CN107296007B - 一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法，通过采用试验动物的筛选、剖取冲洗包囊、制备原头节悬液、镜检原头节、麻醉子午沙鼠、建模等一系列的技术手段，创造性的提供了一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法，利用此方法构建的泡球蚴病动物模型，60d包囊组织几乎长满整个胸腔并完全包裹肺脏，15d、45d、60d子午沙鼠包囊系数较BALB/c小鼠包囊系数均有显著差异，本发明提供的子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法具有成模率高、造模周期短、成本低以及重现性好的优点，对于医学技术领域具有广泛地实用性。

Description

一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法
技术领域
本发明属于医学技术领域，具体的，本发明涉及一种建立肺泡球蚴病动物模型方法的技术领域。
背景技术
包虫病是一种多发于牧区的人兽共患寄生虫病，主要由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus.Eg)的幼体和多房棘球绦虫 (Echinococcusmultilocularis.Em)的幼体感染人体发生。其中多房棘球绦虫幼体(泡球蚴)导致的泡型包虫病由于其包囊具有浸润性生长的特点，又称泡球蚴病(alveolar echinococcosis，Ae)，造成该病极难治愈，被称为“虫癌”。在包虫病高流行地区，包虫病已成为制约当地经济发展、影响社会安定的公共卫生问题。人类包虫病中15％以上是肺包虫病，而目前报道的包虫病动物模型，多是用各种动物建立的腹腔动物模型，未见理想的肺包虫病动物模型报道，因此，建立合适的肺包虫病动物模型，对肺包虫病的发生、治疗和预防具有非常重要的现实意义。
目前，为人类建立动物模型的实验动物品种仍然较少，尚不能满足现有已存在和不断增加的疾病防治和科学研究的需要。而寻找体型小，模拟人类疾病动物模型准确、模型周期短、易于饲养繁殖的动物种类成为丰富实验动物新品种的重要途径。在这种方向的指引下，被逐步驯化的实验动物成为实验动物新品种的主要来源。国内已驯养成功和正在驯化开发的有5-6种，已被国内认可的新型实验动物如黑线仓鼠和长爪沙鼠，已在生物医学研究中广泛应用，而且是多种疾病和病原的模型动物。子午沙鼠(Meriones meridianus)属啮齿目 (Rodentia)、仓鼠科(Cricetidae)、沙鼠亚科(Gerbillinae)、沙鼠属(Meriones)，是欧亚大陆中部荒漠、半荒漠的鼠种，具有体积小、性情温和、繁殖力强、性成熟早、易驯眠和易饲养等特点。作为和长瓜沙鼠同属一个属的子午沙鼠，在生物学方面两者具有相似性，但体型只有长瓜沙鼠的2/3，用小鼠盒就能饲养繁殖。长瓜沙鼠体型大，需要用中鼠盒饲养繁殖，空间是小鼠盒的两倍，饲料消耗比子午沙鼠多三分之一。与长瓜沙鼠相比，子午沙鼠在饲养空间和饲料消耗方面具明显的优势。现有报道显示，用细粒棘球蚴和多房棘球蚴腹腔感染子午沙鼠，发现该鼠对两种棘球蚴的感染效果都明显优于现有实验动物。
动物模型的制备，尤其是模拟自然感染途径，是进行包虫病研究的基础。目前泡球蚴感染小鼠模型有四种造模方式：开腹直视肝脏穿刺接种、经皮肝穿刺接种、门静脉系侧枝血管(回盲部静脉)穿刺接种和腹腔穿刺接种。这四种造模方式均是适用于制备肝包虫病动物模型，且这四种方法具有肝易损伤、腹腔易感染的缺点，不能很好的反映肝脏原发病灶的生长情况，更不适用于肺包虫病动物模型的建立。例如中国专利CN106236318A，公开了一种泡球蚴经肝门静脉途径感染肝脏的泡型包虫病动物模型的构建方法，该专利主要是经肝门静脉途径感染肝脏，从而建立肝包虫病动物模型。现有技术中关于肺包虫病动物模型报道极少，仅有一篇文献是申请人在研究子午沙鼠习性时，向国家申请了自然科学基金《子午沙鼠清洁级种群及其肺包虫病动物模型的建立》项目，项目中记载的内容仅仅是申请人初期对子午沙鼠的研究，这为如何建立肺包虫病动物模型奠定了基础，但如何成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型，仍需要进行进一步研究，不能够获得解决子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型构建技术的突破。因此，需要在现有技术的基础上建立一种更接近自然感染途径、感染率高，以及病灶原发于肺的泡型包虫病动物模型，建立肺包虫病动物模型对研究人类肝包虫病的发生、发展、治疗和预防具有非常重要的现实意义。
