CN109355315B - 以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法与应用 - Google Patents

以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法与应用。本发明是将甘蔗渣通过过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理，将其作为酵母菌发酵乙醇和丁二酸的碳源，添加在发酵培养基中，发酵培养基还含纤维素酶，发酵生产得到乙醇和丁二酸。本发明以甘蔗渣为原料，首次采用过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理甘蔗渣，高度有效，去除木质素和乙酰基的同时可保留住综纤维素，采用高底物结合低酶使用量的方式，显著降低了生产成本，同时实现乙醇和丁二酸的同步生产，提高了底物利用率和生产效率，对实现可持续发展有积极的经济和社会效益。

Description

以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法与应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及以一种以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法与应用。
背景技术
甘蔗渣是制糖工业中产生的木质纤维素类废弃物，全球每年产量高达1.0×108吨。我国是世界上第三大甘蔗种植国家，南方是主要种植甘蔗的地区，甘蔗渣年产量达到约700万吨。
目前甘蔗渣主要的处理方式有燃烧发电、制备家畜饲料和转化高值化学品等。由于组分中包含高含量的结构性糖，甘蔗渣作为生物炼制的重要底物受到广泛的研究。目前生物炼制的新型技术开发倍受重视，但一些具有挑战性的难题如预处理方法的可行性、酶成本高和底物转化效率低下等限制了产业化进程。通过预处理可破坏木质纤维素的抗降解屏障，使木质纤维素能更容易被降解为可发酵糖，因此能够有效提高其作为微生物的底物在生物转化过程中的效率。开发新型的预处理技术，有效降低木质纤维素抗性的同时保留综纤维素，尽可能降低商业酶的用量，使用高效转化菌株结合优良的发酵工艺提高底物转化率和产物产量成为亟待解决的问题。
乙醇是生物质生物转化最具代表性的产物之一。丁二酸，又称琥珀酸，被美国能源部列为未来12种最具价值的生物炼制产品之一，作为重要的平台化合物，丁二酸可被用于合成多种有价值化学品，广泛应用于制药行业、食品添加剂等领域。目前，利用甘蔗渣进行高浓度乙醇和丁二酸的同步发酵技术鲜见报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法。
本发明的另一目的在于提供上述以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法，是将甘蔗渣通过过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理，将其作为酵母菌发酵乙醇和丁二酸的碳源，添加在发酵培养基中，发酵培养基还含纤维素酶，发酵生产得到乙醇和丁二酸，具体包括如下步骤：
(1)将甘蔗渣、过硫酸氢钾和水混匀，得到反应体系；加热，保温，接着用水洗至中性，干燥，得到过硫酸氢钾预处理后的甘蔗渣；
(2)将步骤(1)得到的过硫酸氢钾预处理后的甘蔗渣与氢氧化钠溶液混匀，加热，保温，用水洗至中性，干燥，粉碎，得到过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理后的甘蔗渣；
(3)将酵母菌菌液接种至种子培养基中培养至对数生长期，得到种子液；
(4)将步骤(3)得到的种子液接种到发酵培养基中，进行发酵，得到乙醇和丁二酸；
其中，发酵培养基含有步骤(2)制备的过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理后的甘蔗渣为碳源，以及纤维素酶。
步骤(1)中所述的水优选为蒸馏水。
步骤(1)中所述的过硫酸氢钾的用量按其在反应体系中的浓度为100～200mmol/L计算；更优选为按其在反应体系中的浓度为175mmol/L计算。
步骤(1)中所述的加热的温度为35～75℃；优选为65℃。
步骤(1)中所述的保温的时间为6～14h；优选为10h。
步骤(1)中所述的干燥的方式优选为烘干。
所述的烘干的温度为50～60℃；优选为55℃。
步骤(2)中所述的氢氧化钠溶液的浓度为质量体积比(g/mL)0.4～1％；优选为质量体积比0.5％。
所述的氢氧化钠溶液的用量优选为按过硫酸氢钾预处理后的甘蔗渣：氢氧化钠溶液＝固液比1g:10～25mL计算；更优选为按过硫酸氢钾预处理后的甘蔗渣：氢氧化钠溶液＝固液比1g:20mL计算。
步骤(1)和(2)中所述的加热的方式为采用水浴锅加热。
步骤(2)中所述的加热的温度为60～70℃；优选为65℃。
步骤(2)中所述的保温的时间为30～60min；优选为40min。
步骤(2)中所述的干燥的方式优选为抽滤后再烘干。
所述的抽滤是抽滤至得到固体。
所述的烘干的温度为55℃。
步骤(2)中所述的粉碎的目数为10～100目；优选为20目。
步骤(3)中所述的酵母菌为能利用纤维素的酵母菌，优选为酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)SHY07-1。
所述的种子培养基为酵母菌能生长繁殖的培养基，优选成分如下的培养基：木糖18～22g/L、酵母粉8～12g/L、蛋白胨18～22g/L；更优选成分如下的培养基：木糖20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L。
步骤(3)中所述的培养的条件优选为于28～32℃、150～200rpm培养13h～18h；更优选为于30℃、18rpm培养14h～16h。
步骤(4)中所述的种子液的接种量优选为体积百分比5～15％；更优选为体积百分比10％。
