐球菌脑膜炎，简便易行、重复性好，对实验小鼠损伤小，且隐球菌感染量较恒定。本发明为进一步研究隐球菌致病性、耐药性研究与新药的筛选提供了良好的实验动物模型。

Description

一种同时构建隐球菌肺炎及脑膜炎实验模型的方法

技术领域

本发明属生物医学及实验技术领域，涉及构建实验模型的方法，具体涉及一种构建隐球菌肺炎及脑膜炎实验模型的方法，尤其涉及一种同时构建肺隐球菌肺炎和脑膜炎实验动物模型的方法。

背景技术

现有技术公开了新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)又名溶组织酵母菌(Torula Histolytica)，是土壤、鸽类、牛乳、水果等的腐生菌，也可存在于人体口腔中，为一种条件致病菌。研究显示，所述致病菌大多由呼吸道进入人体，在肺部引起轻度炎症，多为隐性感染，当机体免疫功能下降时，所述隐球菌可经血液向全身播散，易侵犯中枢神经系统，引发隐球菌性脑膜炎、脑炎或脑肉芽肿等疾患。临床实践显示，隐球菌引起的脑膜炎起病隐匿，发现时患者病程较长，病情较重，呈现出头痛、恶心、呕吐，颅内压明显升高症状，据统计，若未经抗真菌干预治疗其病死率高达87％。研究显示，近年来随着免疫抑制剂的广泛使用，以及艾滋病患者的不断增多，本病的发病率明显增加，该现象已成为临床实践中广泛关注的感染性疾病，亦已成为临床微生物学研究的热点。

构建隐球菌性脑膜炎实验模型是研究隐球菌致病性、与宿主免疫反应以及筛选抗真菌药物的重要研究方法之一。临床实践中多采用构建小鼠实验模型进行上述有关研究，目前构建小鼠隐球菌脑膜炎模型主要采用脑室内注射的方法，但实践证实，在施行注射器注射过程中常发生可能损伤小鼠脑组织，易导致小鼠意外死亡的事故，更关键的问题是，由于该方法中将隐球菌直接注射入小鼠脑室，与临床实践中大部分患者通过呼吸道感染隐球菌，经血流播散而致隐球菌脑膜炎的自然感染途径及过程完全不同，因此，无法真正观察到机体在疾病中的免疫状态，获得有价值的实验依据，故，目前需要一种简便易行且能更好模拟临床隐球菌自然感染过程的实验模型及其构建方法，以满足上述隐球菌及其引发脑膜炎的临床研究需要。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种构建隐球菌肺炎及脑膜炎实验模型的方法，尤其涉及一种同时构建肺隐球菌肺炎和脑膜炎实验动物模型的方法。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术存在的缺陷与不足，提供一种构建隐球菌肺炎及脑膜炎实验模型的方法，尤其涉及一种同时构建肺隐球菌肺炎和脑膜炎实验动物模型的方法。本发明的方法能更好模拟临床上隐球菌自然感染过程，较好的满足所述隐球菌及其引发脑膜炎的临床研究及实践需要。

本发明的方法易于操作，重复性好，易标准化，为进一步研究隐球菌致病性、耐药性研究与新药的筛选提供良好的动物模型。

具体的，本发明提供了一种同时构建隐球菌肺炎及脑膜炎实验动物模型的方法，其包括步骤，

1、制备隐球菌菌液；

2、采用耳窥镜优化确定隐球菌菌液干预方式；

3、观察测定指标，包括：

组织隐球菌定量：计数无菌培养的小鼠肺脏、肝脏、肾脏和脑组织的隐球菌；

组织病理：采用PAS方法染色后观察经福尔马林固定后的肺脏、肝脏、肾脏和脑组织中的隐球菌；

4、确认同时构建隐球菌肺炎及脑膜炎模型成功的指标，

组织细菌定量：在day10天小鼠肺部及脑组织经匀浆培养48小时后有隐球菌生长，为建模成功；

组织病理：在day10天小鼠肺部及脑组织病理显示组织中可见隐球菌，为建模成功。

经构建隐球菌肺炎及脑膜炎实验模型实验操作，结果显示，本发明采用耳窥镜优化确定隐球菌菌液干预方式，本发明的实施例中，采用耳窥镜引导并监视常规的实验小鼠气管插管以及实现隐球菌菌液干预，进而同时构建实验小鼠肺炎和脑膜炎模型；结果表明，本发明的方法构建的实验小鼠脑膜炎模型能更好地模拟临床上隐球菌自然感染过程，通过呼吸道感染隐球菌，继而隐球菌全身播散引起隐球菌脑膜炎，简便易行、重复性好，对实验小鼠损伤小，且隐球菌感染量较恒定。

