CN109374881A

CN109374881A - Pd-l1抗体、组合物及试剂盒

Info

Publication number: CN109374881A
Application number: CN201811221810.4A
Authority: CN
Inventors: 许嘉森; 吴诗扬; 董艳; 刘苏燕; 刘志明; 黄洁芬
Original assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Surexam Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2018-07-18
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2038-10-19
Also published as: CN109374881B

Abstract

本发明涉及PD‑L1抗体、组合物及试剂盒，其中，所述抗体包含轻链CDR区和重链CDR区，所述轻链CDR区由CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3组成，所述重链CDR区由CDR‑H1、CDR‑H2和CDR‑H3组成；其中，所述CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1～3所示；所述CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4～6所示。本发明所述抗体对PD‑L1的亲和力强、特异性好，无交叉反应，且稳定性好，有利于PD‑L1的检测。

Description

PD-L1抗体、组合物及试剂盒

技术领域

本发明涉及抗体检测领域，具体而言，涉及PD-L1抗体、组合物及试剂盒。

背景技术

程序性死亡因子1配体1(programmed death ligand-1,PD-L1)，又称B7-H1，也称CD274，由CD274基因编码，是分子量为40KDa的细胞表面糖蛋白，属于B7家族。PD-L1是程序性死亡因子1(programmed death 1，PD1)的配体，是免疫反应中重要的负性调控因子。研究发现，PD-L1蛋白主要表达于抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)、活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、胎盘滋养层细胞、心脏内皮细胞和胸腺皮质上皮细胞。多种恶性肿瘤如肺癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肾细胞癌等均通过表达PD-L1来诱导形成免疫抑制性的肿瘤微环境，逃避机体的抗肿瘤免疫反应。PD-L1的表达与多种癌症的诊断、分级和预后有关。

如何快速、准确地检测PD-L1蛋白的表达情况具有重要意义。免疫检测法由于操作简单、耗时短、成本相对较少，已经成为目前检测PD-L1蛋白表达的主要方法。而PD-L1蛋白的免疫检测法依托于PD-L1抗体，PD-L1抗体的优劣直接影响检测结果的准确性。因此，有必要提供一种与PD-L1蛋白的亲和力好、特异性强、稳定性好的抗体。同时，当将抗体在溶液中长时间保存时，会发生抗体的二硫键或肽键的开裂，会发生化学分解物、不溶性凝集物、可溶性缔合物等的生成。因此，为了提供稳定且安全的抗体，需要研究一种用于抑制这些生成物的方法和试剂。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种亲和力好、特异性强和稳定性好的PD-L1抗体及其衍生的组合物或试剂盒。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

PD-L1抗体，所述抗体包含轻链CDR区和重链CDR区，所述轻链CDR区由CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3组成，所述重链CDR区由CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3组成；

其中，所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1～3所示；

所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4～6所示。

本发明还涉及组合物，所述组合物包括前述PD-L1抗体。

在一些具体的实施方式中，所述PD-L1抗体在所述组合物中的浓度为0.05～0.5μg/mL，例如，0.05μg/mL、0.08μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL或0.5μg/mL。

在一些具体的实施方式中，所述组合物还包括抗体稳定剂。

在一些具体的实施方式中，所述抗体稳定剂包括糖和氨基酸中的一种或多种。

在一些具体的实施方式中，所述糖选自葡萄糖、果糖、蔗糖、鼠李糖、岩藻糖或海藻糖中的一种或多种；所述氨基酸选自半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸或谷氨酸钠中的一种或多种；优选地，所述抗体稳定剂包括HEPES、葡萄糖、海藻糖和甘氨酸；更优选地，所述抗体稳定剂包括50～150mM HEPES、3～7g/L葡萄糖、1～5g/L海藻糖和3～7g/L甘氨酸；最优选地，所述抗体稳定剂包括100mM HEPES、5g/L葡萄糖、3g/L海藻糖和5g/L甘氨酸。

l mol/L(100×)HEPES(羟乙基哌秦乙硫磺酸)贮存液配制方法:取23.8g HEPES溶于90ml双蒸水中，用l M NaOH调pH至7.5-8.0，然后用水定容至100ml，过滤除菌，分装小瓶(2ml/瓶)，4℃或-20℃保存。