发明内容
针对目前国内外有关利用子午沙鼠建立肺泡球蚴病动物模型的报道较少，且现有建模方法存在感染率高、造模周期长，不适用于子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建技术现状，本发明旨在于提供一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法，通过采用试验动物的筛选、剖取冲洗包囊、制备原头节悬液、镜检原头节、麻醉子午沙鼠、建模等一系列的技术手段，创造性的提供了一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法，成功构建一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型， 60d包囊组织几乎长满整个胸腔并完全包裹肺脏，15d、45d、60d子午沙鼠包囊系数较BALB/c小鼠包囊系数均有显著差异，本发明提供的子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法具有成模率高、感染率低、造模周期短、成本低以及重现性好的优点，对于医学技术领域具有广泛地实用性。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案：
本发明提供一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法，具体构建方法步骤如下：
(1)试验动物：选取清洁级封闭群子午沙鼠40只，8-12周龄，雌雄各半，清洁级BALB/c小鼠40只，8-10周龄，雌雄各半。
(2)子午沙鼠的饲养：采用常规饲养模式，饲料类型为钴60辐照大小鼠维持饲料，自由采食，每周添加饲喂胡萝卜10g/只、葵花籽 5g/只，饮用水经高压灭菌处理。
(3)剖取包囊：二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫传代BALB/c 小鼠，采用无菌手术剖取多房棘球绦虫包囊。
(4)研磨冲洗包囊：剪碎包囊置于研钵内研磨，充分研磨后过 80目筛网，同时以双抗溶液冲洗筛网，留取滤液。
(5)制备原头节悬液：采用50ml注射器吸入滤液，加双抗溶液沉淀原头节，排出上清液，反复三次，留取原头节悬液。
(6)镜检原头节：混匀原头节悬液，用0.5％伊红染色后滴入血球计数板计数，同时镜检原头节活力，原头节活力在95％以上方可接种动物，计数后调整原头节悬液浓度至4000-5000个/ml。
(7)麻醉子午沙鼠：对子午沙鼠麻醉处理，在颈部气管处备皮，固定动物于手术台，碘伏酒精消毒手术区域。
(8)建模：沿气管方向切开颈部皮肤钝性分离颌下腺及肌肉，暴露气管，将混匀的原头节悬液0.02-0.03ml注射入气管内，注射后针头置于气管内停留8-10s，防止动物呛咳造成悬液外溢，退针后还纳颌下腺，缝合皮肤，消毒手术创口，将动物置于28-32℃恒温环境至苏醒，成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。
采用子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建后，需要做好术后处理，术后每日以碘伏消毒手术创口，连续三日。
本发明中，双抗溶液由青霉素50万单位、链霉素50万单位溶于 500ml 0.9％无菌生理盐水制备获得。
本发明中，对子午沙鼠麻醉处理时，取子午沙鼠以0.5ml/100g 剂量腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉处理。
本发明中，镜检原头节步骤中，计数后调整原头节悬液浓度至 5000个/ml。
本发明中，建模步骤中，将混匀的原头节悬液0.02ml注射入气管内，注射后针头置于气管内停留10s。
本发明中，恒温环境的温度为30℃。
通过实施本发明具体的发明内容可以达到以下有益效果：
