CN109358195B - 一种中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶及其制备方法和应用 - Google Patents
一种中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109358195B CN109358195B CN201811312340.2A CN201811312340A CN109358195B CN 109358195 B CN109358195 B CN 109358195B CN 201811312340 A CN201811312340 A CN 201811312340A CN 109358195 B CN109358195 B CN 109358195B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- core
- gold
- platinum alloy
- nanocage
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 91
- 229910001260 Pt alloy Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 75
- JUWSSMXCCAMYGX-UHFFFAOYSA-N gold platinum Chemical compound [Pt].[Au] JUWSSMXCCAMYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 75
- 239000002091 nanocage Substances 0.000 title claims abstract description 69
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 title claims abstract description 51
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 61
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 25
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 12
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims abstract description 12
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 52
- 239000002073 nanorod Substances 0.000 claims description 20
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 239000011796 hollow space material Substances 0.000 claims description 4
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 claims description 2
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 claims description 2
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 15
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 abstract description 13
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 abstract description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005530 etching Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000011257 shell material Substances 0.000 description 58
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 11
- 229910021426 porous silicon Inorganic materials 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 7
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000031662 Noncommunicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- 240000008866 Ziziphus nummularia Species 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035040 seed growth Effects 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Powder Metallurgy (AREA)
Abstract
