CN103205473A - 一种甘蔗渣的预处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘蔗渣的预处理方法，该方法将甘蔗渣干燥，粉碎，筛分后，用氢氧化钠和双氧水对甘蔗渣进行预处理，即得到预处理后甘蔗渣，经该方法预处理后的甘蔗渣材料半纤维素和木质素的最大脱除率分别达到78.18%和94.56%，纤维素最高酶水解率为64.37%，相比未处理蔗渣原材料的酶解效率提高了60.67%。由此可见，该方法打破了半纤维素和木质素对纤维素的包裹，提高了纤维素水解率，改善了蔗渣的抗酶解特性，所得到的蔗渣材料被酶解后可用于微生物发酵转化乙醇等高附加值产品，实现蔗渣等生物质资源的有效利用。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种甘蔗渣的预处理方法。
背景技术
木质纤维素是地球上最丰富廉价的可再生资源，主要来源于农业废弃物，工业废弃物和城市废弃物。随着化石燃料的枯竭和环境的日益恶化，利用木质纤维素转化燃料乙醇等能源产物广受关注。
甘蔗渣是甘蔗经机械压榨、浸提后所得的部分，是甘蔗制糖工业的纤维素性残渣副产物，约占压榨量的24%-27%。不完全统计，我国甘蔗渣年总产量达到700万吨以上。云南省是我国糖业优势产区之一，甘蔗制糖是云南省的重要支柱产业，近年来云南食糖产量稳居全国第二位。甘蔗种植业和制糖工业在云南省地方经济中占有重要的地位。2010-2011年，云南甘蔗产量达1750.92万吨，甘蔗渣产量达437.73万吨。如此大量的蔗渣如何处理和有效利用是一个不可忽视的社会和环境问题，目前除用于造纸之外，主要的处理方法是焚烧和作为饲料的原材料，利用效率很低，不但造成资源浪费，甚至会形成严重的环境污染。蔗渣富含丰富的纤维素，利用它生产燃料乙醇被寄予厚望，其综合利用受到国内外越来越广泛的重视。
蔗渣等木质纤维素结构复杂，主要由纤维素、半纤维素和木质素三部分构成。纤维素是由葡萄糖通过β-1,4糖苷键联接而成的高分子聚合物，以聚集态存在，含有大量的结晶区，并且分子间和分子内存在大量的氢键。半纤维素结构变化随原材料的种类不同而不同，主要组成成分含有木糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖等。围绕在纤维素周围，并通过纤维素的孔位深入到纤维素内部。有人认为它是纤维素和木质素之间的粘合剂。木质素是由类苯丙烷结构组成的复杂化合物，通过化学键和半纤维素链接，包围并加固纤维素和半纤维素骨架。这样的复杂结构特征使得木质纤维素降解困难，微生物降解和转化的能力受到了极大的限制。对其直接进行酶水解，水解效率低，不到理论值的20%，而经预处理之后水解率会有很大的提高。因此，利用蔗渣等木质纤维素材料实现乙醇等高附加值产品的转化之前必须进行适当的预处理，改变其天然结构脱去木质素，增加原料的疏松程度，增加纤维素酶或微生物的有效接触，有效的实现木质纤维素高附加值产品的转化。
目前，木质纤维素预处理的主要有物理法（粉碎，球磨等），化学法（碱，酸，氧化剂，有机溶剂处理等），物理化学法(蒸汽爆破，超临界流体，湿热氧化处理等)和生物法（白腐真菌等可以降解木质素的微生物处理）。但是，依然存在成本高，效率低，污染严重等技术瓶颈有待突破，需要进一步研究，降低预处理成本，提高预处理效率。
目前大多文献报道关于蔗渣NaOH或H2O2预处理在单独溶液作用下处理，其中的H2O2溶液浓度较大，尤其是NaOH预处理大多在高温高压的条件下进行，设备成本要求高；会造成很大部分的纤维素脱除，浪费资源；产生的发酵抑制物含量多；经优化结合NaOH和H2O2混合溶液的蔗渣预处理的研究较少。本发明提供的预处理方法采用较低浓度的H2O2结合NaOH溶液在较低温度下对蔗渣进行预处理，降低了整个预处理的成本，提高了纤维素的水解率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甘蔗渣的预处理方法，利用低浓度的NaOH溶液结合H2O2在低温条件下对干燥粉碎后的甘蔗渣进行预处理，从而改变原材料的天然特性，打破纤维素的结晶结构以及半纤维素和木质素对纤维素的包裹，改善甘蔗渣木质纤维素难降解的化学特性，促进纤维素酶和微生物对纤维素的有效接触，实现甘蔗渣木质纤维素到乙醇等产品的高附加值转化。
本发明通过以下步骤实现本发明目的：
