CN109374607A - 一种茶饮料中游离氨基酸总量的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种茶饮料中游离氨基酸总量的测定方法。所述测定方法包括步骤：(一)、试剂的配制，包括L‑谷氨酸标准溶液的配制、2％茚三酮溶液配制、pH8.0缓冲液配置，(二)、氨基酸标准曲线的制作，(三)、样品测定；所述步骤(二)中氨基酸标准曲线的制作至少包括：(1)、在标准曲线制作时，根据氨基酸含量的高低分区段，进行不同含量区间的标准曲线制作，(2)、在标准曲线制作时增加曲线上的浓度点，浓度点增加到12～20个。该测定方法在标准曲线制作时增加曲线上的浓度点并分区段，分区段优选方案为分别制作低含量区间标准曲线与高含量区间标准曲线，使得游离氨基酸总量测定结果准确。

Description

一种茶饮料中游离氨基酸总量的测定方法
技术领域
本发明涉及茶饮料中的氨基酸检测技术，具体涉及一种制作标准曲线时增加浓度点和分区段、测量结果准确的茶饮料中游离氨基酸总量的测定方法。
背景技术
游离氨基酸是茶饮料中的一类重要的品质成分，其含量的高低直接影响到茶饮料的滋味——鲜爽度，因此，准确测定出茶饮料中的游离氨基酸总量尤为重要。但是，不同种类的茶饮料中游离氨基酸含量的高低不一样，因此有必要对其检测方法进行研究。
目前，游离氨基酸总量的测定主要采用GB/T 8314-2013《茶游离氨基酸总量测定》，对于茶饮料中的游离氨基酸总量的测定并没有标准方法，并且在实际操作中我们发现了一些问题：一是标准曲线制作时，国家标准中仅选用了0.00mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL六个点，而从0.00mg/mL到0.20mg/mL跨度太大，并且由此制作出的标准曲形的线性关系并不理想，这样就很难准确测定茶饮料中的游离氨基酸总量，尤其当含量较低时，更加难以获得准确的结果；二是，本标准中沸水浴前不需加水，对操作要求较高，稍有不慎就会导致浓度点的数据相差甚远。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种茶饮料中游离氨基酸总量的测定方法，该测定方法在标准曲线制作时增加曲线上的浓度点并分区段，分区段优选方案为分别制作低含量区间标准曲线与高含量区间标准曲线，使得游离氨基酸总量测定结果准确。
为了解决上述现有技术问题,本发明的技术方案是:
本发明一种茶饮料中游离氨基酸总量的测定方法，所述测定方法包括步骤：(一)、试剂的配制，包括L-谷氨酸标准溶液的配制、2％茚三酮溶液配制、pH8.0缓冲液配置；
(二)、氨基酸标准曲线的制作；
(三)、样品测定。
作为改进，所述步骤(二)中氨基酸标准曲线的制作至少包括：
(1)、在标准曲线制作时，根据氨基酸含量的高低分区段，进行不同含量区间的标准曲线制作；
(2)、在标准曲线制作时增加曲线上的浓度点，由GB/T 8314-2013《茶游离氨基酸总量测定》中所公开的测定方法中的6个浓度点增加到12～20个浓度点。
优选地，所述步骤(二)中氨基酸标准曲线的制作至少包括：
(1)、在标准曲线制作时，根据氨基酸含量的高低分别制作低含量区间标准曲线与高含量区间标准曲线，所述低含量区间为0.06～0.20mg/mL，所述高含量区间为0.20～0.6mg/mL；
(2)、在标准曲线制作时增加曲线上的浓度点到12个，低含量区间标准曲线共8个浓度点，高含量区间标准曲线共5个浓度点，低含量区间标准曲线上的最后一个浓度点与高含量区间标准曲线上的第一个浓度点相同。