(1)本发明提供的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法，通过采用试验动物的筛选、剖取冲洗包囊、制备原头节悬液、镜检原头节、麻醉子午沙鼠、建模等一系列的技术手段，能够成功构建子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型，克服了没有相关动物模型对于包虫病病证机制的研究的限制，具有成模率高、感染率低、造模周期短、成本低以及重现性好的优点，对于医学技术领域具有广泛地实用性。
(2)采用本发明提供的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法，分别于造模后15d、30d、45d、60d四个时间点评价模型建立情况，比较子午沙鼠与BALB/c小鼠经气管感染多房棘球绦虫包囊解剖结果，解剖后可见子午沙鼠接种多房棘球绦虫原头节15d肺组织表面出现较多不规则白色突起，30d形成明显包囊，45d包囊组织迅速增长，60d包囊组织几乎长满整个胸腔并完全包裹肺脏。BALB/c 小鼠接种15d后肺脏表面未见明显异常，30d肺脏表面形成不规则突起，45d可观察到单发的包囊，60d包囊数量、体积较45d均有增加。感染动物肺组织分离包囊后测算包囊系数，15d、45d、60d子午沙鼠包囊系数较BALB/c小鼠包囊系数均有显著差异(P＜0.05)。
(3)采用本发明提供的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法后，对所有感染动物肺组织提取进行cox1基因PCR检测，15d 时子午沙鼠有6只感染多房棘球蚴呈强阳性，而BALB/c小鼠只有2 只；30d和45d子午沙鼠感染强阳性均为7只，BALB/c小鼠感染强阳性分别为4只和3只；60d子午沙鼠感染8只均为强阳性，BALB/c 小鼠为4只。
(4)采用本发明提供的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法后，对子午沙鼠和BALB/c小鼠不同时间点肺组织切片进行病理学诊断，第15d时可见肺泡间隔增厚，炎细胞浸润伴有出血，血管周围炎形成，主要为嗜酸性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞。第30d，炎症反应加剧，并有纤维素囊形成趋势，周围大量炎细胞浸润，主要为浆细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞及淋巴细胞。第45d，肺组织内大量囊腔形成，棘球蚴包囊形成，角质层和生发层可见，囊内有脱落的包囊砂(棘球砂)。第60d，肺组织被大量囊腔取代，棘球蚴包囊形成，角质层和生发层可见，腔内散在大量原头蚴，钙颗粒形态寻常，部分能看到囊液。而BALB/c小鼠第15d肺组织形态正常，无明显病理性改变，第30d可见炎性肉芽肿形成，单核细胞、嗜酸性粒细胞为主，并可见巨嗜细胞，第45d肺泡间隔增厚，炎细胞浸润伴有出血，血管周围炎初步形成，第60d炎症反应加剧，弥漫性炎细胞浸润伴有出血，血管周围炎形成。
附图说明
图1显示为子午沙鼠经气管感染多房棘球绦虫后的解剖观察结果。
图2显示为BALB/c小鼠经气管感染多房棘球绦虫后的解剖观察结果。
图3显示为子午沙鼠与BALB/c小鼠经气管感染多房棘球绦虫肺组织cox1基因PCR检测结果。
图4显示为子午沙鼠经气管感染多房棘球绦虫肺组织病理切片。
图5显示为BALB/c小鼠经气管感染多房棘球绦虫肺组织病理切片。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明所使用的主要实验动物：清洁级封闭群子午沙鼠40只， 8～12周龄，雌雄各半；清洁级BALB/c小鼠40只，8～10周龄，雌雄各半，均有新疆维吾尔自治区实验动物研究中心提供(生产许可： SCXK(新))。
本发明所使用的主要实验动物饲料：钴60辐照大小鼠维持饲料，胡萝卜，葵花籽。
本发明所使用的感染材料：多房棘球绦虫原头节，由新疆维吾尔自治区实验动物研究中心BALB/c小鼠体内保种传代。
本发明所使用的实验试剂和仪器属于本领域常见，其选用的试剂浓度和单位属于本领域熟知方式：0.5％伊红、95％以上原头节活力、双抗溶液、青霉素50万单位、链霉素50万单位溶于500ml 0.9％无菌生理盐水；麻醉剂：1％戊巴比妥钠(美国默克公司)0.9％无菌生理盐水溶液。DP-304组织基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；多房棘球绦虫cox1基因引物(北京博迈德基因技术有限公司)；PCR Master Mix、DNAMarker、核酸染料均购自德国凯杰(qiagen)公司； HE染色相关试剂均购自珠海贝索生物技术有限公司。
