CN109380114A - 一种快速扩繁马铃薯试管苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速扩繁马铃薯试管苗的方法，该方法是将马铃薯单叶节茎段继代于含二氧化硅的扩繁培养基中，在约110 rpm条件下振荡培养60‑90 min，静置于组培架上进行培养。本发明效果在于有效地提高马铃薯试管苗的繁殖系数，同时降低成本：（1）继代初期的振荡培养避免单叶节茎段腋芽淹死，提高腋芽的成活率，成活率达90%以上；（2）振荡培养使二氧化硅和单叶节茎段充分摩擦，并产生轻微伤口，继而诱导愈伤组织并进一步形成试管苗，每茎段从愈伤组织可形成1‑2个试管苗；（3）试管苗培养至6‑8片叶时，进行再扩繁；（4）收集的二氧化硅可灭菌再利用。

Description

一种快速扩繁马铃薯试管苗的方法

技术领域

本发明涉及农业技术领域中的植物组织培养技术，具体是指一种快速扩繁马铃薯试管苗的方法。

背景技术

马铃薯（solanum tuberosum L.）是仅次于小麦、水稻、玉米的四大粮食作物之一，主要以块茎进行无性繁殖。马铃薯种薯一旦感染病毒、真菌、细菌等病害，易造成品种退化及品质和产量的下降，使马铃薯加工产业发展受到严重打击。马铃薯种薯生产一般经过（1）茎尖剥离并经病毒检测获得试管苗；（2）试管苗的快速繁殖及选择生长健壮的试管苗作扩繁材料；（3）在温网室采用无土栽培法在严格隔离条件下生产微型薯即原原种；（4）再生产一、二级原种及一级良种。即生产马铃薯优质良种的关键措施之一就是试管苗的大量生产。大量研究表明，马铃薯试管苗的扩繁技术包括培养基类型、激素类型、营养成分等。茎尖脱毒及病毒检测的马铃薯试管苗培养至6 - 8 cm，切段并继代于固体培养基时，一般4周转接一次；如果是液体培养基则3周继代一次，繁殖系数为4 - 6；液体培养基作为继代增殖培养基时，与固体培养基相比降低成本约30％，生长周期提前约10 d，繁殖倍数提高约1.8倍；适合马铃薯“大西洋”品种的继代增殖培养基为MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA或MS +2.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA；适合“下寨65”和“青薯168”马铃薯品种组织快繁的培养基组合为1/2MS培养基中添加0.5 mg/L IAA和0.3 mg/L IAA；此时，继代培养15 d后的平均展叶数比1/2MS的对照培养基多1片叶。利用培养基（MS + 0.1 mg/L NAA + 20 g/L蔗糖 +琼脂 5 g/L，pH 5.8）继代马铃薯植株单叶节茎段，若每隔25 d继代1次，试管苗可携带5 -6片叶，扩繁系数为3 - 5。另外，适合彩色马铃薯“黑金刚”单叶节茎段扩繁最适培养基为MS+ 1.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA，而1/2 MS 培养基易于诱导生根。

目前，马铃薯试管苗采用特定培养基（MS + 20 g/L蔗糖 + 植物生长调节剂）进行扩繁，该方法不仅扩繁系数较低而且因添加植物生长调节剂而易产生变异试管苗。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的不足而提供一种节省成本、提高马铃薯植株扩繁系数的快速扩繁马铃薯试管苗的方法，该方法通过提高腋芽的成活率和愈伤组织再分化形成试管苗，从而达到快速扩繁马铃薯试管苗的目的。

本发明是以如下技术方案实现的：

一种快速扩繁马铃薯试管苗的方法，包括下列步骤：

（1）扩繁培养基配制：MS培养基中添加白糖，将扩繁培养基分装于250 mL培养瓶中，每瓶再添加二氧化硅，灭菌；

（2）振荡及继代培养：无菌条件下，将马铃薯试管苗切断1.0 - 1.5 cm单叶节茎段，继代于含二氧化硅的扩繁培养基中，之后在摇床上振荡培养60 - 90 min，使二氧化硅和单叶节茎段充分摩擦，使之产生轻微伤口，然后静置于组织培养室的培养架上进行培养。

进一步地，所述的扩繁培养基配制是在MS培养基中添加20 g/L白糖，调节pH 5.7，将15 ml扩繁培养基分装于250 mL培养瓶中，每瓶再添加约1.5 g二氧化硅，在1大气压、121℃，高压灭菌锅中灭菌20 min。