作为改进，所述步骤(二)还包括：配置谷氨酸标准液过程中，加入不同浓度的谷氨酸母液或谷氨酸标准液到容量瓶后，应加pH8.0缓冲液将容量瓶边壁的谷氨酸母液或谷氨酸标准液全部淋洗下去，并摇匀；加完茚三酮显色剂后应摇匀；沸水浴时保证水处于沸腾状态，时间控制在15分钟，沸水浴后立即冷却；定容后静置15分钟后才去比色测定吸光度。
作为改进，所述步骤(三)还包括：配置不同浓度茶饮料过程中，加入不同浓度的茶饮料到容量瓶后，应加pH8.0缓冲液将容量瓶边壁的茶饮料全部淋洗下去，并摇匀；加完茚三酮显色剂后应摇匀；沸水浴时保证水处于沸腾状态，时间控制在15分钟，沸水浴后立即冷却；定容后静置15分钟后才去比色测定吸光度。
本发明一种茶饮料中游离氨基酸总量的测定方法,其有益效果有：
1、采用分区段法制作标准曲线，改善了标准曲线的线性关系，提高了样品检测的重复性及准确度，使样品的加标回收率结果更为满意；
2、改进后的方法扩大了测定范围，提高了检测的准确性，解决了不同氨基酸含量的检测需求。
附图说明
图1，为实施例步骤(二)氨基酸标准曲线的制作中按GB/T8314-2013中的规定绘制的标准曲线；
图2，为实施例步骤(二)氨基酸标准曲线的制作中按分区段方法绘制的低含量区间标准曲线；
图3，为实施例步骤(二)氨基酸标准曲线的制作中按分区段方法绘制的高含量区间标准曲线；
图4，为实施例步骤(三)样品测定中通过按GB/T 8314-2013方法所得曲线和通过分区段方法所得曲线分别计算的茶饮料中氨基酸含量的比较图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例
材料与仪器准备：
L-谷氨酸标准品及茚三酮标准品，其余试剂应为分析纯(AR)，水为蒸馏水；茶饮料：市售红茶、绿茶及乌龙茶饮料。
主要仪器：紫外分光光度计(日本Shimadzu公司，UV-2550)；精密电子天平(瑞士Startorius公司)；恒温水浴锅(DSY-2-8，北京国华医疗器械厂)；超纯水制备仪(美国Millipore公司)；试管及其他玻璃仪器均为国产。
本实施例一种茶饮料中游离氨基酸总量的测定方法包括：
(一)、试剂的配制
L-谷氨酸标准溶液的配制：准确称取250mg L-谷氨酸(纯度不低于99％)用蒸馏水溶于25mL容量瓶中并定容，摇匀后作为母液(10mg/mL)；
2％茚三酮溶液配制：称取水合茚三酮2g，加50mL水溶解混匀后，加入80mg氯化亚锡(SnCl2·2H2O)，溶解并摇匀后放在暗处，静置过夜，过滤后用蒸馏水定容至100mL，避光保存；
pH8.0缓冲液：按GB/T 8314-2013中6.2的规定配制。
(二)、氨基酸标准曲线的制作
分别吸取0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL谷氨酸母液于一组50mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至50mL，得浓度为0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL、0.12mg/mL、0.14mg/mL、0.16mg/mL、0.18mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的谷氨酸标准液。分别取上述不同浓度的谷氨酸标准液1mL于一组25mL容量瓶中，先加入0.5mL pH8.0缓冲液并摇匀，再加入0.5mL2％茚三酮溶液，摇匀，于沸水浴中15min，迅速用冷水冷却后用蒸馏水定容至25mL，摇匀后静置15min。用0.5cm的比色皿于570nm处测定其吸光度(A)；将测得的吸光度与对应的谷氨酸浓度绘制标准曲线，按GB/T 8314-2013中的规定绘制一个标准曲线，从0.00mg/mL至0.6mg/mL共6个点，如图1所示；如图2和图3采用本发明中的方法，分为两个区段制作标准曲线，即从0.06mg/mL至0.2mg/mL，从0.2mg/mL至0.6mg/mL。