本发明还涉及PD-L1检测试剂盒，所述试剂盒包括前述抗体或组合物。

在一些具体的实施方式中，所述试剂盒中还包括其他辅助检测试剂。

在一些具体的实施方式中，所述其他辅助检测试剂包括抗所述PD-L1抗体的二抗、封闭液和内源性过氧化物酶阻断剂中的一种或多种，其中所述二抗标记有显示剂。

在一些具体的实施方式中，所述显示剂选自荧光标记、酶、金属离子或同位素。

在一些具体的实施方式中，所述显示剂为辣根过氧化物酶，所述试剂盒还包括显色底物DAB。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供一种PD-L1抗体、抗体组合物及其衍生试剂盒，所述抗体对PD-L1的亲和力强、特异性好，无交叉反应，且稳定性好；其次，本发明所述抗体组合物以及衍生试剂盒优选采用本发明所述抗体稳定剂进行稀释，与市售的其他抗体稳定剂相比，本发明所述抗体稳定剂的效果更佳，能够进一步提高本发明所述抗体组合物和试剂盒的稳定性。

综上所述，本发明所述抗体、抗体组合物和试剂盒对于PD-L1的检测以及衍生试剂盒的推广及应用具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例3所述试剂盒对B-CPAP细胞的免疫组化染色结果；

图2为实施例3所述试剂盒对MCF-7细胞的免疫组化染色结果；

图3为阴性试剂对B-CPAP细胞的免疫组化染色结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

实施例1 PD-L1单克隆抗体的制备

1.免疫动物

购买人PD-L1重组蛋白作为免疫原，与弗氏完全佐剂混合，免疫6周龄雌性Balb/c小鼠(免疫原用量为100μg/小鼠)，免疫方式为皮下多点免疫；两周之后，将免疫原与不完全弗氏佐剂混合，对所述小鼠进行加强免疫(免疫原用量为50μg/小鼠)，免疫方式为皮下多点免疫；每隔两周以同样的方法进行加强免疫，共加强免疫3次。最后一次加强免疫后的第7天，摘除小鼠眼球，进行小鼠眼眶静脉丛采血并离心分离血清，ELISA检测血清的抗体效价。若P/N≥2.1(P指免疫血清样品OD450值减去空白对照OD450值，N指阴性对照OD450减去空白对照OD450值)，则判断为阳性。

2.制备杂交瘤细胞和单克隆抗体

从阳性血清中挑选抗体效价高的小鼠，在无菌状态下取小鼠的脾脏，制成脾细胞悬液，取对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0，与脾细胞融合，将融合后的细胞悬液分装至96孔细胞培养板，置于HAT选择培养基中进行培养。用ELISA方法进行多轮反复筛选，并进行单克隆化培养，最终筛选获得5株阳性细胞株1A4，2D7，2F1，5E2和6C4，采用小鼠体内诱生法分别制备腹水型单克隆抗体1A4，2D7，2F1，5E2和6C4，通过Protein G亲和层析纯化所述抗体，备用。

3.鉴定单克隆抗体的亚型、亲和常数和特异性

采用试纸快速测定法(Argen公司)鉴定单克隆抗体1A4，2D7，2F1，5E2和6C4的Ig亚型。采用非竞争酶联免疫实验测定前述单克隆抗体的亲和常数K_a，具体方法参见参考文献1。采用ELISA测定前述单克隆抗体在PD-L1和PD-L2中的交叉反应率，具体检测方法参见参考文献2。具体检测结果参见表1。

表1

单抗	亚型	Ka(L/mol)	与PD-L2的交叉反应率
				1A4	IgG1	2.75×10<sup>8</sup>	15％
2D7	IgG2b	1.36×10<sup>9</sup>	8％
				2F1	IgG2a	2.11×10<sup>7</sup>	21％
5E2	IgG1	1.67×10<sup>10</sup>	3％
				6C4	IgG1	1.25×10<sup>8</sup>	13％

实施例2测定单克隆抗体5E2的CDR区氨基酸序列

根据表1所述检测结果，最终确定单克隆抗体5E2为对PD-L1的亲和力最强、特异性最高的抗体，将单克隆抗体5E2送至商业测序平台进行测序，获得其CDR区氨基酸序列。具体结果如表2所示。

表2

	氨基酸序列	SEQ ID NO：
			CDR-L1	QASSWTYKM	1
CDR-L2	TGGDYKTR	2
			CDR-L3	GLWIIAYMD	3
CDR-H1	VIMCANNYKK	4
			CDR-H2	QQPLTKAISQ	5
CDR-H3	TAGASQRGITKS	6

实施例3 PD-L1免疫组化试剂盒的制备

本实施例提供一种PD-L1免疫组化试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：PD-L1抗体试剂：单克隆抗体5E2，已由抗体稳定剂稀释至0.1μg/ml，其中所述抗体稀释剂的配方如下所示：100mM HEPES、葡萄糖5g/L、海藻糖3g/L和甘氨酸5g/L；内源性过氧化物酶阻断剂：3％(v/v)的H₂O₂溶液；HRP-羊抗小鼠IgG：购买于迈新生物技术开发有限公司，Kit-0014；封闭液：磷酸盐缓冲液PBS作为溶剂配制的5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)溶液；DAB显色液，购买于迈新生物技术开发有限公司。