（1）甘蔗渣经干燥、粉碎、筛分制得粒度在18~40目间的原料；
（2）将甘蔗渣加入到NaOH和H2O2的混合水溶液中，在25℃~42℃条件下，摇床中预处理12~36h，其中NaOH在混合水溶液中的终浓度为1%~3%，H2O2在混合水溶液中的终浓度为0.5%~1.5%；
（3）将预处理后的甘蔗渣过滤，滤渣用55℃~65℃蒸馏水洗涤至滤液pH为6.5~7.5，60℃~80℃干燥至恒重，即得到预处理后甘蔗渣，备用；
（4）利用纤维素分析仪测定处理前后蔗渣的纤维素、半纤维素和木质素相对残余量，具体测定方法参照ANKOM A200i纤维素分析仪生产厂家官方网站提供的使用说明书，结果计算：
半纤维素含量计算公式为：半纤维素（%）=NDF（%）-ADF(%)；
纤维素含量计算公式为：纤维素（%）=ADF（%）-72%硫酸洗涤残渣质量（%）；
酸性洗涤木质素（ADL）含量计算公式为：ADL（%）=残渣（%）-灰分（%）；
其中：DNF是指中性洗涤纤维素；ADF是指酸性洗涤纤维；ADL是指酸性洗涤木质素；
（5）对预处理蔗渣的发酵相关品质进行评价，包括纤维素、半纤维素和木质素的脱除率，商业纤维素酶“ONOZUKA”R-10对蔗渣酶水解的酶解效率。
预处理蔗渣的纤维素酶水解方法：每个反应体系中加入pH4.8 0.05M柠檬酸缓冲液4.8ml，称取预处理后的干燥蔗渣样品0.1 g，加入0.2 mL的纤维素酶（Yakult. Co 日本，Cellulase R-10，10mg/ml，40FPU/g底物），在50℃、150rpm下摇床温浴48h，反应结束，4℃、12000rpm离心10min，取上清，用于还原糖的测定。
其中pH4.8 0.05M柠檬酸缓冲液制备方法如下：
（1）0.1 mol/L柠檬酸溶液（A液）：准确称取柠檬酸（C6H8O7·H2O）21.014 g于500 mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入l000 mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000 mL，充分混匀，4℃冰箱中保存备用；
（2）0.1 mol/L柠檬酸钠溶液（B液）：准确称取柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）29.4129 g于500 mL的烧杯中，用蒸馏水溶解后，移入1000 mL的容量瓶中蒸馏水定容至1000 mL，充分混匀，4℃冰箱中保存备用；
（3）取溶液A 205 mL和溶液B 295 mL混匀，移入1000 mL容量瓶中用蒸馏水定容，混匀后即为0.05 mol/L pH 4.8的柠檬酸缓冲液，4℃冰箱中保存备用。
酶解液中总还原糖量和纤维素水解率的测定：取酶解上清液0.2ml加入20ml带刻度试管中，同时加入1.8ml蒸馏水和2ml DNS（3,5-二硝基水杨酸）溶液，充分混匀后沸水浴5min，冷却后用蒸馏水定容至20ml，混匀，在540nm处测定吸光值，通过标准曲线计算出相应的还原糖浓度（mg/ml）。
总还原糖含量（mg）=（还原糖浓度测定值×5）/0.2；
底物糖化水解率（%）=总还原糖量×0.9×100%；
纤维素水解率（%）=底物糖化水解率/纤维素含量百分比；
样品中的葡萄糖和总还原糖含量的测定，首先需要制备葡萄糖的标准曲线，具体实施方法参照发明申请201110092717.X。
本发明方法中所述蔗渣干燥是在80~90℃下干燥48~60h。
本发明方法中所述甘蔗渣和混合水溶液的质量体积比（w/v）为1:15~1:25。
本发明方法中摇床或搅拌预处理中旋转速率是100~200rpm。
本发明相对于现有技术的优点和技术效果：目前对于蔗渣的预处理大多采用高温高压下的酸或碱预处理，所需设备要求成本高。大多关于蔗渣NaOH或H2O2预处理是在单独溶液作用下处理，其中的H2O2溶液浓度较大，尤其是NaOH预处理大多在高温高压的条件下进行，设备成本要求高；会造成原料中部分的纤维素脱除，浪费资源，资源利用率降低；产生的发酵抑制物含量多；经优化结合NaOH和H2O2混合溶液预处理蔗渣的研究较少。而本发明采用较低浓度NaOH和H2O2混合溶液对甘蔗渣进行预处理；整个蔗渣预处理过程在25-42℃之间进行，而且只需要简单的摇床或搅拌即可，降低了预处理成本，改变半纤维素和木质素的含量，提高纤维素水解率；结果显示：妨碍纤维素酶水解的主要组分木质素的最大脱除率达94.56%，半纤维素最大脱除率达78.18%，纤维素酶解率最高达到64.37%，相比未处理蔗渣原材料的酶解效率提高了60%左右，相比现存预处理方法本发明方法具有还原糖得率高、酶解效率高和成本低的优势。