本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。动物实验遵照新疆维吾尔自治区实验动物研究中心实验动物使用与管理委员会的批准，样本取材程序符合新疆维吾尔自治区实验动物研究中心实验动物伦理委员会标准，实验严格遵循动物实验的相关伦理学标准执行，在实验过程中使用麻醉剂，最大限度的减少小动物的术后疼痛。
实施例一：
子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建的具体步骤如下：
(1)试验动物：选取清洁级封闭群子午沙鼠40只，8-12周龄，雌雄各半，清洁级BALB/c小鼠40只，8-10周龄，雌雄各半。
(2)子午沙鼠的饲养：采用常规饲养模式，饲料类型：钴60辐照大小鼠维持饲料，自由采食，每周添加饲喂胡萝卜10g/只、葵花籽 5g/只，饮用水经高压灭菌处理。
(3)剖取包囊：二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫传代BALB/c 小鼠，采用无菌手术剖取多房棘球绦虫包囊。
(4)研磨冲洗包囊：剪碎包囊置于研钵内研磨，充分研磨后过 80目筛网，同时以双抗溶液冲洗筛网，留取滤液。
(5)制备原头节悬液：采用50ml注射器吸入滤液，加双抗溶液沉淀原头节，排出上清液，反复三次，留取原头节悬液。
(6)镜检原头节：混匀原头节悬液，用0.5％伊红染色后滴入血球计数板计数，同时镜检原头节活力，原头节活力在95％以上方可接种动物，计数后调整原头节悬液浓度至4000-5000个/ml。
(7)麻醉子午沙鼠：对子午沙鼠麻醉处理，在颈部气管处备皮，固定动物于手术台，碘伏酒精消毒手术区域。
(8)建模：沿气管方向切开颈部皮肤钝性分离颌下腺及肌肉，暴露气管，将混匀的原头节悬液0.02-0.03ml注射入气管内，注射后针头置于气管内停留8-10s，防止动物呛咳造成悬液外溢，退针后还纳颌下腺，缝合皮肤，消毒手术创口，将动物置于28-32℃恒温环境至苏醒，成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。
经过上述，采用子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法后，进行必要的术后处理：术后每日以碘伏消毒手术创口，连续三日。
本发明中，双抗溶液由青霉素50万单位、链霉素50万单位溶于 500ml 0.9％无菌生理盐水制备获得。
本发明中，对子午沙鼠麻醉处理时，取子午沙鼠以0.5ml/100g 剂量腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉处理。
本发明中，镜检原头节步骤中，计数后调整原头节悬液浓度至 5000个/ml。
本发明中，建模步骤中，将混匀的原头节悬液0.02ml注射入气管内，注射后针头置于气管内停留10s。
本发明中，恒温环境的温度为30℃。
实施例二：
选取清洁级封闭群子午沙鼠40只，8-12周龄，雌雄各半，清洁级BALB/c小鼠40只，8-10周龄，雌雄各半，均采用常规饲养模式，自由采食钴60辐照大小鼠维持饲料，每周添加饲喂胡萝卜10g/只、葵花籽5g/只，饮用水经高压灭菌处理。二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫传代BALB/c小鼠，采用无菌手术剖取多房棘球绦虫包囊，剪碎包囊置于研钵内研磨，充分研磨后过80目筛网，同时采用以青霉素 50万单位、链霉素50万单位溶于500ml 0.9％无菌生理盐水制备的双抗溶液冲洗筛网，采用50ml注射器吸入滤液，加双抗溶液沉淀原头节，排出上清液，反复三次，混匀原头节悬液，用0.5％伊红染色后滴入血球计数板计数，同时镜检原头节活力，原头节活力在95％以上方可接种动物，计数后调整原头节悬液浓度至4000个/ml。