本发明提供了一种中空金铂合金纳米笼核‑多空二氧化硅壳纳米酶及其制备方法和应用，属于纳米材料领域。本发明通过氯铂酸钾刻蚀金核铂壳纳米结构得到中空金铂合金纳米笼；再利用硅酸四乙酯在其表面包被二氧化硅，最终得到了以圆棒状的中空金铂合金纳米笼为内核，内核外为二氧化硅外壳的纳米酶；内核的长度为80‑100nm，直径为20‑25nm；外壳具备3‑5nm的孔道。所述纳米酶带负电。通过正负电荷相吸作用可以结合抗原，形成纳米酶标抗原复合物，用于进行酶联免疫分析。本发明的纳米酶降低了天然酶标抗原复合物试剂成本，延伸了酶联免疫检测的工作环境，克服了天然酶易失活、易变性等缺点，可广泛应用于各种酶联免疫检测中。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种纳米酶，特别是一种金铂合金核二氧化硅壳纳米酶。
背景技术
酶联免疫法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是血清免疫分析中应用最广泛的一种，其基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。通过加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据反应体系的颜色变化进行定性或定量分析。酶联免疫法法检测病毒方便快捷，并且免疫球蛋白抗体测定程序统一化，操作时间短，费用低，敏感性好，作为一种临床筛查是非常有必要的，不但在传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫学诊断上得到了应用，也应用到了分子抗原和抗体的检测，已逐渐成为本世纪主流检测方法之一，但是酶联免疫法检测技术多依附于天然酶免疫标记物的活性，使用及储藏受到温度、pH等环境因素的限制。所以，近年来研究人员开始关注纳米颗粒的类过氧化物酶活性，将其定义为“纳米酶”，并开始将纳米酶作为天然酶（HRP）的替代物引入传统的酶联免疫检测，以期摆脱传统酶联免疫法检测对天然酶活性的依赖性，提高检测的稳定性和灵敏度。研究人员基于纳米材料的过氧化物酶样活性，利用四氧化三铁纳米颗粒[Gao L, Zhuang J, NieL, et al.. Nature Nanotechnology, 2007, 2(9):577.]、氧化石墨烯[Qu F, Li T,Yang M. Biosensors & Bioelectronics, 2011, 26(9):3927.]、铂基合金结构的纳米颗粒[Hu X, Saran A, Hou S, et al. Chinese Science Bulletin, 2014, 59(21):2588-2596.]等取代免疫测定中的辣根过氧化物酶，建立了相应的纳米酶免疫测定体系。然而，目前对纳米酶标抗原复合物取代天然酶标抗原复合物在ELISA中的检测尚缺乏深入研究和报导。同时纳米酶的催化往往发生在无机纳米材料的表面，如能构建中空纳米笼结构可以提供更多的催化位点，进而增加其催化效率，有效地降低纳米酶的使用量。同时由于纳米笼状结构的限域作用，使催化反应局域在微腔中，加快催化反应速度，缩短酶联免疫检测的时间。
发明内容
针对目前缺乏纳米酶标抗原复合物的问题以及现有纳米酶催化效率低的问题，本发明提供一种中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶，可用于标记标抗原复合物，在酶联免疫法检测中响应范围宽、灵敏度高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）将金核铂壳纳米棒溶液与十六烷基三甲基溴化铵溶液混合后加入四氯亚铂酸钾混合均匀成反应液，反应后获得中空金铂合金纳米笼；
（2）将中空金铂合金纳米笼溶液、十六烷基三甲基溴化铵溶液、NaOH溶液和硅酸四乙酯溶液混合均匀成混合液，反应后获得纳米酶。
所述金核铂壳纳米棒的长度为80-100nm，直径为20-25nm。
步骤（1）中，所述金核铂壳纳米棒与四氯亚铂酸钾的摩尔比为0.001:4000-20000。所述金核铂壳纳米棒溶液的浓度为0.05nM-0.5nM。所述十六烷基三甲基溴化铵在反应液中的浓度优选为0.03M-0.1M。
所述金核铂壳纳米棒可以采用现有技术中常规的金核铂壳材料的制备方法；如，金核铂壳纳米棒光学特性的研究（枣庄学院学报, 2016, 33(02): 25-31）中公开的制备金核铂壳纳米棒的方法。优选的，在金纳米棒溶液中通过还原剂还原四氯亚铂酸钾即得。还原剂可选择本领域常用还原剂，如抗坏血酸、硼氢化钠。优选的，金纳米棒的合成方法采用种子生长法；如，金纳米棒的表面改性及与H2O2的作用（高等学校化学学报, 2017, 38(04):517-521）中公开的制备金纳米棒的方法。
步骤（2）中，中空金铂合金纳米笼和硅酸四乙酯的摩尔比为0.0002-0.001:1。NaOH和硅酸四乙酯的摩尔比为1:6。所述中空金铂合金纳米笼的浓度为0.05nM-0.5nM。所述十六烷基三甲基溴化铵在混合液中的浓度优选为5-10mM。
作为优选，步骤（2）的混合液中还包括异丙醇；异丙醇与中空金铂合金纳米笼溶液体积比为10-5:1。
步骤（1）和步骤（2）中，还包括纯化步骤：将产物离心获得沉淀，水重新悬浮沉淀后再离心，获得沉淀即为纯化后产物。
上述制备方法获得的纳米酶，以圆棒状的中空金铂合金纳米笼为内核，内核外为二氧化硅外壳；所述内核的长度为80-100nm，直径为20-25nm，所述内核中空空间的长度为75-95nm，直径为17-22nm；所述外壳具备孔道，孔道直径为3-5nm。所述纳米酶的Zeta电位为-（18-25）mV。
上述中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶在酶联免疫法检测中的应用。所述应用中，中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶与抗原形成复合物，底物为过氧化物。
