CN109369529A - 以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法、由其制备的高纯度木兰花碱及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法、由其制备的高纯度木兰花碱及应用，包括母液的制备、萃取和柱层析。与现有技术相比，本发明提供的以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法、由其制备的高纯度木兰花碱及应用，工艺流程简单易行，提取效率高，以提取黄连总生物碱后的母液为原料，属于废物综合利用，降低了产品成本，采用连续两次硅胶柱色谱纯化，极大提高木兰花碱的分离效率，制备得到的木兰花碱纯度可达到90％以上，应用前景广；并且发现木兰花碱对人角质形成细胞HaCaT凋亡和足癣致病真菌的抑制活性，木兰花碱在浓度大于500ppm呈现出抑制HaCaT细胞凋亡的趋势，抑制红色毛癣菌和须癣毛癣菌的MIC均为62.5μg/mL，在湿疹和脚气治疗上具有应用前景。

Description

以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法、由其制 备的高纯度木兰花碱及应用

技术领域

本发明涉及中药提取技术领域，特别涉及一种以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法、由其制备的高纯度木兰花碱及应用。

背景技术

黄连是著名的常用中药，具有清热燥湿、泻火解毒之功效，在中药复方中使用频繁。现代药学研究表明，黄连具有降糖降脂、抗癌、抗血小板聚集等生理活性。黄连药材中生物碱的含量丰富，是其主要活性成分，其中主要是小檗碱型异喹啉类生物碱，如小檗碱、巴马汀、药根碱、表小檗碱等。

黄连当前主要多集中于利用其活性成分黄连总生物碱。但移除黄连总生物碱后剩余的黄连提取母液少有被利用。经分析在母液中还含有一定量的生物碱，可进一步开发利用，避免资源浪费和废液处理造成的环境压力。黄连中含量在10.0mg/g以上的是小檗碱、非洲防己碱、黄连碱、表小檗碱，另含量在2.0mg/g以上还有巴马汀、药根碱、木兰花碱。黄连中单体化合物的分离工艺主要是针对含量大的生物碱。申请号为201110053453.7的专利公开了利用聚酰胺树脂从黄连中分离得到小檗碱、巴马汀、黄连碱、药根碱、非洲防己碱、Groenlandcine和木兰花碱7个生物碱的工艺，但木兰花碱的纯度只能达到80％左右。木兰花碱在黄连药材中的含量相对较高，但针对黄连中木兰花碱的提取分离工艺报道较少，从黄连提取母液中分离高纯度的木兰花碱还未见报道。由于市场上高纯度木兰花碱价格较为昂贵，严重限制了其应用研究，导致木兰花碱的应用研究少有报道。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明提供一种以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法、由其制备的高纯度木兰花碱及应用，以解决现有的黄连中木兰花碱的提取分离工艺，分离得到的木兰花碱纯度不高，并且分离效率低而造成部分资源浪费、木兰花碱产率低等问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法，关键在于包括以下步骤：

步骤一、母液的制备：将黄连粉碎后，加入稀酸溶液进行提取，然后将提取液依次进行浓缩，静置，过滤，得到母液；

步骤二、萃取：将母液用溶剂组按从小到大的极性顺序进行萃取，每种溶剂萃取多次，然后将中等极性溶剂萃取得到的萃取液合并后浓缩，得到粗浓缩物；

步骤三、柱层析：将粗浓缩物和硅胶拌样后装柱，用双组份洗脱液进行梯度洗脱，用薄层层析法检验各流份，合并含有木兰花碱组分的流份后进行浓缩，得到精浓缩物；将精浓缩物和硅胶拌样后装柱，用双组份洗脱液进行梯度洗脱，用薄层层析法检验各流份，合并含有木兰花碱组分的流份后进行浓缩，得到高纯度木兰花碱；

所述双组份洗脱液为溶剂R-甲醇的混合溶剂，其中溶剂R为二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯。