取子午沙鼠以0.5ml/100g剂量腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉处理，在颈部气管处备皮，固定动物于手术台，碘伏酒精消毒手术区域。沿气管方向切开颈部皮肤钝性分离颌下腺及肌肉，暴露气管，将混匀的原头节悬液0.02ml注射入气管内，注射后针头置于气管内停留8s，防止动物呛咳造成悬液外溢，退针后还纳颌下腺，缝合皮肤，消毒手术创口，将动物置于28℃恒温环境至苏醒，成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。术后每日以碘伏消毒手术创口，连续三日。
实施例三：
选取清洁级封闭群子午沙鼠40只，8-12周龄，雌雄各半，清洁级BALB/c小鼠40只，8-10周龄，雌雄各半，均采用常规饲养模式，自由采食钴60辐照大小鼠维持饲料，每周添加饲喂胡萝卜10g/只、葵花籽5g/只，饮用水经高压灭菌处理。二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫传代BALB/c小鼠，采用无菌手术剖取多房棘球绦虫包囊，剪碎包囊置于研钵内研磨，充分研磨后过80目筛网，同时采用以青霉素 50万单位、链霉素50万单位溶于500ml 0.9％无菌生理盐水制备的双抗溶液冲洗筛网，采用50ml注射器吸入滤液，加双抗溶液沉淀原头节，排出上清液，反复三次，混匀原头节悬液，用0.5％伊红染色后滴入血球计数板计数，同时镜检原头节活力，原头节活力在95％以上方可接种动物，计数后调整原头节悬液浓度至5000个/ml。
取子午沙鼠以0.5ml/100g剂量腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉处理，在颈部气管处备皮，固定动物于手术台，碘伏酒精消毒手术区域。沿气管方向切开颈部皮肤钝性分离颌下腺及肌肉，暴露气管，将混匀的原头节悬液0.03ml注射入气管内，注射后针头置于气管内停留9s，防止动物呛咳造成悬液外溢，退针后还纳颌下腺，缝合皮肤，消毒手术创口，将动物置于29℃恒温环境至苏醒，成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。术后每日以碘伏消毒手术创口，连续三日。
实施例四：
选取清洁级封闭群子午沙鼠40只，8-12周龄，雌雄各半，清洁级BALB/c小鼠40只，8-10周龄，雌雄各半，均采用常规饲养模式，自由采食钴60辐照大小鼠维持饲料，每周添加饲喂胡萝卜10g/只、葵花籽5g/只，饮用水经高压灭菌处理。二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫传代BALB/c小鼠，采用无菌手术剖取多房棘球绦虫包囊，剪碎包囊置于研钵内研磨，充分研磨后过80目筛网，同时采用以青霉素 50万单位、链霉素50万单位溶于500ml 0.9％无菌生理盐水制备的双抗溶液冲洗筛网，采用50ml注射器吸入滤液，加双抗溶液沉淀原头节，排出上清液，反复三次，混匀原头节悬液，用0.5％伊红染色后滴入血球计数板计数，同时镜检原头节活力，原头节活力在95％以上方可接种动物，计数后调整原头节悬液浓度至4000个/ml。
取子午沙鼠以0.5ml/100g剂量腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉处理，在颈部气管处备皮，固定动物于手术台，碘伏酒精消毒手术区域。沿气管方向切开颈部皮肤钝性分离颌下腺及肌肉，暴露气管，将混匀的原头节悬液0.02ml注射入气管内，注射后针头置于气管内停留10s，防止动物呛咳造成悬液外溢，退针后还纳颌下腺，缝合皮肤，消毒手术创口，将动物置于31℃恒温环境至苏醒，成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。术后每日以碘伏消毒手术创口，连续三日。
实施例五：
选取清洁级封闭群子午沙鼠40只，8-12周龄，雌雄各半，清洁级BALB/c小鼠40只，8-10周龄，雌雄各半，均采用常规饲养模式，自由采食钴60辐照大小鼠维持饲料，每周添加饲喂胡萝卜10g/只、葵花籽5g/只，饮用水经高压灭菌处理。二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫传代BALB/c小鼠，采用无菌手术剖取多房棘球绦虫包囊，剪碎包囊置于研钵内研磨，充分研磨后过80目筛网，同时采用以青霉素 50万单位、链霉素50万单位溶于500ml 0.9％无菌生理盐水制备的双抗溶液冲洗筛网，采用50ml注射器吸入滤液，加双抗溶液沉淀原头节，排出上清液，反复三次，混匀原头节悬液，用0.5％伊红染色后滴入血球计数板计数，同时镜检原头节活力，原头节活力在95％以上方可接种动物，计数后调整原头节悬液浓度至4500个/ml。