上述中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标抗原复合物的制备方法，包括以下步骤：将中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶液分散于抗原缓冲液中，37℃孵育后纯化获得纳米酶标抗原复合物。优选的，纯化步骤为离心弃上清。
所述纳米酶与抗原的重量比优选为1:100-1000。
所述抗原选自但不限于风疹病毒抗原、麻疹病毒抗原、水痘-带状疱疹病毒抗原或手足口病毒抗原。
所述中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶抗原复合物是通过正负电荷相吸作用结合抗原。
一种含有上述中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶或中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标抗原复合物的酶联免疫分析试剂盒。
优选的，所述酶联免疫分析试剂盒还包括显色底物与过氧化氢，如过氧化氢。
上述基于中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标抗原复合物的免疫分析方法的测定过程如下：将待测血清加入抗人免疫球蛋白抗体预包被的微孔板中孵育，再加入中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标抗原复合物孵育，从而在微孔板上捕获待测样品的病毒免疫球蛋白抗体，形成一抗-二抗-酶标抗原复合物，然后加入中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标抗原复合物的最适底物液，反应后加入终止剂，如硫酸，终止液终止反应，用酶标仪检测各个微孔的吸光度值，再根据吸光度值的强弱用以定量待测样品。
本发明通过对金核铂壳纳米棒、四氯亚铂酸钾和十六烷基三甲基溴化铵浓度与比例的调节，实现了对金核铂壳纳米棒的有效刻蚀，能够使金核铂壳纳米棒完全形成中空金铂合金纳米笼核。通过中空金铂合金纳米笼和硅酸四乙酯及NaOH的比例调节，有效的在中空金铂合金纳米笼外形成了二氧化硅壳，且外壳具有特殊的孔道结构。一方面形成的孔道结构可以保证反应物与中空金铂合金纳米笼活性位点的接触，另一方面孔道结构也可以增加标记抗原的负载量。
本发明具有以下有益效果：
本发明制备的中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标抗原复合物具有限域效应，成为一种微型酶催化反应器，在酶联免疫法检测中具有响应范围宽、灵敏度高等特点，检测限能够达到ng/mL的水平。本发明所提供的制备方法简单易操作、重复性高，所使用的纳米颗粒成本低廉、易于制备。本发明利用中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标抗原复合物，替代了原有天然酶标抗原复合物，不但降低了试剂成本，而且延伸了酶联免疫检测的工作环境，克服了天然酶易失活、易变性等缺点，与实心金铂合金纳米棒核-多空二氧化硅壳纳米酶相比，具有酶用量少、反应速度快等优点。能够广泛应用于各种酶联免疫检测工作中。
附图说明
图1是实施例1制备的中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶溶液标抗原复合物的结构示意图（A），及其参与的免疫分析反应过程示意图（B）；
图2是实施例1制备的金纳米棒（A）、中空金铂合金纳米笼（B）中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶（C和D）溶液的透描电镜照片；
图3是实施例2制备的中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶溶液纳米酶标风疹抗原复合物相应的Zeta电位数值，图中横坐标1、2、3、4、5分别代表的是复合风疹病毒抗原的量为0.001mg/mL，0.01mg/mL，0.1mg/mL，1mg/mL和10mg/mL；
图4是实施例2制备的中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶溶液标风疹抗原复合物溶液在不同温度下（A）和不同pH值的高离子强度缓冲溶液中（B）放置3 h后的类过氧化物酶的相对活性；
图5是实施例2制备的中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶溶液标风疹抗原复合物溶液免疫分析显色检测风疹病毒免疫球蛋白抗体标准工作曲线图；
图6是对比例1和2制备的金铂合金纳米材料溶液的透描电镜照片。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶的制备
（1）制备金晶种
取7.5 mL浓度为0.1 M十六烷基三甲基溴化铵水溶液，向其中加入100.4 μL浓度为24.7 mM的四氯金酸水溶液，混合均匀后将体积稀释到9.4 mL，在磁力搅拌的条件下加入0.6 mL浓度为0.01 M的硼氢化钠水溶液（使用前临时配制并置于冰水中），搅拌3 min后停止，静置2 h，得到含有金晶种的金晶种溶液，所述金晶种溶液中金的浓度为0.25 mM。
（2）制备金纳米棒
取100 mL浓度为0.1 M的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，向其中加入2.05 mL浓度为24.7 mM的四氯金酸水溶液，1 mL浓度为10 mM的硝酸银水溶液和2 mL 0.5 M的硫酸水溶液，混合均匀后，再加入800 μL浓度为0.1 M的抗坏血酸水溶液，得到的混合溶液由桔红色变为无色，然后加入240 μL步骤（1）制备的金晶种溶液；混合均匀后放入30 ℃恒温水浴中；溶液在20 min后开始出现颜色，经过16 h，最终变为枣红色，说明形成了金纳米棒溶液；通过透射电镜图表征所制备的金纳米棒，如图2A所示。从图2A可以看出，所制备的金纳米棒长约为80 nm，直径约为20 nm。