优选的，所述步骤三中所述双组份洗脱液为体积比为(1-50)：1溶剂R和甲醇混合溶剂。

优选的，步骤二中的溶剂组包含石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯中的两种或两种以上溶剂。

优选的，步骤二中母液与每种溶剂的体积比均为1：(0.5-1.5)，每种溶剂萃取次数为3-6次。

优选的，步骤三中粗浓缩物和硅胶的质量比为1:(3-10)。

优选的，步骤三中精浓缩物和硅胶的质量比为1:(5-15)。

优选的，步骤三中薄层层析法检验流份的条件为：展开剂为体积比为(2：1)的二氯甲烷和甲醇，采用紫外灯下检测或碘化铋钾显色。

一种高纯度木兰花碱，关键在于：所述高纯度木兰花碱由以上任一项所述的方法制备而成。

一种高纯度木兰花碱的应用，关键在于：用于抑制人角质形成细胞HaCaT凋亡和足癣致病真菌的活性。

有益效果：与现有技术相比，本发明提供了以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法、由其制备的高纯度木兰花碱及应用，本工艺技术以提取黄连总生物碱后的母液为原料，属于废物综合利用，降低了产品成本。采用连续两次硅胶柱色谱纯化，极大提高木兰花碱的分离效率，制备得到的木兰花碱纯度可达到90％以上，工艺流程简单易行，提取效率高，工艺稳定，具有广泛的应用前景，并且研究发现木兰花碱对人角质形成细胞HaCaT凋亡和足癣致病真菌(红色毛癣菌和须癣毛癣菌)的抑制活性，木兰花碱在浓度大于500ppm呈现出抑制HaCaT细胞凋亡的趋势，抑制红色毛癣菌和须癣毛癣菌的MIC均为62.5μg/mL，体现了其在湿疹和脚气治疗上的应用前景。

附图说明

图1为本发明产品抑制HaCaT细胞凋亡的实验结果图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作详细说明。

实施例1木兰花碱I的制备

步骤一、将黄连1kg干燥后粉碎，0.5％稀硫酸溶液提取，提取液用氧化钙中和，调节pH值5，浓缩至1.0g/mL。浓缩液加浓盐酸调节调节pH值3，再加入氯化钠，直至溶液中氯化钠的质量分数达到5％wt，放置24小时，离心过滤，移除黄连总生物碱，得到母液；

步骤二、依次用石油醚、二氯甲烷各萃取母液3次，每种溶剂与母液的体积比为1：0.5，将二氯甲烷萃取液合并后浓缩，得到粗浓缩物；

步骤三、柱层析：粗浓缩物硅胶拌样后，按质量比为1:3的粗浓缩物和硅胶装柱，用体积比为(1-10):1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，合并含有木兰花碱组分的流份后进行浓缩，得到精浓缩物。精浓缩物硅胶拌样后，再将质量比为1:5的精浓缩物和硅胶装柱，用体积比为(20-1):1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，合并含有木兰花碱组分的流份后进行浓缩，得到高纯度木兰花碱；其中，用薄层层析检测流份，薄层层析法检测流份的条件为：展开剂为体积比为2：1的二氯甲烷和甲醇，采用紫外灯下检测或碘化铋钾显色。

实施例2木兰花碱II的制备

步骤一、将黄连1kg干燥后粉碎，1％稀硫酸溶液提取，提取液用氧化钙中和，调节pH值7，浓缩至1.25g/mL，浓缩液加浓盐酸调节调节pH值5，再加入氯化钠，直至溶液中氯化钠的质量分数达到10％wt，放置48小时，离心过滤，移除黄连总生物碱，得到母液；

步骤二、依次用石油醚、三氯甲烷各萃取母液3次，每种溶剂与母液的体积比为1：1，将三氯甲烷萃取液合并后浓缩，得到粗浓缩物；

步骤三、柱层析：粗浓缩物硅胶拌样后，按质量比为1:5的粗浓缩物和硅胶装柱，用体积比为(15-30):1的三氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，合并含有木兰花碱组分的流份后进行浓缩，得到精浓缩物。精浓缩物硅胶拌样后，再将质量比为1:10的精浓缩物和硅胶装柱，用体积比为(20-1):1的三氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，合并含有木兰花碱组分的流份后进行浓缩，得到高纯度木兰花碱；其中，用薄层层析检测流份，薄层层析法检测流份的条件为：展开剂为体积比为2：1的二氯甲烷和甲醇，采用紫外灯下检测或碘化铋钾显色。