附图说明
图1是本发明葡萄糖标准曲线；
图2是本发明甘蔗渣处理后的纤维素、半纤维素和木质素相对含量和各组分的脱除率，图中：1、2、3、4分别表示实施例1、2、3、4的结果；
图3是本发明中甘蔗渣处理后的总还原糖量和纤维素水解率，图中：1、2、3、4分别表示实施例1、2、3、4的结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
实施例1：甘蔗渣的预处理方法，具体操作如下：
（1）将40g甘蔗渣在80℃干燥48h后、粉碎、筛分制得粒度在18-40目间的原料；
（2）将甘蔗渣加入NaOH和H2O2的混合水溶液中，在42℃下，150rpm摇床预处理24h，其中NaOH在混合水溶液中的终浓度为1.0%，H2O2在混合水溶液中的终浓度为1.0%，混合水溶液和甘蔗渣的质量体积（w/v）比15:1；
（3）将预处理后的甘蔗渣过滤，滤渣用65℃蒸馏水洗涤至滤液为7.0，60℃干燥至恒重，即得到预处理后甘蔗渣，备用。
将干燥、粉碎、筛分后的未处理的甘蔗渣和预处理之后的蔗渣样品置于80℃干燥至恒重，按照ANKOM A200i纤维分析仪生产厂家提供的产品使用说明书对材料进行纤维素、半纤维素和木质素含量的测定，预处理的目的在于破坏原材料的结构，打破半纤维素和木质素对纤维素的包裹，提高材料中纤维素的可及度。
经检测，未处理过的蔗渣原材料中纤维素、半纤维素和木质素的相对含量分别为52.41%、30.81%和9.15%，经预处理后蔗渣材料的纤维素、半纤维素和木质素相对含量分别为82.30%、13.10%和1.43%，相应的各组分的脱除率分别为3.56%、73.89%和90.38%（见图2中1），半纤维素和木质素的脱除明显。
（4）本实施例利用商业纤维素酶“ONOZUKA”R-10对蔗渣进行酶水解，测定预处理后材料中的总还原糖量，计算纤维素水解率，用于评价预处理效果，采用常规方法制得葡萄糖的标准曲线，结果见图1，测定总还原糖量的操作步骤如下：
每个反应体系中加入pH4.8 0.05M柠檬酸缓冲液4.8ml，称取预处理后的干燥蔗渣样品0.1 g，加入0.2 mL的纤维素酶（Yakult. Co 日本，Cellulase R-10，40FPU/g底物），在50℃、150rpm下摇床温浴48h，反应结束，4℃，12000rpm离心10min，取酶解上清液0.2ml加入20ml带刻度试管中，同时加入1.8ml蒸馏水和2ml DNS溶液，充分混匀后沸水浴5min，冷却后用蒸馏水定容至20ml，混匀，在540nm处测定吸光值。通过葡萄糖标准曲线计算得知，未处理蔗渣原材料的总还原糖量2.08mg，纤维素水解率为3.70%，而经预处理后材料的还原糖量50.04mg，酶水解效率为60.18%（见图3中1），相比未处理原材料纤维素水解率提高了56.48%。从此结果可得出本发明方法可改善蔗渣纤维素的酶解效率，所得材料可实现木质纤维素生物质的高附加值产品转化。
实施例2：甘蔗渣的预处理方法，具体操作如下：
（1）将40g甘蔗渣在90℃干燥54h后、粉碎、筛分制得粒度在18-40目间的原料；
（2）将蔗渣加入NaOH和H2O2的混合水溶液加入甘蔗渣中，在30℃下，100rpm摇床预处理12h，其中NaOH在混合水溶液中的终浓度为3.0%，H2O2在混合水溶液中的终浓度为1.0%，混合水溶液和甘蔗渣的质量比为20:1；
（3）将预处理后的甘蔗渣过滤、滤渣用60℃蒸馏水洗涤至滤液为6.5，75℃干燥至恒重，即得到预处理后甘蔗渣，备用。
按实施例1检测方法检测：未处理过的蔗渣原材料中纤维素、半纤维素和木质素的相对含量分别为52.41%、30.81%和9.15%，经预处理后蔗渣材料的纤维素、半纤维素和木质素相对含量分别为75.28%、18.47%和1.75%，相应的各组分的脱除率分别为5.28%、56.05%和85.98%（见图2中2），包裹纤维素的半纤维素和木质素的脱除明显。纤维素酶水解率为60.39%，相比未处理蔗渣原材料的酶解效率提高了56.69%（见图3中2），从此结果可得出本发明方法可改善蔗渣纤维素的酶解效率，所得材料可实现木质纤维素生物质的高附加值产品转化，且本发明预处理成本较低，在整个预处理应用中存在优势。