步骤(4)中所述的发酵培养基的组成优选如下：100～350g/L过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理得到的甘蔗渣、酵母粉3～6g/L、KH2PO43～6g/L、MgSO4·7H2O 0.3～0.6g/L，纤维素酶5～15FPU/g过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理得到的甘蔗渣，pH6.5～7.0；更优选如下：330g/L过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理得到的甘蔗渣、酵母粉5g/L、KH2PO4 5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，纤维素酶5～15FPU/g过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理得到的甘蔗渣，pH6.8。
步骤(4)中所述的过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理后的甘蔗渣为在发酵时一次加入，或是在发酵过程中分批加入。
步骤(4)中所述的纤维素酶优选为Cellic CTect2。
步骤(4)中所述的纤维素酶为在发酵时一次加入，或是在发酵过程中分批加入。
步骤(4)中所述的发酵的温度为28～32℃；优选为30℃。
步骤(4)中所述的发酵的转速为120～180rpm；优选为150rpm。
步骤(4)中所述的发酵的时间为4～10天；优选为5～9天。
上述以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法在乙醇和丁二酸生产中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明利用甘蔗渣这种来源广、廉价的可再生资源进行发酵，节约了发酵成本。
2.本发明的发酵培养基简单，只有甘蔗渣和少量酵母粉以及两种无机盐。
3.本发明首次采用过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理，高度有效，能够去除92.95％的木质素和100％的乙酰基，同时保留81.2％的综纤维素。
4.本发明的同步糖化共发酵过程中，采用了最高33％(w/v)的碳源量和最低5FPU/g预处理后的甘蔗渣的酶用量。高底物浓度下发酵可显著减少水和能量消耗，结合使用较低的酶用量，显著降低了生产成本，同时提高了底物利用率和生产效率。通过改变发酵策略，如将批次发酵改为补料批次发酵，流加底物和酶，能够显著提高乙醇和丁二酸的生产效率。批次发酵是将碳源和纤维素酶在发酵初始一次性加入；补料批次发酵是将碳源或酶在发酵初始只加入部分，发酵进行一段时间后再补加剩余的物料使得碳源和纤维素酶的总添加量与所述的批次发酵相同。
5.本发明首次利用甘蔗渣进行高浓度乙醇和丁二酸的同步发酵，实现乙醇和丁二酸的同步生产能够有效提高底物利用效率，促进甘蔗渣废弃资源的利用，对实现可持续发展有积极的经济和社会效益。发酵液中高浓度乙醇能够显著降低蒸馏分离的成本。
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理甘蔗渣
(1)过硫酸氢钾预处理：称取5g甘蔗渣加入250mL三角瓶中，同时加入50mL蒸馏水与甘蔗渣混匀。将过硫酸氢钾加入50mL蒸馏水中溶解，得到的过硫酸氢钾溶液的浓度350mmol/L，然后将过硫酸氢钾溶液加入三角瓶中与甘蔗渣混匀，甘蔗渣和(水+过硫酸氢钾溶液)按固液比为1g:20mL配比)，保鲜膜封口后放入65℃水浴锅中保温10h，完成预处理。之后用蒸馏水将甘蔗渣水洗至中性，55℃烘干后备用。
(2)脱乙酰化预处理：脱乙酰化预处理在250ml三角瓶中进行，固液比为1：20。称取氢氧化钠溶于100mL蒸馏水中，使得碱溶液浓度为0.5％(w/v)。称取5g过硫酸氢钾预处理后的甘蔗渣加入250mL三角瓶中，之后将碱溶液加入三角瓶中与甘蔗渣混匀，保鲜膜封口后放入65℃水浴锅中反应40min，完成预处理。之后将甘蔗渣水洗至中性，抽滤得到固体，55℃烘干后粉碎过20目筛，备用。
使用美国国家可再生能源实验室(NREL)方法检测联合预处理后的甘蔗渣中组分含量，综纤维素(除去抽出物和木质素后留下的部分，即纤维素和半纤维素)含量为83.5％，固体回收率为58.5％，综纤维素回收率为81.2％。
表1NREL方法测得的甘蔗渣组分对比
Figure BDA0001870329200000041
实施例2：以预处理后的甘蔗渣为底物进行批次同步糖化共发酵产乙醇和丁二酸
一、材料
菌株：酵母菌Saccharomyces sp.SHY07-1(于2011年9月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC M 2011337，已在国家发明专利201110304975.X中公开)。
发酵培养基：330g/L实施例1过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理得到的甘蔗渣、酵母粉5g/L、KH2PO4 5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH6.8，为发酵培养基A，加入纤维素酶，为发酵培养基，其中酶添加量为5～15FPU/g实施例1过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理得到的甘蔗渣。
种子培养基：木糖20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L；115℃灭菌30min。
二、操作
(1)种子液的制备：从-80℃冰箱中取出1管酵母菌株，放入温水中迅速融化，挑取一环菌液接入种子培养基中，摇床中30℃、180rpm培养14h～16h，即得种子液。
(2)发酵培养基A的制备：将33％(w/v)实施例1预处理得到的甘蔗渣为培养基碳源加入到反应器中，再加入5g/L酵母粉、5g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O，调节pH为6.8。分装，每个瓶子装有发酵培养基A13.5mL。