本发明为进一步研究隐球菌致病性、耐药性研究与新药的筛选提供了良好的实验动物模型。

附图说明

图1显示了造模成功后，实验小鼠肺组织见隐球菌浸润，支气管、肺泡及间质内见大量隐球菌，间质内少量以淋巴细胞为主的炎症反应；PAS染色能明确显示组织内菌体，呈红色点状的即为隐球菌，菌体周围有空晕。

图2显示了实验小鼠脑实质内见灶性隐球菌浸润，周围未见炎症反应，胶质细胞稍增生；PAS染色明确显示组织内菌体，呈红色点状的即为隐球菌，菌体周围有空晕。

图3构建隐球菌肺炎及脑膜炎实验模型实验操作工具，

图中从左至右依次为：气管插管、气管内导管、耳窥镜。

具体实施方式

实施例1

1)制备菌液

取新型隐球菌菌液涂于沙保氏平板上。培养48小时后挑取沙保氏平板上生长的新型隐球菌菌落，稀释入PBS中，调节菌液浓度至1×10⁹/ml；

2)采用耳窥镜优化确定隐球菌菌液干预方式，

本实施例中，采用美国Braintree公司工具盒和啮齿动物工作台，采用耳窥镜引导并监视进行常规的实验小鼠气管插管以及实现隐球菌菌液干预，进而同时构建实验小鼠肺炎和脑膜炎模型；具体包括：实验小鼠常规麻醉后仰卧位固定小鼠于啮齿动物工作台上，缓慢升起工作台至45度，操作者采用电池手柄的耳窥镜引导并监视实验小鼠的拟实行隐球菌菌液干预的部位，时机适宜时，沿插管成功的气管插管进行10μL隐球菌菌液干预，吹打3次，确保菌液干预实验小鼠肺部，操作完毕，小鼠在啮齿动物操作台竖立1分钟后，缓慢放平操作台，将小鼠放回饲养笼中；

3.观察时间点

在注射细菌后的day0、day3、day5、day7和day10天观察小鼠一般情况和体重，在day10天常规处理小鼠。

4.观察指标

组织细菌定量：在细菌干预后即刻无菌法取小鼠肺脏、肝脏、肾脏和脑组织，称重后每0.1g组织加入PBS中，组织匀浆机研磨，取100μL经系列稀释后接种于沙保氏培养板培养48小时后行菌落计数，继而计算每克组织中的细菌含量；在day 10天对所有小鼠，同上检测小鼠肺脏、肝脏、肾脏和脑组织的菌落计数；

组织病理：在day 0和day10天，取3只小鼠肺脏、肝脏、肾脏和脑组织，经福尔马林固定后采用PAS方法染色后观察组织中的隐球菌孢子。

Claims (5)

1.一种同时构建隐球菌肺炎及脑膜炎实验动物模型的方法，其特征在于，其包括步骤，

1)制备隐球菌菌液；

2)采用耳窥镜优化确定隐球菌菌液干预方式；

3)观察测定指标，包括：

组织隐球菌定量；

组织病理：PAS方法染色后组织中的隐球菌；

4)确认同时构建隐球菌肺炎及脑膜炎模型成功的指标，包括，

组织细菌定量：和，组织病理隐球菌指标。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所制备的隐球菌菌液浓度为1×10⁹/ml。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，采用耳窥镜引导并监视进行常规的实验小鼠气管插管以及实现隐球菌菌液干预。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，

在细菌干预后的day0、day3、day5、day7和day10天观察实验小鼠一般情况和体重，在day10天常规处理小鼠；

组织隐球菌定量：计数无菌培养的小鼠肺脏、肝脏、肾脏和脑组织的隐球菌；

组织病理：采用PAS方法染色后观察经福尔马林固定后的肺脏、肝脏、肾脏和脑组织中的隐球菌。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，

组织细菌定量：在day10天小鼠肺部及脑组织经匀浆培养48小时后有隐球菌生长，为建模成功；

组织病理：在day10天小鼠肺部及脑组织病理显示组织中可见隐球菌，为建模成功。