（3）金纳米棒溶液的纯化
先将步骤（2）中的金纳米棒溶液在30 ℃的恒温水浴中静置，然后于12000 rpm下离心10min两次，每次，去掉未反应的离子及多余的十六烷基三甲基溴化铵，得到纯化的金纳米棒溶液，再加入去离子水，控制纯化的金纳米棒溶液中金纳米棒的浓度为0.5 mM。
（4）制备中空金铂合金纳米笼
取1 mL上述离心后的纯化的金纳米棒溶液放入试管中，并先后向其中加入1 mL去离子水、40 μL 2 mM四氯亚铂酸钾水溶液和8 μL 0.1 M的抗坏血酸水溶液混合均匀；然后放入30 ℃的恒温水浴中，反应3 h后溶液由枣红色变成了暗灰色（表明金核铂壳纳米棒的形成），之后再向上述暗灰色的溶液中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液及四氯亚铂酸钾，并使溶液中的金核铂壳纳米棒浓度为0.05 nM，十六烷基三甲基溴化铵浓度为30 mM，四氯亚铂酸钾的浓度为0.2 mM，然后放入30 ℃的恒温水浴中反应3 h；然后再进行离心分离，沉淀即为中空金铂合金纳米笼。通过透射电镜图表征所制备的中空金铂合金纳米笼结构，如图2B所示。
（5）制备中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶
取10 mL中空金铂合金纳米笼溶液（0.5nM），并先后向其中加入75 μL 0.1 M十六烷基三甲基溴化铵水溶液、5 μL 2M氢氧化钠水溶液和30 μL 20 %的硅酸四乙酯水溶液、1mL异丙醇混合均匀，然后放入30 ℃的恒温水浴中搅拌反应0.5 h，然后再加入30 μL 20 %的硅酸四乙酯水溶液继续反应20 h，然后再进行离心分离，得到中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶溶液。通过透射电镜图表征所制备的中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶，如图2C和2D所示。从图2C和2D可以看出，中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶长约为130 nm，直径约为80 nm；二氧化硅壳层具备孔道，孔道直径约为3-5nm。
实施例2 纳米酶标风疹抗原复合物的制备
（1）制备中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标风疹抗原复合物
取50 μL中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳溶液（5nM），分散在450μL含50μL的10 mg/mL风疹病毒抗原的磷酸盐缓冲溶液(0.1M, pH 7)中。混合均匀后放入37 ℃恒温箱中，孵化96 h之后，于12000 rpm转速下离心5min去掉游离的风疹病毒抗原分子。倒掉上清液，将沉淀物分散在100μL 磷酸盐缓冲液(0.1M, pH 7)中备用。通过zeta电位表征所制备的中空金铂合金纳米笼，中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶和中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标风疹抗原复合物，如图3所示。结果显示原始制备的中空金铂合金纳米笼带正电；中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶带负电；与带正电荷的风疹病毒抗原形成复合物后，纳米酶的表面负电荷变小；进一步加大风疹病毒抗原的复合量，表面负电荷会持续减小，说明纳米酶表面风疹病毒抗原的存在，表明已成功制备中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标风疹抗原复合物。
（2）纳米酶标风疹抗原复合物溶液的耐受性
测定了中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标风疹抗原复合物溶液在不同温度下和在不同pH值的高离子强度缓冲溶液中放置3 h后的类过氧化物酶活性，如图4所示。图4A显示的是温度的影响，在pH=5浓度为0.1 M的磷酸缓冲溶液中，在30-80℃温度范围内中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标风疹抗原复合物一直保持良好的类过氧化物酶活度，这说明中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标风疹抗原复合物对温度变化有很高的稳定性。图4B显示的是pH的影响，当pH值从3-9变化过程中，中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标风疹抗原复合物的类过氧化物酶活度几乎不变，这表明中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶标风疹抗原复合物对外界环境酸碱度变化也有很高的稳定性。
实施例3 纳米酶标抗原复合物在酶联免疫分析中的应用
首先，在高亲和力的96孔酶标微孔板上每孔加入300 μL浓度为1 μg/mL的鼠抗人工免疫球蛋白抗体，包被缓冲液为0.1 M的磷酸盐缓冲液(pH=7)在4 ℃下孵育过夜，然后将上述的微孔板用磷酸盐-吐温缓冲液洗涤5次，再每孔加入300 μL封闭液(1.0 wt%牛白蛋白)置于37 ℃下封闭2 h后用磷酸盐-吐温缓冲液洗涤5次。然后，加入100 μL一系列的血清样品在37 ℃下孵育1 h，用磷酸盐-吐温缓冲液洗涤5次，再加入50μL纳米酶标抗原复合物孵育0.5 h，从而在微孔板上捕获待测样品的病毒免疫球蛋白抗体，形成一抗-二抗-酶标抗原复合物，后用磷酸盐-吐温缓冲液洗涤5次以去除未吸附的病毒免疫球蛋白抗体。