取子午沙鼠以0.5ml/100g剂量腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉处理，在颈部气管处备皮，固定动物于手术台，碘伏酒精消毒手术区域。沿气管方向切开颈部皮肤钝性分离颌下腺及肌肉，暴露气管，将混匀的原头节悬液0.02ml注射入气管内，注射后针头置于气管内停留9s，防止动物呛咳造成悬液外溢，退针后还纳颌下腺，缝合皮肤，消毒手术创口，将动物置于30℃恒温环境至苏醒，成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。术后每日以碘伏消毒手术创口，连续三日。
实施例六：
选取清洁级封闭群子午沙鼠40只，8-12周龄，雌雄各半，清洁级BALB/c小鼠40只，8-10周龄，雌雄各半，均采用常规饲养模式，自由采食钴60辐照大小鼠维持饲料，每周添加饲喂胡萝卜10g/只、葵花籽5g/只，饮用水经高压灭菌处理。二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫传代BALB/c小鼠，采用无菌手术剖取多房棘球绦虫包囊，剪碎包囊置于研钵内研磨，充分研磨后过80目筛网，同时采用以青霉素 50万单位、链霉素50万单位溶于500ml 0.9％无菌生理盐水制备的双抗溶液冲洗筛网，采用50ml注射器吸入滤液，加双抗溶液沉淀原头节，排出上清液，反复三次，混匀原头节悬液，用0.5％伊红染色后滴入血球计数板计数，同时镜检原头节活力，原头节活力在95％以上方可接种动物，计数后调整原头节悬液浓度至5000个/ml。
取子午沙鼠以0.5ml/100g剂量腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉处理，在颈部气管处备皮，固定动物于手术台，碘伏酒精消毒手术区域。沿气管方向切开颈部皮肤钝性分离颌下腺及肌肉，暴露气管，将混匀的原头节悬液0.03ml注射入气管内，注射后针头置于气管内停留10s，防止动物呛咳造成悬液外溢，退针后还纳颌下腺，缝合皮肤，消毒手术创口，将动物置于32℃恒温环境至苏醒，成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。术后每日以碘伏消毒手术创口，连续三日。
实施例七：子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的检测评价
采用上述实施例一至实施例六任意一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建，分别于造模后15d、30d、45d、60d四个时间点，对采用上述实施例制备的子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型进行检测评价。
(1)解剖学检查
检查方法：分别于造模后15d、30d、45d、60d四个时间点评价模型建立情况，每次处理子午沙鼠和BALB/c小鼠各8只。称重后异氟烷吸入麻醉处死，解剖胸腔观察肺组织感染情况并记录。对肉眼可见包囊的肺组织，仔细剥离包囊称重，结合动物体重，计算包囊系数(包囊系数＝包囊重/动物体重×100％)。
检查结果：子午沙鼠解剖结果参见附图1，子午沙鼠与BALB/c 小鼠经气管感染多房棘球绦虫包囊系数比较结果见表1。解剖后可见子午沙鼠接种多房棘球绦虫原头节15d肺组织表面出现较多不规则白色突起，30d形成明显包囊，45d包囊组织迅速增长，60d包囊组织几乎长满整个胸腔并完全包裹肺脏。BALB/c小鼠解剖结果参见附图2，BALB/c小鼠接种15d后肺脏表面未见明显异常，30d肺脏表面形成不规则突起，45d可观察到单发的包囊，60d包囊数量、体积较 45d均有增加。
表1：子午沙鼠与BALB/c小鼠经气管感染多房棘球绦虫包囊系数比较
15d 30d 45d 60d
子午沙鼠 0.0282±0.0213* 0.0243±0.0159 0.5567±0.6217* 4.7545±2.8431*
BALB/c小鼠 0.0027±0.0044 0.0111±0.0127 0.0254±0.0244 0.0345±0.0426
注：与BALB/c小鼠相比P＜0.05
由表1可知，感染动物肺组织分离包囊后测算包囊系数，15d、 45d、60d子午沙鼠包囊系数较BALB/c小鼠包囊系数均有显著差异(P ＜0.05)。