由图1可知，当按GB/T 8314-2013中的方法制作标准曲线时，获得的回归方程相关系数R2＝0.9773，线性关系并不是很理想。因此，本研究将分段进行标准曲线的制作，从图2与图3可见，在0.06mg/mL至0.2mg/mL区段获得的回归方程相关系数R2＝0.9991，从0.2mg/mL至0.6mg/mL区段制得的标准曲线相关系数R2＝0.9992，通过分区段制作标准曲线改善了标准曲线的线性关系。
(三)、样品测定
准确吸取2mL茶饮料于25mL容量瓶中，先加入0.5mL pH8.0缓冲液并摇匀，再加入0.5mL 2％茚三酮溶液，摇匀，于沸水浴中15min，迅速用冷水冷却后用蒸馏水定容至25mL，摇匀后静置15min。用0.5cm的比色皿于570nm处，以试剂空白溶液作参比，测定其吸光度(A)。
本实施例中选用红茶、绿茶、乌龙茶3个不同茶类不同品牌的茶饮料9种，其中1、2、3为红茶饮料，4、5、6为绿茶饮料，7、8、9为乌龙茶饮料，每个样品取5份，按上述样品测定方法步骤分别对其游离氨基酸总量进行测定，然后用GB/T 8314-2013方法获得的标准曲线进行含量计算，结果见表1，同时用分区段法获得的标准曲线进行含量计算，结果见表2。
表1茶饮料样品中的游离氨基酸含量
注：含量计算采用GB/T 8314-2013方法获得的标准曲线方程式：y＝0.5452x+0.0502。
表2茶饮料样品中的游离氨基酸含量
注：含量计算采用分区段方法获得的标准曲线，根据标准曲线制作时两个区段不同浓度的吸光度，对样品中吸光度低于0.212的采用方程式：y＝0.7136x+0.0485计算；对于样品中吸光度高于0.212的采用方程式：y＝0.4747x+0.1042计算。
如图4，上方曲线为方法1采用GB/T 8314-2013方法，下方曲线为方法2采用分区段法，采用GB/T 8314-2013方法获得的标准曲线进行游离氨基酸含量计算时，其含量均偏低，而用分区段法的两个标准曲线分别来计算浓度高低不同的茶饮料中的游离氨基酸含量，其结果将会更加准确。从相对标准偏差(RSD)来看，其结果均低于1％，说明测定方法精密度较高，重复性好。
加标验证曲线方程
选用实施例中所用红茶、绿茶、乌龙茶饮料各1个，每个饮料取6份，每份100mL，其中3份饮料中添加10mg L-谷氨酸，另3份添加20mg L-谷氨酸，然后分别测定出游离氨基酸含量，含量分别采用两种曲线法的方程式进行计算，结果见表3。
表3两种曲线方程的加标回收率
注：表中平均测定值1、加标回收量1与回收率1用GB/T 8314-2013方法获得的标准曲线方程式进行计算；平均测定值2、加标回收量2与回收率2用分区段方法获得的标准曲线方程进行计算。
结果表明，采用GB/T 8314-2013法的曲线方程计算出的加标回收率为63.45％～87.88％，而用分区段法的曲线方程获得的加标回收率为98.93％～101.45％。说明用分区段法制作标准曲线更为可靠，检测结果更为准确。
磷酸缓冲液淋洗效果