实施例3木兰花碱III的制备

步骤一、将黄连1kg干燥后粉碎，1.5％稀硫酸溶液提取，提取液用氧化钙中和，调节pH值8，浓缩至1.5g/mL，浓缩液加浓盐酸调节调节pH值6，再加入氯化钠，直至溶液中氯化钠的质量分数达到20％wt，放置72小时，离心过滤，移除黄连总生物碱，得到母液；

步骤二、依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取母液3次，每种溶剂与母液的体积比为1：1，将乙酸乙酯萃取液合并后浓缩，得到粗浓缩物；

步骤三、柱层析：粗浓缩物拌样后，按质量比为1:10的粗浓缩物和硅胶装柱，用体积比为(35-50):1的乙酸乙酯-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，合并含有木兰花碱组分的流份后进行浓缩，得到精浓缩物。精浓缩物硅胶拌样后，再将质量比为1:15的精浓缩物和硅胶装柱，用体积比为(20-1)：1的三氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，合并含有木兰花碱组分的流份后进行浓缩，得到高纯度木兰花碱；其中，用薄层层析检测流份，薄层层析法检测流份的条件为：展开剂为体积比为2：1的二氯甲烷和甲醇，采用紫外灯下检测或碘化铋钾显色。

对各实施例制备得到木兰花碱进行如下测试：

(1)纯度检测：

高效液相色谱检测化合物纯度的条件：Thermo scientific C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长：254nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL。流动相：乙腈(A)，磷酸二氢钾(B)；以乙腈-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液(10：90)为流动相，等度洗脱40min。测试结果如表1中所示。

表1各木兰花碱的纯度测试结果

	木兰花碱I	木兰花碱II	木兰花碱III
				化合物纯度，％	90.11	91.75	90.85

(2)抑制人角质形成细胞HaCaT凋亡试验

a.受试药物：前期通过MTT法筛选出IC₅₀的浓度，随后取木兰花碱II适量，加入DMEM培养基溶解并配成500ppm、1000ppm和1500ppm药物溶液备用。

b.对照药物：同上将黄连碱配成50ppm、100ppm和200ppm，小檗碱15ppm、25ppm和50ppm，表小檗碱25ppm、50ppm和100ppm，药根碱50ppm、100ppm和200ppm，非洲防己碱25ppm、50ppm和100ppm备用。

c.试验细胞：人角质形成细胞HaCaT细胞在其形状良好生长密度达80％以上时，用于给药试验。在6孔板中进行铺板时，通过在显微镜用血球计数板计数控制每孔细胞个数在30万左右。

d.细胞的培养：

1)复苏：迅速将标记有HaCaT细胞的冻存管取出放入37℃水浴中，不断摇动，使之快速通过0℃，在1-3min内细胞完全融化，用75％的酒精擦拭冻存管外部，移入超净工作台内，将细胞悬液吸取到培养瓶中，加入适量培养液，置37℃、5％CO₂培养箱，次日更换一次培养液，继续培养并观察细胞生长情况；