(2)多房棘球绦虫cox1基因PCR检测
检测方法：所有感染动物取30mg肺组织提取总DNA。根据已报道多房棘球绦虫cox1基因设计引物
(Cox1Fw：GTGGTGTTGATTTTTTGATGTTT；Cox1RV： CCAAACGTAAACAACACTATAAAAGA)，扩增体系：2×Ta PCR MasterMix 15μL，样品DNA 3μL，上、下游引物各2μL，dd水8μL，共30μL。扩增条件：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火56℃45s，延伸72℃40s，反复35个循环，72℃延伸12min。扩增产物以2％琼脂糖凝胶电泳检测。
检测结果：对所有感染动物肺组织提取进行cox1基因PCR检测，结果参见附图3，15d时子午沙鼠有6只感染多房棘球蚴呈强阳性，而BALB/c小鼠只有2只；30d和45d子午沙鼠感染强阳性均为7只， BALB/c小鼠感染强阳性分别为4只和3只；60d子午沙鼠感染8只均为强阳性，BALB/c小鼠为4只。
(3)组织病理学检查
检查方法：对子午沙鼠和BALB/c小鼠不同时间点肺组织切片进行病理学诊断，诊断如下：
子午沙鼠检查结果参见附图4，第15d时可见肺泡间隔增厚，炎细胞浸润伴有出血，血管周围炎形成，主要为嗜酸性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞。第30d，炎症反应加剧，并有纤维素囊形成趋势，周围大量炎细胞浸润，主要为浆细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞及淋巴细胞。第45d，肺组织内大量囊腔形成，棘球蚴包囊形成，角质层和生发层可见，囊内有脱落的包囊砂(棘球砂)。第60d，肺组织被大量囊腔取代，棘球蚴包囊形成，角质层和生发层可见，腔内散在大量原头蚴，钙颗粒形态寻常，部分能看到囊液。
BALB/c小鼠检查结果参见附图5，第15d肺组织形态正常，无明显病理性改变。第30d可见炎性肉芽肿形成，单核细胞、嗜酸性粒细胞为主，并可见巨嗜细胞。第45d肺泡间隔增厚，炎细胞浸润伴有出血，血管周围炎初步形成。第60d炎症反应加剧，弥漫性炎细胞浸润伴有出血，血管周围炎形成。
综上所述，通过采用试验动物的筛选、剖取冲洗包囊、制备原头节悬液、镜检原头节、麻醉子午沙鼠、建模等一系列的技术手段，创造性的提供了一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法，本发明提供的子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法具有成模率高、造模周期短、成本低以及重现性好的优点，对于医学技术领域具有广泛地实用性。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (3)

1.一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法中原头节的制备方法，其特征在于，具体制备方法步骤如下：
(1)剖取包囊：将二氧化碳麻醉处死后的多房棘球绦虫传代BALB/c小鼠，采用无菌手术剖取多房棘球绦虫包囊；
(2)研磨冲洗包囊：剪碎包囊置于研钵内研磨，充分研磨后过80目筛网，同时以双抗溶液冲洗筛网，留取滤液；
(3)制备原头节悬液：采用50ml注射器吸入滤液，加双抗溶液沉淀原头节，排出上清液，反复三次，留取原头节悬液；
(4)镜检原头节：混匀原头节悬液，用0.5％伊红染色后滴入血球计数板计数，同时镜检原头节活力，原头节活力在95％以上方可接种动物，计数后调整原头节悬液浓度至4000-5000个/ml。
2.如权利要求1所述的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法中原头节的制备方法，其特征在于，所述的双抗溶液由青霉素50万单位、链霉素50万单位溶于500ml 0.9％无菌生理盐水制备获得。
3.如权利要求1所述的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法中原头节的制备方法，其特征在于，所述的镜检原头节步骤中，计数后调整原头节悬液浓度至5000个/ml。
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