随后再加入100 μL 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物溶液(含0.5 mM的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，20 mM的过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液，pH 5)。反应10min后加入2 M硫酸终止反应，检测450 nm处的吸光度。整个实验设立了对比、阳性对比、阴性对比和空白对照。根据吸光度值和风疹病毒免疫球蛋白抗体浓度变化的关系绘制标准工作曲线，结果如图5所示，可以看出对待测风疹病毒免疫球蛋白抗体响应范围为1 ng/mL-105 ng/mL。
对比例1 金铂合金纳米材料的制备
（1）同实施例1中的步骤（1）；
（2）同实施例1中的步骤（2）；
（3）同实施例1中的步骤（3）；
（4）同实施例1中的步骤（4），不同在于十六烷基三甲基溴化铵的终浓度为25 mM，四氯亚铂酸钾的终浓度为0.05 mM。通过透射电镜图表征所制备的金铂合金纳米材料，如图6A所示。由图可知，制备的材料多数仍为棒状材料，不具备中空的纳米笼结构。
对比例2 金铂合金纳米材料的制备
（1）同实施例1中的步骤（1）；
（2）同实施例1中的步骤（2）；
（3）同实施例1中的步骤（3）；
（4）同实施例1中的步骤（4），不同在于十六烷基三甲基溴化铵的终浓度为150 mM，四氯亚铂酸钾的终浓度为1.5 mM。通过透射电镜图表征所制备的金铂合金纳米材料，如图6B所示。由图可知，金核铂壳纳米棒受刻蚀程度过大，形成了离散的不规则颗粒，制备的材料不具备中空的纳米笼结构。
Claims (7)
1.一种中空金铂合金纳米笼核-多孔二氧化硅壳纳米酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将金核铂壳纳米棒溶液与十六烷基三甲基溴化铵溶液混合后加入四氯亚铂酸钾混合均匀成反应液，反应后获得中空金铂合金纳米笼；
（2）将中空金铂合金纳米笼溶液、十六烷基三甲基溴化铵溶液、NaOH溶液和硅酸四乙酯溶液混合均匀成混合液，反应后获得纳米酶；
步骤（1）中，所述金核铂壳纳米棒与四氯亚铂酸钾的摩尔比为0.001:4000；
步骤（1）中，所述金核铂壳纳米棒的长度为80-100nm，直径为20-25nm；所述金核铂壳纳米棒溶液的终浓度为0.05nM；
步骤（1）中，所述十六烷基三甲基溴化铵在反应液中的终浓度为0.03M。
步骤（2）中，所述混合液还包含异丙醇。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，中空金铂合金纳米笼和硅酸四乙酯的摩尔比为0.0002-0.001:1；NaOH和硅酸四乙酯的摩尔比为1:6。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述中空金铂合金纳米笼的浓度0.5nM。
4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法获得的中空金铂合金纳米笼核-多孔二氧化硅壳纳米酶，其特征在于，以圆棒状的中空金铂合金纳米笼为内核，内核外包裹二氧化硅外壳；所述内核的长度为80-100nm，直径为20-25nm，所述内核中空空间的长度为75-95nm，直径为17-22nm；所述外壳具备孔道，孔道直径为3-5nm；其Zeta电位为-(18-25)mV。
5.一种如权利要求4所述的中空金铂合金纳米笼核-多孔二氧化硅壳纳米酶在酶联免疫法检测中的应用，其特征在于，中空金铂合金纳米笼核-多孔二氧化硅壳纳米酶与抗原形成复合物；底物为过氧化物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗原选自但不限于风疹病毒抗原、麻疹病毒抗原、水痘-带状疱疹病毒抗原或手足口病毒抗原；所述纳米酶与抗原的重量比为1:100-1000。
7.一种含有如权利要求4所述的中空金铂合金纳米笼核-多孔二氧化硅壳纳米酶的酶联免疫分析试剂盒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811312340.2A CN109358195B (zh) | 2018-11-06 | 2018-11-06 | 一种中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811312340.2A CN109358195B (zh) | 2018-11-06 | 2018-11-06 | 一种中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109358195A CN109358195A (zh) | 2019-02-19 |
| CN109358195B true CN109358195B (zh) | 2022-04-26 |
Family
ID=65344203
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811312340.2A Expired - Fee Related CN109358195B (zh) | 2018-11-06 | 2018-11-06 | 一种中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109358195B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110194457A (zh) * | 2019-05-20 | 2019-09-03 | 重庆科技学院 | 一种SiO2中空纳米棒的制备方法和尺寸调控方法 |