2)传代：角质形成细胞株HaCaT细胞在含10％胎牛血清的1640培养液中，37℃、5％CO₂条件下培养，1-2日更换培养液1次，待细胞单层铺满培养瓶后，旋紧瓶盖，移入超净工作台内，轻轻倒去培养瓶中的培养液，先用PBS液洗1-2次，再加入0.25％的胰蛋白酶所加量能盖住细胞即可，置培养箱内6-8min，显微镜下见胞质回缩、细胞间隙增大没有连成一片时，立即倒去胰蛋白酶，加含10％胎牛血清的1640培养液终止消化，用吸管反复吹打使其形成细胞悬液，以1：2或1：3的比例传代培养。

e.试验方法：根据文献检索，采用加入定量TNF-α(10ng/mL)和INF-γ(10ng/mL)刺激HaCaT细胞，来模拟湿疹患者角质形成细胞凋亡的模型。一般选用6孔板进行铺板，并通过计数控制细胞数目在30万左右，每孔加入2mL DMEM培养基，孵育24h。分别设置空白组、模型组、药物组。培养24h后，吸去培养基，加入2mL PBS洗2-3遍，开始上药，将前期配好的药物直接加入，控制每孔保持2mL的体积。药物组及模型组每孔分别加入4μL的TNF-α(10μg/mL)和INF-γ(10μg/mL)，轻轻拍打使其混合均匀。然后继续进行孵育24h。孵育24h后，吸去旧培养基，加入PBS反复洗2-3次，加入400μL胰酶进行消化，加入2mL培养基终止消化，反复吹打，离心2000rpm，5min，加入2mL PBS吹洗再离心，重复操作2次，最后加入500uL的BindingBuffer重悬细胞并转移至2mL的EP管中。每孔加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入10μLPropidium Iodide混匀，室温避光反应5-15min，并在1个小时内使用流式细胞仪进行检测。测试结果如图1中所示。

测试结果：从图1的数据可以看出，木兰花碱在浓度大于500ppm呈现出抑制HaCaT细胞凋亡的趋势，而其他生物碱对HaCaT细胞的影响基本呈现出促进凋亡的趋势，且总凋亡率均大于木兰花碱组。

(3)抑制足癣致病真菌试验

a.受试药物：取木兰花碱II适量，用无菌水配制成4mg/mL的药液备用。

b.对照药物：黄连碱、巴马汀、小檗碱、表小檗碱、黄连总碱、非洲防己碱、药根碱。阳性药物：复方黄柏祛癣搽剂。分别用无菌水配制成4mg/mL的药液备用。

c.试验菌株：红色毛癣菌(编号:ATCC 28188)、须癣毛癣菌(ATCC 9533)均购自上海生物网。

d.菌株的复苏及传代：按照所买菌种的菌种活化操作方法提示，在无菌操作台上，左手持所买装有菌冻干菌种的瓿管底部，将尖端放在酒精灯火焰上加热；右手拿灭菌试管吸取少量无菌水滴于加热处使之破裂；用灭菌镊子轻轻敲下安瓿管顶端；右手持无菌镊子取出小管内的脱脂棉，将小管的开口处再次放入酒精灯火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作；用1000mL移液枪吸取0.5mL的SDA液体培养基加入小管内；轻轻震荡小管，使冻干的真菌菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌体悬液移植在两支斜面培养基上，每支试管接种250μL，此为第一代菌。在28℃恒温培养箱中培养半月左右观察菌丝生长状况较好。刮取菌丝接种于液体培养基，此时为第二代菌。一般取第3代菌进行实验。

e.菌悬液的制备：皮肤癣菌需在沙氏琼脂培养基(SDA)平皿上28℃培养5～7d。用2.0～2.5mL无菌水反复冲击菌落，将菌悬液静置3～5min后取上层不含菌丝片段的菌悬液，将此菌悬液用无菌水稀释。红色毛癣菌菌悬液取200μL用酶标仪在630nm处测得OD值＝0.035；须癣毛癣菌菌悬液取200mL用酶标仪在630nm处测得OD值＝0.1。其对应的孢子浓度为(0.4～5)×106cfu/mL。

f.试验方法：于96孔板中加入SDA液体培养基之后，采用二倍稀释法进行加药稀释，即先在第一孔加入60μL药物，混匀后吸取60μL加入到第二孔，再混匀后吸取60μL加入到第三孔，依次到第七孔，混匀后吸取60μL弃去，最后再加入已制备好的菌悬液每孔60μL，保证每孔最后总体积120μL。药物从高到低浓度依次为：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/mL。