实施例3：甘蔗渣的预处理方法，具体操作如下：
（1）将40g甘蔗渣在85℃干燥60h后、粉碎、筛分制得粒度在18-40目间的原料；
（2）将蔗渣加入NaOH和H2O2的混合水溶液加入甘蔗渣中，在35℃下，200rpm摇床预处理36h，其中NaOH在混合水溶液中的终浓度为1.0%，H2O2在混合水溶液中的终浓度为1.5%，混合水溶液和甘蔗渣的质量比为20:1；
（3）将预处理后的甘蔗渣过滤，滤渣用65℃蒸馏水洗涤至滤液为中性，70℃干燥至恒重，即得到预处理后甘蔗渣，备用。
经按照实施例1检测方法检测：未处理过的蔗渣原材料中纤维素、半纤维素和木质素的相对含量分别为52.41%、30.81%和9.15%，经预处理后蔗渣材料的纤维素、半纤维素和木质素相对含量分别为83.66%、11.52%和1.12%，相应的各组分的脱除率分别为5.75%、77.92%和92.75%（见图2中3），各组分的脱除率较实施例1和2的各组分脱除率均有所升高，包裹纤维素的半纤维素和木质素的脱除明显。相比Silverstei等研究用H2SO4、NaOH、H2O2和O34种预处理，结果表明，NaOH预处理（2%NaOH，90min，121℃）的木质素脱除率为65%，高出27%。纤维素酶水解率为60.17%（见图3中3），比未处理蔗渣原材料的酶解效率提高了56.47%，从此结果可得出本发明方法可改善蔗渣纤维素的酶解效率，所得材料可实现木质纤维素生物质的高附加值产品转化。
实施例4：甘蔗渣的预处理方法，具体操作如下：
（1）将40g甘蔗渣在90℃干燥60h后、粉碎、筛分制得粒度在18-40目间的原料；
（2）将蔗渣加入NaOH和H2O2的混合水溶液加入甘蔗渣中，在25℃下，120rpm摇床预处理30h，其中NaOH在混合水溶液中的终浓度为2.0%，H2O2在混合水溶液中的终浓度为0.5%，混合水溶液和甘蔗渣的质量比为25:1；
（3）将预处理后的甘蔗渣过滤，滤渣用55℃蒸馏水洗涤至滤液为7.5，80℃干燥至恒重，即得到预处理后甘蔗渣，备用。
经按照实施例1检测方法检测：未处理过的蔗渣原材料中纤维素、半纤维素和木质素的相对含量分别为52.41%、30.81%和9.15%，经预处理后蔗渣材料的纤维素、半纤维素和木质素相对含量分别为84.43%、11.55%和1.01%，相应的各组分的脱除率分别为6.23%、78.18%和93.58%（见图2中4），包裹纤维素的半纤维素和木质素的脱除明显。测得总还原糖量为60.38mg，纤维素酶水解率为64.37%（见图3中4），相比未处理蔗渣原材料的酶解效率提高了60.67%，从此结果可得出本发明方法可显著提高蔗渣的木质纤维素水解率，改善其水解效果，且条件温和，处理成本低，可应用于蔗渣等木质纤维素材料的预处理研究中，实现它们到生物乙醇等高附加值产品的转化。
以上仅为本发明的具体实施例，并不以此限定本发明的保护范围，在不违反本发明的构思的基础上所作的任何替换与改进，均属本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种甘蔗渣的预处理方法，其特征在于包括以下的工艺步骤：
（1）甘蔗渣经干燥、粉碎、筛分制得粒度在18~40目间的原料；
（2）将甘蔗渣加入到NaOH和H2O2的混合水溶液中，在25℃~42℃条件下，摇床或搅拌预处理12~36h，其中NaOH在混合水溶液中的终浓度为1%~3%，H2O2在混合水溶液中的终浓度为0.5%~1.5%；
（3）将预处理后的甘蔗渣过滤，滤渣用55℃~65℃蒸馏水洗涤至滤液pH为6.5~7.5，60℃~80℃干燥至恒重，即得到预处理后甘蔗渣，备用。
2.根据权利要求1所述的甘蔗渣预处理方法，其特征在于：步骤（1）所述的蔗渣干燥是在80~90℃下干燥48~60h。
3.根据权利要求1所述的甘蔗渣预处理方法，其特征在于：步骤（2）所述的甘蔗渣和混合水溶液的质量体积比为1:15~1:25。
4.根据权利要求1所述的甘蔗渣预处理方法，其特征在于：摇床或搅拌预处理中旋转速率是100~200rpm。
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