实施例4～7其他PD-L1免疫组化试剂盒的制备

实施例4～7参照实施例3制备免疫组化试剂盒，区别仅在于，所述单克隆抗体5E2的浓度分别为0.5、0.2、0.08和0.05μg/ml。

实施例8 PD-L1免疫组化试剂盒的应用

本实施例提供实施例3所述免疫组化试剂盒在细胞爬片染色中的具体应用：

1、细胞爬片的制备

在含0.5％CO₂的37℃孵育箱内用含10％胎牛血清的1640培养基培养B-CPAP细胞(PD-L1阳性)和MCF-7细胞(PD-L1阴性)；取对数生长期细胞用0.25％胰蛋白酶消化，将其转移至铺有灭菌玻片的六孔板中，所述玻片在使用前预先涂抹多聚赖氨酸；培养48h后，吸尽培养基，滴加4％多聚甲醛固定20min，PBS洗涤4～5次后，于4℃保存。

2.细胞免疫组化

(1)将0.1％TritonX-100工作液滴加至固定后的玻片上，4℃孵育20min，之后，使用PBS洗涤4～5次；

(2)将内源性过氧化物酶阻断剂滴加至玻片上，4℃孵育10min以阻断内源性过氧化物酶干扰，之后，使用PBS洗涤3～4次；

(3)加入封闭液封闭20min，使用PBS洗涤3～4次；

(4)滴加PD-L1抗体试剂，37℃下孵育1h，PBS洗涤3～4次；

(5)滴加HRP-羊抗小鼠IgG，37℃孵育1h，PBS洗涤3～4次；

(6)滴加DAB显色液，室温下避光反应5min，蒸馏水洗涤终止反应，室温下干燥后用中性树胶封片，显微镜下观察染色情况。

3.染色结果

具体染色结果见图1～2。其中，图1为B-CPAP的染色结果(三个重复，分别为图1A、图1B和图1C)，PD-L1着色为棕褐色部分，染色效果明显；图2为MCF-7的染色结果(三个重复，分别为图2A、图2B和图2C)，细胞未被着色，显无色。

本实施例还使用阴性试剂对B-CPAP细胞进行免疫染色，具体染色方法如前述试剂盒的使用方法，区别仅在于，前述试剂盒在使用过程中将PD-L1抗体滴加至细胞爬片，而阴性试剂是将不含PD-L1抗体的抗体稳定剂滴加至细胞爬片。具体染色结果如图3所示(三个重复，分别为图3A、图3B和图3C)。

根据图1～3染色结果可知，本发明实施例3所述试剂盒在进行细胞免疫染色时，信噪比强，非特异性染色弱，具有灵敏度高和特异性强的优点。

实施例9抗体浓度对免疫组化检测效果的影响

本发明实施例3～7所述试剂盒分别对B-CPAP细胞(PD-L1阳性)和MCF-7细胞(PD-L1阴性)进行免疫组化检测，对比染色效果，并进行半定量分析以评价抗体浓度对免疫组化检测效果的影响。具体检测方法参照实施例8，具体半定量分析结果如表3所示，其中，将染色标记免疫特征分为三级，即，弱(1+)、中(2+)和强(3+)。根据表3所示结果可知，本发明所述单克隆抗体5E2在0.5、0.2、0.1、0.08和0.05μg/ml的浓度下均对B-CPAP细胞表现出良好的检出效果，显示为强阳性，其中，以0.1～0.5μg/ml单抗的检测效果最佳，同时，均对阴性对照MCF-7细胞无假阳性结果的检出，表明本发明所述单克隆抗体具有灵敏度高、特异性好的优点。

表3

实施例10抗体稳定剂对免疫组化检测效果的影响

对比试剂盒：参照实施例3制备试剂盒，区别仅在于，使用市售稳定剂Sigma-55514稀释抗体。

采用加速稳定性试验测试本发明稳定剂对免疫组化检测效果的影响。加速稳定性试验是在超常的条件下进行的，通过加速产品的化学或物理变化，探讨产品的稳定性的试验。本发明实施例3所述试剂盒和对比试剂盒在高温(40℃)下保存0天、5天、10天和15天后，分别对B-CPAP细胞(PD-L1阳性)和MCF-7细胞(PD-L1阴性)进行免疫组化检测，对比染色效果，并对染色结果进行半定量分析，以评价抗体的稳定性。具体检测方法参照实施例8，具体半定量分析结果如表4所示，其中，将染色标记免疫特征分为三级，即，弱(1+)、中(2+)和强(3+)。