| CN110646607A (zh) * | 2019-07-12 | 2020-01-03 | 广东工业大学 | 一种介孔二氧化硅包裹的正电荷纳米金偶联抗体及其制备方法和应用 |
| CN110702898B (zh) * | 2019-11-05 | 2020-07-14 | 山东农业大学 | 一种纳米酶标记仿生免疫分析检测磺胺嘧啶的方法 |
| CN113319275B (zh) * | 2021-04-14 | 2022-08-12 | 深圳大学 | 一种Au@AgNRs纳米棒及其制备方法和应用 |
| CN114082938B (zh) * | 2022-01-11 | 2023-08-25 | 苏州艾美特企业管理有限公司 | 一种金属粒子及其制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104502614A (zh) * | 2015-01-26 | 2015-04-08 | 湖南科技大学 | 一种基于金纳米簇模拟酶试剂盒及其制备方法及应用 |
| CN105728036A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-07-06 | 福建医科大学 | 牛血清白蛋白-铂/铋复合纳米材料模拟过氧化物酶 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101450380B (zh) * | 2007-12-03 | 2010-10-06 | 国家纳米科学中心 | 一种制备树枝状金核/铂壳结构的双金属纳米棒的方法 |
| WO2010104819A2 (en) * | 2009-03-09 | 2010-09-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hollow gold nanospheres (haunss) and haunss-loaded microspheres useful in drug delivery |
| CN102019179B (zh) * | 2009-09-17 | 2012-12-26 | 国家纳米科学中心 | 一种金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液及其制备方法 |
| CN102039124B (zh) * | 2009-10-21 | 2012-11-21 | 国家纳米科学中心 | 铂诱导的金核/钯铂岛状合金壳结构纳米棒溶液及制法 |
| CN102319435A (zh) * | 2011-06-20 | 2012-01-18 | 复旦大学 | 含纳米金棒的介孔二氧化硅复合粒子及其制备方法和应用 |
| US9102540B2 (en) * | 2011-07-31 | 2015-08-11 | International Business Machines Corporation | Graphene nanomesh based charge sensor |
| CN102998413B (zh) * | 2011-09-16 | 2015-09-30 | 国家纳米科学中心 | 金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的用途及检测过氧化氢、葡萄糖和胆固醇的方法 |
| CN104707597B (zh) * | 2013-12-13 | 2017-05-10 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 金属纳米线网/介孔二氧化硅核壳结构催化剂的制备方法 |
| CN103645315B (zh) * | 2013-12-18 | 2015-07-01 | 国家纳米科学中心 | 一种铂基合金结构的纳米棒模拟酶溶液及在elisa中的应用 |
| CN103949248B (zh) * | 2014-05-08 | 2016-07-06 | 上海问鼎环保科技有限公司 | 一种二氧化钛包覆金纳米笼结构的复合催化剂及其制备方法和应用 |
| CN105436511B (zh) * | 2014-07-29 | 2017-05-10 | 首都师范大学 | 一种铂纳米笼免疫探针及其制备方法和在制备电化学免疫传感器中的应用 |
| KR20160035941A (ko) * | 2014-09-24 | 2016-04-01 | 주식회사 엘지화학 | 중공 금속 나노입자, 이를 포함하는 촉매 및 중공 금속 나노입자의 제조방법 |
| CN104493160A (zh) * | 2015-01-09 | 2015-04-08 | 江苏大学 | 一种金纳米棒生物复合物及其制备方法和应用 |
| CN104873975B (zh) * | 2015-04-29 | 2017-06-06 | 中国科学院化学研究所 | 一种金纳米材料及其制备方法和应用 |
| CN105036070B (zh) * | 2015-06-30 | 2017-01-25 | 国家纳米科学中心 | 一种金纳米棒‑二氧化硅核壳结构纳米材料、制备方法及用途 |
| CN107890873B (zh) * | 2017-11-06 | 2020-08-25 | 许昌学院 | 一种空心状铂铜钴三元合金纳米颗粒模拟酶及其制备和应用 |
-
2018
- 2018-11-06 CN CN201811312340.2A patent/CN109358195B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104502614A (zh) * | 2015-01-26 | 2015-04-08 | 湖南科技大学 | 一种基于金纳米簇模拟酶试剂盒及其制备方法及应用 |