(3)同步糖化共发酵：加入纤维素酶Cellic CTect2，酶用量分别为5、10或15FPU/g预处理得到的甘蔗渣，得到发酵培养基。用注射器吸取1.5mL种子液(接种量为体积百分比10％)接种到发酵培养基中，至工作体积达到15mL。在摇床中于30℃、150rpm的条件下发酵。
(4)因为底物量非常高，发酵体系在发酵前期(120h)均保持固形物状态而无法取样。当发酵进行到可以取样时每隔24h取样测定发酵产物，结果见表2。
表2不同酶添加量下的同步糖化共发酵结果
Figure BDA0001870329200000051
实施例3：甘蔗渣补料批次同步糖化共发酵
发酵培养基中，初始加入预处理的甘蔗渣添加量为165g/L，发酵至24h补加165g/L预处理的甘蔗渣，使总底物量达到330g/L。酶添加量为10FPU/g甘蔗渣，发酵初始一次性加入。
结果显示，经过96h的发酵，同步获得了114.88g/L乙醇和30.50g/L丁二酸。接种以及发酵条件同实施例2。
实施例4：酶补料批次同步糖化共发酵
发酵培养基中，初始预处理的甘蔗渣添加量为330g/L。初始酶添加量为5FPU/g甘蔗渣，发酵至24h补加5FPU/g预处理的甘蔗渣的酶量，使总酶量达到10FPU/g预处理的甘蔗渣。接种以及发酵条件同实施例2。
结果显示，经过144h的发酵，同步获得了112.69g/L乙醇和33.46g/L丁二酸。
实施例5：底物和酶的补料批次同步糖化共发酵
初始预处理的甘蔗渣添加量为165g/L，初始酶添加量为5FPU/g预处理的甘蔗渣，发酵至24h分别补加165g/L预处理的甘蔗渣和5FPU/g预处理的甘蔗渣，使得总底物量达到330g/L，总酶量达到10FPU/g预处理的甘蔗渣。接种以及发酵条件同实施例2。
结果显示，经过96h的发酵，同步获得了110.53g/L乙醇和38.12g/L丁二酸。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将甘蔗渣和水混匀，再和浓度为350mmol/L的过硫酸氢钾溶液按固液比1g：20mL混匀，固体为甘蔗渣，液体为水和过硫酸氢钾溶液的总量；于65℃水浴10h，接着用水洗至中性，干燥，得到过硫酸氢钾预处理后的甘蔗渣；
（2）将步骤（1）得到的过硫酸氢钾预处理后的甘蔗渣与浓度为0.5%（w/v）的氢氧化钠溶液按固液比1 g：20mL混匀，65℃水浴40 min，用水洗至中性，干燥，粉碎，得到过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理后的甘蔗渣；
（3）将酵母菌菌液接种至种子培养基中培养至对数生长期，得到种子液；
（4）将步骤（3）得到的种子液接种到发酵培养基中，于30℃、150 rpm 的条件下进行发酵，得到乙醇和丁二酸；
其中，发酵培养基含有步骤（2）制备的过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理后的甘蔗渣为碳源，以及纤维素酶；
步骤（3）中所述的酵母菌为酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）SHY07-1，于 2011 年9 月 29 日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC M 2011337；
步骤（4）中所述的发酵培养基的组成如下：100～350 g/L过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理得到的甘蔗渣、酵母粉 3～6 g/L、KH2PO4 3～6 g/L、MgSO4 ·7H2O 0.3～0.6 g/L，纤维素酶5～15 FPU/g过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理得到的甘蔗渣，pH 6.5～7.0；
步骤（4）中所述的过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理后的甘蔗渣为在发酵时一次加入，或是在发酵过程中分批加入；
步骤（4）中所述的纤维素酶为在发酵时一次加入，或是在发酵过程中分批加入；
步骤（4）中所述的纤维素酶为Cellic CTect2；
步骤（4）中所述的发酵的时间为4～10天。
2.根据权利要求1所述的以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的发酵培养基的组成如下：330 g/L过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理得到的甘蔗渣、酵母粉 5 g/L、KH2PO4 5 g/L、MgSO4 ·7H2O 0.5 g/L，纤维素酶5～15 FPU/g过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理得到的甘蔗渣，pH6.8。
3.根据权利要求1所述的以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的过硫酸氢钾的用量按其在反应体系中的浓度为175mmol/L计算。
4.根据权利要求1所述的以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的粉碎的目数为10～100目；
步骤（3）中所述的培养的条件为于28～32℃、150～200 rpm培养13 h～18 h。
5.根据权利要求1所述的以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的水为蒸馏水；
所述的种子培养基的成分如下：木糖 18～22 g/L、酵母粉 8～12g/L、蛋白胨 18～22g/L；
步骤（4）中所述的种子液的接种量为体积百分比5～15%。
6.权利要求1～5任一项所述的以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法在乙醇和丁二酸生产中的应用。
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