根据表4所示实验结果可知，本发明所述试剂盒和对比试剂盒在高温(40℃)下保存10～15天后，仍对B-CPAP细胞具有较好检出效果，表明本发明所述试剂盒与对比试剂盒使用的单克隆抗体5E2本身即具有良好的稳定性。同时，通过比较可知，本发明所述试剂盒稳定性明显优于对比试剂盒，表明与市售稳定剂Sigma-55514相比，本发明所述稳定剂的效果更好。

表4

实施例11 PD-L1免疫组化试剂盒实时稳定性评价

实施例3所述试剂盒、对比试剂盒、市售试剂盒和衍生试剂盒在4℃下保存15天、30天、90天、180天、360天、540天后，分别对B-CPAP细胞(PD-L1阳性)和MCF-7细胞(PD-L1阴性)进行免疫组化检测，对比染色效果，并对染色结果进行半定量分析，以评价抗体的稳定性。具体检测方法参照实施例8。

其中市售试剂盒中使用的抗体为：鼠抗人PD-L1单克隆抗体(Thermo Fisher:14-5983-82)，抗体稀释剂为Sigma-55514，所述单克隆抗体的原始浓度为0.5mg/mL，其工作浓度为0.5μg/ml。衍生试剂盒：同前述市售试剂盒，区别仅在于使用本发明实施例3所述抗体稀释剂稀前述单克隆抗体至工作浓度。

具体半定量分析结果如表5所示。针对同样的样本，实施例3所述试剂盒在4℃下保存一年半(即540天)后，仍然对B-CPAP细胞具有良好的检出效果，表明本发明所述试剂盒无论是在短期还是较长时间内，其对阳性对照B-CPAP细胞的检出效果均显著优于市售试剂盒，表明与现有市售试剂盒相比，本发明所述试剂盒的灵敏度和稳定性更好。同时，通过实施例3与对比试剂盒的比较，以及实施例3与衍生试剂盒的比较可知，本发明所示试剂盒所示的优良稳定性是由本发明所述5E2单克隆抗体与本发明所述抗体稳定剂共同作用而产生的。

表5

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

参考文献1：Raghava GPS,Agrewala JN.Method for determining the affinityof monoclonal antibody using non-competitive ELISA：a computer program,JImmunoassay Immunochem,1994,15(2):115-128。

参考文献2：《感染与免疫学实验教程》，李立伟主编，2015年1月出版，浙江大学出版社，第237页。

SEQUENCE LISTING

<110> 益善生物技术股份有限公司

<120> PD-L1抗体、组合物及试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Gln Ala Ser Ser Trp Thr Tyr Lys Met

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Thr Gly Gly Asp Tyr Lys Thr Arg

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Gly Leu Trp Ile Ile Ala Tyr Met Asp

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Val Ile Met Cys Ala Asn Asn Tyr Lys Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Gln Gln Pro Leu Thr Lys Ala Ile Ser Gln

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Thr Ala Gly Ala Ser Gln Arg Gly Ile Thr Lys Ser

1 5 10

Claims

1.PD-L1抗体，其特征在于，所述抗体包含轻链CDR区和重链CDR区，所述轻链CDR区由CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3组成，所述重链CDR区由CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3组成；

2.组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述PD-L1抗体。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括抗体稳定剂。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述PD-L1抗体在所述组合物中的浓度为0.05～0.5μg/mL，例如，0.05μg/mL、0.08μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL或0.5μg/mL。

5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述抗体稳定剂包括糖和氨基酸中的一种或多种；优选地，所述糖选自葡萄糖、果糖、蔗糖、鼠李糖、岩藻糖或海藻糖中的一种或多种；所述氨基酸选自半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸或谷氨酸钠中的一种或多种；优选地，所述抗体稳定剂包括HEPES、葡萄糖、海藻糖和甘氨酸；更优选地，所述抗体稳定剂包括50～150mM HEPES、3～7g/L葡萄糖、1～5g/L海藻糖和3～7g/L甘氨酸；最优选地，所述抗体稳定剂包括100mM HEPES、5g/L葡萄糖、3g/L海藻糖和5g/L甘氨酸。

6.PD-L1检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述抗体或权利要求2～5任一项所述组合物。

7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括其他辅助检测试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述其他辅助检测试剂包括抗所述PD-L1抗体的二抗、封闭液和内源性过氧化物酶阻断剂中的一种或多种，其中所述二抗标记有显示剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述显示剂选自荧光标记、酶、金属离子或同位素。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述显示剂为辣根过氧化物酶，所述试剂盒还包括显色底物DAB。