| CN105728036A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-07-06 | 福建医科大学 | 牛血清白蛋白-铂/铋复合纳米材料模拟过氧化物酶 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109358195A (zh) | 2019-02-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109358195B (zh) | 一种中空金铂合金纳米笼核-多空二氧化硅壳纳米酶及其制备方法和应用 | |
| US5405743A (en) | Reversible agglutination mediators | |
| CN108982834B (zh) | 纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法 | |
| Ge et al. | Ultrasensitive electrochemical immunosensor for CA 15-3 using thionine-nanoporous gold–graphene as a platform and horseradish peroxidase-encapsulated liposomes as signal amplification | |
| CN110346560B (zh) | 一种多酶信号颗粒及其制备方法与应用 | |
| Li et al. | Antigen-labeled mesoporous silica-coated Au-core Pt-shell nanostructure: a novel nanoprobe for highly efficient virus diagnosis | |
| CN111830255B (zh) | 一种诺氟沙星的检测方法 | |
| WO2017206713A1 (zh) | 一种磁微粒偶联抗体分子的方法 | |
| CN113351182A (zh) | 表面两性离子聚合物修饰的磁性微球及其制备方法和应用 | |
| Zhu et al. | Colorimetric and fluorometric dual-channel detection of α-fetoprotein based on the use of ZnS-CdTe hierarchical porous nanospheres | |
| Wu et al. | Enhanced immunoassay for porcine circovirus type 2 antibody using enzyme-loaded and quantum dots-embedded shell–core silica nanospheres based on enzyme-linked immunosorbent assay | |
| CN113203781A (zh) | 一种基于RGO-CS-Hemin@Pt NPs纳米材料和适配体检测GPC3的方法 | |
| CN113092452A (zh) | 一种生物化学传感器的制备方法及应用 | |
| Chen et al. | Immunoaffinity monolithic capillary microextraction coupled with ICP-MS for immunoassay with quantum dot labels | |
| Xu et al. | A highly sensitive electrochemiluminescence immunosensor based on magnetic nanoparticles and its application in CA125 determination | |
| Tan et al. | Sensitive reagentless electrochemical immunosensor based on an ormosil sol–gel membrane for human chorionic gonadotrophin | |
| CN109917128B (zh) | 抗降钙素原抗体包被颗粒的方法 | |
| CN112206771A (zh) | 一种三元金属Pd-M-Ir纳米酶及其制备方法和应用 | |
| CN112305053B (zh) | 一种硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器及其电化学免疫分析方法 | |
| CA1322067C (en) | Reversible agglutination mediators | |
| CN110261604B (zh) | 抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法及应用 | |
| CN111693721A (zh) | 基于普鲁士蓝纳米酶标记物的酶联免疫吸附实验的制备方法及应用 | |
| CN112305228A (zh) | 一种肌红蛋白直接化学发光检测试剂盒、制备方法及用途 | |
| Chen et al. | Gold Nanoparticles Doped Three‐Dimensional Sol‐gel Matrix for Amperometric Human Chorionic Gonadotrophin Immunosensor | |
| WO2023116586A1 (zh) | Si-FITC比率型荧光纳米探针的合成方法及其在新冠病毒抗原检测中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20220426 |