药物组加入：培养基+药液+菌悬液(各60μL)。

阳性药物对照组加入：培养基+复方黄柏祛癣擦剂+菌悬液(各60μL)。

生长对照组加入：培养基+菌悬液(各60μL)。

空白对照组加入：培养基+药液+无菌水(各60μL)。

每组设置3个副孔，将96孔板置于28℃恒温培养5～7d，每天观察，当阴性对照孔长出菌丝(红色毛癣菌菌丝呈红色，须癣毛癣菌菌丝呈白色)，观察各孔菌落并记录抑菌情况。红色毛癣菌测试结果如表2中所示，须癣毛癣菌测试结果如表3中所示。

表2木兰花碱对红色毛癣菌抑制试验结果

备注：“-”代表无菌生长；“+”代表有菌生长。

表3木兰花碱对须癣毛癣菌抑制试验结果

备注：“-”代表无菌生长；“+”代表有菌生长。

从表2和表3中可以看出，木兰花碱抑制红色毛癣菌和须癣毛癣菌的MIC均为62.5μg/mL，比其他黄连生物碱和阳性药物复方黄柏祛癣搽剂的抑菌效果都要好。

最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、母液的制备：将黄连粉碎后，加入稀酸溶液进行提取，然后将提取液依次进行浓缩，静置，过滤，得到母液；

步骤二、萃取：将母液用溶剂组按从小到大的极性顺序进行萃取，每种溶剂萃取多次，然后将中等极性溶剂萃取得到的萃取液合并后浓缩，得到粗浓缩物；

步骤三、柱层析：将粗浓缩物和硅胶拌样后装柱，用双组份洗脱液进行梯度洗脱，用薄层层析法检验各流份，合并含有木兰花碱组分的流份后进行浓缩，得到精浓缩物；将精浓缩物和硅胶拌样后装柱，用双组份洗脱液进行梯度洗脱，用薄层层析法检验各流份，合并含有木兰花碱组分的流份后进行浓缩，得到高纯度木兰花碱；

所述双组份洗脱液为溶剂R-甲醇的混合溶剂，其中溶剂R为二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯。

2.根据权利要求1所述的以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法，其特征在于：所述步骤三中所述双组份洗脱液为体积比为(1-50)：1溶剂R和甲醇混合溶剂。

3.根据权利要求1或2所述的以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法，其特征在于步骤一具体为：将黄连干燥后粉碎，加入质量分数为0.5～1.5％wt的稀硫酸溶液提取，得到的提取液用氧化钙调节pH值至5～8，然后将混合液浓缩为质量浓度为1.0～1.5g/mL的浓缩液，将浓缩液加入浓盐酸调节pH值至3～6，直至溶液中氯化钠的质量分数达到5～20％wt，放置24-72小时，离心过滤，母液备用。

4.根据权利要求3所述的以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法，其特征在于：步骤二中的溶剂组包含石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯中的两种或两种以上溶剂。

5.根据权利要求4所述的以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法，其特征在于：步骤二中母液与每种溶剂的体积比均为1：(0.5-1.5)，每种溶剂萃取次数为3-6次。

6.根据权利要求1、2或5任一项所述的以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法，其特征在于：步骤三中粗浓缩物和硅胶的质量比为1:(3-10)。

7.根据权利要求6所述的以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法，其特征在于：步骤三中精浓缩物和硅胶的质量比为1:(5-15)。

8.根据权利要求5或7所述的以黄连提取母液为原料制备高纯度木兰花碱的方法，其特征在于步骤三中薄层层析法检验流份的条件为：展开剂为体积比为(2：1)的二氯甲烷和甲醇，采用紫外灯下检测或碘化铋钾显色。

9.一种高纯度木兰花碱，其特征在于：所述高纯度木兰花碱由权利要求1-8任一项所述的方法制备而成。

10.根据权利要求9所述的高纯度木兰花碱的应用，其特征在于：用于抑制人角质形成细胞HaCaT凋亡和足癣致病真菌的活性。