国标茚三酮比色法测定茶叶中游离氨基酸总量时，简化了操作过程，如去掉了加样后加水，这样对操作要求较高，样品稍有贴壁就会导致显色不完全，从而使同一样品的吸光度相差甚远，检测结果重复性差。本实验对加样后加Ph8.0磷酸盐缓冲液时，是否用磷酸盐缓冲液将贴于壁上的样品淋洗下去，进行了淋洗与不淋洗效果比较，选用2.2试验中所用红茶1种、绿茶3种、乌龙茶饮料1个，每个饮料取10份，分为两组，每组5份，一组不用磷酸盐缓冲液淋洗贴壁的样品，一组用磷酸盐缓冲液淋洗贴壁的样品，分别测定出吸光度，并计算出游离氨基酸含量，结果如表4所示。从表4可知，不用磷酸盐缓冲液淋洗贴壁的样品，测得的吸光度差别大，由此计算出的游离氨基酸含量的相对标准偏差(RSD)达2.10～4.67。而采用磷酸盐缓冲液淋洗贴壁的样品，测得的吸光度较为接近，样品中的游离氨基酸含量的相对标准偏差(RSD)低于1％，仅为0.35％～0.56％。由此可见，用磷酸盐缓冲液将贴于壁上的样品淋洗下去，测定值的重复性更好，检测结果的准确度也得到了提高。
表4磷酸盐缓冲液淋洗效果比较
注：表中方法一不用磷酸盐缓冲液淋洗贴壁的样品，方法二用磷酸盐缓冲液淋洗贴壁的样品，A为吸光度，C为计算出的茶饮料中的游离氨基酸含量，RSD为相对标准偏差。
以上已将本发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作一般技术手段的增减或替换，皆应仍属本发明涵盖范围内。

Claims (4)

1.一种茶饮料中游离氨基酸总量的测定方法，所述测定方法包括步骤：(一)、试剂的配制，包括L-谷氨酸标准溶液的配制、2％茚三酮溶液配制、pH8.0缓冲液配置，(二)、氨基酸标准曲线的制作，(三)、样品测定；其特征在于，所述步骤(二)中氨基酸标准曲线的制作至少包括：(1)、在标准曲线制作时，根据氨基酸含量的高低分区段，进行不同含量区间的标准曲线制作；(2)、在标准曲线制作时增加曲线上的浓度点，由GB/T 8314-2013《茶游离氨基酸总量测定》中所公开的测定方法中的6个浓度点增加到12～20个浓度点。
2.根据权利要求1所述的一种茶饮料中游离氨基酸总量的测定方法，其特征在于，所述步骤(二)中氨基酸标准曲线的制作至少包括：
(1)、在标准曲线制作时，根据氨基酸含量的高低分别制作低含量区间标准曲线与高含量区间标准曲线，所述低含量区间为0.06～0.20mg/mL，所述高含量区间为0.20～0.6mg/mL；
(2)、在标准曲线制作时增加曲线上的浓度点到12个，低含量区间标准曲线共8个浓度点，高含量区间标准曲线共5个浓度点，低含量区间标准曲线上的最后一个浓度点与高含量区间标准曲线上的第一个浓度点相同。
3.根据权利要求1所述的一种茶饮料中游离氨基酸总量的测定方法，其特征在于，所述步骤(二)还包括：配置谷氨酸标准液过程中，加入不同浓度的谷氨酸母液或谷氨酸标准液到容量瓶后，应加pH8.0缓冲液将容量瓶边壁的谷氨酸母液或谷氨酸标准液全部淋洗下去，并摇匀；加完茚三酮显色剂后应摇匀；沸水浴时保证水处于沸腾状态，时间控制在15分钟，沸水浴后立即冷却；定容后静置15分钟后才去比色测定吸光度。
4.根据权利要求1所述的一种茶饮料中游离氨基酸总量的测定方法，其特征在于，所述步骤(三)还包括：配置不同浓度茶饮料过程中，加入不同浓度的茶饮料到容量瓶后，应加pH8.0缓冲液将容量瓶边壁的茶饮料全部淋洗下去，并摇匀；加完茚三酮显色剂后应摇匀；沸水浴时保证水处于沸腾状态，时间控制在15分钟，沸水浴后立即冷却；定容后静置15分钟后才去比色测定吸光度。
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