进一步地，所述的摇床转速为110 rpm。

进一步地，所述的培养条件：在温度25℃，光照强度4000 lx，光照时间16 h/d条件下进行培养。

进一步地，所述添加二氧化硅的扩繁培养基形成的试管苗数量为扩繁培养基的1.5 - 2.1倍。

进一步地，所述一种快速扩繁马铃薯试管苗的方法还包括二氧化硅的再利用步骤：培养的试管苗继代之后收集的二氧化硅，可灭菌后再利用。

本发明是一种组织培养技术与二氧化硅相结合快速扩繁马铃薯试管苗的方法，在不添加任何植物生长调节剂的条件下，只通过二氧化硅和植物体的振荡培养而成功诱导愈伤组织，并从愈伤组织再分化形成试管苗，大大提高了扩繁系数，为满足马铃薯种薯生产的需要提供了有力保证。马铃薯试管苗来自两部分，约一半的植株来自于单叶节茎段腋芽的生长，约需5 d；另一半的植株来自摩擦伤口形成的愈伤组织再分化，静置培养约10 d陆续形成；一般情况下，利用植物生长调节剂来诱导愈伤组织，而本发明特别之处在于无需植物生长调节剂的介导而直接诱导愈伤组织并形成试管苗。试管苗充分生长后，再进行切断繁殖。具体为振荡培养使二氧化硅和单叶节茎段充分摩擦，并产生轻微伤口，继而诱导愈伤组织，愈伤组织又再分化形成1 - 2个试管苗。试管苗培养至6 - 8片叶时，进行再扩繁。

本发明因不使用植物生长调节剂而节省成本，继代初期因振荡培养而使营养液中充分溶解氧气，提高单叶节茎段腋芽成活率，避免了液体培养过程中经常发生的部分腋芽被营养液淹死的弊端，提高了腋芽的成活率，成活率达90%以上，振荡培养的腋芽成活率比静置培养的高出约30个百分点；二氧化硅和单叶节茎段因振荡而充分摩擦并造成伤口，伤口很快诱导愈伤组织并通过再分化形成试管苗，从而大大提高了扩繁系数的同时起到植株复壮的作用；每个单叶节茎段愈伤组织可再分化而形成1 - 2个试管苗。另外，二氧化硅的可再利用性也降低了马铃薯试管苗扩繁的生产成本。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明的方法和效果做进一步说明，但不限制本发明的保护范围。

供试品种为“诺兰”（红皮、乳白色瓤、中晚熟品种）和“东农303”（黄皮、乳白色瓤、早熟品种）马铃薯品种。

（1）试管苗获得：经茎尖脱毒并进行病毒检测的无病毒健康的试管苗，利用培养基（MS + 30 g/L白糖 + 8 g/L 琼脂, pH 5.7）培养，每4周继代一次，确保一定数量的试管苗。

（2）扩繁培养基配制：MS培养基中添加20 g/L白糖，利用NaOH或HCl调pH约为 5.7，配置扩繁培养基。于250 mL培养瓶中分装约15 ml的扩繁培养基，每瓶再添加 1.5 g 二氧化硅，在1大气压，121℃，高压灭菌锅中灭菌20 min。

（3）振荡培养：在无菌条件下，将马铃薯试管苗剪切1.0 - 1.5 cm大小的单叶节茎段，置于含二氧化硅的扩繁培养基中，并置于110 rpm的摇床上，振荡培养60 - 90 min。

（4）组培架培养：振荡培养之后，将培养瓶静置于组织培养室的培养架上进行培养至6 – 8 cm试管苗，利用于下一次扩繁培养。

（5）组培室的培养条件：培养条件为温度25 ℃，光照强度4000 lx，光照时间16 h/d。

（6）继代扩繁培养：培养至6 - 8cm的试管苗，切断1.0 - 1.5 cm的单叶节茎段，置于含二氧化硅的扩繁培养基中，重复步骤（3）-（5）。

（7）二氧化硅的再利用：试管苗继代之后收集的二氧化硅，用水冲洗，晾干，灭菌可再利用。

Claims (6)

1.一种快速扩繁马铃薯试管苗的方法，包括下列步骤：

（1）扩繁培养基配制：MS培养基中添加白糖，将扩繁培养基分装于250 mL培养瓶中，每瓶再添加二氧化硅，灭菌；

（2）振荡及继代培养：无菌条件下，将马铃薯试管苗切断1.0 - 1.5 cm单叶节茎段，继代于含二氧化硅的扩繁培养基中，之后在摇床上振荡培养60 - 90 min，使二氧化硅和单叶节茎段充分摩擦，使之产生轻微伤口，然后静置于组织培养室的培养架上进行培养。

2.根据权利要求1所述的一种快速扩繁马铃薯试管苗的方法，其特征是所述的扩繁培养基配制是在MS培养基中添加20 g/L白糖，调节pH 5.7，将15 ml扩繁培养基分装于250 mL培养瓶中，每瓶再添加约1.5 g二氧化硅，在1大气压、121℃，高压灭菌锅中灭菌20 min。

3.根据权利要求1所述的一种快速扩繁马铃薯试管苗的方法，其特征是所述的摇床转速为110 rpm。

4.根据权利要求1所述的一种快速扩繁马铃薯试管苗的方法，其特征是所述的培养条件：在温度25℃，光照强度4000 lx，光照时间16 h/d条件下进行培养。

5.根据权利要求1所述的一种快速扩繁马铃薯试管苗的方法，其特征是所述添加的二氧化硅的扩繁培养基中形成试管苗数量为扩繁培养基的1.5 - 2.1倍。

6.根据权利要求1所述的一种快速扩繁马铃薯试管苗的方法，其特征是还包括二氧化硅的再利用：试管苗继代之后收集的二氧化硅可灭菌后再利用。